專(zhuān)利名稱(chēng)：：靶向半乳凝素-1的基于RNAi的方法用于治療癌癥的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及RNAi技術(shù)用于使腫瘤^L^相關(guān)耙基因(半乳凝素-l)基因沉默的用途。更具體地，本發(fā)明涉及RNAi分子用于治療癌癥的用途，所述癌癥為例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤。
背景技術(shù)：
：2000年以來(lái)的新抗癌劑開(kāi)發(fā)包括約1200個(gè)項(xiàng)目，*從體內(nèi)先導(dǎo)物優(yōu)化、經(jīng)臨床前期到III期臨床試驗(yàn)(ExpertOpinionEmergingDrugs6,2001)。在這1200個(gè)項(xiàng)目中，15%以下處于I期到III期的臨床試驗(yàn)中。細(xì)胞毒性藥物與細(xì)胞抑制藥物以及信號(hào)途徑抑制劑是正在開(kāi)發(fā)的兩個(gè)最大群體。它們同抗血管發(fā)生化合物和生物制劑(例如單克隆抗體)一起代表了2000年以來(lái)在臨床階段進(jìn)行測(cè)試的抗癌藥物中的7(T/q。臨床試驗(yàn)中另外19%的抗癌藥物屬于激素療法、細(xì)胞周期抑制劑、化療保護(hù)劑和組蛋白脫乙?；敢种苿Ｅc上文相比，僅3種抗遷移(抗轉(zhuǎn)移)化合物ii^臨床試驗(yàn)，即腫瘤學(xué)臨床試驗(yàn)中藥物的2%。盡管能獲得更有效的細(xì)胞毒性藥物和細(xì)胞抑制藥物以及靶向癌細(xì)胞的單克隆抗體，但是對(duì)重病患者和/或轉(zhuǎn)移性疾病患者的治療仍然遠(yuǎn)不能令人滿(mǎn)意。信號(hào)途徑抑制劑的^f吏用更為復(fù)雜，因?yàn)檫@類(lèi)途徑在癌癥發(fā)展中并非同時(shí)全部激活。更準(zhǔn)確地說(shuō)，僅當(dāng)相應(yīng)的靶標(biāo)存在于腫瘤組織中時(shí)需要應(yīng)用特定的抑制劑。因此，個(gè)體患者需要在任何治療之前獲得其腫瘤的分子諉(molecularprofiling),這降低了治療效率和成本效益，并且延遲了可以開(kāi)始有效治療的時(shí)機(jī)。由此可見(jiàn)，仍然需要有新的治療方法來(lái)對(duì)抗癌癥。需要新的細(xì)胞靼標(biāo)以及能夠有效攻擊所述耙標(biāo)的治療性分子。細(xì)胞靼標(biāo)可優(yōu)選地涉及不同的癌癥，并在多種疾病機(jī)制(例如癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移)中起作用。半乳凝素(起初稱(chēng)為半乳糖特異性凝集素)是哺乳動(dòng)物中有15個(gè)成員的家族。該家族的每個(gè)成員在有限的一組正常組織和瘤組織中表達(dá)，并與不同的生物功能相關(guān)(Danguy等2002)。半乳凝素形成同型二聚體或寡聚體，它們可容易地與ECM中帶有相似葡聚糖的細(xì)胞表面上存在N-和O-葡聚糖以及糖脂橋接。另外，含P-半乳糖苷的質(zhì)膜糖綴合物的交聯(lián)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、粘附和存活。盡管大部分半乳凝素已被描述為細(xì)胞外作用物，但是細(xì)胞內(nèi)功能也有描述。發(fā)現(xiàn)它們?cè)谏镞^(guò)程(包括癌癥相關(guān)的細(xì)胞過(guò)程)中起到多種重要作用。這樣，半乳凝素的作用與癌癥和其它增生性疾病非常緊密地聯(lián)系在一起。更具體地，本發(fā)明人考慮半乳凝素-1在腫瘤中或腫瘤周?chē)M織中的表達(dá)或過(guò)表達(dá)可以認(rèn)為是腫瘤惡性發(fā)展的征兆，并常與患者的預(yù)后不良相關(guān)，常涉及肺瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處的(轉(zhuǎn)移)或在周?chē)＝M織中的散布以及肺瘤免疫逃逸(immuneescape)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)半乳凝素-1表達(dá)或過(guò)表達(dá)可在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、非霍奇金(NH)淋巴瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤(腦腫瘤)中起到特別重要的作用。這六種癌癥類(lèi)型可占到女性患者中發(fā)生的所有癌癥的約19.8%或更多以及男性患者中發(fā)生的所有癌癥的約37.2%或更多。因此，從這些癌癥類(lèi)型的有效靶向中獲益的女性和男性患者的數(shù)量可以是每年約1,261,000個(gè)新癌癥患者。例如，與正常組織和胰腺炎相比，半乳凝素-l在胰腺導(dǎo)管腺癌中it^達(dá)(Grutzmann等2004;Shen等2004)——(涉及腫瘤細(xì)胞分化水平的情況)(Berberat等2001)。胰腺星形細(xì)胞在胰腺纖維化(慢性胰腺炎和胰腺癌的病理學(xué)特征)的發(fā)生中起重要作用。Fritzner等2005顯示大鼠胰腺星形細(xì)胞的激活與半乳凝素-1表達(dá)的提高相關(guān)，所述半乳凝素-1調(diào)節(jié)胰腺星形細(xì)胞的功能。已證明半乳凝素-1在頭與頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)中表達(dá)。其在與攻擊性(Choufani等1999)相關(guān)的腫瘤侵襲性區(qū)室(Gillenwater1996)中表達(dá)。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的半乳凝素-1表達(dá)常呈陽(yáng)性，其中腺癌尤為突出。半乳凝素-l表達(dá)隨惡性t艮而趨向于提高，并且是可涉及肺瘤細(xì)胞增殖活性的不利的獨(dú)立預(yù)后因素(SzokeT等2005;Gabius等2002)。從細(xì)胞外加入黑色素瘤細(xì)胞中的重組半乳凝素-1誘導(dǎo)層粘連蛋白或纖連蛋白(vandenBrule等1995)上細(xì)胞粘附的劑量依賴(lài)性提高，并通過(guò)與糖蛋白卯K/MAC-2BP相互作用(TinariN等2001)謙導(dǎo)細(xì)胞聚集劑量依賴(lài)性提高。半乳凝素-1的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)以及癌細(xì)胞中半乳凝素-1的表達(dá)與這些腫瘤攻擊性之間的關(guān)聯(lián)(Rabinovich等2002)使得本發(fā)明人提出假說(shuō)腫瘤細(xì)胞可通過(guò)分泌半乳凝素-1而損害T細(xì)胞效應(yīng)子功能，該機(jī)制可有助于在腫瘤位點(diǎn)使平衡向免疫抑制環(huán)境傾斜。Rubinstein等2004主張?jiān)诎肴槟?1介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)與其對(duì)腫瘤免疫逃逸的貢獻(xiàn)之間存在聯(lián)系。阻斷黑色素瘤組織中半乳凝素-1的抑制效應(yīng)導(dǎo)致腫瘤質(zhì)量降低,并在體內(nèi)刺激產(chǎn)生腫瘤特異性T細(xì)胞應(yīng)答。這支持了半乳凝素-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)效應(yīng)子T細(xì)胞的存活或極化而有助于免疫赦免的觀點(diǎn)，并提示了可能與癌癥治療相關(guān)的用于操作T細(xì)胞凋亡的潛在分子靶標(biāo)。盡管正常淋巴組織的管壁不表達(dá)半乳凝素-1，但是淋巴瘤中的血管壁表達(dá)與血管密度相關(guān)的半乳凝素-l(D'Haene等2005)。由于CD7表達(dá)的缺失和細(xì)胞糖基化的改變，Sezary細(xì)胞——皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(Sezary綜合征或蕈樣肉芽腫病(mycosisfungoides))中的惡性T細(xì)胞一一抵抗多種凋亡誘導(dǎo)劑包括半乳凝素-1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。最近的證據(jù)也表明半乳凝素-l(dGal-l)可謙導(dǎo)人T白血病MOLT-4質(zhì)膜上以及早幼粒細(xì)胞系和活化的中性粒細(xì)胞上磷脂酰絲氨酸(與凋亡細(xì)M喧作用相關(guān)的早期細(xì)胞凋亡標(biāo)記)的暴露，但是這不導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而是準(zhǔn)備將細(xì)胞用于吞噬性移除。半乳凝素-1已祐:l艮導(dǎo)為腦生理過(guò)程(physiologicalbrainprocess)中最重要的半乳凝素家族成員(Danguy等2002,Camby砵2001，Zanetta,1998)。本發(fā)明至少部分基于半乳凝素-1與y^神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性的發(fā)生直接相關(guān)這一發(fā)現(xiàn)。在患人神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤的患者中，半乳凝素-1的表達(dá)水平和才莫式與惡性的發(fā)生相關(guān)(Camby等2001)。在最近對(duì)高分級(jí)星形細(xì)胞腫瘤臨床樣品的調(diào)查中，注意到人惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤中半乳凝素-1的低表達(dá)水平與這些惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者異乎尋常的長(zhǎng)存活相關(guān)(Camby等2001)。相反，在人外科樣品和動(dòng)物模型中的高侵襲性腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞中均觀察到提高的半乳凝素-1表達(dá)水平(Camby等2001)。盡管半乳凝素表達(dá)水平的提高與人神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性的發(fā)生相關(guān)，但是人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中這類(lèi)惡性的發(fā)生與半乳凝素-3表達(dá)的顯著降低相關(guān)(Camby等2001)。這些數(shù)據(jù)指出半乳凝素-1和半乳凝素-3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性發(fā)生中的不同作用。因此，抗半乳凝素-3策略用于抗癌治療目的的用途不能外推至神經(jīng)膠質(zhì)瘤。半乳凝素-1與惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤攻擊行為的直接聯(lián)系已被報(bào)導(dǎo)(Camby等2002;Rorive等2001,Gunnersen等2000，Yamaoka等2000)。例如，本申請(qǐng)顯示在體外向U87人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中添加半乳凝素-1可顯著提高其遷移能力(Camby等2002，Rorive等2001)。這些效應(yīng)與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組和小GTPaseRhoA的表達(dá)提高相關(guān)(Camby等2002)。反之，通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)半乳凝素-1反義mRNA的表達(dá)載體改造了組成型表達(dá)降低水平的半乳凝素-1的人U87成M^細(xì)胞瘤細(xì)胞(U87/Gr)。在體內(nèi)，將U87/Gr細(xì)胞顱內(nèi)移植到棵鼠中引起與移植對(duì)照細(xì)胞的小鼠相比長(zhǎng)得多的存活(Camby等2002)。在體外，U87/Gr細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性(motile)不如親本(野生型)和模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(Camby等2002)。這些細(xì)胞中半乳凝素-1表達(dá)的長(zhǎng)期缺乏未改變細(xì)胞生長(zhǎng)特征，但是損害在Boyden腔(Boydenchambers)中的細(xì)胞粘附和侵襲力，并降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)、分泌和活性?；|(zhì)金屬蛋白酶-2在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性發(fā)生中發(fā)揮顯著作用(Rao2003)。腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞中半乳凝素-1表達(dá)和分泌水平的降低使這些肺瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)和分泌水平降低，該特征會(huì)進(jìn)而降低腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞侵襲腦實(shí)質(zhì)的能力(Camby等，2002)。為了進(jìn)一步指導(dǎo)半乳凝素-1促進(jìn)肺瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)性和侵襲的分子機(jī)制的研究，還通過(guò)cDNA微陣列分析將反義半乳凝素-1載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的效應(yīng)與模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及野生型細(xì)胞進(jìn)行比較。91個(gè)基因(可能與癌癥相關(guān)的631個(gè)基因中)的表達(dá)提高至少2倍。p21waf/cipl、cullin-2、p53、a9[51整合素、ADAM-15和MAP-2的免疫細(xì)胞化學(xué)確認(rèn)了蛋白質(zhì)水平的提高。還觀察到a鄧l整合素和ADAM-15蛋白質(zhì)表ii^式的重要差異。半乳凝素抑制劑用于一般治療癌癥的用途已,皮才艮導(dǎo)。例如，已經(jīng)提出抗半乳凝素-4或抗半乳凝素-9治療方法用于對(duì)抗某些癌癥類(lèi)型的用途。然而，本發(fā)明不是耙向半乳凝素-4或半乳凝素-9。US2003/0109464描述了通過(guò)施用治療化合物在受試者中抑制乳腺腫瘤生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移的方法，所述治療化合物與GAL-1或GAL-4結(jié)合和/或抑制其活性。所述治療化合物是與一種或多種糖偶聯(lián)的氨基酸或多肽。在一些情況下，使用GAL-1的一部分和GAL-1蛋白本身(例如結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一部分)作為治療化合物，在其他情況下，使用非GAL蛋白質(zhì)(例如糖胺(glycoamine))作為治療劑。所述方法涉及乳腺癌的治療，不適用于或有效地治療上述癌癥，例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非霍奇金、淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、頭頸癌、黑色素瘤和由不同病理組成的胰腺癌。WO2004/091634描述了通過(guò)組合施用抑制半乳凝素-3抗凋亡活性的藥劑(例如"半乳凝素-3抑制劑")以增強(qiáng)化學(xué)治療劑的毒性，從而增強(qiáng)不同類(lèi)型癌癥和其他增生性疾病治療的方法和組合物。然而，半乳凝素-3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生中不起作用(Camby等，2001a)。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤疾病t艮中以及腫瘤惡性發(fā)生時(shí)，半乳凝素-3的表達(dá)水平顯著降低(Camby等，2001a)。因此，抗半乳凝素3策略用于治療性目的以對(duì)抗癌癥的一般用途不能外推至神經(jīng)膠質(zhì)瘤。因此，基于半乳凝素-3的抗凋亡活性及其抑制的上述方法在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中是無(wú)效的。由此可見(jiàn)，很明顯本領(lǐng)域存在對(duì)用于對(duì)抗癌癥(特別是惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤)的治療方法的需要。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供至少克服目前應(yīng)用的組合物和方法的一些缺點(diǎn)的核酸化合物、組合物和方法，其用于治療癌癥特別是與半乳凝素-1表達(dá)或it^i^目關(guān)的癌癥，尤其是用于治療惡性神經(jīng)^t瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤。發(fā)明概述本發(fā)明一般涉及半乳凝素-1在六種癌癥類(lèi)型的惡性發(fā)展中的作用，因此本發(fā)明涉及抗半乳凝素-1治療方法用于對(duì)抗一^類(lèi)癌癥、特別是惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤的用途。本治療方法特別地基于使用抗半乳凝素-1工具，涉及RNA干擾(RNAi)、反義、病毒載體或目的為敲低(knock-down)人腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞中半乳凝素-l表達(dá)的任何其他相關(guān)方法。在第一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及RNA核酸序列用于制備RNAi分子的用途，所述RNAi分子適于降低腫瘤細(xì)胞中半乳凝素-l的表達(dá)。更具體地，本發(fā)明涉及含有SEQIDNO:1到33中任何序列、優(yōu)選SEQIDNO:2、3或4的序列、其片段或其衍生物的RNA序列用于制備RNAi分子的用途，所述RNAi分子適于降低腫瘤細(xì)胞中半乳凝素-l的表達(dá)。本發(fā)明人驚訝地觀察到用RNAi相關(guān)方法(特別是使用siRNA)獲得的半乳凝素-1表達(dá)下調(diào)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間遠(yuǎn)高于反義寡核苷酸方法。另外，RNAi方法比反義寡核苷酸方法更適于臨床應(yīng)用得多。另外，本發(fā)明人驚訝地意識(shí)到，含有SEQIDNO:2序列、其片段或衍生物的RNAi分子(例如siRNA)在降低腫瘤細(xì)胞中半乳凝素-l表達(dá)中顯示出意外的顯著效力，所述胂瘤細(xì)胞來(lái)自神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、頭頸癌、非霍奇金淋巴瘤和黑色素瘤。例如在實(shí)施例和圖5和圖6中對(duì)"siRNA-1"(其含有SEQIDNO:2序列)所證明的，這些RNAi分子在下調(diào)半乳凝素-1中的有益效果是非常驚人的。含有SEQIDNO:2序列、其片段或衍生物的RNAi分子(例如siRNA)的其他優(yōu)點(diǎn)是其高度傾向于穿透進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，特別是來(lái)自神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、頭頸癌、非霍奇金淋巴瘤和黑色素瘤的腫瘤細(xì)胞(在體外通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察，在體內(nèi)使用靶向針對(duì)gal-1的SEQIDNO:2siRNA的熒光通過(guò)熒光顯孩i鏡觀察)。在另一方面中，本發(fā)明涉及DNA核酸序列用于制備RNAi分子的用途，所述RNAi分子適于降低腫瘤細(xì)胞中半乳凝素-l的表達(dá)。更具體地，本發(fā)明涉及含有SEQIDNO:34到66中任何序列、優(yōu)選SEQIDNO:35、36或37、其片段或衍生物的DNA序列用于制備RNAi分子的用途，所述RNAi分子適于降低腫瘤細(xì)胞中半乳凝素-1的表達(dá)。。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述DNA序列插入適用于生產(chǎn)dsRNA的表達(dá)載體中。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及含有SEQIDNO:34到66中任何序列、優(yōu)選SEQIDNO:35、36或37、其片段或衍生物的表達(dá)載體。在另一方面中，本發(fā)明涉及本文定義的RNAi分子或表達(dá)載體作為藥物的用途和/或用于制造藥物的用途，所述藥物用于治療神經(jīng)M瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤。在另一方面中，本發(fā)明涉及用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤和/或用于延遲神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金、淋巴瘤發(fā)展的藥物組合物，其包含本文定義的RNAi分子或表達(dá)載體以及可藥用栽體。在另一方面中，本發(fā)明還包括試劑盒，所述試劑盒包含本文定義的藥物組合物和用于同時(shí)、單獨(dú)或連續(xù)施用于受試者的活性化合物。在其他方面，本發(fā)明還涉及用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤的方法，以及用于延遲神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金、淋巴瘤發(fā)展的方法。本發(fā)明還提供下調(diào)腫瘤細(xì)胞中半乳凝素-1表達(dá)的方法。本發(fā)明還涉及用于降低腫瘤細(xì)胞特別是神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞遷移的方法。在另一方面中，本發(fā)明還提供用于降低腫瘤細(xì)胞優(yōu)選神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡抗性的方法，以及用于增強(qiáng)治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金^^巴瘤的癌癥療法效力的方法，所述癌癥療法選自包括化學(xué)療法、放射療法、免疫療法和/或基因療法的集合。本發(fā)明提供用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤的核酸、RNAi分子、組合物和方法，其具有與前凋亡活性不同的活性，并基于下調(diào)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞中半乳凝素-l的表達(dá)。本發(fā)明提供能夠在患病受試者中延遲神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤t艮，從而提高患者存活期的核酸、RNAi分子、組合物和方法。本發(fā)明還提供能夠降低腫瘤細(xì)胞優(yōu)選神經(jīng)M瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞遷移水平的新的核酸、RNAi分子、組合物和方法。這些藥劑也可在遷移的腫瘤細(xì)胞中重建一定水平的凋亡，從而在這些限制性遷移腫瘤細(xì)胞中重建對(duì)目前的前凋亡化學(xué)治療劑一定水平的敏感性，并增強(qiáng)前凋亡癌癥療法的效力。例如，這類(lèi)核酸、RNAi分子、組合物和方法能夠降低腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移^腦實(shí)質(zhì)的水平，同時(shí)在這些遷移的腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞中重建一定水平的凋亡。因此，本發(fā)明的組合物和方法重建這些限制性遷移肺瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)目前的前凋亡化學(xué)治療劑一定水平的敏感性，并增強(qiáng)前凋亡癌癥療法的效力。參考下文的詳細(xì)描述之后，本發(fā)明的其他方面將是顯而易見(jiàn)的。圖l表示人凝集素的核紗列，與半乳糖苷結(jié)合、可溶性、1(半乳凝素l)、登記號(hào)BC020675，556bp。圖2表示人凝集素的核酸序列，與半乳糖苷結(jié)合、可溶性、l(半乳凝素l)、登記號(hào)BC001693,543bp。圖3表示人凝集素的核酸序列，與半乳糖苦結(jié)合、可溶性、l(半乳凝素l)、登錄號(hào)NM—002305,526bp;標(biāo)出了三個(gè)推定的siRNA序列(SEQIDNO:71(下劃線(xiàn))、72(粗體)和73(粗體加下劃線(xiàn)))的位置。圖4表示兩個(gè)siRNA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖5通過(guò)Western印跡(圖5A)和免疫細(xì)胞化學(xué)焚光染色(圖5B)展示半乳凝素-1在已轉(zhuǎn)染本發(fā)明siRNA分子的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)。圖6顯示已轉(zhuǎn)染本發(fā)明RNAi表達(dá)載體的細(xì)胞中半乳凝素-l的表達(dá)。共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用(*)標(biāo)記以便于識(shí)別。紅色熒光顯示半乳凝素-1的免疫細(xì)胞化學(xué)表達(dá)。U6TetO為空載體。測(cè)試了四種shRNA構(gòu)建體。一組載體為shl-2和shl-3，另一組為sh3-2和sh3-5，分別是含有SEQIDN035和37序列的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒允許表達(dá)shRNA分子，其分別產(chǎn)生類(lèi)似于siRNA-l和siRNA-3的siRNA分子。圖7顯示體內(nèi)遞送用于治療實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抗半乳凝素-1siRNA。發(fā)明詳述引言神經(jīng)膠質(zhì)瘤占所有腦腫瘤的50%以上，是迄今為止兒童和成人中最普遍的原發(fā)性腦腫瘤(Kleihues和Cavenee2000;Lefranc等，2005a)。它們包括特征為不同進(jìn)攻性和惡性水平的三個(gè)組織病理學(xué)亞組，即室管膜瘤(<所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤的10%)、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤(所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤的5-30%)和星形細(xì)胞瘤(所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤的60-70%)。惡性星形細(xì)胞瘤由于其擴(kuò)散性地滲透進(jìn)正常腦實(shí)質(zhì)的能力而與最差的預(yù)后相關(guān)，因此包括世界衛(wèi)生組織(WHO)的II級(jí)、III級(jí)和IV級(jí)腫瘤(Kleihues和Cavenee2000;Lefranc等，2005a)。在患這些腫瘤的病例中，預(yù)后仍不樂(lè)，見(jiàn)(Kleihues和Cavenee2000)。即4更進(jìn)行了激進(jìn)的多類(lèi)型治療，患成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(WHOIV級(jí))一一所有神經(jīng)M腫瘤類(lèi)型中最?lèi)盒缘男问揭灰换颊叩闹形淮婊顣r(shí)間仍在l年范圍內(nèi)。迄今為止，尚無(wú)一例成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者被治愈(Lefranc等，2005a)。成膠質(zhì)細(xì)胞瘤占所有神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤的約50%，即成人中所有實(shí)體瘤的2%到3%以及和兒童中所有實(shí)體瘤的至多10-15%。因此，惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤屬于所有癌癥中最難于成功治療的，因?yàn)樗鼈兊奶卣鞑粌H為攻擊性增生和膨脹，還在于它們必然侵襲遠(yuǎn)處的腦組織(Lefranc等，2005a)。腦實(shí)質(zhì)中高水平的腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤的快速?gòu)?fù)發(fā)(3-6個(gè)月內(nèi))，所述復(fù)發(fā)主要在切除腔附近，但也在遠(yuǎn)離原發(fā)位點(diǎn)處發(fā)生。腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移i^腦實(shí)質(zhì)的水平不能通過(guò)^:射療法和/或化學(xué)療法減輕，因?yàn)閕)遷移的腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)凋亡有抵抗力，和ii)目前使用的放射療法和大部分化學(xué)治療劑是前凋亡劑(Lefranc等，2005a)。由此可見(jiàn)，很明顯現(xiàn)有技術(shù)中非常需要不依賴(lài)于細(xì)胞凋亡途徑的對(duì)抗惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新型治療方法。在遷移的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，大量信號(hào)途徑被激活。已經(jīng)提出通過(guò)使用針對(duì)涉及細(xì)胞遷移的一種或多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑來(lái)治療惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤。然而，主要的缺點(diǎn)在于這些途徑并不是在任何一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤中全部同時(shí)被組成型地激活(Lefranc等，2005a)。因此，為獲得成功，這類(lèi)策略需JH5l在相應(yīng)靶標(biāo)存在于腫瘤組織時(shí)應(yīng)用特定的抑制劑。因此在進(jìn)行任何對(duì)抗其惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的治療之前，這類(lèi)策略需要個(gè)體患者獲得其肺瘤的分子鐠。顯然，是這類(lèi)策略遠(yuǎn)不是有效、成本效益高的，并會(huì)在開(kāi)始有效治療前延誤寶貴的時(shí)間(Lefranc等，2005a)。跌腺癌癥(Pancreaticcancer)或腹腺癌(pancreaticcarcinoma)最通常地是指導(dǎo)管腺癌。存在外分泌胰腺癌和導(dǎo)管胰腺癌，它們構(gòu)成卯％以上的胰腺癌診斷案例。胰島細(xì)胞瘤或內(nèi)分泌胰腺胂瘤一般構(gòu)成10%以下的"^斷案例。頭頸癌包括受試者頭與頸區(qū)組織中的任何癌。這樣的頭頸癌包括如口癌、食道癌、咽癌、喉癌、甲狀腺癌、舌癌、唇癌、唾液腺癌、鼻癌、鼻旁竇癌、鼻咽癌、上鼻腔(superiornasalvault)和鼻竇腫瘤、成感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞瘤、鱗狀上皮細(xì)胞癌、惡性黑色素瘤、鼻竇未分化癌(SNUC)或血的瘤形成(bloodneoplasia)-還包括局部淋巴結(jié)(包括頸淋巴結(jié)、喉前淋巴結(jié)、肺食管旁淋巴結(jié)和下頜下淋巴結(jié))的癌(Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine,Isselbacher等編,McGraw-Hill,Inc.,第13版，1850-1853頁(yè)，1994)。黑色素瘤是指來(lái)自皮膚黑色素細(xì)胞系和其他器官(包括如口腔、食道、肛管、陰道、柔腦膜和/或眼結(jié)膜)的惡性或良性肺瘤。黑色素瘤的非限制性實(shí)例包括肢端黑色素瘤、無(wú)黑色素性黑色素瘤、良性幼年型黑素瘤、惡性雀斑^(guò)"痣黑色素瘤、惡性黑色素瘤、結(jié)節(jié)性黑色素瘤、甲下黑色素瘤、淺表擴(kuò)散性黑色素瘤等。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)包括其三種亞型的任何一種，即肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌和肺大細(xì)胞癌。淋巴瘤是在淋巴細(xì)胞中發(fā)生的癌癥。它們被廣泛地分為兩類(lèi)霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤。術(shù)語(yǔ)"非霍奇金淋巴瘤"4艮廣泛，包括不是霍奇金病的所有淋巴瘤。根據(jù)它們生長(zhǎng)的速度和攻擊性，淋巴瘤被分為三種類(lèi)型低級(jí)是生長(zhǎng)最緩慢的類(lèi)型，有時(shí)被稱(chēng)為"無(wú)痛"淋巴瘤；中級(jí)淋巴瘤生長(zhǎng)迅速；高級(jí)淋巴瘤是生長(zhǎng)最快和最有攻擊性的類(lèi)型。然而迄今為止，沒(méi)有開(kāi)發(fā)出以半乳凝素-l作為靶標(biāo)的用于對(duì)抗人癌癥(包括上述g癌、頭頸癌、黑色素瘤、NSCLC、非霍奇金淋巴瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤)的合適策略?，F(xiàn)在，本申請(qǐng)4示了抗?fàn)幰话阈园┌Y和惡性人神經(jīng)膠質(zhì)瘤和優(yōu)選的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤的改進(jìn)策略，特別是基于抗半乳凝素-l治療方法。本發(fā)明具有若干個(gè)方面，涉及半乳凝素-l在癌癥的發(fā)生和惡性中的作用，所述癌癥具體為神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和肺霍奇金'淋巴瘤。更具體地，本發(fā)明涉及RNA干擾(RNAi)用于實(shí)現(xiàn)敲低乾基因(特別是半乳凝素-1基因)表達(dá)的用途。定義本文使用的術(shù)語(yǔ)"凋亡"指在發(fā)育和其他正常的生物過(guò)程中清除不需要的或無(wú)用的細(xì)胞的生理過(guò)程。凋亡是在正常生理?xiàng)l件下發(fā)生的細(xì)胞死亡模式，且細(xì)胞是其自身死亡的積極參與者("細(xì)胞自殺，，)。本文使用的"把基因，，是指受試者中需要沉默的基因，在本文具體指人半乳凝素-l基因。"RNA干擾"或"RNAi"是最初應(yīng)用于在植物和蠕蟲(chóng)中觀察到的現(xiàn)象的術(shù)語(yǔ)，其中雙鏈RNA(dsRNA)以特異性和轉(zhuǎn)錄后的方式阻斷基因表達(dá)。RNAi提供了體外或體內(nèi)抑制基因表達(dá)的有用方法。在本文中，表達(dá)"dsRNA，，指能夠引起RNA干擾的雙鏈RNA。根據(jù)本發(fā)明，任何能夠指導(dǎo)靼基因RNAi或RNA介導(dǎo)的基因沉默的任何合適的雙鏈RNA片段均可^f吏用。本文使用的"雙鏈核糖核酸分子(dsRNA)"是指含有形成RNA雙鏈體的兩個(gè)鏈的任何RNA分子、片段或區(qū)段，可以存在未配對(duì)核苷酸的單鏈突出。雙鏈RNA包含退火的互補(bǔ)鏈，其中之一的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于待下調(diào)耙基因的耙核苷酸序列(即至少為mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分)。雙鏈RNA的另一鏈與該靼核苷酸序列互補(bǔ)。雙鏈RNA僅需要與待表達(dá)耙基因的mRNA序列充分相似就可以具有介導(dǎo)RNAi的能力。因此，本發(fā)明具有能夠容忍序列變異的優(yōu)點(diǎn)，所述變異可能由于遺傳突變、菌林多態(tài)性或進(jìn)化趨異而可以預(yù)期。靶序列和dsRNA序列的核苷酸序列之間容忍的核苷酸錯(cuò)配的數(shù)量不大于5個(gè)4^對(duì)中1個(gè)，或10個(gè)>5^^中1個(gè)，或20個(gè)>^對(duì)中1個(gè)或50個(gè)^54i^t中l(wèi)個(gè)。根據(jù)本發(fā)明，無(wú)論何時(shí)提到能夠引起干擾的RNA，"dsRNA"或"雙鏈RNA，，均可由兩個(gè)分離的(有義和反義)RNA鏈退火在一起而形成?；蛘?，dsRNA可以具有折疊的莖-環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中dsRNA的兩個(gè)退火鏈共價(jià)連接。在該實(shí)施方案中，dsRNA的有義鏈和反義鏈由部分自身互補(bǔ)的單個(gè)RNA序列的不同區(qū)域形成。本文使用的術(shù)語(yǔ)"RNAi分子"是一般術(shù)語(yǔ)，指雙鏈RNA分子，包括小干擾RNA(siRNA)、發(fā)夾RNA(shRNA)和能在體內(nèi)切割形成siRNA的其他RNA分子。RNAi分子可包含與耙核酸序列相同或基本相同的dsRNA的長(zhǎng)片段，或僅與耙核,列的一個(gè)區(qū)域相同或基本相同的dsRNA短片段。本發(fā)明的RNAi分子可以是"小干擾RNA"或"siRNA"。siRNA分子通常以雙鏈分子合成，其中每個(gè)鏈長(zhǎng)度為19-30個(gè)核苷酸左右，甚至更優(yōu)選地長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸。siRNA被理解為募集核酸酶復(fù)合體，并通過(guò)與特異序列配對(duì)將所述復(fù)合體引導(dǎo)至靶mRNA。結(jié)果，靶mRNA4皮蛋白質(zhì)復(fù)合體中的核酸酶降解。在具體的實(shí)施方案中，siRNA分子包含3，羥基。在某些實(shí)施方案中，siRNA構(gòu)建體可在dicer酶的存在下，通過(guò)加工較長(zhǎng)的雙鏈RNA而產(chǎn)生?；蛘撸琑NAi分子是義夾結(jié)構(gòu)的形式，稱(chēng)為發(fā)夾RNA或shRNA。發(fā)夾RNA可以外源性合成，或可以在體內(nèi)由RNA聚合酶III啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄形成。優(yōu)選地，這類(lèi)發(fā)夾RNA在細(xì)胞或動(dòng)物中改造，以確保持續(xù)和穩(wěn)定地抑制目的基因。本領(lǐng)域已知，siRNA可以通過(guò)在細(xì)胞中加工發(fā)夾RNA產(chǎn)生。本發(fā)明的RNAi分子可包括對(duì)磷酸-糖主鏈或核苦的修飾，例如用于降低對(duì)細(xì)胞核酸酶的敏感性、提高生物利用率、改善組成特征和/或改變其他藥代動(dòng)力學(xué)特性。在一些情況下，RNAi分子的至少一鏈具有長(zhǎng)度約1到約6核苷酸(例如長(zhǎng)度為2到4個(gè)核苷酸)的3，突出。更優(yōu)選地，3，突出長(zhǎng)度為l-3個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)鏈具有3，突出，另一鏈具有平末端或也具有突出。每個(gè)鏈的突出長(zhǎng)度可以相同或不同。為了進(jìn)一步增強(qiáng)RNAi分子的穩(wěn)定性，可以針對(duì)降解穩(wěn)定3，突出。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)包含嘌呤核苷酸(例如腺苷或鳥(niǎo)苷核苷酸)來(lái)穩(wěn)定RNA?；蛘撸眯揎椀念?lèi)似物取代嘧咬核苷酸(例如用2，-脫氧胸腺嘧咬核苷取代尿嘧咬核苷3，突出)是可容忍的，并不影響RNAi的效力?？赏ㄟ^(guò)化學(xué)合成法或通過(guò)重組核酸技術(shù)進(jìn)行RNAi分子的生產(chǎn)。RNAi分子可以SW生產(chǎn)或通過(guò)部分/完全有機(jī)合成生產(chǎn)。任何修飾的核糖核普酸均可通過(guò)體外S^成或有機(jī)合成引入?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的大量技術(shù)純化RNAi分子。例如，可使用凝膠電泳純化RNAi分子?；蛘呖墒褂梅亲冃苑椒?如非變性柱層析)純化RNAi分子。另外，可使用層析(例如尺寸排阻層析)、甘油梯度離心、使用抗體的親和純化來(lái)純化RNAi分子。核酸、RNAi分子和表達(dá)構(gòu)建體在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及核酸序列用于制備RNAi分子的用途，所述RNAi分子適于降低肺瘤細(xì)胞中靼基因(優(yōu)選半乳凝素-l基因)的表達(dá)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"降低耙基因的表達(dá)"是指所述RNAi分子以特異性的轉(zhuǎn)錄后方式阻斷耙基因表達(dá)的能力。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及RNA序列用于制備本文定義的RNAi分子(優(yōu)選siRNA分子)的用途。所述siRNA分子具有以下標(biāo)準(zhǔn)中一項(xiàng)或多項(xiàng)、優(yōu)選全部的特征-與靼mRNA具有至少50%的序列同一性，優(yōu)選地至少70%的序列同一性，更優(yōu)選至少80%的序列同一性，進(jìn)一步更優(yōu)選至少卯％的序列同一性；-具有靶向靼基因外顯子區(qū)的序列；-顯示耙向耙基因3，端而不是耙向耙基因5，端的偏好。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述siRNA分子還具有以下標(biāo)準(zhǔn)中的一個(gè)或多個(gè)特征畫(huà)長(zhǎng)度為15到25個(gè)核苷酸之間，優(yōu)選18到22個(gè)核苷酸之間，優(yōu)選19個(gè)核普酸；-GC含量為30%和50%之間；畫(huà)在其3，端顯示TT(T)序列；-釆用雙鏈體形式時(shí)顯示無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)；-Tm(解鏈溫度)低于20匸-核苷^列中具有表1指出的核苷酸，其中h是a、c、t/u，但不是g，并且其中d是a、g、t/u，但不是c，并且其中w是a或t/u,但不是g或c:表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>TT在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有任何以下序列、其片段或衍生物的RNA序列用于制備適于降低胂瘤細(xì)胞中半乳凝素-1表達(dá)的RNAi分子的用途5-aucagccagcccauggccc-3'(SEQIDNO:1)5'-gcugccagauggauacgaa-3'(SEQIDNO:2)，5'-agacagcaacaaccugugc-3'(SEQIDNO:3)5'-guguugcagaggugugcau-3'(SEQIDNO:4)5'-cauccucc卿aGUcaauc-3'(SEQIDNO:5)5'-ucauggcuuguggucuggu-3'(SEQIDNO:6)5'-ccugaaucucaaaccugga-3'(SEQIDNO:7)5'-ucucaaaccuggagagugc-3'(SEQIDNO:8)5'-accuggagagugccuucga-3'(SEQIDNO:9)5'-ccuggagagugccuucgag-3'(SEQIDNO:10:5'-gagcuucgugcugaaccug隱3'(SEQIDNO:11:5'-ccugggcaaagacagcaac-3'(SEQIDNO:12:5'-gacagcaacaaccugugcc-3'(SEQIDNO:135'-caaccugugccugcacuuc畫(huà)3'(SEQIDNO:14)5'-CGugugccugcacuucaac-3*(SEQIDNO:15)5'-cccucgcuucaacgcccac-3，(SEQIDNO:16)5'-cgcccacggcgacgccaaC"3'(SEQIDNO:17)5'-caccaucgugugcaacagc-3'(SEQIDNO:18)5'-cagcaaggacggcggggcc-3'(SEQIDNO:195'匿ggacggcggggccuggggg-3'(SEQIDNO:20:5'-ccugaccgucaagcugcca-3'(SEQIDNO:21)5'-uucaaguuccccaaccgco3'(SEQIDNO:22)5'-guuccccaaccgccucaac-3'(SEQIDNO:23)5'-ccgccucaaccuggaggcc-3'(SEQIDNO:24)5'-ccuggaggccaucaacuac-3'(SEQIDNO:25)5'-cuacauggcagcugacggu-3'(SEQIDNO:26:5'-gaucaaauguguggccuuu-3'(SEQIDNO:27:5'-auguguggccuuugacuga-3'(SEQIDNO:28,5'-uguguggccuLiLigacugaa-3'(SEQIDNO:29:5'-ucagccagcccauggccc》3'(SEQIDNO:30)5'-uaaaggcagcugccucugo3'(SEQIDNO:31:5'匿aggcagcugccucugcucc-3'(SEQIDNO:32)5'-ggcagcugccucugcuccc-3'(SEQIDNO:33)在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)"片段和衍生物，，是指這樣的核酸，其與原始核酸的差異可在于它們?cè)?，或3，端、兩端或內(nèi)部核延長(zhǎng)或縮短，或在一端延長(zhǎng)另一端縮短，只要得到的RNAi分子的功能(即下調(diào)耙基因)不消失或受到抑制。術(shù)語(yǔ)"片段和衍生物"還涉及這樣的核酸，其與原始核酸的差異可在于一個(gè)或多個(gè)原始序列的核苷酸通過(guò);^支術(shù)人員可得到的方法被其他核苷酸替換和/或(化學(xué)地)修飾，只要得到的RNAi分子的功能不消失或受到抑制。"片段和衍生物"一般可與原始核酸顯示至少80%,例如至少85%，優(yōu)選至少卯％，例如至少95%或甚至至少99%的序列同一性。兩核普酸序列之間的序列同一性可通過(guò)比對(duì)所述序列并確定比對(duì)中兩個(gè)序列含有相同核酸威基的位置數(shù)與比對(duì)中位置總數(shù)的比值來(lái)計(jì)算。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，任何上文給出的序列或其互補(bǔ)序列均可用于制備RNAi分子，即雙鏈RNA分子。當(dāng)提供了上文7>開(kāi)的核酸(特別是RNA)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何制備RNAi分子。筒言之，與本發(fā)明核酸互補(bǔ)的鏈通過(guò)任何可獲得的方法合成，并在適當(dāng)?shù)臈l件下將互補(bǔ)鏈與本發(fā)明核酸退火。退火條件(例如溫度和孵育時(shí)間)可根據(jù)相應(yīng)核酸序列進(jìn)行調(diào)節(jié)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有SEQIDNO:2的RNA序列、其片段或衍生物用于制備RNAi分子(優(yōu)選siRNA分子)的用途。優(yōu)選地，使用SEQIDNO:2序列獲得的雙鏈siRNA分子在本文中也稱(chēng)為siRNA-l。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有SEQIDNO:3的RNA序列、其片段或衍生物用于制備RNAi分子(優(yōu)選siRNA分子)的用途。優(yōu)選地，使用SEQIDNO:3序列獲得的雙鏈siRNA分子在本文中也稱(chēng)為siRNA-2。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有SEQIDNO:4的RNA序列、其片段或衍生物用于制備RNAi分子(優(yōu)選siRNA分子)的用途。優(yōu)選地，使用SEQIDNO:4序列獲得的雙鏈siRNA分子在本文中也稱(chēng)為siRNA-3。為了發(fā)揮所期望的功能，即降低腫瘤細(xì)胞中半乳凝素-1的表達(dá)，將如上所述由本發(fā)明核糖核酸制備的本發(fā)明RNAi分子(特別是siRNA分子)遞送進(jìn)耙細(xì)胞，優(yōu)逸人癌細(xì)胞，例如人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或者胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤的細(xì)胞。存在將(核糖)核酸引入動(dòng)物細(xì)胞中的若干公知方法，其中任一種均可用于本發(fā)明，這取決于宿主。最簡(jiǎn)單地，核酸可直接注射進(jìn)靼細(xì)胞/靼組織。其他方法包括將受體細(xì)胞與含有核酸的細(xì)菌原生質(zhì)體融合，使用組合物如氯化鈣、氯化銀、氯化鋰、磷酸釣、DEAE葡聚糖、陽(yáng)離子脂質(zhì)或脂質(zhì)體，或者如受體介導(dǎo)的內(nèi)才聶作用、生物射彈粒子轟擊("基因槍"法)、用病毒載體感染、電穿孔等的方法。適于將本文定義的RNAi分子遞送進(jìn)靼細(xì)胞的其他技術(shù)或方法包括從聚(乳酸-共畫(huà)乙醇酸)多聚體微球中連續(xù)遞送本文定義的RNAi分子(參閱Benny等2005),或?qū)⑹鼙Ｗo(hù)的(穩(wěn)定的)RNAi分子直接注射進(jìn)微泵中，所述微泵將手術(shù)切除孔中的產(chǎn)物遞送至仍然存在于手術(shù)位點(diǎn)的腫瘤細(xì)胞，例如將神經(jīng)外科切除孔中的產(chǎn)物遞送至仍然存在于腦實(shí)質(zhì)中的腫瘤細(xì)胞，如上文對(duì)其他抗遷移化合物用途的詳細(xì)描述(參閱Lefranc等2003)。也可使用本文定義的穩(wěn)定RNAi分子的對(duì)流增強(qiáng)遞送(convection-enhanceddelivery)，如Kawakami等(2004)所詳細(xì)描述的。另一種可能是使用^型的釋放藥物的可生物降解微球，最近由Menei和Benoit(2003)綜述。應(yīng)當(dāng)明白，還可使用不同上述遞送才莫式或方法的組合。優(yōu)選的方法是使用遞送本RNAi分子的Ommaya貯器(微泵)以及包裹在可生物降解微球中的RNAi分子，或同時(shí)使用兩種方法。基于使用微泵的相似方法可用于本發(fā)明感興趣的五種其他癌癥類(lèi)型(除了神經(jīng)膠質(zhì)瘤外)，即非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。通過(guò)RNAi技術(shù)實(shí)現(xiàn)體內(nèi)基因沉默的主要障礙是遞送。為了促進(jìn)RNAi工具的熱穩(wěn)定性、對(duì)核酸酶消化的抗性和增強(qiáng)細(xì)胞吸收，測(cè)試了多種方法。包括-化學(xué)修飾，如封閉的核酸(LNA,Elmen等2005)、磷硫酰取代(Harboth等2003)、2，-氟取代(Harboth等2003)、2'畫(huà)0-甲基取代(Czauderna等2003)、穩(wěn)定的stealthTMRNAi(Invitrogen)等。-將RNAi工具包裹在多種類(lèi)型的脂質(zhì)體(免疫脂質(zhì)體、PEG化的(免疫)脂質(zhì)體)、陽(yáng)離子脂質(zhì)和聚合物、納米顆粒或dendrimer、聚(乳酸-共-乙醇酸)聚合微球、植入型的釋放藥物的可生物降解微球等(Zhang等2004，Shi等2000;Schiffelers等2004)。-RNAi工具與保護(hù)劑如核酸酶抑制劑M三羧酸共注射(Spankuch等2004)。優(yōu)選地，可將已任選地穩(wěn)定、包裹或進(jìn)行上述其他修飾的本發(fā)明RNAi工具遞送至腫瘤位點(diǎn)，例如原發(fā)性肺瘤和/或轉(zhuǎn)移灶。實(shí)現(xiàn)局部遞送的一種方式^_使用別處所述的Ommaya貯器。將本發(fā)明RNAi工具靼向腫瘤細(xì)胞的另一方法是使用抗體指導(dǎo)的細(xì)胞類(lèi)型特異性遞送。例如，RNAi(例如siRNA)可以和特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的Fab復(fù)合，例如Fab-魚(yú)精蛋白復(fù)合物(Song等，2005)，或者RNAi可以包裹在免疫脂質(zhì)體內(nèi)。這類(lèi)抗體靶向的RNAi工具(例如納米顆粒形式的)可以通過(guò)多種途徑施用，例如全身給藥(靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射、口服給藥、鼻吸入等)或局部給藥(例如使用Ommaya貯器)?？贵w靼向的遞送可證明特別適于治療在天然表達(dá)半乳凝素-1的組織中發(fā)生的肺瘤。在該情況下，胂瘤細(xì)胞的免疫靶向會(huì)將腫瘤周?chē)＝M織中下調(diào)半乳凝素-1表達(dá)的相關(guān)副作用最小化。可以應(yīng)用本RNAi工具的^l^給藥，例如以鼻噴霧或氣溶膠混合物的形式，并可能特別適用于頭頸癌(例如一些類(lèi)型的頭與頸鱗狀上皮細(xì)胞癌)和非小細(xì)胞肺癌。siRNA的體內(nèi)遞送已4皮描述，例如棵的或4皮脂質(zhì)包裹的siRNA分子的靜脈給藥(Schiffders等，2004;Morrissey等，2005)、腦室內(nèi)給藥(Thakker等，2004)或鼻內(nèi)給藥(Zhang*,2005);還描述了包裹在免疫脂質(zhì)體或病毒顆粒內(nèi)的shRNA載體的靜脈內(nèi)給藥(Spankuch等，2004;Zhang等，2004);通過(guò)參考并入本文。當(dāng)分子如前文所述直接應(yīng)用于細(xì)胞時(shí)，i人為RNAi分子的效應(yīng)，即耙基因表達(dá)的降低僅僅是瞬時(shí)的。為了實(shí)現(xiàn)RNAi分子在腫瘤細(xì)胞中的穩(wěn)定產(chǎn)生，將編碼相應(yīng)靶RNAi分子的核酸(優(yōu)選地DNA)整合進(jìn)表達(dá)載體中會(huì)是有利的。如果存在如下文所述的合適元件，則DNA轉(zhuǎn)錄為能夠形成目的RNAi分子的相應(yīng)雙鏈RNA。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供表達(dá)構(gòu)建體以便于引入宿主細(xì)胞和/或便于表達(dá)和/或便于維持編碼本發(fā)明RNAi分子的核苷i^列。表#建體可以插入可購(gòu)得的質(zhì)粒、病毒或載體中。因此在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及DNA序列用于制備本文定義的RNAi分子(優(yōu)選siRNA分子)的用途。更具體地，本發(fā)明涉及含有任何SEQIDNO:34-66序列、其片段或衍生物的DNA序列用于制備適于降低腫瘤細(xì)胞中半乳凝素-l表達(dá)的RNAi分子的用途，5'-ateagccagcccatggccc(N)xgggccatgggctggctgat-3'(SEQIDMO:34)5'-gctgccagatggatacgaa(N》ttcgtatocatctggcagctt-3'(SEQIDNO:35),5'-agacagcaacaacctgtgc(N)xgcacaggttgttgctgtcttt-3'(SEQIDNO:36)5'-gtgttgcagaggtgtgcat(N)xatgcacacctctgcaacactt-3'(SEQIDNO:37)5'-catcctcctggactcaatc(N)xgattgagtccaggaggatgtt-3'(SEQIDNO:38)5'-tcatggcttgtggtctggt(N)xaccagaccacaagccatgatt-3，(SEQIDNO:39)5'-cctgaatctcaaacctgga(N〉xtccaggtttgagattcaggtt-3，(SEQIDNO:40)5'-tctcaaacctggagagtgc(N)xgcactctccaggtttgagatt-3'(SEQIDNO:41)5'-acctggagagtgccttcga(N)xtcgaaggcactctccaggttt-3'(SEQIDNO:42)5'-cctggagagtgccttcgag(N)xctcgaaggcactctccaggtt-3'(SEQIDNO:43)5'-gagGttcgtgctgaacctg(N)xcaggttcagcacgaagctctt-3'(SEQIDNO:44)5'-cctgggcaaagacagcaac(N)xgttgctgtcUtgcccaggtt-3'(SEQIDNO:45)5'-gacagcaacaacctgtgcc(N)xggcacaggttgttgctgtctt-3'(SEQIDNO:46)5'-caacctgtgcctgcacttG(N)xgaagtgcaggcacaggttgtt-3'(SEQIDNO:47)5'-cctgtgcctgcacttcaac(N)xgttgaagtgcaggcacaggtt-3'(SEQIDNO:48)5'-ccctcgcttcaacgcccac(N)xgtgggcgttgaagcgagggtt-3'(SEQIDNO:49)5'^cgcccacggcgacgccaac(N)xgttggcgtcgccgtgggcgtt-3'(SEQIDNO:50)5'-caccategtgtgca3cagc(N)xgctgttgcacacgatggtgtt-3'(SEQIDNO:51)5'-cagcaaggacggcggggcc(N)xggccccgccgtccttgctgtt-3'(SEQIDNO:52〉5'-ggacggcggggcctggggg(N〉xCGCccaggccccgccgtectt-3'(SEQIDNO:53)5'-cctgaccgtcaagctgcca(N)xtggcagcttgacggtcaggtt-3'(SEQIDNO:54)5'-ttcaagttccccaaccgGC(N)xggcggttggggaacttgaatt-3,(SEQIDNO:55)5'-gttccccaaccgcctcasc(N》gttgaggcggttggggaactt-3'(SEQIDNO:56)5'-ccgcctcaacctggaggcc灘ggcctGcaggttgaggcggtt-3'(SEQIDNO:57)5'-cctggaggccatcaactac(N)xgtagttgatggcctccaggtt-3'(SEQIDNO:58)5'-ctacatggcagctgacggt(N)xaccgtcagctgccatgtagtt-3'(SEQIDNO:59>S'-gatcaaatgtgtggcctttfNhaaaggccacacatttgatctW(SEQIDNO:60)5'-atgt胸gcctttgactga(N)xtcagtcaaaggccacacattt-3'(SEQIDNO:61)5'-tgtgtggcctttgactgaa(N)xttcagteaaaggccacacatt-3，(SEQIDNO:62)5，-tcagGcagcccatggcccc(N)xggggccatgggctggctgatt-3'(SEQIDNO:63)5'-taa3ggcagctgcctctgc(N)xgcagaggcagctgcctttatt-3,(SEQIDNOr64)5'鄰gcagctgcctctgctcc(^l)xggagcag3ggc3gctgccttt-3,(SEQIDNO:65)5'-ggc3gctgcctctgctcGc(N)xgggagc8gaggcagctgcctt-3,(SEQIDNO:66)其中N為a、c、t或g,并且其中x在4至15之間。上文列舉的帶有SEQIDNO:34-66的序列包含分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1-33所述RNA序列的DNA序列、接頭以及與所述DNA互補(bǔ)的序列。接頭長(zhǎng)度優(yōu)選為4到15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地，接頭長(zhǎng)度為4到10個(gè)核苷酸，最優(yōu)選為4到8個(gè)核苷酸。接頭可由任何合適的核苷酸序列組成。優(yōu)選地，所述列舉的序列由來(lái)自半乳凝素-1基因的19個(gè)核苷酸的序列組成，所述序列與同一19個(gè)核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列被4到15個(gè)核普酸的接頭分開(kāi)(大寫(xiě)字母N,其中N為a、c、t或g,其中x在4和15之間)并在其3，端顯示tt(t)序列。在另一實(shí)施方案中，將上文列舉的DNA序列插入表達(dá)栽體，優(yōu)選允許產(chǎn)生dsRNA的表達(dá)載體。還在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有任何SEQIDNO:34到66的序列(優(yōu)選SEQIDNO:35、36或37)、其片段或衍生物的表達(dá)載體。本發(fā)明還考慮由兩個(gè)相同或不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)產(chǎn)生dsRNA的兩條互補(bǔ)鏈。在該情況下，分隔兩條互補(bǔ)鏈的核苷酸接頭可省略。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)地，在該情況下編碼兩條互補(bǔ)siRNA鏈的DNA可以存在于一個(gè)或兩個(gè)表達(dá)載體中。能夠產(chǎn)生形成本文定義dsRNA的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)載體可以為例如克隆載體、二元載體或整合載體。因此，本發(fā)明還涉及包含任何上述DNA序列的載體。優(yōu)選地，所述表達(dá)載體是真核表達(dá)載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、質(zhì)粒、噬菌體或通常用于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的任何其他載體。這類(lèi)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。需要或期望時(shí)，DNA核酸可以與指導(dǎo)mRNA在真核細(xì)胞中合成的調(diào)節(jié)元件有效連接。本文^^用的術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列"和"控制序列"可用于多種語(yǔ)境，指能夠驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)與其相連或有效連接的序列表達(dá)的調(diào)節(jié)性核酸序列。就真核生物中的表達(dá)而言，調(diào)控序列通常包括啟動(dòng)子、終止子和(在一些情況下)增強(qiáng)子和/或5，和3，非翻譯序列，但是也可包含內(nèi)含子或類(lèi)似元件，例如促進(jìn)或有助于載體穩(wěn)定性和擴(kuò)增、選擇成功遞送和/或宿主基因組穩(wěn)定整合的元件，如促ii&因組中目的位點(diǎn)同源重組的區(qū)域。術(shù)語(yǔ)"控制序列"旨在至少包括表達(dá)必需的所有組分，還可包括其他有利組分。術(shù)語(yǔ)"控制序列"包括啟動(dòng)子或能夠激活或增強(qiáng)核酸分子在細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)的序列。為了驅(qū)動(dòng)dsRNA的表達(dá)，這些載體通常含有RNAPolI、RNAPolII、RNAPolIII、T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶和優(yōu)選RNA聚合酶III的啟動(dòng)子(例如HI或U6啟動(dòng)子)，因?yàn)镽NA聚合酶III在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表ii^目對(duì)大量的小RNA，并在摻入一串3-6個(gè)尿苷后終止轉(zhuǎn)錄。III型啟動(dòng)子完全位于被轉(zhuǎn)錄序列的上游，其消除了任何對(duì)RNAi分子中包括啟動(dòng)子序列的需要。如果編碼目的RNAi分子的DNA要從一個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，則優(yōu)選DNA在其每^:上均含有耙基因的目的編碼區(qū)及其反向互補(bǔ)序列，其中編碼序列及其反向互補(bǔ)序列由核苷酸接頭分開(kāi)，允許得到的轉(zhuǎn)錄物自身折疊形成所謂莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，并形成所謂的shRNA分子。ShRNA由特定啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，由DICERRNA酶加工為短雙鏈RNA(siRNA)并整合進(jìn)RISC(Dykxhoom等2003)，隨后使耙mRNA失活。任選地，表達(dá)載體中也可整合進(jìn)一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)錄終止序列"包括轉(zhuǎn)錄單位末端的控制序列，其發(fā)出原始轉(zhuǎn)錄物3，加工和多腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)。表達(dá)構(gòu)建體中可整合其他調(diào)節(jié)元件，例如轉(zhuǎn)錄或翻譯增強(qiáng)子。對(duì)于治療目的，已證明使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體最適合于將目的核酸遞送進(jìn)靼細(xì)胞中。含有本發(fā)明DNA序列的RNAi表達(dá)載體可通過(guò)上述任何遞送方法引入耙細(xì)胞中。用途、組合物和試劑盒本發(fā)明的RNAi分子和/或載體可作為用于治療癌癥優(yōu)選神經(jīng)M瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤的藥物，或者用于制造治療癌癥優(yōu)選神經(jīng)膠質(zhì)瘤(優(yōu)選成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤的藥物。根據(jù)本發(fā)明的RNAi分子和/或載體可作為用于延遲癌癥優(yōu)選神經(jīng)M瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤t艮的藥物，或者用于制造藥物延遲癌癥優(yōu)選神經(jīng)膠質(zhì)瘤(優(yōu)選成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤t艮的藥物。本文使用的術(shù)語(yǔ)"延遲癌癥t艮"是指延遲癌癥在生長(zhǎng)30%以上，優(yōu)選地5()o/。以上，更優(yōu)選70%以上，和/或延長(zhǎng)患病受試者的存活時(shí)間。本發(fā)明的RNAi分子和/或載體可以單獨(dú)使用，或與選自化學(xué)療法、放射療法、免疫療法和/或基因療法的任何癌癥療法組合使用。本文使用的術(shù)語(yǔ)"癌癥療法"旨在包括放射療法、化學(xué)療法、免疫療法、基于基因的療法及其組合。術(shù)語(yǔ)"放射療法"是指使用輻射治療癌癥。術(shù)語(yǔ)"化學(xué)療法，，是指用化學(xué)物質(zhì)(所謂的化療治療劑)治療癌癥。本文使用的術(shù)語(yǔ)"免疫療法"是指通過(guò)4吏用免疫治療劑刺激免疫系統(tǒng)的反應(yīng)性以消滅癌癥細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"基于基因的療法"是指基于將遺傳物質(zhì)(DNA，或可能是RNA)轉(zhuǎn)移ii^個(gè)體的癌癥治療。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本RNAi分子和/或表達(dá)載體可以單獨(dú)使用，或者與適用于治療癌癥(優(yōu)選神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤)的一種或多種活性化合物組合使用。術(shù)語(yǔ)"活性化合物，，是指用于治療癌癥(優(yōu)選神經(jīng)M瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤)的、除RNAi分子或載體外的化合物?；钚曰衔锟蓛?yōu)選地選自放射治療藥物、化療藥物(包括但不限于替莫唑胺、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、丙卡巴阱、卡莫司汀、洛莫司汀、紫杉醇、多西紫杉醇、他莫昔芬、視黃酸(retinoicacid)、5-氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺和沙利度胺)、免疫治療劑(例如但不限于活化的T細(xì)胞和接受到脈沖的樹(shù)突細(xì)胞)和/或基于基因的治療方法(涉及與遞送本文定義RNAi分子一起將CD3、CD7和CD45轉(zhuǎn)移進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中)。本發(fā)明的RNAi分子和/或表達(dá)載體可以單獨(dú)施用，或與一種或多種活性化合物組合施用。后者可以在施用RNAi分子和/或表達(dá)載體之前、之后或同時(shí)施用。本發(fā)明RNAi分子和/或表達(dá)載體或活性化合物的劑量以及孵育的持續(xù)時(shí)間和溫度可以變化，并i.a.取決于待治療的受試者。本發(fā)明的另一對(duì)象是藥物制劑，其包含治療有效量的本文定義RNAi分子和/或表達(dá)載體以及可藥用載體，即一種或多種可藥用載體物質(zhì)和/或添加劑。本文使用的術(shù)語(yǔ)"治療有效量"是指研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)學(xué)博士或其他醫(yī)師所尋找的在組織、系統(tǒng)、動(dòng)物或人中引發(fā)生物學(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)答的RNAi分子和/或表達(dá)載體的量。因此在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于治療癌癥(優(yōu)選神經(jīng)膠質(zhì)瘤(優(yōu)選成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤)的藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的RNAi分子和/或表達(dá)載體以及可藥用載體。還在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于延遲癌癥(優(yōu)選神經(jīng)膠質(zhì)瘤(優(yōu)選成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤)t艮的藥物組合物，其包含本發(fā)明的RNAi分子和/或表達(dá)載體以及可藥用載體。本發(fā)明的藥物組合物還可包含至少一種上文定義的活性化合物。本發(fā)明的藥物組合物可以以例如丸劑，片劑，涂層片劑(lacqueredtablets),糖衣片劑，顆粒劑，硬明膠和軟明膠膠嚢劑，水性的、含醇的或油溶液，糖漿，乳劑或懸浮劑的形式口服給藥，或以例如栓劑的形式經(jīng)直腸給藥。可以以用于注射或輸注的溶液形式腸胃外地(例如皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi))進(jìn)行施用。其他合適的給藥形式是例如以軟膏劑、酊劑、噴霧劑或經(jīng)皮治療體系的形式例如經(jīng)皮施用或局部給藥，或以鼻噴霧或氣霧劑混合物或例如孩m嚢劑、埋植劑或棒劑(rod)的形式吸入給藥。藥物組合物的制備可以以本身已知的方式進(jìn)行。為此，將核酸和/或活性化合物與一種或多種固體或液體的藥物載體物質(zhì)和/或添加物(或輔料物質(zhì))一起，需要時(shí)與具有治療或預(yù)防作用的其他藥物活性化合物組合制成合適的給藥形式或劑型，然后可將所述給藥形式或劑型用作人醫(yī)學(xué)的藥物。對(duì)丸劑、片劑、糖衣片劑和硬明皿嚢劑的生產(chǎn)而言，可能使用例如乳糖、淀粉(例如玉米淀粉)或淀粉衍生物、滑石、硬脂酸或其鹽等。用于軟明皿嚢劑和栓劑的載體為例如脂肪、蠟、半固體和液體多元醇、天然或經(jīng)氫化的油等。用于制備溶液(例如注射液)或乳劑或糖漿劑的合適栽體為例如水、氯化鈉生理溶液、醇(例如乙醇、丙三醇、多元醇)、蔗糖、轉(zhuǎn)化糖、葡萄糖、甘露醇、植物油等。還可能將核酸和/或活性化合物低壓凍干，并使用得到的低壓凍干物用于如制備注射用或輸注用的制劑。用于孩級(jí)嚢、埋植劑、或棒劑的合適載體為例如乙醇酸和乳酸的共聚物。藥物制劑還可含有添加劑，例如填充劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、分歉劑、防腐劑、增甜劑、著色劑、調(diào)味劑、芳化劑、增稠劑、稀釋劑、緩沖物質(zhì)、溶劑、增溶劑、用于實(shí)現(xiàn)儲(chǔ)存效應(yīng)(depoteffect)的物質(zhì)、用于改變滲透壓的鹽、包衣劑或抗氧化劑。優(yōu)選地，本組合物在含有或不含有環(huán)-p-糊精和/或類(lèi)似化合物的GLP/GMP溶液中施用。與待施用的一種或多種活性化合物組合使用的RNAi分子和/或表達(dá)載體的劑量或量取決于個(gè)體案例，并如慣例根據(jù)個(gè)體情況調(diào)節(jié)以實(shí)現(xiàn)最佳效應(yīng)。因此，其取決于受治疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，也取決于待治療的人或動(dòng)物的性別、年齡、體重和個(gè)體應(yīng)答性，取決于所使用的化合物作用的效力和持續(xù)時(shí)間，取決于療法是否是急性的或慢性的或預(yù)防性的，或取決于除核酸和/或RNAi分子和/或表達(dá)載體外是否施用其他活性化合物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是可注射的，并腸胃外施用。組合物可例如借助于標(biāo)準(zhǔn)的Ommaya貯器(微泵)施用，所述Ommaya貯器用于在具有腦部病理的患者中施用藥物。神經(jīng)外科切除神經(jīng)膠質(zhì)瘤時(shí)將這些微泵皮下放置(在頸中)。這些微泵使得能夠?qū)a(chǎn)物(本文定義的RNAi分子、載體或藥物組合物)遞送至腫瘤細(xì)胞。被遞送的化合物(例如本文定義的RNAi分子、載體或藥物組合物)優(yōu)選地在數(shù)月中或甚至數(shù)年中每周注射一或兩次。在有技術(shù)問(wèn)題的情況下可以更換微泵。使用貯器如上文Ommaya貯器(微泵)的遞送也可用于將產(chǎn)物(本文定義的RNAi分子、載體或藥物組合物)遞送至癌癥類(lèi)型細(xì)胞的腫瘤中，所述癌癥類(lèi)型具體為神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非霍奇金'淋巴瘤、黑色素瘤、胰腺癌、頭頸癌和非小細(xì)胞肺癌。例如，帶有靜脈內(nèi)導(dǎo)管的微泵能將產(chǎn)物(本文定義的RNAi分子、載體或藥物組合物)單獨(dú)或結(jié)合其他療法(例如化學(xué)療法、放射療法、免疫療法等)一起遞送進(jìn)患者中，例如進(jìn)入患者血流中。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明藥物組合物和本文定義的活性化合物的試劑盒，其用于同時(shí)、分開(kāi)或連續(xù)地施用給需要的受試者。治療方法不限于任何理論地，本發(fā)明人考慮敲低并從而顯著降低腫瘤細(xì)胞中半乳凝素-1表達(dá)的治療益處可通過(guò)以下來(lái)介導(dǎo)-降低癌細(xì)胞的遷移水平，從而延遲轉(zhuǎn)移灶的形成，或延遲癌癥侵襲鄰近健康組織(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤情況下為腦)的局部區(qū)域過(guò)程，鑒于半乳凝素-l與癌癥(特別是神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤中)中的細(xì)胞遷移特征和/或遷移過(guò)程直接相關(guān)；-提高這些遷移的限制性癌細(xì)胞中對(duì)前凋亡劑的敏感性，因?yàn)?a)遷移的癌細(xì)胞通常是抗凋亡的，(b)遷移受限制的癌細(xì)胞可開(kāi)始對(duì)凋亡敏感，從而對(duì)前凋亡劑敏感，(c)目前用于對(duì)抗上述癌癥類(lèi)型的大部分藥物是前凋亡藥物；因此除敲低癌癥患者(見(jiàn)上文)胂瘤細(xì)胞中半乳凝素-1的直接治療益處外，本發(fā)明還考慮化學(xué)療法和/或放射療法與抗半乳凝素-1方法一起組合4吏用；-降低腫瘤細(xì)胞防御免疫系統(tǒng)攻擊自身的能力，因?yàn)橛赡[瘤細(xì)胞分泌的半乳凝素-1在這些活化T細(xì)胞中誘導(dǎo)可觀的細(xì)胞死亡過(guò)程，所述4皮激活的T細(xì)胞必定破壞癌癥細(xì)胞；因此除敲低癌癥患者(見(jiàn)上文)腫瘤細(xì)胞中半乳凝素-1的直接治療益處外，本發(fā)明還考慮除抗-半乳凝素-1敲低方法外的免疫療法(使用例如活化T細(xì)胞)和/或基因療法(使用半乳凝素-1細(xì)胞死亡受體(例如CD3、CD7、CD45、CD95)人腫瘤細(xì)胞的定向轉(zhuǎn)染)。例如，敲低并由此顯著降低腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞中半乳凝素-1表達(dá)的治療益處如下。半乳凝素-1在至少三個(gè)不同的水平上涉及惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的遷移特性，即誦腫瘤星形贈(zèng)細(xì)胞粘附，通過(guò)調(diào)節(jié)整合素a9pi和ADAM15的表達(dá)，-腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞移動(dòng)力，通過(guò)修飾RhoA表達(dá)來(lái)修飾肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的組織(Camby等2002),和-肺瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞侵襲，通過(guò)修飾MMP-2的表達(dá)和分泌水平。敲寸"神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中半乳凝素-1表達(dá)允許降低腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞侵襲進(jìn)入患者的腦，從而能夠延遲疾病的H提高患者的存活期。另外，半乳凝素-1直接激活神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移特性(Camby等2001,Rorive等2001，Rao2003)，臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，涉及遷移肺瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑使得它們獲得對(duì)細(xì)胞凋亡的抗性，從而獲得對(duì)化學(xué)療法和放射療法所誘導(dǎo)的凋亡的抗性。已經(jīng)證明，降低腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移水平提高實(shí)驗(yàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤對(duì)前凋亡劑(如替莫唑胺)的敏感性(Lefranc等，2005b)。因此，降低人神經(jīng)自瘤中腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力〗吏腫瘤星形^t細(xì)胞^腦實(shí)質(zhì)的遷移能力降低，這是會(huì)進(jìn)而降低肺瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)前凋亡劑抗性的特征，會(huì)進(jìn)而重建腫瘤劑對(duì)前凋亡劑(例如替莫唑胺)提高的敏感性的新特征。因此，除敲低神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者(如上文)中腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞中半乳凝素-1的直接治療益處外，我們還要求保護(hù)化學(xué)療法(如涉及使用替莫唑胺或PCV組合的化學(xué)療法)和/或放射療法與我們的抗半乳凝素-l方法的組合使用。另外，由腫瘤細(xì)胞分泌的半乳凝素-1是有效的免疫調(diào)節(jié)劑，其誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞死亡，從而有利于腫瘤的免疫逃逸(Rubinstein等2004，Lui等2005)。因此，敲低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的半乳凝素-1表達(dá)會(huì)降低半乳凝素-1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤周?chē)M織中的釋放，從而有利于針對(duì)所述腫瘤的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，除敲低神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞中半乳凝素-1的直接治療益處(見(jiàn)第1點(diǎn))夕卜，我們還要求保護(hù)除我們的抗半乳凝素-l敲低方法外，免疫療法(使用例如活化T細(xì)胞)和/或基因療法(使用半乳凝素-l細(xì)胞死亡受體(例如CD3、CD7、CD45、CD95)i^人腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞中的定向轉(zhuǎn)染)用于治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的組合用途。由此可見(jiàn)，本發(fā)明提供用于在受試者中治療癌癥(優(yōu)選地治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤(優(yōu)選成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤)的方法，所述方法包括向所述受試者施用本文定義的RNAi分子、載體或組合物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于在受試者中延遲癌癥(優(yōu)選神經(jīng)膠質(zhì)瘤(優(yōu)選成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金、淋巴瘤)iO艮的方法，所述方法包括向所述受試者施用本文定義的RNAi分子、載體或組合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)"受試者"優(yōu)選指人，但是針對(duì)馴養(yǎng)家畜、實(shí)驗(yàn)室或?qū)櫸飫?dòng)物的獸醫(yī)應(yīng)用也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。由此可見(jiàn)，本發(fā)明還提供用于下調(diào)半乳凝素-1表達(dá)的方法，包括施用本文定義的RNAi分子、載體或組合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)"下調(diào)半乳凝素-l表達(dá)"是指將半乳凝素-1(轉(zhuǎn)錄后)表達(dá)優(yōu)選降低至少50%以上，更優(yōu)選地70%以上，進(jìn)一步更優(yōu)選卯o/。以上。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及降低腫瘤細(xì)胞(優(yōu)選神經(jīng)M瘤(優(yōu)選成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤的細(xì)胞)遷移的方法，所述方法包括施用本文定義的RNAi分子、載體或組合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)"降低肺瘤細(xì)胞遷移"是指將遷移的腫瘤細(xì)胞數(shù)量?jī)?yōu)選地降低30%以上，更優(yōu)選50%以上，進(jìn)一步更優(yōu)選70%以上。還在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于降低腫瘤細(xì)胞(優(yōu)選神經(jīng)膠質(zhì)瘤(優(yōu)選成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤的細(xì)胞)對(duì)凋亡抗性的方法，所述方法包括施用本文定義的RNAi分子、載體或組合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)"降低腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的抗性"是指抗凋亡腫瘤細(xì)胞數(shù)量?jī)?yōu)選降低30%以上，更優(yōu)選50%以上，進(jìn)一步更優(yōu)選70%以上。本發(fā)明還提供用于增強(qiáng)用于治療癌癥(優(yōu)選神經(jīng)膠質(zhì)瘤(優(yōu)選成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金、淋巴瘤)的癌癥療法(選自化學(xué)療法、^L射療法、免疫療法和/或基因療法)的效力的方法，所述方法包括施用本文定義的RNAi分子、載體或組合物，和同時(shí)地、分開(kāi)地或連續(xù)地施用所述癌癥療法。本文使用術(shù)語(yǔ)"增強(qiáng)癌癥療法的效力"是指改進(jìn)常規(guī)癌癥治療，包括降低在常規(guī)癌癥治療中應(yīng)用的抗癌組合物的量(例如放射療法中的輻射量、化學(xué)療法中化學(xué)治療劑的量、免疫療法中免疫治療劑的量或基于基因的療法中的載體量)，和/或提高以常規(guī)劑量或量應(yīng)用時(shí)常規(guī)療法和抗癌組合物的效力。降低癌癥治療中應(yīng)用的輻射和化學(xué)治療劑的劑量具有若干優(yōu)點(diǎn)。減少使用昂貴的抗癌組合物(例如放射或化學(xué)治療劑)不僅具有成本效益，而且允許降低患者中被應(yīng)用組合物的毒性及其相關(guān)副作用。一般地，以常規(guī)劑量應(yīng)用的抗癌組合物效力的提高還能夠減少常規(guī)癌癥療法的持續(xù)時(shí)間和重復(fù)次數(shù)，這也具有成本效益，并且從患者的觀點(diǎn)看是有利的，因?yàn)榻档土硕拘院透弊饔玫膯?wèn)題?？傊景l(fā)明涉及抗半乳凝素-1治療方法對(duì)抗一^A癌癥和特別地對(duì)抗惡性人神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金^^巴瘤的用途。本治療方法基于^f吏用抗半乳凝素-l工具(其涉及RNAi干擾(RNAi)、反義、病毒載體或任何其他相關(guān)方法)所述工具目的在于敲^A腫瘤細(xì)胞中半乳凝素-1的表達(dá)。本途徑的技術(shù)可行性借助于下文的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步闡述，其中展示了(I)siRNA(或shRNA)敲低肺瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞中半乳凝素-1表達(dá)的用途(實(shí)施例1)，(II)可用于在腫瘤星形膠質(zhì)細(xì)胞中遞送這些siRNA(或shRNA)的載體類(lèi)型的實(shí)例(實(shí)施例2)，和(III)治療方案，其基于臨W目關(guān)體內(nèi)模型在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中遞送本文基于抗-半乳凝素-1的治療方法的用途(實(shí)施例3)。實(shí)施例實(shí)施例1靶向半乳凝素-1的siRNA序列的實(shí)施例比^A半乳凝素-1的三個(gè)序列(來(lái)自GenBank)，包括登錄號(hào)BC020675(圖1)、BC001693(圖2)和NM_002305(圖3)的序列。除長(zhǎng)度差異外，NM_002305在2個(gè)位置上i另外兩個(gè)序列不同19位的C插入和524位的T缺失。這些差異對(duì)本發(fā)明RNAi分子的鑒定沒(méi)有影響。在來(lái)自BC020675(SEQIDNO:67)的代表性序列中可發(fā)現(xiàn)33個(gè)"AA"雙聯(lián)體，如圖l序列中的下劃線(xiàn)所示。基于這些序列鑒定了33個(gè)適用于制備人半乳凝素-1siRNA序列的推定的DNA核酸，并定義為SEQNO:70-101;包括:aaatcagccagcccatggccc(S￡QIDNO:70),aagctgccagatggatacgaa(S￡QIDNO:71),aaagacagcaacaacctgtgc(SEQIDNO:72),aagtgttgcagaggtgtgcat(SEQIDNO:73),aacatcctcctggactcaatc(SEQIDNO:74)，aatcatggcttgtggtctggt(SEQIDNO:75)，aacctgaatctcaaacctgga(SEQ.IDNO:76),aatctcaaacctggagagtgc(SEQIDNO:77),aaacctggagagtgccttcga(SEQIDNO:78)，aacctggagagtgccttcgag(SEQIDNO:79)，aagagcttcgtgctgaacctg(SEQIDNO:80)，aacctgggcaaagacagcaac(SEQIDNO:81),aagacagcascsacctgtgcc(SEQIDNO:82),aacaacctgtgcctgcacttc(SEQIDNO:83),aacctgtgcctgcacttcaac(SEQIDNO:84),aaccctcgcttcaacgcccac(SEQIDNO:85)，aacgcccacggcgacgccaac(SEQIDNO:86),aacaccatcgtgtgcaacagc(SEQIDNO:87),aacagcaaggacggcggggcc(SEQIDNO:88),aaggacggcggggcctggggg(SEQIDNO:89),aacctgaccgtcaagctgcca(SEQIDNQ:90)，aattcaagttccccaaccgcc(SEQIDNO:91)，aagttc;cccaaccgcctcaac(SEQIDNO:92),aaccgcctcaacctggaggcc(SEQIDNO:93),aacctggaggccatcaactac(SEQIDNO:94)，aactacatggcagclgacggt(SEQIDNO:95),aagatcaaatgtgtggccttt(SEQIDNO:96)，aaatgtgtggcctttgactga(SEQIDNO:97),aatgtgtggcctttgactgaa(SEQIDNO:98),aatcagccagcccatggcccc(SEQIDNO:99),aatsaaggcagctgcctctgc(SEQIDNO:簡(jiǎn))'aaaggcagctgcctctgctcc(SEQIDNO:101)，aaggcagctgcctctgctccc(SEQIDNO:102).進(jìn)一步測(cè)試SEQIDNO:71、72和73的序列。圖3展示了人半乳凝素-lmRNA序列(登記號(hào)NM_002305)上SEQIDNO:71(下劃線(xiàn))、72(粗體)和73(粗體、下劃線(xiàn))序列的位置?；谏鲜鲂蛄校搶?shí)施例中用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的兩個(gè)siRNA的序列示于圖4，稱(chēng)為siRNA-1和siRNA-3。在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的體外模型(即U87、U373、Hs683)中轉(zhuǎn)染(用磷酸鉀，CaP)這些序列后，通過(guò)Western印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色檢驗(yàn)半乳凝素-1的蛋白質(zhì)表達(dá)。其結(jié)果示于圖5。綠色焚光顯示半乳凝素-1的特異性免疫細(xì)胞化學(xué)表達(dá)。這些結(jié)果顯示與對(duì)照相比，半乳凝素-1在siRNA-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)降低卯％，所述對(duì)照即未轉(zhuǎn)染的(CT)、僅用CaP處理的(CaP)或用亂序siRNA轉(zhuǎn)染的(Scrb)。用siRNA-3轉(zhuǎn)染后也觀察到相似的，但是較不顯著的半乳凝素-l表達(dá)降低。亂序?qū)φ諚l件是siRNA-l的非特異性亂序序列。通過(guò)BLAST比對(duì)檢驗(yàn)該序列對(duì)任何已知的人mRNA均無(wú)特異性。實(shí)施例2根據(jù)本發(fā)明的shRNA分子的實(shí)施例在本實(shí)施例中，將抗半乳凝素-1shRNA序列克隆進(jìn)由Dr.D.Takai(DepartmentofRespiratoryMedicine,UniversityofTokyo,Japan,Matsukura等2003)描述和>^開(kāi)的質(zhì)粒載體中。基于上文所述siRNA-1和siRNA-3序列構(gòu)建shRNA表達(dá)載體。為了克隆的目的以及shRNA的表達(dá)，向siRNA序列上游和下游添加核苷酸序列。通過(guò)這種類(lèi)型構(gòu)建體在細(xì)胞胞質(zhì)中獲得的終產(chǎn)物與siRNA-1和siRNA-3相似。通過(guò)將質(zhì)粒部分測(cè)序來(lái)檢查已插入質(zhì)粒載體中的序列。將這些載體與編碼綠色熒光蛋白質(zhì)的GFP凈艮告子栽體共轉(zhuǎn)化于U373成膠質(zhì)細(xì)胞瘤模型中。通過(guò)焚光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)這些細(xì)胞中的半乳凝素-l表達(dá)。結(jié)果示于圖6。整合了質(zhì)粒載體(綠色熒光所示)的細(xì)胞特征為與對(duì)照和鄰近的未轉(zhuǎn)染細(xì)J!^目比半乳凝素-1表達(dá)(紅色熒光所示)的降低。用編碼siRNA-1的載體轉(zhuǎn)染是最有效的。實(shí)施例3體內(nèi)實(shí)驗(yàn)性遞送基于抗半乳凝素-1的RNAi分子為了證明體內(nèi)遞送針對(duì)半乳凝素-1的RNAi相關(guān)化合物可以對(duì)患有惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的患者有益，需要臨W目關(guān)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＿@些模型已被開(kāi)發(fā)，涉及惡性大鼠或人神經(jīng)膠質(zhì)瘤在常規(guī)的或棵的小鼠或大鼠腦中的同位移植(orthotopicgraftXLefranc等2002;Branle等2002,Lefranc等2003,Lefranc等2004)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床實(shí)踐通常是手術(shù)切除腫瘤塊，隨后是旨在對(duì)抗同剩余的滲透性細(xì)胞和遷移細(xì)胞的佐劑治療，其負(fù)責(zé)這些腫瘤的惡化預(yù)后。為了盡可能地接近神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床實(shí)踐，手術(shù)切除由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的同位移植而進(jìn)入小鼠或大鼠腦中發(fā)生的神經(jīng)膠質(zhì)瘤，并通過(guò)全身性注射或借助于微泵直接注射至手術(shù)位點(diǎn)來(lái)施用佐劑實(shí)驗(yàn)性RNAi治療，所述微泵通過(guò)導(dǎo)管在手術(shù)位點(diǎn)遞送RNAi相關(guān)化合物。與臨床上一樣，這樣將實(shí)驗(yàn)性治療施用于手術(shù)后殘余的滲透性惡性腫瘤細(xì)胞(Lefranc等2002;Branle等2002,Lefranc等2003,Lefranc等2004)。實(shí)施例4體內(nèi)實(shí)驗(yàn)性遞送基于抗-半乳凝素-1的RNAi分子用于治療實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的半乳凝素-1siRNASEQIDNO:2(siRNA-l)實(shí)驗(yàn)性體內(nèi)遞送抗顯示于圖7中。本實(shí)施例顯示當(dāng)埋入微泵中被遞送進(jìn)入第三腦室以對(duì)抗逃離腫瘤體積和將逃避手術(shù)清除(surgeryde-bulking)的遷移神經(jīng)^Lt瘤細(xì)胞時(shí)，siRNA如何在體內(nèi)使用。將Hs683神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞立體定向地(stereotactically)移;^UV棵鼠腦中。移植后第5天將含有siRNA的微泵皮下^，其導(dǎo)管將siRNA遞送進(jìn)第三腦室。移植后第12、19和26天將siRNA立體定向地注射入腫瘤(時(shí)間線(xiàn)上的菱形)。一些動(dòng)物還接受Temodal(替莫唑胺)靜脈注射(時(shí)間線(xiàn)上的箭頭，空心標(biāo)志為存活曲線(xiàn))。帶有顱內(nèi)移植物并用抗半乳凝素-1siRNA和Temodal組合施用處理過(guò)的小鼠對(duì)其腫瘤而言比對(duì)照顯著存活得更久(T/C指標(biāo)183%)。(CT，實(shí)心圓-對(duì)照；CT+Tem，空心圓，用Temodal的對(duì)照；Sbl，實(shí)心三角，亂序siRNA;Sbl+Tem,空心三角，亂序siRNA和Temodal;SiGall,實(shí)心方塊，抗半乳凝素-1siRNA;SiGall+Tem,空心方塊，抗半乳凝素-1siRNA和Temodal)?？梢允褂玫葍r(jià)方法以使用本發(fā)明的抗半乳凝素-1RNAi(如siRNA)臨床治療癌癥患者，特別是用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、胰腺癌、頭頸癌和非小細(xì)胞肺癌。從而這類(lèi)方法能夠使用帶有靜脈內(nèi)導(dǎo)管的微泵，所述微泵在例如化學(xué)治療方案中將抗-半乳凝素-1RNAi遞送進(jìn)患者(例如患者的血流)中。參考文獻(xiàn)Be呵O,Duvshani-EshetM,CargloliT，BelloL'BikfalviA,CarrollRS,MachlufM.Continuousdeliveryofendogenousinhibitorsfrompoly(lactic-co-glycolicacid)polymericmicrospheresinhibi'tsgliomatumorgrowth.ClinicalCancerResearch11:768-776，2005.BerberatPO,FriessH，WangL'ZhuZ,BleyT，F(xiàn)rigeriL，ZimmermannA，Buchler,.Comparativeanalysisofgalectinsinprimary'tumorsandtumormetastasisinhumanpancreaticcancer.JHistochemCytochem49:539-549,2001,BranleF，LefrancF，CambyI，JeukenJ,Geurts-MoespotS，SprengerS，SweepF'KissR，SalmonLEvaluationoftheefficiencyofchemotherapyininvivoorthotopicmodelsofhumang卩omacellswithandwithout1p19qdelet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遲癌癥發(fā)展的方法，包括向所述受試者施用權(quán)利要求2所述RNAi分子、權(quán)利要求5所述栽體和/或權(quán)利要求12或13所述組合物，所述癌癥優(yōu)選為神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤。17.用于下調(diào)腫瘤細(xì)胞中半乳凝素-l表達(dá)的方法，包括使所述細(xì)胞接觸權(quán)利要求2所述RNAi分子、權(quán)利要求5所述載體和/或權(quán)利要求12或13所述組合物。18.用于降低腫瘤細(xì)胞遷移的方法，包括施用權(quán)利要求2所述RNAi分子、權(quán)利要求5所述載體和/或權(quán)利要求12或13所述組合物，所述腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞。19.用于降低肺瘤細(xì)胞凋亡抗性的方法，包括施用權(quán)利要求2所述RNAi分子、權(quán)利要求5所述載體和/或權(quán)利要求12或13所述組合物，所述腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞。20.用于增強(qiáng)癌癥療法用于治療癌癥的效力的方法，所述癌癥療法選自包括化學(xué)療法、放射療法、免疫療法和/或基因療法的集合，所述癌癥優(yōu)選為神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌或非霍奇金淋巴瘤，所述方法包括-施用權(quán)利要求2所述RNAi分子、權(quán)利要求5所述載體和/或權(quán)利要求12或13所述組合物，和-同時(shí)地、分開(kāi)地或連續(xù)地施用所述癌癥療法。全文摘要本發(fā)明涉及適用于降低半乳凝素-1表達(dá)的RNAi分子及其作為藥物或用于制造藥物的用途，所述RNAi分子含有SEQIDNO1-33的任何序列，優(yōu)選SEQIDNO2、3或4的序列，所述藥物用于治療癌癥和/或延遲其發(fā)展，所述癌癥優(yōu)選為神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤。本發(fā)明還涉及用于治療癌癥和用于延遲癌癥發(fā)展、用于降低腫瘤細(xì)胞遷移和/或用于增強(qiáng)癌癥療法效力的組合物與方法，所述癌癥優(yōu)選為神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤；所述腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤的細(xì)胞；所述癌癥療法用于治療癌癥，優(yōu)選用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和非霍奇金淋巴瘤，所述療法選自包括化學(xué)療法、放射療法、免疫療法和/或基因療法的集合。文檔編號(hào)A61K48/00GK101228274SQ200680016376公開(kāi)日2008年7月23日申請(qǐng)日期2006年3月9日優(yōu)先權(quán)日2005年4月12日發(fā)明者伊莎貝爾·康比,帕特里克·昂列,弗洛朗斯·勒弗朗,皮埃爾·庫(kù)爾圖瓦,羅伯特·基什申請(qǐng)人:布魯塞爾大學(xué);魯汶大學(xué)