一種-20°c保存的2×pcr混合液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可放-20°C保存的2×PCR混合液，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。100μl2×PCR混合液配置如下：7.5μl二甲基亞砜，7.5μl0.1%牛血清蛋白溶液，10μl10mMdNTP溶液，20μl10×PCRbuffer，50μl30%重量比甘油溶液，5μlrTaq酶，將上述混勻后離心，存放于-20°C冰箱中。該混合液能長期存放于-20°C保存，具有較高的應(yīng)用價值，能減少PCR擴增體系配置時間以及提高PCR體系配置的準(zhǔn)確性和減少PCR擴增過程中的污染。
【專利說明】-種-20° C保存的2X PCR混合液

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可放_20° C保存的2XPCR混合液，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR)是一種體外快速擴增特定 DNA片段的技術(shù)，它是現(xiàn)代分子生物學(xué)最重要的手段之一。其基本原理是根據(jù)獲諾貝爾 1953年生理學(xué)獎的DNA雙螺旋模型所建立的體細胞復(fù)制的機制以及雙鏈DNA在體外可隨溫 度變化發(fā)生變性與復(fù)性的特點設(shè)計。1985年Randll.K. Skaii等利用Klenow DNA聚合酶建 立了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，并將其應(yīng)用于鐮刀形貧血病的基因診斷。它是80年代分子生物 學(xué)領(lǐng)域的一項革命性突破，被譽為分子生物學(xué)資源發(fā)展史上的又一里程碑。此項技術(shù)一經(jīng) 問世就因其操作簡單、快速、靈敏度高和特異性強等優(yōu)點迅速在與分子生物學(xué)相關(guān)的學(xué)科 得到廣泛應(yīng)用，如分子生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)檢驗、動植物檢驗、法醫(yī)鑒定及考古等各個領(lǐng)域。
[0003] 在PCR過程中，DNA聚合酶起著關(guān)鍵性作用。目前已有100多個DNA聚合酶的相 關(guān)基因被克隆和測序，Thermus aquaticus是一種水生嗜熱菌，從該菌中分離出的DNA聚合 酶（Taq DNA聚合酶）具有催化以DNA為模板合成DNA的功能。
[0004] Taq NDA聚合酶是Mg2+依賴性酶，該酶的催化活性對Mg2+濃度非常敏感。研究表 明，Mg2+濃度低于ImM，dNTP過多，鰲合Mg2+作用強時，Mg2+對Taq DNA聚合酶的催化作 用幾乎喪失，不產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。隨著Mg2+濃度的增加，其催化作用增強，擴增產(chǎn)物增多，但 產(chǎn)物濃度增大的同時，背景也明顯增強。
[0005] 常規(guī)的PCR擴增體系配置，往往是將dNTP、Buffer、rTaq酶等試劑單獨保存，待要 進行PCR擴增時，將樣品分別加到同一 PCR管中，在操作過程中除了經(jīng)常忘記加入個別試劑 的缺點外，多次的使用會對試劑造成污染，影響后續(xù)使用。因此，研發(fā)一種PCR擴增體系對 于減少PCR擴增體系配置時間以及提高PCR體系配置的準(zhǔn)確性和減少PCR擴增過程中的污 染有著極其大的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種可放-20° C保存的2XPCR混合液，該混合液能長期存放 于-20° C保存，具有較高的應(yīng)用價值。
[0007] 本發(fā)明的一種-20 ° C保存的2 X PCR混合液： (1)2X PCR混合液的配置：100μ1 2XPCR混合液配置如下：7. 5μ1二甲基亞砜， 7·5μ1 0.1% 牛血清蛋白溶液，10μ1 10mM dNTP 溶液，20μ1 10XPCR buffer，50yl 30% 重量比甘油溶液，5 μ 1 rTaq酶，將上述混勻后離心，存放于-20° C冰箱中。
[0008] 其中 10XPCR buffer 的配置如下：100mM Tris-HCl pH 8. 3,500 mM KC1，15mM MgCl2。
[0009] (2)2X PCR混合液的使用：從冰箱中取出2X PCR混合液，配置PCR體系，以20 μ 1 的PCR體系為例，配置如下：2Χ PCR混合液10μ 1，引物R 1μ 1，引物F 1μ 1，模版1μ 1， 滅菌水7 μ 1。
[0010] 常規(guī)性的PCR擴增體系的配置都是將每個實驗藥品單獨加到PCR管中進行PCR擴 增，這樣的配置方式不僅費時，同時也增加了實驗操作的不穩(wěn)定性。通過將PCR體系配置 過程中必須的實驗藥品配成混合體系不僅可以節(jié)省大量時間，同時可以防止藥品的交叉污 染，單純地將PCR體系配置中的必須藥品混合在一起并無法長期放于-20° C保存。因此本 混合液中加入了 30%甘油溶液對DNA聚合酶的活性進行保護，使其可以長期放于-20° C。 [0011] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點： 1.能夠減少PCR體系配置的時間。
[0012] 2.能夠盡量降低PCR的污染。
[0013] 3.能夠低溫保存，使用方便。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為PCR擴增結(jié)果圖，泳道1是DNA mark，泳道2-4是新鮮配置的rTaq酶擴增 結(jié)果，泳道5-6是存放于-20° C 6個月的混合液的擴增結(jié)果。

【具體實施方式】
[0015] 實施例1 本發(fā)明的-20 ° C保存的2 X PCR混合液的試劑盒及方法，具體步驟如下： (1)2X PCR混合液的配置：100μ1 PCR混合液體系配置如下：7. 5μ1二甲亞砜 (DMS0)溶液，7·5μ1 0.1%牛血清蛋白（BSA)溶液，10μ1 lOmMDNTP 溶液，20μ1 10XPCR buffer，50 μ 1 30%甘油溶液，5 μ 1 rTaq酶。將配置好的溶液混勻后離心，存放于-20° C 冰箱中。
[0016] PCR擴增體系的配置：從冰箱中取出2 X PCR混合液，配置PCR體系，20 μ 1的 PCR體系配置如下：2Χ PCR混合液10μ1，引物R Ιμ?，引物F Ιμ?，模版Ιμ?，滅菌 水7μ1。同時配置新鮮的rTaq酶擴增體系（常規(guī)配置)，20μ1的PCR體系配置如下：2ul 10XPCR buffer，0.5ul 二甲亞砜（DMS0)溶液，0·5μ1 0.1% 牛血清蛋白（BSA)溶液，Ιμ? 10mM DNTP溶液，引物R 1μ 1，引物F 1μ 1，模版 1μ 1，0,5μ 1 rTaq酶，12.5ul 滅菌水。模 板為水稻cDNA。將以上配置好的體系同時進行PCR擴增，PCR擴增的程序為： 95° C 5min 95° C 30 ! 58 : C 30s ^ 30 times 72° C lmin ； 72° C ΙΟη?ι 將獲得的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
[0017] 其中 10XPCR buffer 的配置方法如下：100mM Tris-Hcl (PH 8. 3)，500 mM Kcl， 15mM Mgcl2。引物 R :5, -TATAGGGTACCGCGAGGCCGGCCAAGGTGCAGGAGATGTTCG-3' 引物 F: 5' -GGCGACTAGTCTAGTTGGTGAAGTTGTTGAGGCAGGCGTGGG-3， 如圖1所示，-20° C保存6個月的2XPCR混合液的擴增結(jié)果仍然與常規(guī)的PCR體系 配置方法擴增效果相當(dāng)，且本發(fā)明通過添加 DMSO和BSA等物質(zhì)提高了 PCR擴增過程中的穩(wěn) 定性和特異性。另外在大批量PCR體系的配置過程中，由于需要加的樣品過多經(jīng)常導(dǎo)致漏 加或多加，對實驗的結(jié)果產(chǎn)生了很大的影響，通過配置2XPCR混合液可以大大縮減PCR體 系配置的時間，同時進一步提高了實驗的準(zhǔn)確性。同時由于本混合液可放于-20° C保存， 在最大程度上保護了 DNA聚合酶的活性。因此可以一次配置，多次使用，提高了 PCR擴增體 系配置的便捷性和穩(wěn)定性。
【權(quán)利要求】
1. 一種-20° C保存的2XPCR混合液，其特征在于，100yl2XPCR混合液配置如下： 7·5μ1 二甲基亞砜，7·5μ1 0.1% 牛血清蛋白溶液，10μ1 10mM dNTP 溶液，20μ1 10XPCR buffer，50yl 30%重量比甘油溶液，5μ1 rTaq酶，將上述混勻后離心，存放于-20° C冰箱 中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的-20° C保存的2XPCR混合液，其特征在于，所述10XPCR buffer 的配置如下：100mM Tris-HCl pH 8. 3,500 mM KCl，15mM MgCl2。
【文檔編號】C12N15/10GK104195132SQ201410449320
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】王清水, 余彥 申請人:福建師范大學(xué)