一種混菌發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術領域，特別設及一種利用混菌發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的 方法。
【背景技術】
[000引 1，3-丙二醇仰0)是一種重要的化工原料，廣泛應用于油墨、印染、涂料、潤滑劑、 抗凍劑等行業(yè)，還可用作醫(yī)藥和有機合成的中間體。1,3-丙二醇還可作為聚合物單體合成 高分子材料，特別是合成性能優(yōu)異的新型聚醋纖維聚對苯二甲酸丙二醋（PTT)。PTT被認為 是一種兼具聚對苯二甲酸己二醋（陽T)的高性能和聚對苯二甲酸了二醋（PBT)的易加工性 的新型聚醋材料，并且具有自然循環(huán)的可生物降解特性，是目前合成纖維新品種開發(fā)的熱 點。該些都表明1,3-丙二醇有著良好的應用前景，但價格偏高卻阻礙了其廣泛應用。
[0003] 1，3-丙二醇的生產(chǎn)方法可分為化學合成法和微生物發(fā)酵法。化學法是用化工原 料經(jīng)過一系列化學催化反應，最終合成1，3-丙二醇；生物法是指微生物利用可再生的原 料甘油或者葡萄糖轉化為1，3-丙二醇，相對化學法工藝路線，微生物發(fā)酵法具有原料可再 生、污染小和成本低等優(yōu)點，故成為現(xiàn)在1,3-丙二醇生產(chǎn)研發(fā)的熱點。至今所有被發(fā)現(xiàn)的 1,3-丙二醇生產(chǎn)菌種均為細菌，其中克雷伯氏菌化lebsiellapneumoniae)、弗氏巧樣酸 桿菌（CitrobacterfreudU)和了酸梭菌（Clostridiumbutyri州m)具有較高的 1,3-丙 二醇轉化率和生產(chǎn)強度，而且對底物和產(chǎn)物具有較高的耐受性，因此具有較高的開發(fā)前景， 從而得到了較多關注。目前生產(chǎn)1，3-丙二醇的微生物法大致可分為=類；一是用腸道細 菌將甘油歧化為 1，3-丙二醇扣SP5254467 ;EP0373230A1 ;ZL01117282. 7);二是W葡萄糖 為底物利用基因工程菌生產(chǎn) 1，3-丙二醇（PCT/US96/06705 ;USP5599689 ;USP6025184 ;W0 96/35796 ;W09821340 ;W09821339 ;ZL96195288) 是將生產(chǎn)甘油和生產(chǎn) 1,3-丙二醇的兩 株菌混合培養(yǎng)扣SP5599689)。該些方法各有優(yōu)缺點，第一種方法的產(chǎn)物轉化率較高，但菌種 對甘油的耐受性較低，產(chǎn)物濃度有待提高；第二種方法可W降低原料成本，產(chǎn)物濃度較高， 但基因工程菌的穩(wěn)定性還有待進一步驗證；第=種方法有助于減少兩步發(fā)酵的時間，但由 于兩種菌的生長條件不盡相同，如產(chǎn)甘油菌通常在好氧條件下生長，而產(chǎn)1,3-丙二醇菌通 常在厭氧條件下生長，前者的底物葡萄糖對后者有抑制作用，二者的最適抑和溫度也存在 差異，因此很難取得較為理想的效果。
[0004] W廉價的粗甘油（如生物柴油的副產(chǎn)物）為底物，通過從活性污泥中篩選出的混 菌發(fā)酵生產(chǎn)1, 3-丙二醇被證明是可行的。如MargaridaF.Temudo等人炬iotechnology andBioengineering, 2008, 100化）：1088-1098)利用從酒廠廢水和±豆淀粉加工廠污泥中 的混菌進行甘油發(fā)酵，其利用的甘油濃度僅為4~25g/l，且其主產(chǎn)物為己醇，1，3-丙二醇 的轉化率相當?shù)?，僅為 0. 16mol/mol;PriscillaA.Selembo等人炬iotechnologyandBio engineering, 2009, 104化）：1098-1106)利用來自±壤、堆肥和污泥中的混菌來生產(chǎn)氨氣和 1，3-丙二醇，但其可利用的甘油濃度很低，僅為3g/L。另有學者將1，3-丙二醇菌和甲燒菌 在一個發(fā)酵罐的兩側同步發(fā)酵炬ioprocessBiosystEng, 2010, 33:507-523)，利用甲燒菌 解除有機酸對甘油發(fā)酵的抑制，有利于后續(xù)分離，但發(fā)酵效果并不顯著。
[0005] 目前，使用高濃度甘油發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇也有了一些研究。CN102421907A 公開了一種經(jīng)遺傳修飾的丙酬了醇梭菌，W90-120g/l，優(yōu)選約105g/L的初始甘油濃度 連續(xù)發(fā)酵，產(chǎn)物中1,3-丙二醇僅為32.68g/l，生產(chǎn)強度為2g/(L.h)。DonnaDietz等人 (BioprocessBiosystE：ng, 2014, 37:225-233)利用選自沼氣池污泥中的混菌進行高濃度 甘油發(fā)酵，但其最高耐受甘油濃度僅為95g/l，且在2化左右僅能消耗約50g/L甘油，隨后便 不再消耗。馬彬彬等考察了甘油濃度對克雷伯氏桿菌的生長及合成1，3-丙二醇的影響，經(jīng) 多次甘油耐受后消耗最高甘油濃度113. 98g/l，產(chǎn)生1，3-丙二醇51. 89g/l，摩爾轉化率為 0. 55mol/mol，生產(chǎn)強度為0. 72g/(L.h)，而副產(chǎn)物較多，乳酸11. 19g/l，己酸10. 61g/l，了 二酸7. 09g/L(食品與發(fā)酵工業(yè)，2008, 34(3) : 37-39)。趙紅英等也研究了初始甘油濃度對 克雷伯氏桿菌發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的影響，其最高耐受甘油濃度僅為102.Ig/l，且在長達 6化后僅能消耗約36.8g/L甘油，隨后便不再消耗。此文中克雷伯氏桿菌W11. 7~102.Ig/ 以優(yōu)選約59.Ig/L的初始甘油濃度存在，此時1，3-丙二醇濃度和轉化率分別可達19.8g/L 和0.492mol/mol;在較高甘油初始濃度（72.6g/L)的情況下，經(jīng)馴化培養(yǎng)獲得的耐底物抑 制菌株，可將最終1，3-丙二醇濃度和轉化率分別提高到22. 9g/L和0. 530mol/mol;采用流 加甘油發(fā)酵工藝，1，3-丙二醇濃度和轉化率分別可提高到30. 2g/L和0. 625mol/mol(現(xiàn)代 化工，2002, 22(7) :：34-38)。
[0006] 在克雷伯氏菌發(fā)酵甘油產(chǎn)生1,3-丙二醇的過程中，細胞的生長受到底物甘 油和多種產(chǎn)物的抑制作用?？死撞戏窝讞U菌在利用甘油合成1,3-丙二醇的同時還 合成2, 3- 了二醇、己偶姻（3-哲基-2- 了酬）、己醇、班巧酸、己酸和乳酸等副產(chǎn)物，畐U 產(chǎn)物的合成消耗大量的底物，降低了轉化率，同時給1,3-丙二醇的分離提取帶來沉重 的負擔（Appliedmicrobiologyandbiotechnology, 2008, 78(6):917-926;生物技 術，2014, 24(1) :92-96)。在副產(chǎn)物中，有機酸使得發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH值不斷下降，影 響菌體的生長（生物工程學報，2011，27 (3) :493-501)，其中W乳酸的產(chǎn)量最多，野生型克 雷伯氏菌發(fā)酵甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇的過程中乳酸產(chǎn)量可達40g/LW上；副產(chǎn)物己酸對發(fā)酵 的抑制作用最強烈，6g/L的己酸即能顯著抑制細菌生長與發(fā)酵，研究報道7.6g/L己酸能減 少50%細菌生長，培養(yǎng)基中15g/L己酸可完全抑制細菌生長。大量副產(chǎn)物的生成不但對細 胞生長不利，還會造成底物甘油的浪費（CN103146740A)。
[0007] 需要特別提出的是2, 3-了二醇，因其與1,3-丙二醇的結構和性質相似，沸 點比較接近，導致二者分離難度很大?；痑ng等通過基因工程手段敲除2, 3-了二醇 途徑來增加1,3-丙二醇的轉化率，但與野生菌株相比，其副產(chǎn)物也明顯增加（Appl BiochemBiotechnol, 2012, 168:116-128)。Qii等也證明敲除 2, 3- 了二醇途徑更 趨于增加乳酸的產(chǎn)量，而過量的乳酸會阻止細胞利用敲除2, 3-了二醇途徑得到的過 量NADH，并且會抑制細胞生長，從而影響1, 3-丙二醇的產(chǎn)生（JournalofApplied Microbiology, 2014, 117:690-698)。Wu等通過插入甲酸脫氨酶基因使己偶姻還原酶失 活，從而使2, 3-了二醇和甲酸減少，但并沒有完全阻止其產(chǎn)生（JournalofBiotechnolo gy,2013, 168:194-200)。
[000引綜上所述，分離篩選底物耐受性好、副產(chǎn)物少、PDO發(fā)酵性能優(yōu)、生產(chǎn)強度高的菌 種，采用批式或連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)PD0仍然具有重要的實用價值。

【發(fā)明內容】

[0009] 針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供一種利用混菌發(fā)酵甘油生產(chǎn)1，3-丙 二醇的方法，該方法具有良好的底物耐受性，且發(fā)酵產(chǎn)物中副產(chǎn)物較少，尤其是不含 2, 3- 了二醇，有利于主產(chǎn)物1，3-丙二醇的分離等特點。
[0010] 本發(fā)明所述的混菌是從大連