基于錳過氧化物酶的工程菌及其實現(xiàn)方法
【專利摘要】一種基因工程領(lǐng)域的基于錳過氧化物酶的工程菌及其實現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點和聚組氨酸標(biāo)簽的引物進行PCR擴增得到編碼錳過氧化物酶的核苷酸序列；然后將擴增得到的基因序列連接到表達載體，再將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株內(nèi)，獲得錳過氧化物酶過表達重組菌株。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的由于錳過氧化物酶在生物體內(nèi)多為胞內(nèi)酶且表達量較低導(dǎo)致的應(yīng)用范圍和效果嚴(yán)重受限等不足，應(yīng)用基因工程手段實現(xiàn)其體外的大量表達合成，此外本發(fā)明通過在表達重組蛋白C端添加聚組氨酸標(biāo)簽的方法，提高蛋白活性的同時也保證了純化后錳過氧化物酶的純度；此外，本發(fā)明通過載體信號肽實現(xiàn)了目的蛋白的周質(zhì)空間表達，提高了錳過氧化物酶的活性。
CGMCC NO.5706
2012.01.09
【專利說明】基于錳過氧化物酶的工程菌及其實現(xiàn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的基因及其工程菌株，具體是一種灰 略紅鏈霉菌的基于錳過氧化物酶的工程菌及其實現(xiàn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 木質(zhì)纖維素是植物界中最為豐富的天然高分子化合物，是植物通過光合作用產(chǎn)生 的主要干物質(zhì)，主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。木質(zhì)纖維素的生物降解和解聚作用 是一個高度復(fù)雜的過程，它涉及眾多酶系的參與。木質(zhì)纖維素中的木質(zhì)素是由四種醇單體 (對香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇）形成的一種復(fù)雜酚類聚合物。木質(zhì)素是構(gòu)成 植物細胞壁的成分之一，具有聯(lián)結(jié)強化細胞的作用。此外，木質(zhì)素也是一種含許多負電集團 的多環(huán)高分子有機物，對土壤中的高價金屬離子有較強的親和力。
[0003] 根據(jù)單體的不同，可將木質(zhì)素分為3種類型：由紫丁香基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成 的紫丁香基木質(zhì)素 （S -木質(zhì)素），由愈創(chuàng)木基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成的愈創(chuàng)木基木質(zhì)素 (G -木質(zhì)素）和由對-羥基苯基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成的對-羥基苯基木質(zhì)素 （H -木質(zhì) 素）。一般而言，木質(zhì)素在裸子植物主要存在類型為愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G)，雙子葉植物主要 含愈創(chuàng)木基-紫丁香基木質(zhì)素 （G - S)，單子葉植物則為愈創(chuàng)木基-紫丁香基-對-羥基苯 基木質(zhì)素 （G - S - H)。從植物學(xué)觀點出發(fā)，木質(zhì)素就是包圍于管胞、導(dǎo)管及木纖維等纖維束 細胞及厚壁細胞外的物質(zhì)；從化學(xué)觀點來看，木質(zhì)素是由高度取代的苯基丙烷單元隨機聚 合而成的高分子，它與纖維素、半纖維素一起，形成植物骨架的主要成分，在數(shù)量上僅次于 纖維素。木質(zhì)素填充于纖維素構(gòu)架中增強植物體的機械強度，利于輸導(dǎo)組織的水分運輸和 抵抗不良外界環(huán)境的侵襲。
[0004] 木質(zhì)素單體同時含有多種活性官能團，如羥基、羰基、羧基、甲基及其它側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。 其中羥基在木質(zhì)素中存在較多，以醇羥基和酚羥基兩種形式存在，而酚羥基的多少又直接 直接影響木質(zhì)素的物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)，如能反映出木質(zhì)素的醚化和縮合程度，同時也能衡量 木質(zhì)素的溶解性能和反應(yīng)能力；在木質(zhì)素的側(cè)鏈上，有對羥基安息香酸、香草酸、紫丁香酸、 對羥基肉桂酸、阿魏酸等酯型結(jié)構(gòu)存在，這些酯型結(jié)構(gòu)存在于側(cè)鏈的α位或 Y位。在側(cè)鏈 α位除了酯型結(jié)構(gòu)外，還有醚型連接或作為聯(lián)苯結(jié)構(gòu)的碳-碳聯(lián)結(jié)。同酚羥基一樣，木質(zhì)素 的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)也直接關(guān)系它的化學(xué)特性。
[0005] 由于木質(zhì)素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)、高分子量及高度疏水性，與纖維素與半纖維素相比，木 質(zhì)素的降解相對緩慢。已發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素降解酶主要有3類：漆酶（Laccase)、錳過氧化物酶 (Manganese peroxidase)和木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin peroxidase)。
[0006] 灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)作為一種廣泛存在于土壤的細菌， 具有很強的木質(zhì)素降解能力并得到了研究者越來越多的關(guān)注。明確灰略紅鏈霉菌降解木質(zhì) 素的分子機制，克隆并表達關(guān)鍵木質(zhì)素降解酶，對于開發(fā)新型木質(zhì)素降解酶制劑進而實現(xiàn) 木質(zhì)素乃至木質(zhì)纖維素的快速降解具有重要意義。
[0007] 經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利文獻號CN102703344A公開（公告）日 2012. 10. 03,公開了一株秸桿降解放線菌及其應(yīng)用，但該技術(shù)產(chǎn)生的錳過氧化物酶為胞內(nèi) 酶，產(chǎn)量較低因此應(yīng)用范圍受限。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的由于錳過氧化物酶在生物體內(nèi)多為胞內(nèi)酶且表達量 較低導(dǎo)致的應(yīng)用范圍和效果嚴(yán)重受限等不足，提出一種基于錳過氧化物酶的工程菌及其實 現(xiàn)方法，能夠應(yīng)用基因工程手段實現(xiàn)其體外的大量表達合成，此外本發(fā)明通過在重組蛋白 添加聚組氨酸標(biāo)簽的方法，方便了后期蛋白的純化，可為錳過氧化物酶的規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn) 提供一種新的途徑。
[0009] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0010] 本發(fā)明涉及一種錳過氧化物酶的工程菌，該工程菌為外源表達錳過氧化物酶的大 腸桿菌。
[0011] 所述的胞內(nèi)猛過氧化物酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1錳過氧化物酶基因 SG - MNP，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，編碼該錳過氧化物酶核苷酸序列為2226bp，共編碼741個氨基酸。
[0012] 所述的 SEQ ID NO. 1 克隆自灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD-1, 現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國 科學(xué)院微生物研究所郵編100101。
[0013] 所述的錳過氧化物酶編碼基因通過全基因組測序和PCR擴增的方式克隆獲得。
[0014] 本發(fā)明涉及上述工程菌的實現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有 酶切位點和聚組氨酸（HIS 6 · Tag)標(biāo)簽的引物進行PCR擴增得到編碼錳過氧化物酶的核苷 酸序列；然后將擴增得到的基因序列連接到表達載體PET - 22b (+)，再將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 入大腸桿菌表達菌株內(nèi)，獲得錳過氧化物酶過表達重組菌株。
[0015] 所述的含有酶切位點和聚組氨酸（HIS6 · Tag)標(biāo)簽的引物，即含有Msc I和EcoR I酶切位點引物，具體包括：
[0016] MNP - Msc I - F：GATGGCCATGACCGAGAACCATGACGCGAT
[0017] MNP - EcoR I - R：GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGACGAGGTCGAACCGGTCGA
[0018] 所述的PCR擴增的條件為：98°C預(yù)變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個 循環(huán)后68°C終延伸3min。
[0019] 所述的大腸桿菌表達菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。
[0020] 本發(fā)明涉及一種錳過氧化物酶的工程菌的應(yīng)用，將其用于錳過氧化物酶的體外高 效表達，并用于降解木質(zhì)纖維素。 技術(shù)效果
[0021] 現(xiàn)有錳過氧化物酶在灰略紅鏈霉菌內(nèi)為胞內(nèi)酶且表達量很低，因此嚴(yán)重限制了其 使用范圍和效果；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種全新的錳過氧化物酶基因序列；通 過構(gòu)建外源表達載體，實現(xiàn)了錳過氧化物酶的外源高效表達，在重組蛋白C端添加聚組氨 酸標(biāo)簽（HIS 6· Tag)的方法并結(jié)合高濃度咪唑洗脫液，提高了蛋白洗脫的效率及純度、保證 蛋白生物學(xué)活性的同時也方便后續(xù)蛋白的純化；此外，本發(fā)明通過載體信號肽實現(xiàn)了目的 蛋白的周質(zhì)空間表達，保證了錳過氧化物酶在如高溫及堿性的特殊條件下具有更穩(wěn)定的酶 學(xué)特性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為灰略紅鏈霉菌錳過氧化物酶（MNP)信號肽預(yù)測圖。
[0023] 圖2為灰略紅鏈霉菌錳過氧化物酶（MNP)在不同碳源誘導(dǎo)下表達量示意圖。
[0024] 圖3為灰略紅鏈霉菌錳過氧化物酶（MNP) 3D空間模型示意圖。
[0025] 圖4為重組錳過氧化物酶（HIS6 · Tag)體外表達SDS - PAGE驗證圖。
[0026] 圖5為重組猛過氧化物酶（HIS6 · Tag)體外表達Western Blot驗證圖。
[0027] 圖6為重組錳過氧化物酶（HIS6 · Tag)在不同pH下酶活性示意圖。
[0028] 圖7為重組錳過氧化物酶（HIS6 · Tag)在不同溫度下酶活性示意圖。
[0029] 圖8為重組錳過氧化物酶（HIS6 · Tag)在不同金屬離子下酶活性示意圖。
[0030] 圖9為重組錳過氧化物酶（HIS6 · Tag)在不同酶活性抑制劑下酶活性示意圖。

【具體實施方式】
[0031] 下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。 實施例1
[0032] 本實施例包括以下步驟：
[0033] 步驟1)灰略紅鏈霉菌的分離及培養(yǎng)
[0034] 灰略紅鏈霉菌分離自上海市浦江鎮(zhèn)收集的腐爛秸桿，保藏編號為CGMCC No. 5706。 將該菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，32 °C培養(yǎng)48h。
[0035] 上述LB液體培養(yǎng)基組分為：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCl 10. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液體培養(yǎng)基中加入15. 0 - 20. 0g/L瓊脂即得LB固體培養(yǎng)基。
[0036] 步驟2)灰略紅鏈霉菌基因組DNA提取
[0037] 收集2. OmL菌液，12000rpm離心2min。棄上清，收集菌體沉淀，加入180yL溶菌酶 (20mg/mL)和20yL EDTA溶液（0.5M，pH 8.0)，37°C處理45min，加入4yL RNase A(100mg/ mL)，震蕩混勻15s，室溫放置5min，隨后按照細菌DNA提取試劑盒（TIANGEN)操作說明完成 剩余操作，得到高純度基因組DNA。通過0. 8%瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質(zhì)量，確保 無明顯RNA條帶，基因組條帶清洗、完整、無降解、無污染。
[0038] 步驟3)灰略紅鏈霉菌基因組測序
[0039] 確定全基因組鳥槍法（WGS)策略，采用第二代測序技術(shù)，構(gòu)建不同插入片段長度 的文庫，采用Illumina Miseq(2X250bp)平臺進行測序。收集測序的原始數(shù)據(jù)，對帶接頭、 低質(zhì)量的數(shù)據(jù)進行過濾，隨后采用Newbler version 2. 8對去除接頭的測序數(shù)據(jù)進行從頭 拼接，構(gòu)建contigs及scaffolds，最后使用GapCloser程序進行缺口填補得到鏈霉菌基因 組草圖。
[0040] 步驟4)蛋白編碼基因功能預(yù)測
[0041] 采用Glimmer 3. 0軟件對全基因組序列進行基因預(yù)測?；蝾A(yù)測模型選取自我訓(xùn) 練基因預(yù)測模型，即提取拼裝序列中最長的序列，以該序列作為基因預(yù)測模型訓(xùn)練的序列。 然后以該序列構(gòu)建的基因預(yù)測模型，對所有序列進行基因預(yù)測，設(shè)定開放閱讀框的長度為 llObp，其余參數(shù)為Glimmer 3. 0的默認設(shè)置。
[0042] 步驟5)錳過氧化物酶膜定位預(yù)測
[0043] 采用SignalP 4. 1分別對錳過氧化物酶氨基酸序列進行信號肽模擬預(yù)測，如圖1 所示。結(jié)果表明錳過氧化物酶不存在明顯的信號肽序列，推測該酶為胞內(nèi)酶。
[0044] 步驟6)灰略紅鏈霉菌總RNA的提取
[0045] 將鏈霉菌JSD -1接種于以水稻秸桿（纖維素、木聚糖、果膠、木質(zhì)素或葡萄糖）為 唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基，32°C、150rpm條件下培養(yǎng)72h。離心收集菌體沉淀，并按細菌總 RNA提取試劑盒要求（TIANGEN)提取高純度的鏈霉菌總RNA。
[0046] 上述無機鹽培養(yǎng)基組分為：KN032. Og/L，KH2P041. Og/L，NaCl 0. 5g/L，MgS04 · 7H20 0. 5g/L，CaCl2 · 2H200. lg/L，F(xiàn)eS04 · 7H20 0. 01g/L，水稻秸桿（纖維素、木聚糖、果膠、木質(zhì) 素或葡萄糖）10. 〇g/L。
[0047] 步驟7)灰略紅鏈霉菌錳過氧化物酶表達水平測定
[0048] 根據(jù)錳過氧化物酶基因序列，通過DNAMAN 6. 0軟件設(shè)計特異性PCR引物，引物序 列如下：
[0049] MNP - F ：CAAGCAGTGGGTCGCCAAGA
[0050] MNP - R ：CCAGGTCGGTGGTGAGCAT
[0051] 同樣的，根據(jù)16S rRNA的特異性序列設(shè)計引物，并作為內(nèi)參基因，引物序列如下：
[0052] 16S rRNA - F ：CGTATTCACCGCAGCAATGC
[0053] 16S rRNA - R ：GCGAGGTGGAGCGAATCTCA
[0054] 以鏈霉菌總RNA模板進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA文庫，并按照熒光定量PCR試劑盒 (TaKaRa)要求進行相關(guān)操作。設(shè)置三個重復(fù)，待實驗完成收集處理數(shù)據(jù)，分析在不同碳源誘 導(dǎo)作用下，錳過氧化物酶的表達量（圖2)。結(jié)果表明，當(dāng)以水稻秸桿（主要成分為木質(zhì)纖維 素）與木質(zhì)素為碳源進行誘導(dǎo)時，該錳過氧化物酶的表達量顯著上調(diào)，證明該酶參與木質(zhì) 素的代謝過程。
[0055] 上述的熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性30s ;95°C變性10s，60°C退火 30s，72°C延伸15s，共40個循環(huán)。
[0056] 步驟8)錳過氧化物酶3D空間模型預(yù)測
[0057] 運用PHYRE 2在線程序?qū)﹀i過氧化物酶3D空間模型進行預(yù)測，結(jié)果如圖3所示。 結(jié)果表明該錳過氧化物酶與PDB數(shù)據(jù)庫中已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白模型的最高覆蓋度與相似 度分別可達97 %和61 %，預(yù)測結(jié)果具有100 %可信度。通過氣3D空間建構(gòu)可以推測其C端 (紅色）裸露在外面，適合連接融合標(biāo)簽以方便蛋白的后期純化。
[0058] 步驟9)錳過氧化物酶表達載體構(gòu)建
[0059] 根據(jù)錳過氧化物酶基因序列，設(shè)計含有酶切位點的引物，序列如下：
[0060] MNP - Msc I - F：GATGGCCATGACCGAGAACCATGACGCGAT
[0061] MNP - EcoR I - R：GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGACGAGGTCGAACCGGTCGA
[0062] 以灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)基因組DNA為模板，用含有Msc I和EcoR I酶切位點引物進行PCR擴增獲得錳過氧化物酶基因序列，使用DNA A -Tailing Kit加 A后連接到T-Vector PMD? 19-T(TaKaRa)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5a大腸桿菌內(nèi)。 挑選陽性克隆，搖菌提取質(zhì)粒測序。Msc I和EcoR I進行雙酶切（37°C)，回收錳過氧化物 酶DNA片段MNP。用相同內(nèi)切酶酶切表達載體pET - 22b (+)并回收載體DNA片段。將MNP 與載體片段混合，T4DNA Ligase(TaKaRa)過夜連接（16°C)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5a大腸桿 菌感受態(tài)細胞內(nèi)，通過抗性平板及菌落PCR篩選含有目的基因的表達載體的陽性克隆。挑 取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素（100 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，180rpm、37°C培養(yǎng)16 小時后提取質(zhì)粒。
[0063] 上述PCR擴增條件為：98°C預(yù)變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個循環(huán) 后68°C終延伸3min。
[0064] 步驟10)錳過氧化物酶過表達轉(zhuǎn)基因菌株的構(gòu)建
[0065] 將上述猛過氧化物酶表達載體轉(zhuǎn)入Transetta(DE3)大腸桿菌，在含有氨節(jié)青霉 素（100 μ g/mL)和氯霉素（34 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基上篩選，獲得錳過氧化物酶過表達 菌株。
[0066] 上述的Transetta(DE3)具有以下特征：該菌株具有氯霉素（Canf)，且含有大腸桿 菌缺乏的6種稀有密碼子（AGA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)對應(yīng)的tRNA，可有效提高外源基 因，尤其是真核生物及鏈霉菌等高GC含量生物基因在原核系統(tǒng)中的表達水平。
[0067] 步驟11)重組錳過氧化物酶體外過表達
[0068] 挑取陽性克隆于含有氨芐青霉素（100 μ g/mL)和氯霉素（34 μ g/mL)的LB液體培 養(yǎng)基中，在32°C震蕩培養(yǎng)，當(dāng)0D6(KI達到0. 8 -1. 0時，加入IPTG和MnS04溶液使其在發(fā)酵液 中的濃度達到100 μ M，25°C繼續(xù)培養(yǎng)16小時進行誘導(dǎo)表達。誘導(dǎo)表達培養(yǎng)好的發(fā)酵液離 心收集菌體，利用破胞緩沖液洗滌菌體一次，再利用1/10發(fā)酵液體積的磷酸鹽緩沖液緩沖 液重懸菌體后在冰浴條件下利用超聲波破胞至菌液澄清，13000rpm/min離心15min收集上 清，上清液即為錳過氧化物酶的粗酶液。
[0069] 重組菌誘導(dǎo)表達錳過氧化物酶的SDS - PAGE驗證
[0070] 制備 12% SDS -PAGE 膠，將粗酶液與 5XSDS -PAGE Loading Buffer 比例混合，與 沸水浴5min，每個點樣孔上樣20 μ L，在160V電壓下電泳60 - 70min，直至溴酚藍指示條帶 完全跑出膠。停止電泳，用考馬斯亮藍R - 250溶液染色20min，然后用脫色液進行洗滌，直 至背景色完全脫去，條帶清晰可見（如圖4)。
[0071] 所述的12% SDS - PAGE是由濃縮膠與分離膠構(gòu)成的，其組分分別為：
[0072] 分離膠：蒸餾水 1. 6mL，30%丙烯酰胺溶液 2. OmL，1. 5M Tris -HC1 (pH 8. 8) 1. 3mL， 10% 過硫酸銨（APS)0. 05mL，10% SDS 溶液 0· 05mL，TEMED 0· 002mL ;
[0073] 濃縮膠：蒸餾水 0· 68mL，30 % 丙烯酰胺溶液 0· 17mL，1. 0M Tris - HC1 (pH 6. 8)0. 13mL，10%過硫酸銨（APS)0. OlmL，10% SDS 溶液 0· OlmL，TEMED 0· OOlmL ;
[0074] 所述的 5XSDS - PAGE Loading Buffer 組分為：1M Tris - HC1 (pH 6. 8) 1. 25mL， SDS 0· 5g，溴酚藍25mg，甘油2. 5mL，去離子水定容至5mL。小份分裝（500 μ L)后與室溫保 存，使用前每小份加入β -巰基乙醇25 μ L。
[0075] 所述的考馬斯亮藍R - 250溶液組分為：考馬斯亮藍R - 2501g，異丙醇250mL，冰醋 酸100mL，去離子水650mL。
[0076] 所述的脫色液組分為：冰醋酸100mL，無水乙醇50mL，去離子水850mL。
[0077] 重組菌誘導(dǎo)表達猛氧化物酶的Western Blot驗證
[0078] Western Blot詳細步驟如下：
[0079] 按順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置：正電極、海綿、三張濾紙、PVDF膜、SDS - PAGE膠、三張濾紙、 海綿和負電極。其中PVDF膜使用前先用甲醇泡lOmin，濾紙用電轉(zhuǎn)液浸泡。將裝好的轉(zhuǎn)膜 裝置放入電轉(zhuǎn)槽，4°C 100V轉(zhuǎn)60 - 70min。
[0080] 所述的SDS - PAGE膠是指：實施例12中已完成電泳、未染色的膠塊；所述電轉(zhuǎn)液 的組分為：甘氨酸2. 9g/L，Tris5. 8g/L，SDS 0. 37g，甲醇200mL，去離子水800mL，配好之后 4°C預(yù)冷。
[0081] 封閉：將轉(zhuǎn)好的PVDF膜置于封閉液中，并置于水平振蕩器上室溫封閉lh。
[0082] 所述封閉液組分為：5. 0g脫脂奶粉溶解于100mL TBST緩沖液；所述的TBST緩沖 液組分為：NaCl 8. 8g，1M Tris - HC1 (pH 8. 0) 20mL，吐溫-200. 5mL，去離子水 980mL。
[0083] 一抗雜交：將封閉完的PVDF膜轉(zhuǎn)入一抗溶液中，置于滾動搖床37°C、150rpm孵育 lh〇
[0084] 所述的一抗溶液組分為：將抗His -兔多克隆抗體以1 :5000溶在封閉液中。
[0085] 洗膜：將一抗孵育完的PVDF膜轉(zhuǎn)入TBST緩沖液中，在搖床上震蕩清洗3次，每次 l〇min ;之后再在TBS緩沖液中清洗1次，10min。
[0086] 所述TBS緩沖液是指不含吐溫-20組分的TBST緩沖液。
[0087] 二抗雜交：將沖洗干凈的PVDF膜放入二抗溶液中，置于滾動搖床37°C、150rpm孵 育lh。
[0088] 所述的二抗溶液組分為：將羊抗兔IgG - HRP以1 :5000溶在封閉液中。
[0089] 洗膜：同前。
[0090] 染色：將染色液均勻涂抹于PVDF膜上，靜置lmin。通保鮮膜包好PVDF膜，置于X -光片盒中，并用透明膠帶固定。
[0091] 所述的染色液組分是將EasySee Western Blot Kit(TRANSGEN)中 500μ L溶液A、 500 μ L溶液Β與1 μ L溶液C混合。
[0092] 顯影：于暗室中壓片洗膜顯影，結(jié)果如圖5。
[0093] 重組錳過氧化物酶在不同條件下生物學(xué)活性測定
[0094] 錳過氧化物酶活性是以愈創(chuàng)木酚為底物，在錳過氧化物酶和Mn2+作用下，愈創(chuàng)木 酚被氧化成四鄰甲氧基連酚，分光光度法測定有色產(chǎn)物四鄰甲氧基連酚的形成。反應(yīng)條件 為：琥珀酸鈉緩沖液或乳酸鈉緩沖液，pH 4. 0 - 4. 5,0. 2mM MnS04,0. ImM H202,0. 4mM愈創(chuàng)木 酚，測定波長為465nm。
[0095] 采用上述方法測定在不同溫度（20°C - 80°C )、pH值（3· 0 - 12. 0)、濃度為ImM的 金屬鹽（含似+、1%2+、0&2+^11 2+、2112+、(：112+、取2+、0(12+、？6 2+)溶液及酶活性抑制劑（01'1^0丁八、 SDS、NaN3)處理下，錳過氧化物酶粗酶液的活性。測定結(jié)果表明（圖6和圖7)，在pH 9. 0 和50°C下，粗酶液具有最大錳過氧化物酶活性，說明該錳過氧化物酶在高溫和堿性可以維 持較強的生物學(xué)活性。此外，該錳過氧化物酶對多種金屬離子（Na+、Mg 2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、 Cu2+、Fe2+)及酶活性抑制劑（DTT、EDTA、NaN3)有較強的耐受能力（圖8和圖9)。上述酶學(xué) 特性，保證了該酶具有廣泛的工業(yè)用途。
【權(quán)利要求】
1. 一種錳過氧化物酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達錳過氧化物酶的大 腸桿菌； 所述的胞內(nèi)猛過氧化物酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD-l 錳過氧化物酶基因 SG-MNP，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示，編碼該錳過氧化物酶核苷酸序列為2226 bp，共編碼741個氨基酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日。
3. -種根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的工程菌的實現(xiàn)方法，其特征在于，以灰略紅鏈霉菌 基因組DNA為模板，與含有酶切位點和聚組氨酸標(biāo)簽的引物進行PCR擴增得到編碼錳過氧 化物酶的核苷酸序列；然后將擴增得到的基因序列連接到表達載體PET - 22b (+)，再將獲得 的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株內(nèi)，獲得錳過氧化物酶過表達重組菌株。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位點和聚組氨酸標(biāo)簽的引 物，即含有Msc I和EcoR I酶切位點引物，具體包括： MNP - Msc I - F ：GATGGCCATGACCGAGAACCATGACGCGAT MNP - EcoR I - R ：GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGACGAGGTCGAACCGGTCGA〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR擴增的條件為：98°C預(yù)變性 3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個循環(huán)后68°C終延伸3min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達菌株為 Transetta(DE3)大腸桿菌。
7. -種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的錳過氧化物酶的工程菌的應(yīng)用，其特征在于，將 其用于錳過氧化物酶的體外高效表達，并用于降解木質(zhì)纖維素。
【文檔編號】C12N15/70GK104232555SQ201410462406
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】周培, 馮?，|, 孫玉靜, 支月娥 申請人:上海交通大學(xué)