基于木質(zhì)素過氧化物酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法
【專利摘要】一種基因工程領(lǐng)域的基于木質(zhì)素過氧化物酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點(diǎn)和谷胱甘肽標(biāo)簽的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到編碼木質(zhì)素過氧化物酶的核苷酸序列；然后將擴(kuò)增得到的基因序列連接到表達(dá)載體，再將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株內(nèi)，獲得木質(zhì)素過氧化物酶過表達(dá)重組菌株。本發(fā)明通過構(gòu)建外源表達(dá)載體，優(yōu)化蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件和融合標(biāo)簽等方法，實(shí)現(xiàn)了木質(zhì)素過氧化物酶的胞外過表達(dá)。
CGMCC NO.5706
2012.01.09
【專利說明】基于木質(zhì)素過氧化物酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的基因及其工程菌株，具體是一種灰 略紅鏈霉菌的基于木質(zhì)素過氧化物酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 木質(zhì)素是由四種醇單體（對香豆醇、松柏醇、5 -羥基松柏醇、芥子醇）形成的一種 復(fù)雜酚類聚合物。木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的成分之一，具有聯(lián)結(jié)強(qiáng)化細(xì)胞的作用。此外， 木質(zhì)素也是一種含許多負(fù)電集團(tuán)的多環(huán)高分子有機(jī)物，對土壤中的高價(jià)金屬離子有較強(qiáng)的 親和力。
[0003] 根據(jù)單體的不同，可將木質(zhì)素分為3種類型：由紫丁香基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成 的紫丁香基木質(zhì)素 （S -木質(zhì)素），由愈創(chuàng)木基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成的愈創(chuàng)木基木質(zhì)素 (G -木質(zhì)素）和由對-羥基苯基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成的對-羥基苯基木質(zhì)素 （H -木質(zhì) 素）。一般而言，木質(zhì)素在裸子植物主要存在類型為愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G)，雙子葉植物主要 含愈創(chuàng)木基-紫丁香基木質(zhì)素 （G - S)，單子葉植物則為愈創(chuàng)木基-紫丁香基-對-羥基苯 基木質(zhì)素 （G - S - H)。從植物學(xué)觀點(diǎn)出發(fā)，木質(zhì)素就是包圍于管胞、導(dǎo)管及木纖維等纖維束 細(xì)胞及厚壁細(xì)胞外的物質(zhì)；從化學(xué)觀點(diǎn)來看，木質(zhì)素是由高度取代的苯基丙烷單元隨機(jī)聚 合而成的高分子，它與纖維素、半纖維素一起，形成植物骨架的主要成分，在數(shù)量上僅次于 纖維素。木質(zhì)素填充于纖維素構(gòu)架中增強(qiáng)植物體的機(jī)械強(qiáng)度，利于輸導(dǎo)組織的水分運(yùn)輸和 抵抗不良外界環(huán)境的侵襲。
[0004] 木質(zhì)素單體同時(shí)含有多種活性官能團(tuán)，如羥基、羰基、羧基、甲基及其它側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。 其中羥基在木質(zhì)素中存在較多，以醇羥基和酚羥基兩種形式存在，而酚羥基的多少又直接 直接影響木質(zhì)素的物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)，如能反映出木質(zhì)素的醚化和縮合程度，同時(shí)也能衡量 木質(zhì)素的溶解性能和反應(yīng)能力；在木質(zhì)素的側(cè)鏈上，有對羥基安息香酸、香草酸、紫丁香酸、 對羥基肉桂酸、阿魏酸等酯型結(jié)構(gòu)存在，這些酯型結(jié)構(gòu)存在于側(cè)鏈的α位或 Y位。在側(cè)鏈 α位除了酯型結(jié)構(gòu)外，還有醚型連接或作為聯(lián)苯結(jié)構(gòu)的碳-碳聯(lián)結(jié)。同酚羥基一樣，木質(zhì)素 的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)也直接關(guān)系它的化學(xué)特性。
[0005] 由于木質(zhì)素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)、高分子量及高度疏水性，與纖維素與半纖維素相比，木質(zhì) 素的降解相對緩慢。已發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素降解酶主要有3類：漆酶（Laccase)、木質(zhì)素過氧化物酶 (Manganese peroxidase)和木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin peroxidase)。
[0006] 灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)作為一種廣泛存在于土壤的細(xì)菌， 具有很強(qiáng)的木質(zhì)素降解能力并得到了研究者越來越多的關(guān)注。明確灰略紅鏈霉菌降解木質(zhì) 素的分子機(jī)制，克隆并表達(dá)關(guān)鍵木質(zhì)素降解酶，對于開發(fā)新型木質(zhì)素降解酶制劑進(jìn)而實(shí)現(xiàn) 木質(zhì)素乃至木質(zhì)纖維素的快速降解具有重要意義。
[0007] 經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)：中國專利文獻(xiàn)號CN103205403A公開（公告）日 2013.07. 17,公開了一種生產(chǎn)降解木質(zhì)素酶的方法。該技術(shù)首先分別從微生物中克隆木質(zhì) 素過氧化物酶，錳過氧化物酶和漆酶基因；構(gòu)建含上述三種基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá) 載體和釀酒酵母表達(dá)載體，并將載體轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主菌而獲得工程菌。分別發(fā)酵畢赤酵母 工程菌和釀酒酵母工程菌生產(chǎn)重組木質(zhì)素過氧化物酶，錳過氧化物酶和漆酶。但該技術(shù)中 的木質(zhì)素過氧化物酶克隆自白腐真菌，真菌來源木質(zhì)素過氧化酶對環(huán)境因素敏感，在高溫 和高pH下難以維持較高的生物學(xué)穩(wěn)定性。
[0008] 中國專利文獻(xiàn)號CN102703344A公開（公告）日2012. 10. 03,公開了一株秸桿降解 放線菌及其應(yīng)用，但該技術(shù)中涉及的木質(zhì)素過氧化物酶在灰略紅鏈霉菌內(nèi)為表達(dá)酶，為誘 導(dǎo)酶且表達(dá)量較低，難以滿足生產(chǎn)需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的由于木質(zhì)素過氧化物酶在生物體內(nèi)多為胞內(nèi)酶且表 達(dá)量較低導(dǎo)致的應(yīng)用范圍和效果嚴(yán)重受限等不足，提出一種基于木質(zhì)素過氧化物酶的工程 菌及其實(shí)現(xiàn)方法，通過構(gòu)建外源表達(dá)載體，優(yōu)化蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件和融合標(biāo)簽等方法，實(shí) 現(xiàn)了木質(zhì)素過氧化物酶的胞外過表達(dá)。
[0010] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 本發(fā)明涉及一種木質(zhì)素過氧化物酶的工程菌，該工程菌為外源表達(dá)木質(zhì)素過氧化 物酶的大腸桿菌。
[0012] 所述的胞內(nèi)木質(zhì)素過氧化物酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD - 1木質(zhì)素過氧化物酶基因 SG - LIP,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 示，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，編碼該木質(zhì)素過氧化物酶核苷酸序列為1278bp，共編 碼425個(gè)氨基酸。
[0013] 所述的 SEQ ID NO. 1 克隆自灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD-1, 現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國 科學(xué)院微生物研究所郵編100101。
[0014] 所述的木質(zhì)素過氧化物酶編碼基因通過全基因組測序和PCR擴(kuò)增的方式克隆獲 得。
[0015] 本發(fā)明涉及上述工程菌的實(shí)現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有 酶切位點(diǎn)和谷胱甘肽的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到編碼木質(zhì)素過氧化物酶的核苷酸序列；然后 將擴(kuò)增得到的基因序列連接到表達(dá)載體PET - 41a(+)，再將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 表達(dá)菌株內(nèi)，獲得木質(zhì)素過氧化物酶過表達(dá)重組菌株。
[0016] 所述的含有酶切位點(diǎn)和谷胱甘肽標(biāo)簽的引物，即含有Spe I和EcoR I酶切位點(diǎn)引 物，具體包括：
[0017] Lip - Spe I - F:GACTAGTATGGCTGACCCTTCCCTGTCGCA
[0018] Lip - EcoR I - R:GGAATTCTCACCCCTCCAGCAGCGCCTGAC
[0019] 所述的PCR擴(kuò)增的條件為：98°C預(yù)變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個(gè) 循環(huán)后68°C終延伸3min。
[0020] 所述的大腸桿菌表達(dá)菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。
[0021] 本發(fā)明涉及一種木質(zhì)素過氧化物酶的工程菌的應(yīng)用，將其用于木質(zhì)素過氧化物酶 的體外高效表達(dá)，并用于木質(zhì)素過氧化物酶的規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)。 技術(shù)效果
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)中的木質(zhì)素過氧化物酶在生物體內(nèi)多為胞 內(nèi)酶且表達(dá)量較低，導(dǎo)致應(yīng)用范圍和效果嚴(yán)重受限等不足，應(yīng)用基因工程手段實(shí)現(xiàn)其體外 的大量表達(dá)與合成。此外，本發(fā)明通過在重組蛋白N端添加谷胱甘肽標(biāo)簽的方法，在顯著提 高表達(dá)量的同時(shí)也方便了蛋白后期的純化，為木質(zhì)素過氧化物酶的規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)提供一 種新的方向。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為灰略紅鏈霉菌木質(zhì)素過氧化物酶信號肽預(yù)測圖。
[0024] 圖2為重組木質(zhì)素過氧化酶（GST · Tag)體外過表達(dá)SDS - PAGE驗(yàn)證圖。
[0025] 圖3為重組木質(zhì)素過氧化酶（GST · Tag)體外過表達(dá)Western Bolt驗(yàn)證圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。 實(shí)施例1
[0027] 本實(shí)施例包括以下步驟：
[0028] 步驟1)灰略紅鏈霉菌的分離及培養(yǎng)
[0029] 灰略紅鏈霉菌分離自上海市浦江鎮(zhèn)收集的腐爛秸桿，保藏編號為CGMCC No. 5706。 將該菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，32 °C培養(yǎng)48h。
[0030] 上述LB液體培養(yǎng)基組分為：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCllO. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液體培養(yǎng)基中加入15. 0 - 20. 0g/L瓊脂即得LB固體培養(yǎng)基。
[0031] 步驟2)灰略紅鏈霉菌基因組DNA提取
[0032] 灰略紅鏈霉菌基因組DNA提取
[0033] 收集2. OmL菌液，12000rpm離心2min。棄上清，收集菌體沉淀，加入180 μ L溶 菌酶（20mg/mL)和 20 μ L EDTA 溶液（0· 5Μ, ρΗ8· 0)，37 °C 處理 45min，加入 4 μ L RNase A (100mg/mL)，震蕩混勻15s，室溫放置5min，隨后按照細(xì)菌DNA提取試劑盒（TIANGEN)操作 說明完成剩余操作，得到高純度基因組DNA。通過0. 8%瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質(zhì) 量，確保無明顯RNA條帶，基因組條帶清洗、完整、無降解、無污染。
[0034] 步驟3)灰略紅鏈霉菌基因組測序
[0035] 確定全基因組鳥槍法（WGS)策略，采用第二代測序技術(shù)，構(gòu)建不同插入片段長度 的文庫，采用Illumina Miseq(2X250bp)平臺進(jìn)行測序。收集測序的原始數(shù)據(jù)，對帶接頭、 低質(zhì)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，隨后采用Newbler v2. 8對去除接頭的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭拼接，構(gòu) 建contig及scaffold,最后使用GapCloser程序進(jìn)行缺口填補(bǔ)得到鏈霉菌基因組草圖。
[0036] 步驟4)蛋白編碼基因功能預(yù)測
[0037] 采用Glimmerf. 0軟件對全基因組序列進(jìn)行基因預(yù)測?；蝾A(yù)測模型選取自我訓(xùn) 練基因預(yù)測模型，即提取拼裝序列中最長的序列，以該序列作為基因預(yù)測模型訓(xùn)練的序列。 然后以該序列構(gòu)建的基因預(yù)測模型，對所有序列進(jìn)行基因預(yù)測，設(shè)定開放閱讀框的長度為 llObp，其余參數(shù)為Glimmer3. 0的默認(rèn)設(shè)置。
[0038] 步驟5)木質(zhì)素過氧化物酶膜定位預(yù)測
[0039] 采用SignalP4. 1分別對木質(zhì)素過氧化物酶氨基酸序列進(jìn)行信號肽模擬預(yù)測，如 圖1所示。結(jié)果表明木質(zhì)素過氧化物酶不存在明顯的信號肽序列，推測該酶為胞內(nèi)酶。
[0040] 步驟6)木質(zhì)素過氧化物酶表達(dá)載體構(gòu)建
[0041] 根據(jù)木質(zhì)素過氧化物酶基因序列，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物，序列如下：
[0042] Lip - Spe I - F:GACTAGTATGGCTGACCCTTCCCTGTCGCA
[0043] Lip - EcoR I - R:GGAATTCTCACCCCTCCAGCAGCGCCTGAC
[0044] 以灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)基因組DNA為模板，用含有 Spe I和EcoR I酶切位點(diǎn)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得木質(zhì)素過氧化物酶基因序列，使用DNA A-Tailing Kit 加 A 后連接到 T-Vector ?]\?11119-1'〇^1^1^)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入0!15〇 大腸桿菌內(nèi)。挑選陽性克隆，搖菌提取質(zhì)粒測序。Spe I和EcoR I進(jìn)行雙酶切（37°C)，回 收木質(zhì)素過氧化物酶DNA片段Lip。用相同內(nèi)切酶酶切表達(dá)載體pET-41a(+)并回收載體 DNA片段。將Lip與載體片段混合，T4DNA Ligase(TaKaRa)過夜連接（16°C)，將連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過抗性平板及菌落PCR篩選含有重組表達(dá)質(zhì)粒的陽 性克隆。挑取陽性克隆接種于含有卡那霉素（50yg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，180rpm、37°C 培養(yǎng)16小時(shí)后提取質(zhì)粒。
[0045] 上述PCR擴(kuò)增條件為：98°C預(yù)變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個(gè)循環(huán) 后68°C終延伸3min。
[0046] 步驟7)木質(zhì)素過氧化物酶過表達(dá)轉(zhuǎn)基因菌株的構(gòu)建
[0047] 將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入Transetta(DE3)大腸桿菌，并在含有卡那霉素（50 μ g/ mL)和氯霉素（34 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基上篩選，獲得木質(zhì)素過氧化物酶過表達(dá)菌株。
[0048] 上述的Transetta(DE3)具有以下特征：該菌株具有氯霉素（Canf)，且含有大腸桿 菌缺乏的6種稀有密碼子（AGA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)對應(yīng)的tRNA，可有效提高外源基 因，尤其是真核生物及鏈霉菌等高GC含量生物基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。
[0049] 步驟8)重組木質(zhì)素過氧化物酶體外過表達(dá)及純化
[0050] 挑取陽性克隆于含有卡那霉素（50 μ g/mL)和氯霉素（34 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng) 基中，在32°C震蕩培養(yǎng)，當(dāng)0D6(?達(dá)到0. 8 - 1. 0時(shí)，28°C加入IPTG溶液使培養(yǎng)液IPTG濃度 達(dá)到100 μ M，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)好的發(fā)酵液離心收集菌體，利 用破胞緩沖液洗滌菌體一次，再利用1/10發(fā)酵液體積的磷酸鹽緩沖液緩沖液重懸菌體后 在冰浴條件下利用超聲波破胞至菌液澄清，13000rpm/min離心15min收集上清，上清液即 為木質(zhì)素過氧化物酶的粗酶液。通過0. 45 μ m濾膜過濾掉粗酶液中的雜質(zhì)，隨后通過GST 蛋白純化試劑盒的操作要求完成融合蛋白的純化。
[0051] 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)木質(zhì)素過氧化物酶的SDS - PAGE驗(yàn)證
[0052] 制備 12% SDS -PAGE 膠，將粗酶液與 5XSDS -PAGE Loading Buffer 比例混合，與 沸水浴5min，每個(gè)點(diǎn)樣孔上樣20 μ L，在160V電壓下電泳60 - 70min，直至溴酚藍(lán)指示條帶 完全跑出膠。停止電泳，用考馬斯亮藍(lán)R - 250溶液染色20min，然后用脫色液進(jìn)行洗滌，直 至背景色完全脫去，條帶清晰可見（如圖2)。
[0053] 所述的12% SDS - PAGE是由濃縮膠與分離膠構(gòu)成的，其組分分別為：
[0054] 分離膠：蒸餾水 1. 6mL，30%丙烯酰胺溶液 2. OmL，1· 5M Tris - HC1 (ρΗ8· 8) 1. 3mL， 10% 過硫酸銨（APS)O. 05mL，10% SDS 溶液 0· 05mL，TEMEDO. 002mL ;
[0055] 濃縮膠：蒸餾水0.68mL，30 %丙烯酰胺溶液0. 17mL，1.0M Tris-HCl(pH6.8)0.13mL，10 % 過硫酸銨（APS)0.01mL，10 % SDS 溶液 O.OlmL， TEMEDO. OOlmL ；
[0056] 所述的 5X SDS - PAGE Loading Buffer 組分為：1M Tris - HC1 (pH6. 8) 1. 25mL， SDSO. 5g，溴酚藍(lán)25mg，甘油2. 5mL，去離子水定容至5mL。小份分裝（500 μ L)后與室溫保 存，使用前每小份加入β -巰基乙醇25 μ L。
[0057] 所述的考馬斯亮藍(lán)R - 250溶液組分為：考馬斯亮藍(lán)R - 250 lg，異丙醇250mL，冰 醋酸100mL，去離子水650mL ;所述的脫色液組分為：冰醋酸100mL，無水乙醇50mL，去離子 水 850mL。
[0058] 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)木質(zhì)素過氧化物酶的Western Blot驗(yàn)證
[0059] Western Blot詳細(xì)步驟如下：
[0060] 按順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置：正電極、海綿、三張濾紙、PVDF膜、SDS - PAGE膠、三張濾紙、 海綿和負(fù)電極。其中PVDF膜使用前先用甲醇泡10min，濾紙用電轉(zhuǎn)液浸泡。將裝好的轉(zhuǎn)膜 裝置放入電轉(zhuǎn)槽，4°C 100V轉(zhuǎn)60 - 70min。
[0061] 所述的SDS - PAGE膠是指：實(shí)施例9中已完成電泳、未染色的膠塊；所述電轉(zhuǎn)液的 組分為：甘氨酸2. 9g/L，Tris5. 8g/L，SDS0. 37g，甲醇200mL，去離子水800mL，配好之后4°C 預(yù)冷。
[0062] 封閉：將轉(zhuǎn)好的PVDF膜置于封閉液中，并置于水平振蕩器上室溫封閉lh。
[0063] 所述封閉液組分為：5. 0g脫脂奶粉溶解于100mL TBST緩沖液；所述的TBST緩沖 液組分為：NaC18. 8g，1M Tris - HC1 (ρΗ8· 0) 20mL，吐溫-20 0· 5mL，去離子水 980mL。
[0064] 一抗雜交：將封閉完的PVDF膜轉(zhuǎn)入一抗溶液中，置于滾動(dòng)搖床37°C、150rpm孵育 lh〇
[0065] 所述的一抗溶液組分為：將抗His -兔多克隆抗體以1 :5000溶在封閉液中。
[0066] 洗膜：將一抗孵育完的PVDF膜轉(zhuǎn)入TBST緩沖液中，在搖床上震蕩清洗3次，每次 l〇min ;之后再在TBS緩沖液中清洗1次，10min。
[0067] 所述TBS緩沖液是指不含吐溫-20組分的TBST緩沖液。
[0068] 二抗雜交：將沖洗干凈的PVDF膜放入二抗溶液中，置于滾動(dòng)搖床37°C、150rpm孵 育lh。
[0069] 所述的二抗溶液組分為：將羊抗兔IgG - HRP以1 :5000溶在封閉液中。
[0070] 洗膜：同前。
[0071] 染色：將染色液均勻涂抹于PVDF膜上，靜置lmin。通保鮮膜包好PVDF膜，置于X -光片盒中，并用透明膠帶固定。
[0072] 所述的染色液組分是將EasySee Western Blot Kit(TRANSGEN)中 500μ L溶液A、 500 μ L溶液Β與1 μ L溶液C混合。于暗室中壓片洗膜顯影，結(jié)果如圖3所示。
【權(quán)利要求】
1. 一種木質(zhì)素過氧化物酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達(dá)木質(zhì)素過氧化 物酶的大腸桿菌； 所述的胞內(nèi)木質(zhì)素過氧化物酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1木質(zhì)素過氧化物酶基因 SG -LIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如 SEQ ID No. 2所示，編碼該木質(zhì)素過氧化物酶核苷酸序列為1278bp，共編碼425個(gè)氨基酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日。
3. -種根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的工程菌的實(shí)現(xiàn)方法，其特征在于，以灰略紅鏈霉菌 基因組DNA為模板，與含有酶切位點(diǎn)和谷胱甘肽標(biāo)簽的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到編碼木質(zhì)素 過氧化物酶的核苷酸序列；然后將擴(kuò)增得到的基因序列連接到表達(dá)載體PET -41a(+)，再將 獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株內(nèi)，獲得木質(zhì)素過氧化物酶過表達(dá)重組菌株。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位點(diǎn)和谷胱甘肽標(biāo)簽的引 物，即含有Spe I和EcoR I酶切位點(diǎn)引物，具體包括： Lip - Spe I - F:GACTAGTATGGCTGACCCTTCCCTGTCGCA Lip - EcoR I - R:GGAATTCTCACCCCTCCAGCAGCGCCTGAC〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR擴(kuò)增的條件為：98°C預(yù)變性 3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個(gè)循環(huán)后68°C終延伸3min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達(dá)菌株為 Transetta(DE3)大腸桿菌。
7. -種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的木質(zhì)素過氧化物酶的工程菌的應(yīng)用，其特征在 于，將其用于木質(zhì)素過氧化物酶的體外高效表達(dá)，并用于木質(zhì)素過氧化物酶的規(guī)?；l(fā)酵 生產(chǎn)。
【文檔編號】C12R1/19GK104232556SQ201410462409
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】周培, 馮?，|, 支月娥, 孫玉靜 申請人:上海交通大學(xué)