一種基于dna芯片的數(shù)字化定量檢測核酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于DNA芯片的數(shù)字化定量檢測核酸的方法，通過在基片上固定有擴(kuò)增引物，通過單個(gè)核酸分子模版擴(kuò)增目標(biāo)核酸，標(biāo)記探針與擴(kuò)增核酸雜交檢測標(biāo)記基團(tuán)上的信息，或者通過微測序方法讀出擴(kuò)增核酸分子信息，便可讀出每一個(gè)克隆點(diǎn)的信號，每個(gè)信號點(diǎn)就代表原始目標(biāo)DNA分子的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)信號點(diǎn)數(shù)量計(jì)算出該核酸的數(shù)量。為核酸分子定量分析提供一種新方法，建立快速，準(zhǔn)確，便宜的核酸檢測技術(shù)。
【專利說明】—種基于DNA芯片的數(shù)字化定量檢測核酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于DNA芯片的數(shù)字化定量檢測核酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]一切生命組成都離不開蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)是由核酸編碼的，因此核酸可以說是生命的基礎(chǔ)。核酸(如DNA)包含著所有生物機(jī)體的藍(lán)圖，對核酸序列的研究對生命科學(xué)至關(guān)重要。隨著人類基因組計(jì)劃和各種模式生物基因組計(jì)劃的開展和完成，使人類步入了后基因時(shí)代，對當(dāng)代的生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生了巨大的影響，分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科得到了迅猛的發(fā)展。人們在對核酸的研究過程中，除了關(guān)注它的序列、突變等一些定性的方面以夕卜，還要關(guān)注它的量，因?yàn)樯矬w內(nèi)各種基因mRNA量的變化，會導(dǎo)致翻譯出的蛋白質(zhì)數(shù)量的改變，最終發(fā)生病理變化。故測定mRNA的量可以判斷生理病理變化情況。同樣，在臨床上，通過檢測病毒基因的數(shù)量，可以判斷病毒的復(fù)制情況。而基因表達(dá)研究、藥物篩選、藥效學(xué)評價(jià)和致病基因檢測診斷等也需要對核酸進(jìn)行定量檢測。因此，在分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)中基因的定量檢測具有重要意義。
[0003]傳統(tǒng)的核酸定量方法，如化學(xué)發(fā)光法、分子光譜分析法以及電化學(xué)分析法由于在定量分析上準(zhǔn)確度差而且無法對微量樣本做出分析，已不適應(yīng)如今快速發(fā)展的結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物技術(shù)藥物代謝動力學(xué)等新興生命科學(xué)分支的要求。取而代之的是近年發(fā)展起來的具有高靈敏度、高通量和具有自動化分析能力的核酸定量方法，如:定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、基因表達(dá)系列分析(Serial Analysis ofExpress1n, SAGE)、微陣列技術(shù)(Microarrays)。
[0004]隨著高量測序技術(shù)的應(yīng)用，對核酸定量分析要求越來越高，目前這些核酸檢測技術(shù)，都難以達(dá)到數(shù)字化精確檢測水平。如果用這些相對落后的定量檢測技術(shù)對目前先進(jìn)的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析，明顯不能滿足要求。本發(fā)明的目的就是通過在基片上直接進(jìn)行單分子擴(kuò)增技術(shù)，然后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到對核酸數(shù)字化定量分析。為核酸的定量分析提供一種新方法，建立快速，準(zhǔn)確，便宜的核酸定量分析技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種基于DNA芯片的數(shù)字化定量檢測核酸的方法，該方法利用每個(gè)模板DNA分子經(jīng)過固相擴(kuò)增后都得到了大量的分子，對這些分子的檢測很容易利用目前的熒光探針或微測序技術(shù)檢測，達(dá)到絕對定量檢測DNA目的。
[0006]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]—種基于DNA芯片的數(shù)字化定量檢測核酸的方法，在核酸的數(shù)字化定量檢測是通過在基片上固定有擴(kuò)增引物，通過單個(gè)核酸分子模版擴(kuò)增目標(biāo)核酸，標(biāo)記探針與擴(kuò)增核酸雜交檢測標(biāo)記基團(tuán)上的信息，或者通過微測序方法讀出擴(kuò)增核酸分子信息，統(tǒng)計(jì)信號點(diǎn)數(shù)量計(jì)算出該核酸的數(shù)量。
[0008]本發(fā)明所述的檢測核酸的方法，檢測對像核酸為脫氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA。
[0009]本發(fā)明所述的檢測核酸的方法，所述的基片分成一個(gè)或一個(gè)以上的分區(qū)，每一個(gè)分區(qū)固定有一種引物，各區(qū)域的引物序列相同或不相同，所述的分區(qū)可以采用物理分區(qū)，即把引物固定時(shí)，每一個(gè)區(qū)域都隔開一定距離。
[0010]本發(fā)明所述的檢測核酸的方法，所述的單個(gè)模版核酸分子含有與固定在基片上的一個(gè)引物序列互補(bǔ)配對的一段序列，含有與目標(biāo)核酸上相鄰兩段堿基序列互補(bǔ)配對的兩段序列，含有與標(biāo)記探針上一段堿基序列互補(bǔ)配對的一段序列。
[0011]本發(fā)明所述的檢測核酸的方法，未知單鏈DNA模板位于溶液、平面基片、96或384孔板或修飾的珠子上，未知單鏈DNA模板通過常規(guī)的PCR，滾環(huán)擴(kuò)增、固相擴(kuò)增、橋式擴(kuò)增以及固相酶連接反應(yīng)增加其分析用數(shù)量，擴(kuò)增可以是單重的，即一次擴(kuò)增一個(gè)目的片斷，或者是多重的，即一次擴(kuò)增多個(gè)目的片斷。
[0012]本發(fā)明所述的檢測核酸的方法，定量檢測DNA模板數(shù)量為一個(gè)或多個(gè)同時(shí)進(jìn)行。
[0013]本發(fā)明的有益效果為:1)本發(fā)明的最大優(yōu)點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)對核酸分子的數(shù)字化定量分析，由于模板核酸分子通過引物固定在DNA芯片上進(jìn)行固相擴(kuò)增，得到的分子量大，對這些分子的檢測很容易利用目前的熒光探針或微測序技術(shù)檢測，所以操作簡單、可行性高；2)本發(fā)明的所需要的試劑和儀器均為常用，無需特殊購買，相比較傳統(tǒng)的數(shù)字化定量檢測核酸的方法PCR而言，擴(kuò)增效率特異性高，節(jié)省擴(kuò)增時(shí)間，避免了熱循環(huán)對擴(kuò)增的影響。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是用于連接成環(huán)的DNA序列結(jié)構(gòu)示意圖；
[0015]圖2是圖1所示序列在連接酶體系和模板e ；
[0016]圖3是圖1所示序列在連接酶體系和模板e連接成閉環(huán)結(jié)構(gòu)；
[0017]圖4是固定有引物序列的DNA芯片；
[0018]圖5是DNA聚合酶及其反應(yīng)體系和圖3的閉環(huán)DNA存在下進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增后圖示；
[0019]圖6是突光標(biāo)記探針識別圖示。

【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0021]實(shí)例I熒光探針雜交法檢測疼痛相關(guān)基因BDNF在VTA區(qū)的表達(dá)
[0022]設(shè)計(jì)以下序列:
[0023]Bdnf-P:5’ P-GCGTGCAAATTG CCCTATAGTGAGTCGTATTACTATAGTGTCACCGGCAAAGGATCG3，；
[0024]Gapdh-P:5’ P GTTATCGTGTAGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTTAGTCACTACTGCACAACTGGTT3，；
[0025]IM-primer:5’ amino_TTTTTTTTTTTTTTAATACGACTCACTATAGGG3’ ；
[0026]Probel:5’ cy3_CTATAGTGTCACC3’ ；
[0027]Probe2:5， cy5_GTTAGTCACTACT3，；
[0028]T18:TTTTTTTTTTTTTTTTTT。
[0029]提取小鼠VTA區(qū)總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄引物T18及反轉(zhuǎn)錄試劑盒，把RNA轉(zhuǎn)為cDNA。在連接反應(yīng)體系中加入反轉(zhuǎn)錄好的cDNA，Bdnf-P和Gapdh-P混合在一起進(jìn)行連接反應(yīng)使Bdnf-P和Gapdh-P連接成環(huán)狀單鏈DNA (此時(shí)環(huán)狀單鏈DNA的量就代表著cDNA模板量的多少)；同時(shí)制備醒基修飾的DNA芯片,把氨基修飾的引物IM-primer固定到醒基修飾的DNA芯片上(可以按照成熟的傳統(tǒng)DNA芯片制備方法獲得，也可以通過商業(yè)途徑獲得)；phi29DNA聚合酶(也可以選用Bst DNA聚合酶)以及相應(yīng)的反應(yīng)體系中加入之前連接產(chǎn)物作為模板，在芯片上進(jìn)行單分子固相擴(kuò)增。然后利用Probel和Probe2探針進(jìn)行雜交，在芯片掃描儀或共聚焦顯微鏡下觀察熒光，Probel所攜帶熒光cy3信號代表Bdnf基因在VTA區(qū)的表達(dá)量，Probe2所攜帶熒光cy5信號代表Gapdh基因在VTA區(qū)的表達(dá)量，計(jì)算熒光點(diǎn)數(shù)目即為BDNF和GAPDH基因的表達(dá)量。
[0030]實(shí)例2微測序法檢測疼痛相關(guān)基因BDNF，NNAT以及內(nèi)參基因GAPDH在VTA區(qū)的表達(dá)。
[0031]設(shè)計(jì)以下序列:
[0032]Bdnf-P:5’ P-GCGTGCAAATTG CCCTATAGTGAGTCGTATTACTATAGTGTCACCGGCAAAGGATCG3，；
[0033]Gapdh-P:5’ PGTTATCGTGTAGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTTAGTCACTACTGCACAACTGGTT3，；
[0034]Nnat-P:5’ PGCTGCAGGTGTTCCCTATAGTGAGTCGTATTATTGATCCATGAGACTTCCGCGTGCT3，；
[0035]IM-primer:5’ amino_TTTTTTTTTTTTTTAATACGACTCACTATAGGG3’ ；
[0036]T18 ;TTTTTTTTTTTTTTTTTT.
[0037]Seq-primer:CCCTATAGTGAGTCGTATTA。
[0038]按實(shí)例I方法,把Bdnf-P、Gapdh-P和Nnat-Ρ連接成單鏈DNA環(huán),單分子固相擴(kuò)增后，把Seq-primer與擴(kuò)增模板進(jìn)行雜交，然后把熒光標(biāo)記的cy3_dCTP，Cy5_dGTP，fam-dUTP以及相應(yīng)的聚合酶體系一起進(jìn)行延伸反應(yīng)，在芯片掃描儀或共聚焦顯微鏡下觀察熒光熒光信號，cy3-dCTP, cy5-dGTP, fam-dUTP所對應(yīng)的信號分別為Bdnf, Gapdh和Nnat基因，計(jì)算熒光點(diǎn)數(shù)目即為BDNF、GAPDH和Nnat基因的表達(dá)量。
[0039]實(shí)例3微測序法檢測疼痛相關(guān)基因BDNF，NNAT以及內(nèi)參基因GAPDH在不同處理小鼠VTA區(qū)的表達(dá)。
[0040]與實(shí)例2所用試劑和方法相同，差異之處在于所制備的固定有IM-primer通過阻水筆或其他手段把一張DNA芯片畫分為不同區(qū)域，不同區(qū)域?qū)Σ煌幚順颖具M(jìn)行擴(kuò)增。
[0041]如圖1所示，被檢測核酸分子e，其中a與d互補(bǔ)，b是能與固定在DNA芯片上的引物序列反向互補(bǔ)序列，c是任一段DNA序列，可通過DNA互補(bǔ)配對雜交原則被熒光標(biāo)記探針?biāo)鶛z測或通過微測序列方法檢測，如圖2所示，連接酶體系和模板e，該序列在連接酶體系和模板e存在時(shí)，可以連接成環(huán)(圖3)，在DNA聚合酶及其反應(yīng)體系和圖3的閉環(huán)DNA存在下，在固有芯片(圖4)上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增后如圖5所示，然后利用Probel和Probe2探針進(jìn)行雜交，在芯片掃描儀或共聚焦顯微鏡下觀察熒光，如圖6所示，被熒光標(biāo)記探針識別。
【權(quán)利要求】
1.一種基于DNA芯片的數(shù)字化定量檢測核酸的方法，其特征在于:通過在基片上固定有擴(kuò)增引物，通過單個(gè)核酸分子模版擴(kuò)增目標(biāo)核酸，標(biāo)記探針與擴(kuò)增核酸雜交檢測標(biāo)記基團(tuán)上的信息，或者通過微測序方法讀出擴(kuò)增核酸分子信息，統(tǒng)計(jì)信號點(diǎn)數(shù)量計(jì)算出該核酸的數(shù)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸的方法，其特征在于:該方法檢測對像核酸為脫氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸的方法，其特征在于:所述的基片分成一個(gè)或一個(gè)以上的分區(qū)，每一個(gè)分區(qū)固定有一種引物，各區(qū)域的引物序列相同或不相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸的方法，其特征在于:所述的單個(gè)模版核酸分子含有與固定在基片上的一個(gè)引物序列互補(bǔ)配對的一段序列，含有與目標(biāo)核酸上相鄰兩段堿基序列互補(bǔ)配對的兩段序列，含有與標(biāo)記探針上一段堿基序列互補(bǔ)配對的一段序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸的方法，其特征在于:未知單鏈DNA模板位于載體上，通過PCR，滾環(huán)擴(kuò)增、固相擴(kuò)增、橋式擴(kuò)增以及固相酶連接反應(yīng)增加其分析用數(shù)量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測核酸的方法，其特征在于:所述的載體為溶液、平面基片、孔板或修飾的珠子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸的方法，其特征在于:該方法定量檢測DNA模板數(shù)量為一個(gè)或多個(gè)同時(shí)進(jìn)行。
【文檔編號】C12Q1/68GK104357549SQ201410500400
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】李燕強(qiáng), 韓文燦, 潘志強(qiáng), 夏靜, 許可 申請人:徐州醫(yī)學(xué)院