一種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基含有谷氨酸鈉、植物蛋白胨、L-脯氨酸、NaCl、KH2PO4g、KCl、MgCl2·6H2O、Tris、L-胱氨酸、煙酸、維生素C、還原型谷胱甘肽、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、β環(huán)糊精、或/和瓊脂；培養(yǎng)方法包括：菌種開(kāi)啟、傳二代培養(yǎng)、傳三代培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)。本發(fā)明培養(yǎng)基為無(wú)動(dòng)物源成分、完全避免了因動(dòng)物攜帶病原體給疫苗安全帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，提高了疫苗的安全性，減少疫苗接種的副反應(yīng)；利用此培養(yǎng)基培養(yǎng)百日咳桿菌的方法具有操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)方便、取材容易、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基及其培養(yǎng) 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 百日咳是引起全球嬰幼兒死亡的一個(gè)重要原因。據(jù)WHO報(bào)道，2008年全球百日咳 發(fā)病約1600萬(wàn)例，其中95%發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，約19. 5萬(wàn)兒童因此死亡。在我國(guó)，從近幾 年的全國(guó)法定傳染病疫情通報(bào)中可看出每年都有2000人左右發(fā)病。
[0003] 百日咳是由百日咳鮑特菌（Bordetella pertussis)通過(guò)飛沫從感染者傳播給易 感個(gè)體引起的。數(shù)十年來(lái)，通過(guò)使用質(zhì)量可靠的百日咳疫苗對(duì)嬰幼兒開(kāi)展免疫接種，在全球 范圍內(nèi)成功預(yù)防了嬰幼兒中出現(xiàn)嚴(yán)重的百日咳病例。2008年，全球約82%的嬰幼兒接種了 3針次百日咳疫苗。WHO報(bào)道，2008年全球通過(guò)接種百日咳疫苗，避免了約68. 7萬(wàn)例死亡。
[0004] 我國(guó)的國(guó)家免疫規(guī)劃中已將無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗代替了全細(xì)胞的百白破疫苗。 傳統(tǒng)的全細(xì)胞疫苗由于其較嚴(yán)重的副作用和無(wú)細(xì)胞百白破疫苗快速發(fā)展后展現(xiàn)出的巨大 優(yōu)勢(shì)而逐漸被停用。無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗（APV)自身具有免疫效果好且副反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)。WHO 推薦的無(wú)細(xì)胞疫苗包括PT、FHA (絲狀血凝素）、PRN、FM2和FM3五種抗原，其中，百日咳 毒素（PT)為APV的主要成分。理想的百日咳疫苗應(yīng)是由抗原成分明確、具有良好的免疫原 性及保護(hù)效果而無(wú)毒性作用的百日咳抗原組成。
[0005] 而百日咳疫苗生產(chǎn)廠(chǎng)家一般均采用將百日咳菌種開(kāi)啟到包姜氏培養(yǎng)基（含羊血 成分），再傳活性炭培養(yǎng)基（含牛源的酸水解酪蛋白），最后接種SS培養(yǎng)基（或改良的SS 培養(yǎng)基），改良SS培養(yǎng)基可能會(huì)含有牛源的酸水解酪蛋白。這些在培養(yǎng)基中加入的動(dòng)物血 液成分和動(dòng)物來(lái)源的氮源成分均存在潛在的感染動(dòng)物攜帶病毒的風(fēng)險(xiǎn)，而且成分復(fù)雜，給 疫苗帶來(lái)不安全的風(fēng)險(xiǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng) 基，該培養(yǎng)基為無(wú)動(dòng)物源成分、完全避免了因動(dòng)物攜帶病原體給疫苗安全帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，提高 了疫苗的安全性，減少疫苗接種的副反應(yīng)；
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用此培養(yǎng)基培養(yǎng)百日咳桿菌的方法，該方法具 有操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)方便、取材容易、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基，所 述培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基，其中，固體培養(yǎng)基的配方包括如下組分：相對(duì)于溶劑 用量為IOOOml的量，含有谷氨酸鈉 ：4. 1?10g、植物蛋白胨：3. 0?10g、L-脯氨酸：0? 0· 24g、NaCl :0· 75 ?2. 5g、KH2PO4 :0· 15 ?0· 5g、KCl :0· 06 ?0· 2g、MgCl2 · 6H20 :0· 03 ? 0· 2g、Tris :0· 45 ?6. lg、L-胱氨酸：L 2 ?4. 0g、煙酸：0· 12 ?（λ 4g、維生素 C :0· 12 ? 40g、還原型谷胱甘肽：4· 5 ?15g、FeSO4 · 7H20 :0· 3 ?I. 0g、CaCl2 · 2H20 :0· 6 ?2. 0g、β 環(huán)糊精：〇?l〇〇g、瓊脂：15?20g ;
[0009] 所述培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，配方包括如下組分：相對(duì)于溶劑用量為1000ml的量， 含有谷氨酸鈉：4. 1?10g、植物蛋白胨：3. 0?10g、L-脯氨酸：0?0. 24g、NaCl :0. 75? 2. 5g、KH2PO4 :0· 15 ?0· 5g、KCl :0· 06 ?0· 2g、MgCl2 · 6H20 :0· 03 ?0· 2g、Tris :0· 45 ? 6. lg、L-胱氨酸：1. 2?4. 0g、煙酸：0. 12?0. 4g、維生素 C :0. 12?40g、還原型谷胱甘肽： 4. 5 ?15g、FeSO4 · 7H20 :0· 3 ?I. 0g、CaCl2 · 2H20 :0· 6 ?2. 0g、β 環(huán)糊精：0 ?100g。
[0010] 進(jìn)一步地，所述植物蛋白胨為大米蛋白胨、小麥蛋白胨、大豆蛋白胨的一種或多種 的組合。
[0011] 應(yīng)用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)百日咳桿菌的方法，它包括以下步驟：
[0012] SI.菌種開(kāi)啟：?jiǎn)㈤_(kāi)百日咳工作種子批菌種，接種于固體培養(yǎng)基，35°C?37°C培養(yǎng) 48?96小時(shí)；
[0013] S2.傳二代培養(yǎng)：將步驟Sl開(kāi)啟的百日咳菌種接種于二代搖瓶液體培養(yǎng)基中，起 始OD6c?值為0. 1?0. 4, 35°C?37°C培養(yǎng)20?26小時(shí)，為二代菌種菌液；
[0014] S3.傳三代培養(yǎng)：將二代菌種菌液接種于三代搖瓶液體培養(yǎng)基中，起始0D_值為 0. 1?0. 4,35°C?37°C培養(yǎng)20?26小時(shí)，為三代菌種菌液；
[0015] S4.發(fā)酵罐培養(yǎng)：將三代菌種菌液接種于發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中，通氣攪拌培養(yǎng)，培 養(yǎng)溫度為35°C?37°C，培養(yǎng)時(shí)間為35?45小時(shí)，培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值為7. 2?07. 4, OD6tltl 值為5. 0?10,將發(fā)酵液下罐，通過(guò)分離純化制備百日咳抗原。
[0016] 進(jìn)一步地，步驟S4中所述通氣攪拌的通氣量為10?20L/min，攪拌速度為150? 300rpm〇
[0017] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的百日咳桿菌培養(yǎng)基作為無(wú)動(dòng)物源成分、采用植物 氮源的培養(yǎng)基，能在菌種傳代時(shí)進(jìn)行良好的菌種復(fù)蘇和擴(kuò)增培養(yǎng)，產(chǎn)毒亦可達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)， 因此本發(fā)明培養(yǎng)基完全避免了因動(dòng)物攜帶病原體給疫苗安全帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，提高了疫苗的安 全性，可以減少疫苗接種的副反應(yīng)；本發(fā)明提供的利用此培養(yǎng)基培養(yǎng)百日咳桿菌的方法具 有操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)方便、取材容易、成本低的優(yōu)點(diǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所 述。
[0019] 實(shí)施例1 : 一種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基的配方包括如 下組分：相對(duì)于溶劑用量為1000ml的量，含有谷氨酸鈉：4. lg、大米蛋白胨：3. 0g、NaCl : 0· 75g、KH2PO4 :0· 15g、KCl :0· 06g、MgCl2 ·6Η20 :0· 03g、Tris :0· 45g、L-胱氨酸：1. 2g、煙酸： 0· 12g、維生素 C :0· 12g、還原型谷胱甘肽：4. 5g、FeSO4 · 7H20 :0· 3g、CaCl2 · 2H20 :0· 6g、瓊 脂：15g。
[0020] 實(shí)施例2 :-種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基的配方包括如下 組分：相對(duì)于溶劑用量為1000ml的量，含有谷氨酸鈉：10g、小麥蛋白胨：10g、L-脯氨酸 ： 0· 24g、NaCl :2. 5g、KH2P04 :0· 5g、KCl :0· 2g、MgCl2 ·6Η20 :0· 2g、Tris :6. lg、L-胱氨酸：4. 0g、 煙酸：0. 4g、維生素 C :40g、還原型谷胱甘肽：15g、FeS04 · 7H20 :1. 0g、CaCl2 · 2H20 :2. 0g、β 環(huán)糊精：100g、瓊脂：20g。
[0021] 實(shí)施例3 :-種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基的配方包括如下 組分：相對(duì)于溶劑用量為IOOOml的量，含有谷氨酸鈉：6g、大豆蛋白胨：4. 2g、大米蛋白胨： 4g、L-脯氨酸：0· 15g、NaCl :1. 4g、KH2PO4 :0· 32g、KCl :0· 14g、MgCl2 · 6H20 :0· lg、Tris : 3. 82g、L-胱氨酸：2. 6g、煙酸：0. 27g、維生素 C :25g、還原型谷胱甘肽：8g、FeSO4 · 7H20 : 0· 6g、CaCl2 · 2H20 :01. 3g、β 環(huán)糊精：56g、瓊脂：18g。
[0022] 實(shí)施例4 :一種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的配方包括如下 組分：相對(duì)于溶劑用量為IOOOml的量，含有谷氨酸鈉：4. lg、小麥蛋白胨：5g、大米蛋白胨： 5g、NaCl :2. 5g、KH2P04 :0· 15g、KCl :0· 2g、MgCl2 ·6Η20 :0· 03g、Tris :6. lg、L-胱氨酸：1. 2g、 煙酸：0. 4g、維生素 C :0. 12g、還原型谷胱甘肽：15g、FeSO4 · 7H20 :0. 3g、CaCl2 · 2H20 :2. 0g。
[0023] 實(shí)施例5 :-種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的配方包括如下 組分：相對(duì)于溶劑用量為IOOOml的量，含有谷氨酸鈉：10g、大米蛋白胨：3. 0g、L-脯氨酸： 0· 24g、NaCl :0· 75g、KH2PO4 :0· 5g、KCl :0· 06g、MgCl2 · 6H20 :0· 2g、Tris :0· 45g、L-胱氨酸： 4. 0g、煙酸：0· 12g、維生素 C :40g、還原型谷胱甘肽：4. 5g、FeSO4 · 7H20 :L 0g、CaCl2 · 2H20 : 0. 6g、β 環(huán)糊精：100g。
[0024] 實(shí)施例6 :-種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的配方包括如下 組分：相對(duì)于溶劑用量為IOOOml的量，含有谷氨酸鈉：8g、植物蛋白胨：6. 2g、L-脯氨酸： 0· 15g、NaCl :2g、KH2PO4 :0· 34g、KCl :0· 12g、MgCl2 · 6H20 :0· 08g、Tris :5. 2g、L-胱氨酸： 3. 6g、煙酸：0. 30g、維生素 C :34g、還原型谷胱甘肽：12g、FeSO4 · 7H20 :0. 7g、CaCl2 · 2H20 : 1. 3g、β 環(huán)糊精：80g。
[0025] 實(shí)施例7 :-種培養(yǎng)百日咳桿菌的方法，它包括以下步驟：
[0026] SI.菌種開(kāi)啟：?jiǎn)㈤_(kāi)百日咳工作種子批菌種，接種于實(shí)施例1制備的固體培養(yǎng)基， 35°C°C培養(yǎng)48小時(shí)；
[0027] S2.傳二代培養(yǎng)：將步驟Sl開(kāi)啟的百日咳菌種接種于二代搖瓶液體培養(yǎng)基中，液 體培養(yǎng)基為實(shí)施例4制備的，起始0D_值為0. 1，35°C培養(yǎng)20小時(shí)，為二代菌種菌液；
[0028] S3.傳三代培養(yǎng)：將二代菌種菌液接種于三代搖瓶液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基為 實(shí)施例4制備的，起始0D_值為0. 1，35°C培養(yǎng)20小時(shí)，為三代菌種菌液；
[0029] S4.發(fā)酵罐培養(yǎng)：將三代菌種菌液接種于發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基為實(shí) 施例4制備的，通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時(shí)間為35小時(shí)，培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值為 7. 2,0D_值為5. 0,將發(fā)酵液下罐，通過(guò)分離純化制備百日咳抗原，其中，所述通氣攪拌的通 氣量為l〇L/min，攪拌速度為150rpm。
[0030] 實(shí)施例8 :-種培養(yǎng)百日咳桿菌的方法，它包括以下步驟：
[0031] SI.菌種開(kāi)啟：?jiǎn)㈤_(kāi)百日咳工作種子批菌種，接種于實(shí)施例2制備的固體培養(yǎng)基， 37°C培養(yǎng)96小時(shí)；
[0032] S2.傳二代培養(yǎng)：將步驟Sl開(kāi)啟的百日咳菌種接種于二代搖瓶液體培養(yǎng)基中，液 體培養(yǎng)基為實(shí)施例5制備的，起始0D_值為0. 4, 37°C培養(yǎng)26小時(shí)，為二代菌種菌液；
[0033] S3.傳三代培養(yǎng)：將二代菌種菌液接種于三代搖瓶液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基為 實(shí)施例5制備的，起始0D_值為0. 4, 37°C培養(yǎng)26小時(shí)，為三代菌種菌液；
[0034] S4.發(fā)酵罐培養(yǎng)：將三代菌種菌液接種于發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基為實(shí) 施例5制備的，通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間為45小時(shí)，培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值為 7.4, OD6c?值為10,將發(fā)酵液下罐，通過(guò)分離純化制備百日咳抗原，其中，所述通氣攪拌的通 氣量為20L/min，攪拌速度為300rpm。
[0035] 實(shí)施例9 :一種培養(yǎng)百日咳桿菌的方法，它包括以下步驟：
[0036] SI.菌種開(kāi)啟：?jiǎn)㈤_(kāi)百日咳工作種子批菌種，接種于實(shí)施例3制備的固體培養(yǎng)基， 36°C培養(yǎng)72小時(shí)；
[0037] S2.傳二代培養(yǎng)：將步驟Sl開(kāi)啟的百日咳菌種接種于二代搖瓶液體培養(yǎng)基中，液 體培養(yǎng)基為實(shí)施例6制備的，起始0D_值為0. 3, 36°C培養(yǎng)24小時(shí)，為二代菌種菌液；
[0038] S3.傳三代培養(yǎng)：將二代菌種菌液接種于三代搖瓶液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基為 實(shí)施例6制備的，起始0D_值為0. 2, 36°C培養(yǎng)23小時(shí)，為三代菌種菌液；
[0039] S4.發(fā)酵罐培養(yǎng)：將三代菌種菌液接種于發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基為實(shí) 施例6制備的，通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36°C，培養(yǎng)時(shí)間為42小時(shí)，培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值為 7. 3,0D_值為8,將發(fā)酵液下罐，通過(guò)分離純化制備百日咳抗原，其中，所述通氣攪拌的通氣 量為15L/min，攪拌速度為220rpm。
[0040] 以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明本發(fā)明的有益效果：
[0041] 本發(fā)明培養(yǎng)基與傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)比較實(shí)驗(yàn)
[0042] 1.培養(yǎng)基：本發(fā)明固體或液體培養(yǎng)基，對(duì)照組為常規(guī)包姜氏培養(yǎng)基、活性炭培養(yǎng) 基、SS培養(yǎng)基；
[0043] 2.培養(yǎng)結(jié)果：如表1所不：
[0044] 表1 :本發(fā)明培養(yǎng)基與傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)比較結(jié)果
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基或液體 培養(yǎng)基，其中，固體培養(yǎng)基的配方包括如下組分：相對(duì)于溶劑用量為1000ml的量，含有谷氨 酸鈉 ：4. 1 ?10g、植物蛋白胨：3· 0 ?10g、L-脯氨酸：0 ?0· 24g、NaCl :0· 75 ?2. 5g、KH2P04 : 0· 15 ?0· 5g、KC1 :0· 06 ?0· 2g、MgCl2 · 6H20 :0· 03 ?0· 2g、Tris :0· 45 ?6. lg、L-胱氨 酸：1. 2?4. 0g、煙酸：0· 12?0· 4g、維生素 C :0· 12?40g、還原型谷胱甘肽：4. 5?15g、 FeS04 · 7H20 :0· 3 ?1. 0g、CaCl2 · 2H20 :0· 6 ?2. 0g、β 環(huán)糊精：0 ?100g、瓊脂：15 ?20g ; 所述培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，配方包括如下組分：相對(duì)于溶劑用量為l〇〇〇ml的量，含有 谷氨酸鈉：4. 1?10g、植物蛋白胨：3. 0?10g、L-脯氨酸：0?0. 24g、NaCl :0. 75?2. 5g、 ΚΗ2Ρ04 :0· 15 ?0· 5g、KC1 :0· 06 ?0· 2g、MgCl2 · 6H20 :0· 03 ?0· 2g、Tris :0· 45 ?6. lg、 L_胱氨酸：1. 2?4. 0g、煙酸：0. 12?0. 4g、維生素 C :0. 12?40g、還原型谷胱甘肽：4. 5? 15g、FeS04 · 7H20 :0· 3 ?1. 0g、CaCl2 · 2H20 :0· 6 ?2. 0g、β 環(huán)糊精：0 ?100g。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種百日咳桿菌的無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基，其特征在于，所述植物蛋 白胨為大米蛋白胨、小麥蛋白胨、大豆蛋白胨的一種或多種的組合。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)百日咳桿菌的方法，其特征在于，它包括以下步 驟：
51. 菌種開(kāi)啟：?jiǎn)㈤_(kāi)百日咳工作種子批菌種，接種于固體培養(yǎng)基，35°C?37°C培養(yǎng) 48?96小時(shí)；
52. 傳二代培養(yǎng)：將步驟S1開(kāi)啟的百日咳菌種接種于二代搖瓶液體培養(yǎng)基中，起始 〇D6(?值為0. 1?0. 4, 35°C?37°C培養(yǎng)20?26小時(shí)，為二代菌種菌液；
53. 傳三代培養(yǎng)：將二代菌種菌液接種于三代搖瓶液體培養(yǎng)基中，起始0D_值為 0. 1?0. 4,35°C?37°C培養(yǎng)20?26小時(shí)，為三代菌種菌液；
54. 發(fā)酵罐培養(yǎng)：將三代菌種菌液接種于發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中，通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫 度為35°C?37°C，培養(yǎng)時(shí)間為35?45小時(shí)，培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值為7. 2?7. 4, 0D6(KI值為 5. 0?10,將發(fā)酵液下罐，通過(guò)分離純化制備百日咳抗原。
4. 如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)百日咳桿菌的方法，其特征在于，步驟S4中所述通氣攪拌 的通氣量為10?20L/min，攪拌速度為150?300rpm。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104263687SQ201410515654
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】陳道遠(yuǎn), 朱沖, 陳元芬, 韓煉, 趙丹 申請(qǐng)人:成都?xì)W林生物科技股份有限公司