一種具有串聯(lián)ABRE順式作用元件的RhNAC3啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種具有串聯(lián)ABRE順式作用元件的RhNAC3啟動(dòng)子及其應(yīng)用。所述啟動(dòng)子是一種對脫落酸敏感的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中所包含的ABRE順式作用元件對其下游基因的表達(dá)具有累積效應(yīng)，由此可以利用脫落酸對下游基因表達(dá)進(jìn)行定量控制。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述下游基因是抗逆基因例如RhNAC3，利用植物在逆境脅迫例如干旱脅迫條件下產(chǎn)生的脫落酸來誘導(dǎo)所述抗逆基因地表達(dá)，由此使植物能夠在遇到逆境脅迫條件時(shí)能夠自主地提高抗逆基因的表達(dá)量，從而提高其抗逆性。因此，所述啟動(dòng)子提高植物抗逆性方面具有非常重大的利用價(jià)值。
【專利說明】-種具有串聯(lián)ABRE順式作用元件的RhNAC3啟動(dòng)子及其應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，提供了誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以及利用啟動(dòng)子通過脫 落酸控制植物表達(dá)該啟動(dòng)子下游基因表達(dá)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，特指具有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域的 一類蛋白質(zhì)，其名稱來源于矮牽牛的NAM基因、擬南芥中的ATAFl，2基因和CUC2基因的首 字母。由于此三種基因編碼的蛋白質(zhì)在N-端具有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，后來又發(fā)現(xiàn)具有 此類特征的基因在植物中數(shù)量很多，就把這類基因稱為NAC (NAM，ATAFl，2,和⑶C2)家族基 因，其編碼的蛋白稱為NAC蛋白。
[0003] NAC類蛋白廣泛存在于不同的植物中，而且在同一植物中數(shù)量眾多。NAC類轉(zhuǎn)錄因 子的結(jié)構(gòu)大致分為N-端保守的NAC結(jié)構(gòu)域和多樣的C-端結(jié)構(gòu)域。NAC蛋白還包含N-端 NAC結(jié)構(gòu)域的核定位信號和C-端高度分化的基序，C-端為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域，多數(shù)具有轉(zhuǎn)錄激活 功能，部分NAC類轉(zhuǎn)錄因子在C-端還具有跨膜基序，用于行使跨膜功能。
[0004] 由于NAC家族成員在結(jié)構(gòu)、順式作用元件周圍序列以及其它輔助作用因子等方面 存在的差異，使其在生物活性和生理功能上有所不同，因此NAC轉(zhuǎn)錄因子在多種組織中廣 泛存在，參與眾多代謝過程的調(diào)控。NAC類轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的生長發(fā)育、激素調(diào)控和 環(huán)境脅迫應(yīng)答，是一類調(diào)節(jié)植物體內(nèi)各種生理反應(yīng)的關(guān)鍵因子。NAC轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞分化、 胚和花發(fā)育、側(cè)根形成、次生壁形成、葉片衰老、病原菌防御、應(yīng)對外界不良環(huán)境等方面起著 非常重要的調(diào)控作用。
[0005] 脫落酸（ABA, abscisic acid)作為一個(gè)脅迫信號植物激素，能夠被失水脅迫所誘 導(dǎo)，在植物整體水平到細(xì)胞水平的調(diào)節(jié)中起到一個(gè)非常重要的作用。ABA的功能多樣，廣泛 參與植物生長和發(fā)育的許多方面，如胚胎成熟、種子發(fā)育、種子萌發(fā)、氣孔開度調(diào)節(jié)和激活 許多脅迫響應(yīng)基因，參與植物開花，ABA還可以調(diào)節(jié)蒸騰效率控制萎蔫，進(jìn)而減少植物水分 流失。在失水情況下，大量脅迫相關(guān)基因受ABA所調(diào)節(jié)。盡管ABA的功能多樣，在參與失水 脅迫方面主要表現(xiàn)在通過促進(jìn)氣孔關(guān)閉而保存植物體內(nèi)的水分，同時(shí)它還調(diào)節(jié)大量失水脅 迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)從而使植物對失水脅迫作出響應(yīng)。目前，ABA在分子水平上的作用 機(jī)制仍未清楚。
[0006] 本發(fā)明人前期研究發(fā)現(xiàn)，RhNAC3是月季中脅迫相關(guān)NAC(stress-associated NAC， SNAC)類轉(zhuǎn)錄因子，其定位在細(xì)胞核內(nèi)并具有轉(zhuǎn)錄激活特性，RhNAC3的轉(zhuǎn)錄水平受失水脅 迫等非生物脅迫處理所誘導(dǎo)并能夠結(jié)合CAC[G/T]順式作用元件。月季花瓣中沉默RhNAC3 后降低了花瓣的失水脅迫耐性。擬南芥中異源過表達(dá)RhNAC3提高了植株的失水脅迫耐 受力。轉(zhuǎn)錄因子RhNAC3通過調(diào)節(jié)滲透脅迫類基因的表達(dá)參與失水脅迫耐性（Jiang X， Zhang C，LiiP，Jiang G，Liu X，Dai F and Gao J. 2014. RhNAC3, a stress-associated NAC transcription factor， has a role in dehydration tolerance through regulating osmotic stress-related genes in rose petals.Plant biotechnology journal,12(I)： 38-48)。RhNAC3 R經(jīng)由本發(fā)明人公開，其GenBank登錄號為TK617768. I (可參見http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/nucest/.TK617768)。雖然已有工作對 RhNAC3 蛋白進(jìn)行了研究，但 是本領(lǐng)域?qū)hNAC3蛋白的調(diào)控機(jī)制仍不明晰，特別是不清楚其與植物激素 ABA的關(guān)系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是通過分子生物學(xué)手段來使植物具有有利的生物學(xué)性狀，尤其是使 植物具有有利的耐受逆境脅迫的能力，即具有有利的抗逆性。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案 來實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 1、一種NAC蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動(dòng)子，其中，所述啟動(dòng)子與SEQ No. 1具有至少 50%，例如60%、70%、80%、90%、91%、92%、95%、97%、98%、99%或100%的同一性；優(yōu) 選的是，所述核苷酸序列包含選自由acgtg、acgtgc、acgtgg、acgtgc和acgtgtc組成的組 中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種順式作用元件。
[0009] 2、用于對技術(shù)方案1所述的啟動(dòng)子進(jìn)行克隆、檢測、定位、過表達(dá)或沉默的引物 對，其中，所述引物對選自由引物對SEQ NO. 2和15、SEQ NO. 2和16、SEQ NO. 2和17、SEQ NO. 2 和 18、SEQ NO. 3 和 19、SEQ NO. 4 和 19、SEQ NO. 5 和 6、引物對 SEQ NO. 7 和 8、引物對 SEQ NO. 9 和 12、引物對 SEQ NO. 10 和 12、引物對 SEQ NO. 11 和 12、引物對 SEQ NO. 13 和 14 組成的組。
[0010] 3、一種克隆技術(shù)方案1所述的啟動(dòng)子的方法，其中，所述方法使用選自由引物對 SEQ NO. 2 和 15、SEQ NO. 2 和 16、SEQ NO. 2 和 17、SEQ NO. 2 和 18、SEQ NO. 3 和 19、SEQ NO. 4 和19組成的組中的至少一個(gè)引物進(jìn)行。
[0011] 4、一種克隆或檢測技術(shù)方案1所述的啟動(dòng)子的方法，其中，所述方法包括使用引 物對SEQ No. 5和6、和/或引物對SEQ NO. 7和8進(jìn)行；優(yōu)選的是，所述檢測通過⑶S活性 檢測進(jìn)行，并且使用引物對SEQ NO. 7和8進(jìn)行。
[0012] 5、一種檢測植物對ABA的敏感性的方法，所述方法包括對技術(shù)方案1所述的啟動(dòng) 子進(jìn)行檢測；優(yōu)選的是，所述方法包括對所述啟動(dòng)子的ABA順式作用元件的存在和/或數(shù)量 進(jìn)行檢測。
[0013] 6、一種提高植物耐受逆境脅迫能力的方法，所述方法包括利用技術(shù)方案1所述的 啟動(dòng)子進(jìn)行；優(yōu)選的是，所述方法通過改變植物對ABA的敏感性來實(shí)現(xiàn)；另外優(yōu)選的是，所 述方法通過提高植物對ABA的敏感性來實(shí)現(xiàn)；另外優(yōu)選的是，所述逆境脅迫導(dǎo)致所述植物 的ABA生成量增加；另外優(yōu)選的是，所述逆境脅迫選自由低溫逆境脅迫、高溫逆境脅迫、干 旱逆境脅迫、水澇逆境脅迫、高鹽逆境脅迫、生物脅迫、機(jī)械傷害脅迫組成的組。
[0014] 7、如技術(shù)方案6所述的方法，其中，所述方法通過將所述啟動(dòng)子與耐受逆境脅迫 有關(guān)的基因的融合表達(dá)來實(shí)現(xiàn)；優(yōu)選的是，所述耐受逆境脅迫有關(guān)的基因?yàn)镽hNAC3。
[0015] 8、根據(jù)技術(shù)方案6或7所述的方法，其中，所述融合表達(dá)利用外部施加的外源性 ABA或者植物本身產(chǎn)生的內(nèi)源性ABA來誘導(dǎo)；進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述融合表達(dá)利用植物本身 產(chǎn)生的內(nèi)源性ABA來誘導(dǎo)。
[0016] 9、RhNAC3基因在提高植物耐受脅迫能力中的應(yīng)用；優(yōu)選的是，所述應(yīng)用通過將所 述RhNAC3基因與技術(shù)方案1所述的啟動(dòng)子的融合表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
[0017] 10、含有技術(shù)方案1所述的啟動(dòng)子的載體；優(yōu)選的是，所述載體為質(zhì)粒載體、噬菌 體載體或病毒載體；另外有選的是，所述載體為克隆載體或表達(dá)載體。
[0018] 本發(fā)明所提供的包含串聯(lián)ABRE順式作用元件的RhNAC3啟動(dòng)子序列參與對植物干 旱脅迫耐性和ABA敏感性的調(diào)控。例如，在植物中該啟動(dòng)子表達(dá)具有廣泛性，對ABA的響應(yīng) 表現(xiàn)出累計(jì)效應(yīng)；在植物中過表達(dá)該基因在種子萌發(fā)、初生根生長和氣孔開度方面表現(xiàn)出 對ABA超敏；在植物中能夠調(diào)控ABA響應(yīng)基因的表達(dá)。這將使NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白RhNAC3在 參與植物非生物脅迫耐性提高植物對ABA敏感性上具有獨(dú)特的優(yōu)勢。所述RhNAC3啟動(dòng)子 為誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，可以與不同功能類型的基因（抗旱、抗寒、耐鹽堿）相融合，并調(diào)控其在植 物體內(nèi)的表達(dá)，在ABA處理下可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對逆境脅迫的抵抗， RhNAC3啟動(dòng)子區(qū)域中含有串聯(lián)的ABRE順式作用元件，不同缺失片段包含不同數(shù)目ABRE元 件的缺失啟動(dòng)子可以定量調(diào)控所啟動(dòng)基因的表達(dá)。所述RhNAC3啟動(dòng)子對與參與調(diào)控植物 對非生物脅迫的研究具有重要的意義，可為利用基因工程手段培育性狀優(yōu)良的植物提供了 遺傳資源儲(chǔ)備。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1顯示了 RhNAC3啟動(dòng)子重要順式作用元件示意和表達(dá)特性。其中，A圖：RhNAC3 啟動(dòng)子序列示意圖。不同矩形框展示了 RhNAC3啟動(dòng)子中與逆境脅迫相關(guān)的W-box、ABRE、 MYC、MYB、CBF等重要的脅迫響應(yīng)順式作用元件。圖A下半部分的表格中的數(shù)字表示啟動(dòng)子 序列中ABRE元件的核苷酸序列類型和具體位置，在RhNAC3啟動(dòng)子區(qū)域中，在-484 (核苷酸 acgtg)、_516(核苷酸 acgtgc)、_600(核苷酸 acgtgg)、_914(核苷酸 acgtgc)和-1134(核 苷酸&〇8七8"）處為481?順式作用元件位置。由4圖可知1^嫩03具有多個(gè)串聯(lián)的481?(八8八 順式作用元件），這RhNAC3在植物應(yīng)對脅迫響應(yīng)途徑中發(fā)揮作用的研究結(jié)果吻合，尤其是 在ABA依賴的調(diào)控途徑中。B圖：RhNAC3在擬南芥中的組織化學(xué)定位。將RhNAC3啟動(dòng)子驅(qū) 動(dòng)的GUS基因的表達(dá)在5d擬南芥實(shí)生苗（a)，14d實(shí)生苗（b)，幼嫩葉片（c)，幼嫩葉片氣孔 (d)，花（e)，柱頭（f)，花瓣（g)，花序頂端莖（h)，成熟果莢（i)，未成熟種子（k)的表達(dá)情 況，圖上的標(biāo)尺為1mm。由B圖可知：RhNAC3基因在植物生長發(fā)育的各個(gè)階段都有表達(dá)，并 且在各個(gè)部分廣泛表達(dá)，尤其在葉片保衛(wèi)細(xì)胞（圖lB-d)和一些維管組織（圖lB-b和c) 中有更強(qiáng)烈的表達(dá)。
[0020] 圖2顯示了不同片段RhNAC3啟動(dòng)子缺失分析和ABA劑量效應(yīng)。A圖：RhNAC3啟動(dòng) 子缺失片段在擬南芥原生質(zhì)體中的GUS活性分析。A圖上部分示意性地顯示RhNAC3啟動(dòng)子 序列中不同的ABRE順式作用元件的分布，A圖的下部分為3個(gè)不同的重組質(zhì)粒（N0，N1，N2) 和空載對照（NC)的相對⑶S活性，⑶S活性在孵育后24h后檢測，其中，NO (-1447?-160bp) 包含有圖1的A圖所示的所有5個(gè)串聯(lián)的ABRE順式作用元件，NI (-707?-160bp)包含有圖 1的A圖所示的其中3個(gè)串聯(lián)的ABRE順式作用元件，N2 (-377?-160bp)不含有圖1的A圖 所示的ABRE順式作用元件，NC位空載體對照；與NC相比較，包含有5個(gè)串聯(lián)的ABRE順式作 用元件的NO (-1447?-160bp)與NC相比較差異極顯著（雙星號，P < 0. 01)，包含有3個(gè)串 聯(lián)的ABRE順式作用元件的NI (-707?-160bp)與NC相比較差異顯著（單星號，P <0.05); B圖：外源ABA對包含RhNAC3啟動(dòng)子缺失重組體的擬南芥原生質(zhì)體中⑶S活性的影響。不 同缺失片段的RhNAC3啟動(dòng)子（N0，N1，N2)和空載對照（NC)被轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體，其中， NO, NI, N2和NC如上所述。采用O μ M和10 μ M ABA處理原生質(zhì)體2h ;孵育24h之后檢測 ⑶S活性。由圖B可知，與對照NC相比較，在未加 ABA時(shí)，不同片段之間⑶S活性無顯著性 差異，當(dāng)施加10 μ MABA處理后，含有5個(gè)串聯(lián)的ABRE順式作用元件的NO (-1447?-160bp) 與NC相比較達(dá)到極顯著差異（雙星號，P值< 0. 01)，含有3個(gè)串聯(lián)的ABRE順式作用元件 的NI (-707?-160bp)與NC相比較達(dá)到顯著差異（單星號，P值<0.05)。C圖：RhNAC3啟 動(dòng)子對ABA的響應(yīng)。MS培養(yǎng)基生長9天的轉(zhuǎn)基因?qū)嵣甾D(zhuǎn)入有10 μ M ABA的MS培養(yǎng)基生 長4d，然后進(jìn)行⑶S染色。由圖可知，ABA強(qiáng)烈的誘導(dǎo)了 RhNAC3轉(zhuǎn)錄活性的表達(dá)。從上可 知：RhNAC3啟動(dòng)子中ABREs元件對RhNAC3的轉(zhuǎn)錄活性有一個(gè)累積效應(yīng)（圖2A)，并且ABA 處理可以更加明顯誘導(dǎo)RhNAC3啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性（圖2B)。ABA處理可以加強(qiáng)RhNAC3啟 動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性（圖2C)。
[0021] 圖3顯示了 RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系提高了對ABA的敏感性。A圖：對照（WT和VC)和 RhNAC3轉(zhuǎn)基因植株（0E#3,6，12)種子的萌發(fā)率。3個(gè)RhNAC3過表達(dá)株系（0E#3,6，12)和 對照（WT，VC)種子分別播種在含有0,0. 2,0. 4 μ M ABA的MS培養(yǎng)基中。圖中所示為所播植 株5d后的生長情況，萌發(fā)率為在生長7d時(shí)統(tǒng)計(jì)。B圖：RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0Ε#3,6，12)和 對照（WT，VC)的種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)。雙星號顯示為在0.2和0.4 μ MABA RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系 (0E#3,6,12)與對照（VC)相比較差異極顯著（P值< 0. 01)。誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤（η = 3)。B 圖：對照和轉(zhuǎn)基因植株中ABA劑量對主根長度和側(cè)根數(shù)目的影響。C圖：對照（WT和VC)和 RhNAC3轉(zhuǎn)基因植株（0Ε#3,6，12)根生長表型。7d大的對照實(shí)生苗（WT，VC)和3個(gè)RhNAC3 轉(zhuǎn)基因株系（〇E#3, 0E#6, 0E#12)分別被轉(zhuǎn)移到分別含有0, 5,10和30 μ M ABA的MS培養(yǎng) 基中，IOd之后統(tǒng)計(jì)根形態(tài)表型，由圖可知，在分別以0和5μ M ABA處理時(shí)，RhNAC3轉(zhuǎn)基因 株系（0E#3,6,12)和對照（WT，VC)根部表型一致，10 μ M和30 μ M ABA的MS培養(yǎng)基中，與 對照（VC)相比較，RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0Ε#3,6,12)的初生根根長更短，側(cè)根數(shù)目更少；D 圖：RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0Ε#3,6，12)和對照（WT，VC)初生根主根長分析。RhNAC3轉(zhuǎn)基因 株系（0E#3,6，12)和對照（WT，VC)植株生長IOd之后進(jìn)行初生根主根長長度統(tǒng)計(jì)，hNAC3 轉(zhuǎn)基因株系（〇E#3,6，12)和對照（WT，VC)植株分別用15棵苗子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；E圖：RhNAC3轉(zhuǎn) 基因株系（〇E#3,6，12)和對照（WT，VC)側(cè)根數(shù)量分析，RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0E#3,6，12)和 對照（WT，VC)植株生長IOd之后側(cè)根數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析，RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0E#3,6，12)和對 照（WT，VC)植株分別用15棵苗子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。上述結(jié)果表明：擬南芥種子萌發(fā)率隨ABA濃 度的升高有所下降，而在同水平ABA (0. 2和0. 4 μ M ΑΒΑ)處理下，與對照（VC)植株相比較， RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0Ε#3,6，12)植株種子萌發(fā)率降低更為顯著（圖3Α和Β)，說明在轉(zhuǎn)基 因擬南芥中，RhNAC3過表達(dá)導(dǎo)致種子萌發(fā)階段的ABA超敏感性。在幼苗根部表型上，與對 照（VC)植株相比較，RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0E#3,6,12)植株在初生根長度和側(cè)根數(shù)目上均 出現(xiàn)降低趨勢，RhNAC3過表達(dá)在根部生長階段也對ABA表現(xiàn)敏感（圖3C、D和E)。
[0022] 圖4顯示了 ABA和干旱處理下擬南芥中RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系的氣孔開度情況。A圖： ABA處理下對照（WT，VC)和RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0E#3,6，12)葉片氣孔開度，3周苗齡的2 個(gè)對照（WT，VC)和3個(gè)RhNAC3的轉(zhuǎn)基因株系（0E#3,6，12)的成熟葉片分別用氣孔緩沖液 (0 μ M)和10 μ M ABA (氣孔緩沖液基礎(chǔ)上添加10 μ M ΑΒΑ)處理2h。選取遠(yuǎn)軸端的表皮細(xì) 胞氣孔用光學(xué)顯微鏡（Olympus BX-51)觀測拍照。RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0E#3,6，12)和對照 (WT，VC)植株，每個(gè)株系樣本至少用20個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞測量氣孔開度（寬度/長度）。雙星號 表示在10 μ M ABA處理下過表達(dá)株系與對照相比差異極顯著（P < 0. 01)。標(biāo)尺=10 μ m。 B圖：干旱處理下對照（WT，VC)和RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（OE#3,6，12)葉片氣孔開度。3周苗 嶺的對照（WT、VC)和RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（OE#3,6，12)分別在正常條件生長和干旱處理?xiàng)l 件下生長l〇d，分別取遠(yuǎn)軸端的表皮細(xì)胞氣孔用光學(xué)顯微鏡（Olympus BX-51)拍照后測量， 每個(gè)株系用至少20個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞測量氣孔開度（寬度/長度）。單星號表示在IOd干旱處 理下過表達(dá)株系（〇E#3)與對照（VC)相比差異顯著（P < 0. 05)，雙星號表示在IOd干旱處 理下過表達(dá)株系（〇E#6,12)與對照（VC)相比差異極顯著（P< 0.01)。標(biāo)尺=10 μ m。上 述結(jié)果表明：ABA可以促進(jìn)氣孔關(guān)閉，并且可極大地促進(jìn)RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系的氣孔關(guān)閉，使 ABA處理下RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0E#3,6，12)氣孔開度更小，氣孔關(guān)閉更為迅速（圖4A) ;10d 干旱處理可以誘導(dǎo)RhNAC3轉(zhuǎn)基因植物葉片氣孔開度相對于對照（VC)明顯減小（圖4B)。 RhNAC3以依賴ABA的方式參與植物對水分脅迫的響應(yīng)。
[0023] 圖5顯示了 RhNAC3可以正調(diào)控ABA響應(yīng)基因的表達(dá)。A圖：RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系 (0E#3，6，12)中ABA響應(yīng)基因基因的表達(dá)模式。已經(jīng)明確，RD29A、RD29B、RD20、RD26、C0R47、 C0R15A、KIN2、ABII、ABI3、ABF4、ABA3分別為擬南芥中ABA響應(yīng)基因，長日照（16h光照/8h 黑暗）條件下，取3周大的VC和和RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0E#3,6,12)生長的地上部分放在 實(shí)驗(yàn)臺(tái)上（23-25°C，40-50%相對濕度）干旱3h并進(jìn)行取樣。Trizol法提取總RNA后并反 轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用qRT-PCR法分析11個(gè)ABA響應(yīng)基因的在干旱脅迫后的基因表達(dá)量的相對 誘導(dǎo)倍數(shù)，誘導(dǎo)倍數(shù)大于2視為上調(diào)表達(dá)。圖中數(shù)值代表干旱與對照條件下，每個(gè)基因的誘 導(dǎo)倍數(shù)用3個(gè)株系的生物學(xué)重復(fù)的平均值表示，用內(nèi)標(biāo)基因 Actin2作標(biāo)準(zhǔn)化。B圖：月季 中與擬南芥高度同源的ABA響應(yīng)類基因。RU25535、RU07831、RU01455、RU06450、RU04740、 RU22946、RU24499、RU03861、RU26868分別為月季中與擬南芥ABA響應(yīng)基因的同源基因 。C 圖：月季中ABA響應(yīng)基因在正常植株（TRV)和RhNAC3沉默花瓣中（TRV-RhNAC3)的表達(dá)。 不同基因的數(shù)據(jù)代表TRV-RhNAC3相對于TRV的每個(gè)基因的倍數(shù)變化，變化倍數(shù)小于0. 66 視為表達(dá)受到抑制，RhUbil為內(nèi)標(biāo)作為標(biāo)準(zhǔn)化。上述結(jié)果表明：在擬南芥中，RhNAC3正向 調(diào)控了 ABA響應(yīng)基因的表達(dá)（圖5A)，在RhNAC3沉默月季花瓣中，ABA信號及下游基因的表 達(dá)受到明顯的抑制（圖5B和C)，這些結(jié)果表明RhNAC3正向調(diào)節(jié)ABA響應(yīng)基因的表達(dá)參與 ABA信號途徑。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 本發(fā)明在提供了一種NAC蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動(dòng)子，其中，所述啟動(dòng)子與SEQ No. 1 具有至少 50%，例如 60%、70 %、80 %、90%、91 %、92%、95 %、97 %、98%、99 % 或 100%的同一'丨生；優(yōu)選的是，所述核苷酸序列包含選自由acgtg、acgtgc、acgtgg、acgtgc和 acgtgtc組成的組中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種順式作用元件。
[0025] 本發(fā)明人通過對所述啟動(dòng)子進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，所述啟動(dòng)子是一種誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子，具有多種不同類型的逆境脅迫順式作用元件，特別是包含有串聯(lián)的ABRE順式作用元 件，能夠受到例如ABA等反式作用因子的作用，從而誘導(dǎo)其下游基因例如ABA響應(yīng)基因的表 達(dá)。這使得該啟動(dòng)子在植物的基因工程中具有極其重要的利用價(jià)值。
[0026] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明可以利用該啟動(dòng)子的可誘導(dǎo)特性，通過對該啟動(dòng)子進(jìn) 行遺傳修飾，從而促進(jìn)或抑制該啟動(dòng)子對其下游基因表達(dá)的誘導(dǎo)，由此促進(jìn)或抑制下游基 因的表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，可以通過例如對某一有害植物中與該啟動(dòng)子同源的內(nèi)源性 啟動(dòng)子進(jìn)行修飾，從而抑制該啟動(dòng)子的下游基因的表達(dá)，由此影響有害植物的正常生長。在 另外一些實(shí)施方式中，可以通過對某一植物中的與該啟動(dòng)子同樣的內(nèi)源性啟動(dòng)子進(jìn)行遺傳 修飾，或者通過遺傳工程手段例如轉(zhuǎn)基因技術(shù)，轉(zhuǎn)入該啟動(dòng)子或者轉(zhuǎn)入該啟動(dòng)子與所要表 達(dá)的目標(biāo)蛋白的基因（即下游基因）的融合基因，從而促進(jìn)或者過表達(dá)下游基因，由此可控 地生成或者促進(jìn)生成由下游基因編碼的有用蛋白。
[0027] 在一些實(shí)施方式中，所述下游基因可以是編碼任何有用蛋白的基因。例如所述有 用蛋白可以能夠用于藥物、營養(yǎng)、保健等用途的蛋白。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述下游 基因是與植物耐受逆境脅迫能力有關(guān)的基因。所述逆境脅迫選自由低溫逆境脅迫、高溫逆 境脅迫、干旱逆境脅迫、水澇逆境脅迫、高鹽逆境脅迫、生物脅迫、機(jī)械傷害脅迫組成的組。
[0028] 本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，所述啟動(dòng)子是一種ABA敏感性的啟動(dòng)子，能夠受到ABA的作用而 影響其下游基因的表達(dá)。
[0029] 于是，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明利用ABA作用于所述啟動(dòng)子從而控制該啟動(dòng)子 下游基因的表達(dá)。如上文所述，ABA是一種非常重要的植物激素，廣泛參與植物生長和發(fā)育 的許多方面，如胚胎成熟、種子發(fā)育、種子萌發(fā)、氣孔開度調(diào)節(jié)和激活許多脅迫響應(yīng)基因，參 與植物開花，ABA還可以調(diào)節(jié)蒸騰效率控制萎蔫，進(jìn)而減少植物水分流失。另外，本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)當(dāng)了解的是，植物在逆境脅迫的作用下常常會(huì)產(chǎn)生比在非逆境條件下多得多的ΑΒΑ。 這些逆境脅迫包括例如低溫逆境脅迫、高溫逆境脅迫、干旱逆境脅迫、水澇逆境脅迫、高鹽 逆境脅迫、生物脅迫、機(jī)械傷害脅迫等。
[0030] 于是，本發(fā)明提供了一種提高植物耐受逆境脅迫能力的方法，所述方法通過融合 表達(dá)所述啟動(dòng)子與抗逆蛋白基因來進(jìn)行。當(dāng)植物遇到逆境脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生ABA，該ABA作 用于植物體內(nèi)的所述啟動(dòng)子，由此誘導(dǎo)抗逆蛋白基因的表達(dá)，從而提高植物的抗逆性，這是 非常有利的。當(dāng)植物處在非逆境條件下，植物沒有產(chǎn)生或者只是產(chǎn)生低水平的ABA，因此沒 有或極少有ABA作用于所述啟動(dòng)子，因此植物不會(huì)誘導(dǎo)表達(dá)或者極少誘導(dǎo)表達(dá)抗逆蛋白基 因。當(dāng)植物處在逆境脅迫的條件下時(shí)，植物會(huì)產(chǎn)生比在非逆境脅迫條件下更多的ABA，從而 誘導(dǎo)表達(dá)抗逆蛋白基因，從而使植物可以在遇到逆境脅迫時(shí)能夠非常聰明地自主提高其抗 逆性，無需采用人工措施來防止植物在逆境脅迫條件下無法正常生長。
[0031] 當(dāng)然，如果植物在逆境條件下所產(chǎn)生的ABA的量不足以充分地作用于所述啟動(dòng) 子，從而無法誘導(dǎo)足量的抗逆蛋白基因以使植物能夠具有預(yù)期水平的抗逆性，也可以通過 人為施用ABA來提高植物的抗逆性。
[0032] 另外，由于所述啟動(dòng)子對ABA敏感，因此，可以利用ABA控制帶有與所述啟動(dòng)子同 源的內(nèi)源性啟動(dòng)子或者轉(zhuǎn)入由所述啟動(dòng)子或啟動(dòng)子與下游基因的植物控制下游基因的表 達(dá)，所述下游基因可以是任何有用的基因，例如抗逆基因，所述抗逆基因例如可以為RhNAC 基因。根據(jù)本申請所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員在知道所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，尤其 是對ABA敏感的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的情況下，完全有能力將有用的基因作為下游基因與所述啟 動(dòng)子融合并轉(zhuǎn)入到植物中，從而利用ABA來控制轉(zhuǎn)基因植物中有用基因的表達(dá)。因此，此處 所述有用基因絕非限于RhNAC基因。另外，所述ABA可以是植物本身產(chǎn)生的內(nèi)源性ABA，也 可以是外部施加的外源性ΑΒΑ。優(yōu)選的是，所述ABA是內(nèi)源性ΑΒΑ。
[0033] 另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，所述啟動(dòng)子中在植物中該啟動(dòng)子表達(dá)具有廣泛性，并且尤 為重要的是，所述啟動(dòng)包含多種串聯(lián)ABRE順式作用元件，這些順式作用元件對ABA的響應(yīng) 表現(xiàn)出累計(jì)效應(yīng)。尤其可以通過遺傳修飾手段控制所述順式作用元件的種類和數(shù)量，量化 地或者精確地控制所述啟動(dòng)子下游基因的表達(dá)。
[0034] 本發(fā)明還提供了用于所述啟動(dòng)子進(jìn)行克隆、檢測、定位、過表達(dá)或沉默的引物對， 其中，所述引物對選自由引物對SEQ NO. 2和15、SEQ NO. 2和16、SEQ NO. 2和17、SEQ NO. 2 和 18、SEQ NO. 3 和 19、SEQ NO. 4 和 19、SEQ NO. 5 和 6、引物對 SEQ NO. 7 和 8、引物對 SEQ NO. 9和12、引物對SEQ NO. 10和12、引物對SEQ NO. 11和12、引物對SEQ NO. 13和14組成 的組。
[0035] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了一種克隆所述的啟動(dòng)子的方法，其中，所述方 法使用選自由引物對 SEQ NO. 2 和 15、SEQ NO. 2 和 16、SEQ NO. 2 和 17、SEQ NO. 2 和 18、SEQ NO. 4和19組成的組中的至少一個(gè)引物進(jìn)行。所述方法包括如下步驟：以植物DNA為模板， 通過 PCR 由引物對 SEQ NO. 2 和 15、SEQ NO. 2 和 16、SEQ NO. 2 和 17、SEQ NO. 2 和 18 中的 任意一對引物獲得的第一產(chǎn)物；以所述第一產(chǎn)物為模板，通過PCR由所述引物對SEQ NO. 3 和19獲得第二產(chǎn)物；以及以所述第二產(chǎn)物為模板，通過PCR由所述引物對SEQ NO. 4和19 克隆所述啟動(dòng)子。在另外一些實(shí)施方式中，所述方法以植物DNA作為模板由所述引物對SEQ NO. 5和6直接克隆得到所述啟動(dòng)子。
[0036] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種克隆或檢測技術(shù)方案1所述的啟動(dòng)子的方 法，其中，所述方法包括使用引物對SEQ NO. 5和6、和/或引物對SEQ NO. 7和8進(jìn)行；優(yōu)選 的是，所述檢測通過⑶S活性檢測進(jìn)行，并且使用引物對SEQN0. 7和8進(jìn)行。
[0037] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了一種檢測植物對ABA的敏感性的方法，所述 方法包括對技術(shù)方案1所述的啟動(dòng)子進(jìn)行檢測；優(yōu)選的是，所述方法包括對所述啟動(dòng)子的 ABA順式作用元件的存在和/或數(shù)量進(jìn)行檢測。
[0038] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種提高植物耐受逆境脅迫能力的方法，所述 方法包括利用技術(shù)方案1所述的啟動(dòng)子進(jìn)行；優(yōu)選的是，所述方法通過改變植物對ABA的 敏感性來實(shí)現(xiàn)；另外優(yōu)選的是，所述方法通過提高植物對ABA的敏感性來實(shí)現(xiàn)；另外優(yōu)選的 是，所述逆境脅迫導(dǎo)致所述植物的ABA生成量增加；另外優(yōu)選的是，所述逆境脅迫選自由低 溫逆境脅迫、高溫逆境脅迫、干旱逆境脅迫、水澇逆境脅迫、高鹽逆境脅迫、生物脅迫、機(jī)械 傷害脅迫組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述方法通過將所述啟動(dòng)子與耐受逆境脅迫有關(guān) 的基因的融合表達(dá)來實(shí)現(xiàn)；優(yōu)選的是，所述耐受逆境脅迫有關(guān)的基因?yàn)镽hNAC3。在一些實(shí) 施方式中，所述融合表達(dá)利用外部施加的外源性ABA或者植物本身產(chǎn)生的內(nèi)源性ABA來誘 導(dǎo)；進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述融合表達(dá)利用植物本身產(chǎn)生的內(nèi)源性ABA來誘導(dǎo)。
[0039] 本發(fā)明人還驚訝地發(fā)現(xiàn)，RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系提高了對ABA的敏感性。ABA和干旱 處理下RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系的氣孔關(guān)閉更迅速，從而降低了植物受到干旱脅迫時(shí)的失水速 度和失水量，由此提高了植物耐受失水脅迫的能力。植物在眾多逆境脅迫中都會(huì)產(chǎn)生ABA， 而RhNAC3的上述啟動(dòng)子對ABA敏感。因此，本發(fā)明還提供了 RhNAC3在提高植物耐受逆境 脅迫能力中的應(yīng)用，尤其是提高植物耐受失水脅迫能力中的應(yīng)用。優(yōu)選的是，所述應(yīng)用通過 將所述RhNAC3基因與所述的啟動(dòng)子的融合表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
[0040] 另外，本發(fā)明還提供了含有技術(shù)方案1所述的啟動(dòng)子的載體；優(yōu)選的是，所述載體 為質(zhì)粒載體、噬菌體載體或病毒載體；另外有選的是，所述載體為克隆載體或表達(dá)載體。
[0041] 下文將通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實(shí)施例僅僅 出于說明目的，不應(yīng)被理解為是對本發(fā)明請求保護(hù)的范圍的限制。
[0042] 實(shí)施例
[0043] 為了研究RhNAC3的調(diào)控機(jī)制，對RhNAC3上游調(diào)節(jié)序列進(jìn)行分離，提取了月季基因 組 DNA，利用基因組 DNA，以 High-tail PCR(Liu Y，Chen Y(2007)High_efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. BioTechniques43 :649-656.)方法經(jīng)過3輪反向PCR獲得RhNAC3的啟動(dòng)子片段，并采用生 物信息學(xué)的方法對獲得的啟動(dòng)子片段進(jìn)行分析，以明確其中所包含的重要順式作用元件。
[0044] 1 · RhNAC3啟動(dòng)子克隆
[0045] 試驗(yàn)材料月季切花（Rosa hybrid L.)品種'薩蔓莎'（'Samantha'），于旺盛營養(yǎng) 生長期采收健康月季的幼嫩莖葉和處于商業(yè)采收級別為2級（處于花蕾時(shí)期）的花枝，立 即插于水中。將芽尖和幼葉去除葉柄后放于塑料袋中，用于DNA的提取。
[0046] 月季葉片基因組DNA的提取采用CTAB法，具體操作如下：
[0047] A.取2g月季切花的幼嫩葉片樣本，置于液氮預(yù)冷的研缽中充分研磨至樣本呈現(xiàn) 粉末狀，迅速轉(zhuǎn)入50mL離心管中，加入10mL65°C預(yù)熱的2XCTAB溶液（1M Tris-HCl，pH8. 0， 0.5M EDTA，5M NaCl，2% CTAB)。置于碎冰中冰浴。
[0048] B.加入ImL B-巰基乙醇，用光滑的玻璃棒攪拌。置于水浴搖床中56°C、轉(zhuǎn)速 IOOrpm下水浴45min，水浴過程中用玻璃棒小心攪拌混合數(shù)次。
[0049] C.加入IOmL CIA(氯仿：異戊醇=24 : 1，體積比）抽提液，輕柔顛倒混合，放入 37°C水浴搖床中、轉(zhuǎn)速120rpm下水浴20min。
[0050] D.常溫、3000rpm轉(zhuǎn)速下離心20min。用切除尖端的ImL槍頭，吸取上清液（含有 基因組DNA)，轉(zhuǎn)入新的50mL離心管中。
[0051] E.加入上清液體積1/10的CTAB溶液，輕柔混合，然后再加入10ml CIA (氯仿：異 戊醇=24 : 1，體積比）置入37°C水浴搖床中于、轉(zhuǎn)速120rpm下水浴20min。
[0052] F.常溫、3000rpm轉(zhuǎn)速下離心20min。小心吸取上清液到新的50mL離心管中。
[0053] G.沿試管壁緩慢加入 DNA 沉淀緩沖液（1M Tris-HCl，pH8. 0,0. 5M EDTA，1% CTAB)，輕柔顛倒混合15-20次，至DNA完全沉淀。
[0054] H.用玻璃彎鉤（酒精噴燈高溫拉伸做成）挑取出DNA絮狀沉淀，轉(zhuǎn)入含有5mL的 IM NaCl的試管中，56 °C水浴輕輕搖動(dòng)2h。
[0055] I.分別用70%和100%乙醇清洗DNA兩遍，在空氣或真空中晾干。
[0056] J.加入 ImL 的 TE 溶液（IOmM Tris-HCl，pH8. 0, ImM EDTA)使 DNA 溶解，于 37°C下 過夜。
[0057] 獲得月季DNA后，按照High-Tail PCR的方法利用通用簡并引物（SEQ NO. 15至19) 和RhNAC3基因3條反向的特異引物（SEQ NO. 2、SEQ NO. 3和SEQN0. 4)進(jìn)行3輪PCR反應(yīng) 擴(kuò)增。
[0058] 第一輪PCR用簡并引物（SEQ NO. 15至18)分別和引物SEQ NO. 2進(jìn)行反應(yīng)，條 件如下：94°C 5min，95°C IOminl 個(gè)循環(huán)；95°C 15s，61°C 15s，72°C 30s5 個(gè)循環(huán)；95°C 15s， 25°C 3min，0. 5°C /s 升至 72°C 3min，72°C 2minl 個(gè)循環(huán)；
[0059] 95 °C 15s, 44 °C 15s, 72 °C 30s3min ；95 °C 15s, 61 °C 15s, 72 °C 2min,95 °C 15s, 61°C 15s，72°C 2min，95°C 15s，44°C 15s，72°C 2minl5 個(gè)循環(huán)；72°C IOminl 個(gè)循環(huán)；KTC結(jié) 束；
[0060] 將各對引物獲得的四個(gè)第一輪產(chǎn)物分別稀釋50倍后用于第二輪PCR反應(yīng)模板，第 二輪PCR用簡并引物（SEQ NO. 19)和特異性引物（SEQ NO. 3)進(jìn)行反應(yīng)，條件如下：
[0061] 95°C 15s，63°C 15s，72°C 2min，95°C 15s，63°C 15s，72°C 2min，95°C 15s，44°C 15s， 72°C 2minl5 個(gè)循環(huán)；72°C IOminl 個(gè)循環(huán)；10°C結(jié)束。
[0062] 將四個(gè)第二輪產(chǎn)物分別稀釋100倍后用于第三輪PCR反應(yīng)模板，第三輪PCR用簡 并引物（SEQ NO. 19)和特異性引物（SEQ NO. 4)進(jìn)行反應(yīng)，條件如下：95°C 15s，64°C 15s， 72 °C 2min，95 °C 15s，64 °C 15s，72 °C 2min，95 °C 15s，44 °C 15s，72 °C 2minl5 個(gè)循環(huán)； 72°C IOminl 個(gè)循環(huán)；10°C結(jié)束。
[0063] 3輪反應(yīng)結(jié)束后，將第二輪和第三輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離，根據(jù) 第二輪和第三輪反應(yīng)產(chǎn)物的大小和設(shè)計(jì)SEQ NO. 4和SEQ NO. 3所差的位置確定所得片段 是否為目的片段，將所得目的片段采用Axygen的DNA快速純化/回收試劑盒（AP-GX-50， Axygen)回收目的 DNA，連接到 Promega 公司的 pGEM-T Easy Vector Systems (Promega)。 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dh5 α，取I μ I菌液為模板，用PCR檢測和瓊脂糖凝膠電泳分析 確定陽性克隆。利用陽性克隆測序并保存陽性克隆以備后用。根據(jù)測序后結(jié)果設(shè)計(jì)引物對 SEQ NO. 5 和 SEQ NO. 6。
[0064] 以基因組DNA作為模版，利用SEQ NO. 5和SEQ NO. 6弓丨物擴(kuò)增得到長度為1447bp 的序列（參見SEQN0. 1)。將該序列命名為RhNAC3啟動(dòng)子序列。
[0065] 2.啟動(dòng)子序列分析
[0066] 將分離得到的RhNAC3啟動(dòng)子提交到植物順式調(diào)控元件在線數(shù)據(jù)庫 PLACE(http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/signalscan. html)和 PlantCARE(http:// bioinformatics· psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行順式作用兀件分析，分 析結(jié)果表明，在1447bp的啟動(dòng)子序列中，除含有CAAT和TATA等啟動(dòng)子基本元件外，還包含 有W-box、MYC結(jié)合元件、CBF結(jié)合元件、MYB結(jié)合元件等不同種類的逆境脅迫相關(guān)的順式作 用元件。而且更加令人驚訝的是，RhNAC3啟動(dòng)子還含有串聯(lián)的5種不同核苷酸類型的ABRE 結(jié)合元件。
[0067] 經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，未見有關(guān)于RhNAC3啟動(dòng)子的分離和功能研究的報(bào)道。
[0068] 3.⑶S表達(dá)的組織化學(xué)定位和熒光活性檢測
[0069] 獲得RhNAC3啟動(dòng)子后，為了研究RhNAC3啟動(dòng)子的基本特性，對其組織化學(xué)定位進(jìn) 行了研究，同時(shí)由于RhNAC3啟動(dòng)子中包含有5個(gè)串聯(lián)的ABRE順式作用元件，對其在ABA處 理下的誘導(dǎo)特性和不同缺失片段的GUS活性進(jìn)行了探究，以期明確RhNAC3的調(diào)控機(jī)制。
[0070] 組織化學(xué)定位：以⑶S作為報(bào)告子，將RhNAC3啟動(dòng)子融合⑶S后轉(zhuǎn)入擬南芥中， 利用引物對SEQ NO. 7和SEQ NO. 8檢測獲得帶有RhNAC3啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植株（采用花序 浸蘸法將RhNAC3啟動(dòng)子融合GUS載體轉(zhuǎn)入擬南芥中）。將不同苗齡的T3代擬南芥轉(zhuǎn)基 因植株的葉片、根和花等器官放入2ml試管中，加入200 μ 1組織化學(xué)染色液（75. 5mM磷 酸鈉 ρΗ7· 0,0· 1 % Triton X-100,0· 05mM K3/K4FeCN，IOmM EDTA，20 % 甲醇（v/v)，50 μ g mrS-溴-4-氯-3-吲哚基-葡萄糖醛酸）。37°C培養(yǎng)箱中放置5h，再用70%的酒精脫色 至顯現(xiàn)白色。在體式顯微鏡（Olympus SEX16)下觀察⑶S表達(dá)部位并拍照記錄。
[0071] 熒光活性檢測：利用引物對SEQ NO. 9和SEQ NO. 12獲得含有5個(gè)串聯(lián)ABRE順式作 用元件的N0,利用引物對SEQ NO. 10和SEQ NO. 12獲得含有3個(gè)串聯(lián)ABRE順式作用元件的 N1，利用引物對SEQ NO. 11和SEQ NO. 12獲得不含有ABRE順式作用元件的N2,將含有不同 數(shù)目ABRE順式作用元件缺失片段（NO, NI, N2和NC)轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體后測定熒光活性 (方法同上），將RhNAC3啟動(dòng)子融合⑶S的轉(zhuǎn)基因株系用10 μ M處理后，分別測定ABA處理 前后的⑶S熒光活性，將擬南芥植株放入I. 5ml Eppendorf試管中，加入300 μ 1擬南芥⑶S 提取液（50mM磷酸鈉（ρΗ7. 0)，IOmM Na2-乙二胺四乙酸（EDTA，ρΗ8. 0)，0. 1 %月桂酰肌氨 酸鈉，0. 1% Triton Χ-100, ΙΟπιΜβ -巰基乙醇），在冰上用勻漿機(jī)將組織磨碎。4°C 8000rmp 離心IOmin,將上清液轉(zhuǎn)入新管。預(yù)先準(zhǔn)備160μ L的MUG溶液（ImM)于I. 5ml Eppendorf 試管中，37°C下水浴5min，加入40μ 1的上清液，迅速充分混勻，并立刻取出100μ 1反應(yīng)混 合液加入到900 μ 1的終止液中（0. 2mol/L的Na2CO3)，將該管作為酶促反應(yīng)的0點(diǎn)。15min 后，取出剩余的100 μ 1反應(yīng)混合液，加入到900 μ 1的終止液中。用分光光度計(jì)在激發(fā)波長 365nm、發(fā)射波長455nm下，測定反應(yīng)前后不同處理樣品的熒光值。取100 μ 1的上清液，考 馬斯亮藍(lán)法測定樣品蛋白含量。計(jì)算每個(gè)樣品單位時(shí)間內(nèi)的GUS活性。
[0072] GUS活性=(反應(yīng)后突光值-反應(yīng)前突光值）/蛋白質(zhì)含量/反應(yīng)時(shí)間
[0073] GUS測定后的結(jié)果如圖2所示，A圖顯示RhNAC3啟動(dòng)子缺失片段在擬南芥 原生質(zhì)體中的GUS活性分析，與NC相比較，包含有5個(gè)串聯(lián)的ABRE順式作用元件的 NO (-1447?-160bp)與NC相比較差異極顯著（雙星號，P < 0. 01)，包含有3個(gè)串聯(lián)的ABRE 順式作用元件的NI (-707?-160bp)與NC相比較差異顯著（單星號，P < 0. 05)。B圖顯 示外源ABA對包含RhNAC3啟動(dòng)子缺失重組體的擬南芥原生質(zhì)體中⑶S活性的影響。與對 照NC相比較，在未加 ABA時(shí)，不同片段之間⑶S活性無顯著性差異，當(dāng)施加10 μ M ABA處理 后，含有5個(gè)串聯(lián)的ABRE順式作用元件的NO (-1447?-160bp)與NC相比較達(dá)到極顯著差 異（雙星號，P值< 〇. 01)，含有3個(gè)串聯(lián)的ABRE順式作用元件的NI (-707?-160bp)與NC 相比較達(dá)到顯著差異（單星號，P值< 0. 05)。C圖顯示RhNAC3啟動(dòng)子對ABA的響應(yīng)。ABA 強(qiáng)烈的誘導(dǎo)了 RhNAC3轉(zhuǎn)錄活性的表達(dá)。
[0074] 4. RhNAC3轉(zhuǎn)基因植株表型觀測
[0075] ABRE順式作用元件的存在對RhNAC3的轉(zhuǎn)錄活性具有非常重要的作用，為了進(jìn)一 步明確RhNAC3的功能，特別是ABA處理后RhNAC3轉(zhuǎn)基因植株的表型，對RhNAC3轉(zhuǎn)基因植 株的種子萌發(fā)率和幼苗期根生長表型以及ABA處理下氣孔開度進(jìn)行了測定。
[0076] 1)萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)
[0077] 將篩選出的RhNAC3轉(zhuǎn)基因 T2代純合體植株播于含有ABA (0,0. 2 μ M，0. 4 μ M)的 MS培養(yǎng)基中（含有3%蔗糖和0.7%的瓊脂），4°C低溫春化4d后，長日照（16h光照，8h黑 暗）條件培養(yǎng)7d后，拍照并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。
[0078] 萌發(fā)率如圖3所示，擬南芥種子萌發(fā)率隨ABA濃度的升高有所下降，而在同水平 ABA (0· 2和0· 4 μ M ΑΒΑ)處理下，與對照（VC)植株相比較，RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0E#3,6,12) 植株種子萌發(fā)率降低更為顯著（圖3A和B)
[0079] 2)初生根根長及側(cè)根統(tǒng)計(jì)
[0080] T2代種子在附加3%蔗糖和0. 6%瓊脂的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，4°C低溫春化4d后，長 日照條件培養(yǎng)7d后，轉(zhuǎn)移到新的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中包含ABA (0, 5 μ M，10 μ M，30 μ M)，長 日照條件下將培養(yǎng)皿立向生長IOd之后拍照并統(tǒng)計(jì)植株根長及側(cè)根數(shù)目。
[0081] 在幼苗根部表型上，與對照（VC)植株相比較，RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0E#3,6,12)植 株在初生根長度和側(cè)根數(shù)目上均出現(xiàn)降低趨勢，RhNAC3過表達(dá)在根部生長階段也對ABA表 現(xiàn)敏感（圖3C、D和E)。
[0082] 3)轉(zhuǎn)基因植株氣孔運(yùn)動(dòng)觀測
[0083] 選擇10片葉齡期的擬南芥（移栽以后ll-13d左右，3周左右大小的苗子），選擇 次新一輪大小，狀態(tài)一致的葉片。如果葉片上有褶皺等不健康的狀態(tài)均不進(jìn)行選擇。
[0084] A.選取整齊一致的擬南芥植株，選取同一輪葉片中大小，狀態(tài)一致的葉片，帶葉柄 剪下。
[0085] B.葉片背面朝上，放入表皮條緩沖液中（2.0離心管），浸入緩沖液液面以下。每 個(gè)管中一片葉子，且不同管中葉片的液下深度要求一致。
[0086] C.將不同的株系均勻置于冷光源下，照射3h。
[0087] D.撕取葉片中脈一側(cè)的下表皮進(jìn)行觀測，看氣孔是否已經(jīng)完全打開。
[0088] E.若氣孔已經(jīng)完全打開，則加入ABA進(jìn)行處理3h。
[0089] F.撕取葉片中脈另一側(cè)的下表皮進(jìn)行觀測。
[0090] ABA用無水乙醇配置成IOOmM母液，工作液為ImM，用水稀釋即可。平時(shí)存于-20°C。
[0091] 氣孔開度的測定結(jié)果如圖4所示，ABA可以促進(jìn)氣孔關(guān)閉，并且可極大地促進(jìn) RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系的氣孔關(guān)閉，使ABA處理下RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系（0E#3,6，12)氣孔開度更 小，氣孔關(guān)閉更為迅速（圖4A) ;10d干旱處理可以誘導(dǎo)RhNAC3轉(zhuǎn)基因植物葉片氣孔開度相 對于對照（VC)明顯減小（圖4B)。RhNAC3以依賴ABA的方式參與植物對水分脅迫的響應(yīng)。
[0092] RhNAC3轉(zhuǎn)基因株系在ABA處理下表現(xiàn)為對ABA更為敏感，為了進(jìn)一步解釋高ABA 敏感性的調(diào)控方式，選取擬南芥和月季中ABA響應(yīng)基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對其表達(dá)量 進(jìn)行檢測，以期明確ABA響應(yīng)基因與ABA敏感性的關(guān)系。
[0093] 5.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT-PCR)
[0094] A.采用Trizol法提取植物組織材料RNA，用分光光度計(jì)檢測濃度，甲醛變性膠檢 測質(zhì)量。
[0095] B.利用 DNase I (Takara 公司，D2215, 5U/ μ L)處理 RNA 樣品。
[0096] 采用乳如下的IOyL反應(yīng)體系：總RNA5yg(可處理2?5yg) ;DNase IlyL5DEPC H20補(bǔ)齊到10 μ L ;
[0097] C.體系混勻后輕離心，在37°C下處理20min。
[0098] D.反應(yīng)完成后65 °C處理IOmin使DNaseI變性（PCR儀中完成），變性完的樣品 在-80°C保存。
[0099] E.取1 μ L樣品跑膠檢測RNA質(zhì)量，另外取1 μ L稀釋100倍，測定RNA的含量。
[0100] F.米用 SuperScriptTM II RNase H Reverse Transcriptase (Invitrogen)和 Oligo dT18 (Invitrogen)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用如下的25 μ L反應(yīng)體系：寡聚dT引物1 μ L ;總 尺隱2以8;補(bǔ)水至18以1^，701€變性5111；[11，迅速冷卻至少1111；[11，離心 ；5\第一鏈緩沖液5 μ L ; dNTPl μ L ;uperScriptTM II RNase H 逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μ L。
[0101] G.加完樣品后輕彈管底混勻離心，42°C反應(yīng)90min，后冰浴lOmin，稀釋5倍獲得 cDNA第一鏈-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0102] Η·實(shí)時(shí)熒光定量 PCR :采用儀器 ABI PRISM St印 ONE Plus Real-time PCR System(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA, USA)和試劑盒 ΚΑΡΑ SYBR FAST qPCR KIT (ΚΑΡΑ Biosystems，Boston，Massachusetts，USA)進(jìn)行定量 PCR 反應(yīng)。
[0103] I.加好反應(yīng)體系后，將樣品加入實(shí)時(shí)定量PCR儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA, USA)中，設(shè)置反應(yīng)條件如下：
[0104] 95°C IOmin ;95°C 15s ;6(TC lmin，40 個(gè)循環(huán)。
[0105] J.反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用雙Λ ΛΤ方法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量。
[0106] 在擬南芥和月季中對ABA響應(yīng)基因的表達(dá)檢測結(jié)果如圖5所示。在擬南芥中， RhNAC3正向調(diào)控了 ABA響應(yīng)基因的表達(dá)（圖5Α)，在沉默RhNAC3月季花瓣中，ABA信號及 下游基因得表達(dá)受到明顯的抑制（圖5B和C)，這些結(jié)果表明RhNAC3正向調(diào)節(jié)ABA響應(yīng)基 因的表達(dá)參與ABA信號途徑。
[0107] 利用擬南芥數(shù)據(jù)庫（http://www. arabidopsis. org)TAIR Loci Upstream Seq-IOOObp方法，對擬南芥中ABA響應(yīng)基因的上游調(diào)節(jié)序列進(jìn)行了進(jìn)一步分析，以期確定 這些基因的上游調(diào)節(jié)區(qū)域中是否含有NAC蛋白結(jié)合元件，所得結(jié)果如表1所示。其中獲得 了 11個(gè)ABA響應(yīng)基因的上游IOOObp的調(diào)控序列，通過對上游調(diào)節(jié)序列的分析。在所分析 的11個(gè)ABA響應(yīng)基因中，均發(fā)現(xiàn)含有不同數(shù)目和類型的NAC蛋白結(jié)合位點(diǎn)，表明上述基因 是RhNAC3調(diào)控的直接靶基因。
[0108] 表IABA響應(yīng)基因啟動(dòng)子序列NAC結(jié)合元件分析
[0109]

【權(quán)利要求】
1. 一種NAC蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動(dòng)子，其中，所述啟動(dòng)子與SEQ No. 1具有至少50%， 例如 60%、70%、80%、90%、91%、92%、95%、97%、98%、99%或 100% 的同一性； 優(yōu)選的是，所述核苷酸序列包含選自由acgtg、acgtgc、acgtgg、acgtgc和acgtgtc組 成的組中的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種順式作用元件。
2. 用于對權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子進(jìn)行克隆、檢測、定位、過表達(dá)或沉默的引物對，其 中，所述引物對選自由引物對SEQ NO. 2和15、SEQ NO. 2和16、SEQ NO. 2和17、SEQ NO. 2和 18、5￡0勵(lì).3和19、5￡0勵(lì).4和19、5￡0勵(lì).5和6、引物對5￡0勵(lì).7和8、引物對5￡0勵(lì).9 和12、引物對SEQ NO. 10和12、引物對SEQ NO. 11和12、引物對SEQ NO. 13和14組成的組。
3. -種克隆權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子的方法，其中，所述方法使用選自由引物對SEQ NO. 2 和 15、SEQ NO. 2 和 16、SEQ NO. 2 和 17、SEQ NO. 2 和 18、SEQ NO. 3 和 19、SEQ NO. 4 和 19組成的組中的至少一個(gè)引物進(jìn)行。
4. 一種克隆或檢測權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子的方法，其中，所述方法包括使用引物對 SEQ No. 5和6、和/或引物對SEQ NO. 7和8進(jìn)行； 優(yōu)選的是，所述檢測通過GUS活性檢測進(jìn)行，并且使用引物對SEQ NO. 7和8進(jìn)行。
5. -種檢測植物對ABA的敏感性的方法，所述方法包括對權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子進(jìn) 行檢測； 優(yōu)選的是，所述方法包括對所述啟動(dòng)子的ABA順式作用元件的存在和/或數(shù)量進(jìn)行檢 測。
6. -種提高植物耐受逆境脅迫能力的方法，所述方法包括利用權(quán)利要求1所述的啟動(dòng) 子進(jìn)行； 優(yōu)選的是，所述方法通過改變植物對脫落酸的敏感性來實(shí)現(xiàn)； 另外優(yōu)選的是，所述方法通過提高植物對脫落酸的敏感性來實(shí)現(xiàn)； 另外優(yōu)選的是，所述逆境脅迫導(dǎo)致所述植物的脫落酸生成量增加； 另外優(yōu)選的是，所述逆境脅迫選自由低溫逆境脅迫、高溫逆境脅迫、干旱逆境脅迫、水 澇逆境脅迫、高鹽逆境脅迫、生物脅迫、機(jī)械傷害脅迫組成的組。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述方法通過將所述啟動(dòng)子與耐受逆境脅迫有關(guān) 的基因的融合表達(dá)來實(shí)現(xiàn)； 優(yōu)選的是，所述耐受逆境脅迫有關(guān)的基因?yàn)镽hNAC3。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中，所述融合表達(dá)利用外部施加的外源性脫落酸 或者植物本身產(chǎn)生的內(nèi)源性脫落酸來誘導(dǎo)； 進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述融合表達(dá)利用植物本身產(chǎn)生的內(nèi)源性脫落酸來誘導(dǎo)。 9. RhNAC3基因在提高植物耐受脅迫能力中的應(yīng)用； 優(yōu)選的是，所述應(yīng)用通過將所述RhNAC3基因與權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子的融合表達(dá)來 實(shí)現(xiàn)。
10. 含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子的載體； 優(yōu)選的是，所述載體為質(zhì)粒載體、噬菌體載體或病毒載體； 另外有選的是，所述載體為克隆載體或表達(dá)載體。
【文檔編號】C12N15/10GK104372005SQ201410528697
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】張常青, 姜新強(qiáng), 高俊平 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)