Tp1基因3’utr區(qū)功能snp位點及其檢測引物、試劑盒和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種影響種公牛精液品質優(yōu)劣的TP1基因3’UTR區(qū)功能SNP位點及其檢測引物、試劑盒和檢測方法。該SNP位點為：g.528G>A；核苷酸位置的編號基于GenBank登錄號為AC_000159.1的牛TP1基因序列，且以TP1基因的起始密碼子ATG作為+1；用于種公牛TP1基因3'UTR區(qū)功能SNP位點基因分型的引物，上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物序列如SEQ ID NO.5所示；本發(fā)明還公開了檢測該SNP位點的引物、試劑盒和方法。本發(fā)明首次闡明了TP1基因SNP位點與公牛精液品質優(yōu)劣的相關性，減少種公牛飼養(yǎng)的盲目性，節(jié)約成本，增加經(jīng)濟效益。
【專利說明】TP1基因3'UTR區(qū)功能SNP位點及其檢測引物、試劑盒和檢 測方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及家畜分子生物學【技術領域】，具體涉及一種影響種公牛精液品質優(yōu)劣的 TPl基因3' UTR區(qū)功能SNP位點及其檢測引物、試劑盒和檢測方法。

【背景技術】
[0002] 在人工授精及冷凍精液等技術被廣泛推廣的今天，種公牛已經(jīng)成為現(xiàn)代奶牛改良 體系中最重要的一環(huán)，其精液品質優(yōu)劣是牛群能否可以快速穩(wěn)定發(fā)展的指示標。公牛的采 精量、鮮精活力、凍精解凍后活力、鮮精密度和精子畸形率是國際公認的衡量種公牛精液品 質的重要指標。一項權威數(shù)據(jù)表明，我國的荷斯坦公牛年均凍精生產(chǎn)量僅僅為2. 18萬份， 但在國外，最高的生產(chǎn)水平是一頭公牛年產(chǎn)凍精25萬份。這種巨大的差距，直接表明了我 國奶牛行業(yè)的實際水平還處在起步階段，未來還有較長路要走。因此，如何提高公牛整體遺 傳素質，解決公牛凍精質量差的問題，并進而培育大量良種公牛已迫在眉睫。然而，種公牛 精液品質屬于數(shù)量性狀，遺傳力極低，過去的常規(guī)育種手段很難在較短時間內發(fā)揮作用。因 而，現(xiàn)在育種工作者們開始將目光聚焦到分子水平上以期解決這一問題，即借助標記輔助 選擇（MAS)方法，研究與種公牛精液品質性狀相關的候選基因，進一步分析與侯選基因緊 密連鎖的分子標記，從而達到育種目的。
[0003] 單核苷酸多態(tài)性（SNP)是哺乳動物基因組最常見的變異類型，它們可以調控基因 的表達，從而對其作用的發(fā)揮產(chǎn)生影響，進而引起表型的差異。通常情況下，我們將SNP分 為三類，即編碼區(qū)的SNP、基因間的SNP以及基因周邊的SNP?；?'UTR區(qū)的SNP便屬于 基因周邊SNP中的一種。研究表明，基因3' UTR的SNP主要影響MicroRNA與3' UTR結合， 促進或抑制基因翻譯，發(fā)揮著重要的作用。
[0004] 種公牛過渡蛋白I (Transition protein 1，TP1)是精子中特異存在的一類富含精 氨酸和賴氨酸的蛋白，其主要參與了精子變態(tài)過程中組蛋白一魚精蛋白轉換這一標志性事 件。即體細胞的組蛋白逐漸被睪丸特異性的組蛋白I(HlT)替換，后再由過渡蛋白（TP)替 換Η1Τ，最后TP被魚精蛋白（Prm)順序性的替換，形成精子的核魚精蛋白。由此看見，TPl 作為這一事件的參與者之一，對于牛精子正常發(fā)生是必需的。
[0005] 已有很多證據(jù)顯示，在牛上，相關基因3'UTR區(qū)的SNP可以通過影響MicroRNA與 3' UTR結合，調節(jié)精液品質特征。如牛KATNAL1基因3' UTR SNP可以影響bta-miR-22-5p 對革El基因表達的調控，從而影響牛的精液品質特征（張曉建等，2014)，商青等（2014)在牛 TNP2基因上也發(fā)現(xiàn)類似的機制。但是，在牛TPl基因上至今未有相關SNP及MicroRNA作用 對精液品質特征影響的報道。


【發(fā)明內容】

[0006] 針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明的目的是提出一種影響種公牛精液品質優(yōu)劣的TPl基 因3' UTR區(qū)功能SNP位點，該SNP位點可以在篩選和鑒定種公牛是否具有優(yōu)質的精液品質 中進行應用。本發(fā)明還提供了該SNP位點的引物、試劑盒和檢測方法。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的具體技術方案如下：
[0008] -種影響種公牛精液品質優(yōu)劣的TPl基因3' UTR區(qū)功能SNP位點，所述SNP位點 為：g. 528G>A ;核苷酸位置的編號基于GenBank登錄號為 AC_000159. 1(105576568. . 105577 158)的牛TPl基因序列，且以TPl基因的起始密碼子ATG作為+1。
[0009] 上述TPl基因3' UTR區(qū)功能SNP位點在篩選和鑒定種公牛是否具有優(yōu)質的精液品 質中的應用。該種公牛TPl基因3' UTR區(qū)SNP g. 528G>A可作為功能性分子標記，繼而對種 公牛精液品質產(chǎn)生影響。經(jīng)細胞瞬時轉染實驗驗證，通過雙熒光素報告系統(tǒng)進行分析，結 果表明，TPl基因3' UTR區(qū)SNP能夠改變bta-miR-532結合能力，突變后3' UTR區(qū)靶序列與 bta-miR-532的結合能力比突變前增強，這樣使TPl在突變前后呈現(xiàn)出不同表達水平，從而 影響種公牛精液品質的優(yōu)劣。
[0010] 一種用于檢測TPl基因3' UTR區(qū)功能SNP位點的引物，上游引物的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 一種用于檢測種公牛TPl基因3'UTR區(qū)功能SNP位點基因分型的引物，上游引物 GF序列如SEQ ID NO. 4所示，下游引物GR序列如SEQ ID NO. 5所示。PCR所擴增的片段 含有牛TPl第528位核苷酸（PCR擴增的片段序列如SEQ ID NO. 6所示）。
[0012] 一種用于種公牛精液品質優(yōu)劣篩選的試劑盒，包括：上游引物GF(K) μ mol/L)，其 序列如SEQ ID NO. 4所示；下游引物GR(IOymoVL)，其序列如SEQ ID NO. 5所示；上述引 物能夠擴增出序列如SEQ ID NO. 6所示的片段；2XTaq PCR MasterMix ;ddH20;FastDigest 限制酶 Taq I ;10XFastDigest buffer。
[0013] 一種用于種公牛精液品質優(yōu)劣篩選的方法，以種公?；蚪MDM為模板，利用SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示的引物對待檢測的種公牛的TPl基因3' UTR區(qū)進行擴增，將 PCR產(chǎn)物用FastDigest限制酶Taq I進行切割，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，并最終 根據(jù)銀染后的電泳結果進行判定：對于TPl基因3' UTR區(qū)SNP位點（g. 528G>A)，共有三種基 因型，分別是GG基因型（電泳顯示僅有一條283bp的帶，24bp的帶分子量太小在電泳圖中 不顯示），GA基因型（電泳顯示有307bp，283bp兩條帶，24bp的帶分子量太小在電泳圖中不 顯示）以及AA基因型（電泳顯示僅有307bp-條帶）。其中GG基因型可使bta-miR-532 與TPl基因3'UTR結合能力降低，有利于TPl的表達，且SAS統(tǒng)計分析顯示GG基因型的種 公牛個體的一次射精量顯著高于AA基因型個體（P〈0. 05)，GG基因型種公牛個體畸形率要 顯著低于GA、AA基因型個體（P〈0. 05)。因此GG基因型具有優(yōu)良的精液品質性狀，可作為 有效的種公牛分子標記。
[0014] 上述所用的種公?；蚪MDNA，是通過苯酚/氯仿抽提法或高鹽法提取得來，并最 終將其濃度稀釋至50ng/l·! 1，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0015] 上述是25 μ I PCR擴增反應的體系，主要包括：上游引物GF(如SEQ ID NO. 4所 示）和下游引物GR(如SEQIDN0·5所示）各lμl，引物濃度為10μmol/L;2XTaqPCR MasterMixl2. 5 μ 1 ;模板 DNA 1 μ 1，DNA 濃度為 50ng/ μ I ;ddH20 9. 5 μ 1。
[0016] 上述PCR擴增反應的條件是：第一步預變性，溫度94°C，時間5min ;第二步35個循 環(huán)，包括94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸20s ;第三步終延伸，溫度72°C，時間10min。
[0017] 上述所用的FastDigest限制酶Taq I，用于識別TPl基因3' UTR區(qū)SNP位點 (g. 528G>A)。
[0018] 上述是10 μ I的FastDigest限制酶Taq I的酶切體系：PCR產(chǎn)物2· 5 μ 1， FastDigest 限制酶 Taq I 0.5 μ 1，IOXFastDigest buffer 2 μ l，ddH20 5 μ 1。
[0019] 上述FastDigest限制酶Taq I的酶切反應條件是：37°C，30min。
[0020] 上述聚丙烯酰胺凝膠電泳所用的凝膠的質量濃度為：1〇%。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：
[0022] (1)本發(fā)明的用于篩選種公牛精液品質優(yōu)劣的方法，既涉及到SNP對MicroRNA結 合能力的影響，又運用了統(tǒng)計學手段進行分析，二者相互結合，大大增加了結果的可靠性， 且具有新穎、低成本等優(yōu)點。
[0023] (2)本發(fā)明提供了一種應用性極強的新型試劑盒，利用種公牛TPl基因3'UTR區(qū) SNP位點（g.528G>A)進行種公牛精液品質優(yōu)劣的篩選。GG基因型作為優(yōu)良精液品質特征 的有效分子標記，予以留種。應用該試劑盒可增加檢測效率，減少了檢測的盲目性，使成本 費用更低、操作更加簡單化。在實際中，可以大規(guī)模用于早期對種公牛篩選，淘汰部分精液 品質不合格的種公牛，縮短育種所用時間，以期可以積極的推動我國奶牛行業(yè)的發(fā)展。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1 :種公牛TPl基因3' UTR區(qū)SNP位點（g. 528G>A)的測序圖及位置；
[0025] 圖2 :種公牛TPl基因3' UTR區(qū)SNP g. 528G>A在突變前后和bta-miR-532結合的 自由能變化示意圖；
[0026] 圖3 :種公牛TPl基因3' UTR區(qū)SNP位點（g. 528G>A)在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳 中的基因分型圖；
[0027] 圖4 :細胞瞬時轉染實驗驗證g. 528G>A對bta-miR-532與牛TPl基因3' UTR區(qū)結 合的影響。

【具體實施方式】
[0028] 結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對其內容進行限定。
[0029] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如Sambrook等 人，分子克?。簩嶒炇謨裕∟ew York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述 的條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0030] 實施例1 :種公牛TPl基因3' UTR區(qū)SNP的鑒定及功能驗證
[0031] 1.采集500頭種公牛血液或精液（本發(fā)明所使用的種公牛精液或血液取自北京 奶牛中心、上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司、山東奧克斯種公牛站）。采用苯酚/氯仿抽提法 提取血液基因組DNA，依照高鹽法提取精液基因組DNA，然后利用紫外分光光度計對提取的 DNA樣品進行純度和濃度的檢測，并最終稀釋成50ng/ μ 1，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0032] 2.以牛精液基因組DNA為模板，利用Primer Premier5.0軟件設計引物TPl-F (如 SEQ ID NO. 1所示）和TPl-R (如SEQ ID NO. 2所示），進行PCR擴增，擴增后的序列如SEQ ID NO. 3所示。PCR擴增產(chǎn)物直接測序，測序結果與GenBank登錄號為AC_000159. 1 (10557 6568…105577158)的牛TPl基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)1個SNP位點g. 528G>A (以TPl基因 的起始密碼子ATG作為+1)，位于TPl基因3' UTR區(qū)域內。
[0033] 3.利用 miRNA 在線預測軟件 TargetScan(http://www. targetscan. org/index. htmL)預測與TPl基因3' UTR區(qū)域SNP結合的miRNAs。結果表明TPl基因3' UTR上的SNP g. 528G>A位于bta-miR-532的種子區(qū)，可與突變型AA的TP13' UTR片段結合，且突變前后和 bta-miR-532結合的自由能發(fā)生變化，結果如圖2所示。通常情況下自由能越小，結合能力 越強，因此，結合圖2可以得出突變后牛TPl基因3' UTR區(qū)與bta-miR-532的結合能力可能 比突變前增強。
[0034] 4.利用創(chuàng)造酶切位點的方法，設計出特異性的專用分型引物GF(如SEQ ID NO. 4 所示）和GR (如SEQ ID NO. 5所示），使牛TPl第528位堿基G - A突變（g. 528G>A)可以 被FastDigest限制酶Taq I識別。以種公牛基因組DNA為模板，利用上述特異性的專用分 型引物GF (如SEQ ID NO. 4所示）和GR (如SEQ ID NO. 5所示）進行PCR擴增，擴增后的 序列如SEQ ID NO. 6所示。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)FastDigest限制酶Taq I切割后，在10 %的聚 丙烯酰胺凝膠電泳中予以分型。分型結果如圖3所示。三種基因型分別為：GG基因型（電 泳顯示僅有一條283bp的帶，24bp的帶分子量太小在電泳圖中不顯示），GA基因型（電泳 顯示有307bp，283bp兩條帶，24bp的帶分子量太小在電泳圖中不顯示）以及AA基因型（電 泳顯示僅有307bp -條帶）
[0035] 5.利用細胞瞬時轉染實驗對上述預測結果進行驗證，分別將含有野生型（GG)和 突變型（AA)的3' UTR片段與pMIR載體連接，構建3' UTR熒光素酶表達質粒，并對應命名為 pMIR-3' UTR-G和pMIR-3' UTR-A ;同時，構建bta-miR-532質粒。隨后將3' UTR熒光素酶表 達質粒pMIR-3' UTR-G和pMIR-3' UTR-A，分別與bta-miR-532質粒、內參β -gal質粒共轉 染小鼠睪丸間質細胞（MLTC-I)，培養(yǎng)36小時后，通過雙熒光素報告系統(tǒng)進行分析，結果如 圖4所示。野生型質粒的活性高于突變型的質粒，這和上述的預測結果一致。說明突變后 即AA基因型時，bta-miR-532與牛TPl基因3'UTR區(qū)結合能力比突變前即GG基因型時強， 從而使TPl基因表達量降低。TPl基因的低表達不利于種公牛精液品質的提商，因此再次可 以認定GG基因型是有利的分子標記，AA基因型為不利的分子標記。
[0036] 實施例2 :牛TPl基因3' UTR區(qū)SNP分子標記與種公牛精液品質的關聯(lián)分析
[0037] 利用統(tǒng)計學軟件SAS 9. 0,比較分析牛TPl基因3' UTR區(qū)SNP (g. 528G>A)的不同基 因型與種公牛精液品質的相關性。其模型為：Yijk= μ+Α+Υ^^+θ#。Yijk為公牛精液品質 性狀的觀察值；μ為群體平均值；Gi:基因型的固定效應；Yj :季節(jié)的固定效應；Hk :場次的 固定效應；eijk :隨機殘差效應。以期通過此關聯(lián)分析，選擇優(yōu)質精液品質的基因型個體進行 留種。
[0038] 關聯(lián)性分析的結果如表1所示，可以得出結論：野生（GG)基因型的種公牛個體的 一次射精量顯著高于突變（AA)基因型個體（P〈0. 05)，野生（GG)基因型的種公牛個體的精 子畸形率顯著低于雜合（GA)和突變（AA)基因型個體（P〈0. 05)。同時野生（GG)基因型比 突變（AA)基因型種公牛個體的鮮精活力、鮮精密度和凍后活力都相對高。因此，野生（GG) 基因型是高精液品質的有利基因型，可以在種公牛育種改良過程中作為有效地功能性分子 標記，用于輔助選擇具有優(yōu)良精液品質特征的種公牛個體。
[0039] 表1種公牛TPl基因3' UTR區(qū)SNP g. 528G>A的不同基因型與種公牛精液品質的 關聯(lián)分析
[0040]

【權利要求】
1. 一種影響種公牛精液品質優(yōu)劣的TP1基因3'UTR區(qū)功能SNP位點，其特征在于， 所述SNP位點為：g. 528G>A ;核苷酸位置的編號基于GenBank登錄號為AC_000159. 1，在 105576568與105577158之間的牛TP1基因序列，且以TP1基因的起始密碼子ATG作為+1。
2. 權利要求1所述的TP1基因3' UTR區(qū)功能SNP位點在篩選和鑒定種公牛是否具有優(yōu) 質的精液品質中的應用。
3. -種用于檢測種公牛TP1基因3' UTR區(qū)功能SNP位點的引物，其特征在于，上游引物 的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 權利要求3所述的引物在篩選和鑒定種公牛是否具有優(yōu)質的精液品質中的應用。
5. -種用于檢測種公牛TP1基因3' UTR區(qū)功能SNP位點基因分型的引物，其特征在于， 上游引物序列如SEQ ID NO. 4所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 5所示。
6. 權利要求5所述的引物在篩選和鑒定種公牛是否具有優(yōu)質的精液品質中的應用。
7. 采用權利要求5所述的引物進行種公牛精液品質優(yōu)劣篩選的方法，其特征在于，以 種公?；蚪MDNA為模板，利用SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示的引物對待檢測的種公 牛的TP1基因3'UTR區(qū)進行擴增，將PCR產(chǎn)物用FastDigest限制酶Taq I進行切割，聚丙 烯酰胺凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，并根據(jù)銀染后的電泳結果進行判定：若得到283bp -條帶， 則為GG基因型；若得到307bp，283bp兩條帶，則為GA基因型；若得到307bp-條帶，則為 AA基因型；其中，GG基因型具有優(yōu)良的精液品質性狀，作為種公牛精液品質優(yōu)劣篩選的分 子標記。
8. -種用于種公牛精液品質優(yōu)劣篩選的試劑盒，其特征在于，含有權利要求5所述的 引物。
9. 如權利要求8所述的用于種公牛精液品質優(yōu)劣篩選的試劑盒，其特征在于，包括： 上游引物10μmol/L，其序列如SEQIDN0·4所示 ；下游引物10μmol/L，其序列如SEQID NO. 5所示；上述引物能夠擴增出序列如SEQ ID NO. 6所示的片段；2XTaq PCR MasterMix ; ddH20;FastDigest 限制酶 Taq I ;10XFastDigest buffer。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293951SQ201410531776
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權日:2014年10月10日
【發(fā)明者】鞠志花, 張帥, 王長法, 張燕, 王秀革, 黃金明, 李建斌, 仲躋峰 申請人:山東省農業(yè)科學院奶牛研究中心