一種使牛trim5α基因沉默的siRNA及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了使牛trim5α基因沉默的干擾方法，siRNA序列，siRNA人慢病毒表達(dá)載體，復(fù)制缺陷型人慢病毒，人慢病毒感染的MDBK細(xì)胞。本發(fā)明的RNAi和siRNA慢病毒表達(dá)載體有效的干擾牛trim5α基因的表達(dá)，顯著提高人慢病毒載體在牛腎傳代細(xì)胞MDBK中的基因表達(dá)。本發(fā)明為牛病毒病相關(guān)基因功能和轉(zhuǎn)基因牛培育的研究提供新的技術(shù)支持。CCTCC No. C20141162014.07.08
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種使牛trims a基因沉默的si RNA及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種牛trims a下調(diào)表達(dá)的 SiRNA及其應(yīng)用。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在RNA干擾技術(shù)出現(xiàn)W前，基因敲除（gene knockout)是主要的反向遺傳學(xué) (reverse genetics)研究手段，但其技術(shù)難度高，操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)。由于RNA干擾可W利 用SiRNA或SiRNA表達(dá)載體快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的同時(shí)又具有高度的序列專(zhuān)一性，可W特異地 使特定基因沉默，獲得功能喪失或減低突變序列特異方式剔除目的基因表達(dá)，現(xiàn)在已經(jīng)成 為探索基因功能的重要研究手段。在功能基因組研究中，需要對(duì)特定基因功能喪失或減低 突變，W確定其功能，因此RNA干擾可W作為一種強(qiáng)有力的研究工具，用于功能基因組的研 究。
[0004] 大量研究表明，針對(duì)同一祀基因的不同SiRNA序列具有不同的沉默效率，要從具 有不同沉默效率的SiRNA序列中篩選出高效的SiRNA序列，運(yùn)用RNAi技術(shù)更有效地沉默 祀基因，SiRNA序列的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。SiRNA序列在祀基因中的位置一般從祀基因起 始密碼子AUG下游50?100個(gè)核巧酸開(kāi)始搜尋理想的SiRNA序列，越靠近祀基因的3 ' 端，其基因沉默效果可能越好（McManus MT等.RNA，2002,8 (6) :842-850)。W前的研究表 明；不要W 5'非翻譯區(qū)巧'UTR)和3'非翻譯區(qū)（3' UTR)及起始密碼子附近序列作 為設(shè)計(jì)SiRNA的模板，該些區(qū)域含有調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)（如翻譯起始復(fù)合物），調(diào)節(jié)蛋白 可與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物巧ISC)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合SiRNA序列，降低RNAi效應(yīng)腳bashir SM 等.2002,26(2) =199-213);也要避開(kāi)外顯子與外顯子的交界區(qū)域和單核巧酸多態(tài)性（SNP) 區(qū)域。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在5' UTR中引入一個(gè)抑巧順譯的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該樣可W改變mRNA 半衰期（Anthonisen IL 等.RNA，2001，7(7):1024 - 1033)。當(dāng) 5'UTR 的序列中存在著堿 基配對(duì)時(shí)，就可形成發(fā)卡式或莖環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。該類(lèi)結(jié)構(gòu)會(huì)阻止核糖體小亞基的遷移，對(duì) 翻譯起始具有順式阻抑作用。因此運(yùn)用RNAi技術(shù)作用于5' UTR或3' UTR序列，同樣 可引起碑!基因沉默值oench JG 等.Genes Dev, 2003,17 (4) :438-442 ;Eckmann CR 等.Dev Cell, 20023(5) :697-710)，該些發(fā)現(xiàn)使SiRNA序列的篩選范圍涉及到了基因全序列的非編 碼區(qū)和編碼區(qū)。
[0005] 目前常用的H種RNAi的研究策略如下；第一種是直接合成針對(duì)祀基因的SiRNA, 通過(guò)轉(zhuǎn)染的方法使之進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，參與到RNAi途徑，發(fā)揮使祀基因沉默的效應(yīng)。二是構(gòu)建 ShRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成shRNA，利用細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶生成相 應(yīng)的SiRNA,發(fā)揮RNAi作用。H是構(gòu)建ShRNA的病毒表達(dá)載體，常用的病毒載體有腺病毒載 體、腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體等，機(jī)制與質(zhì)粒載體相似，利用了病毒感染細(xì)胞效率比較 高的特點(diǎn)，解決了用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率低的缺陷。利用病毒載體把ShRNA導(dǎo)入細(xì)胞，載體中 的U6啟動(dòng)子確保ShRNA總是表達(dá)；該種裝載了 ShRNA載體可被傳遞到子代細(xì)胞中去，從而 使基因的沉默可被遺傳。
[0006] 對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移是基因功能及基因治療研究中的重要環(huán)節(jié)。病毒 載體W其高的轉(zhuǎn)染率等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用。重組慢病毒是近年逐步發(fā)展起來(lái)的新型基 因轉(zhuǎn)移載體，相比其它常用的病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒等具有較獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，例如 可有效感染非分裂期細(xì)胞、具穩(wěn)定整合能力、細(xì)胞毒性低、免疫反應(yīng)小等（Joseph A等.J Virol, 2008, 82化）：3078-3089)。慢病毒載體目前已發(fā)展至第H代，在系統(tǒng)穩(wěn)定性和安全 性等方面獲得了很大提高，顯示出巨大的應(yīng)用潛力（Niemann H，Kues WA. R巧rod Fertil Dev, 2007,19化）：762-770.)。目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)RNAi的研究中。由于有 些類(lèi)型細(xì)胞用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的SiRNA半衰期短，體外合成SiRNA對(duì)基因 表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠 表達(dá)SiRNA的載體，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄SiRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種 類(lèi)增加，而且對(duì)基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成SiRNA,在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞 中，甚至可W發(fā)揮長(zhǎng)期阻斷基因表達(dá)的作用。在所構(gòu)建的SiRNA表達(dá)載體中，是由RNA聚合 酶III啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)RNA合成的，該是因?yàn)镽NA聚合酶III有明確的起始和終止序列，而且合成 的RNA不會(huì)帶poly A尾。當(dāng)RNA聚合酶III遇到連續(xù)4個(gè)或5個(gè)T時(shí)，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會(huì)停 止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3'端形成1 - 4個(gè)U。U6和化RNA啟動(dòng)子是兩種RNA聚合酶III依賴(lài)的啟動(dòng) 子，其特點(diǎn)是啟動(dòng)子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)21ntRNA和SOntRNA莖環(huán)結(jié) 構(gòu)（stem loop)。在SiRNA表達(dá)載體中，構(gòu)成SiRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動(dòng)子分別 轉(zhuǎn)錄，然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成SiRNA ;也可由載體直接表達(dá)小發(fā)卡狀RNA(small hairpin RNA，shRNA)，載體包含位于RNA聚合酶III啟動(dòng)子和4 - 5個(gè)T轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間的莖環(huán)結(jié) 構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有1 - 4個(gè)U的3'突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工 成siRNA。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達(dá)ShRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細(xì)胞、 干細(xì)胞、受精卵W及分化的后代細(xì)胞中表達(dá)ShRNA,實(shí)現(xiàn)在多種類(lèi)型的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中 特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)的功能性沉默，為在原代的人和動(dòng)物細(xì)胞組織中快速而高效地研究 基因功能，W及產(chǎn)生特定基因表達(dá)降低的動(dòng)物提供了可能性。
[0007] 牛腎傳代細(xì)胞（MDBK)是一種研究病毒感染增殖的常用細(xì)胞。MDBK細(xì)胞對(duì)小鼠 N型逆轉(zhuǎn)錄病毒和人1型HIV(Human immunodeficiency virus type)病毒的感染率極低， 在感染指數(shù)MOI為1的情況下，感染百分率不到1 % (Si, Z.等.Proc.化tl. Acad. Sci. U. S. A. 2006, 103 (19)，7454-7459)，質(zhì)粒載體的直接脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率也很低，造成了 MD服 細(xì)胞對(duì)攜帶外源基因的小鼠N型逆轉(zhuǎn)錄病毒和人1型HIV病毒重組載體的轉(zhuǎn)染效率低，外 源基因表達(dá)水平低下，使外源基因高水平穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因MD服細(xì)胞有效篩選成為費(fèi)時(shí) 費(fèi)力的工作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] TRIMCTripartite motif)家族蛋白具有3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域。該H個(gè)結(jié)構(gòu)域從N端 至Ij C端的順序依次是RING結(jié)構(gòu)域（RING domain)、1個(gè)或2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域、一個(gè)卷曲螺旋 結(jié)構(gòu)域（Coiled-coil domain)，此外該家族還具有一個(gè)可變的C-末端，因此TRIM家族也 稱(chēng)為RBCC家族。自從1991年TRIM(RBCC)蛋白家族第一個(gè)成員XNF7克隆鑒定后，目前人 類(lèi)基因組已發(fā)現(xiàn)和鑒定近70個(gè)TRIM蛋白成員。研究人員在建立能夠被HIV-I感染并產(chǎn)生 致病作用的動(dòng)物模型時(shí)，2004年在非人靈長(zhǎng)動(dòng)物舊世紀(jì)猴中首次發(fā)現(xiàn)了 trims a (Stremlau M，等.化化re, 2004, 427:848-853.)，在多種靈長(zhǎng)類(lèi)品系中如人、類(lèi)人猿和新世紀(jì)猴中也 發(fā)現(xiàn)了 TRIMS基因的存在。在其他哺乳動(dòng)物品系中如牛和兔亦存在TRIMS基因。TRIMS 基因具有多種可變剪接形式（TRIM5 a，目，Y，5，e等），trims a是各種剪接體中最 長(zhǎng)的一個(gè)，是其中唯一 C端具有B30. 2 (PRYSPRY)結(jié)構(gòu)域的剪接體，牛trims a的基因位 于15號(hào)染色體上，全長(zhǎng)2630bp。目前有關(guān)trimSa的主要研究有；trimSa基因序列 (Ylinen, L M.等.2006, J. Virol. 80 (15)，7332-7338)、分子進(jìn)化（Si, Z.等.Proc.化tl. Acad. Sci. U. S. A. 2006, 103 (19)，7454-7459)、抗病毒感染作用（Li X 等.Virology, 2007 ; 366(2) : 2:34-244 ;Brass A L 等.Science, 2008, 3,19 (5865) :234-244 ;Diaz-Griffero F 等.J Virol, 2009:83 (20): 10737-10751)。研究表明部分TRIM蛋白具有抗病毒功能，尤其 是對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒具有限制作用，并且參與了與天然免疫相關(guān)一系列生物過(guò)程。
[0009] 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)通過(guò)RNA干擾牛trims a基因表達(dá)能夠有效地提高人慢病毒載體在牛 腎傳代細(xì)胞中的基因表達(dá)。獲得了牛trims a下調(diào)表達(dá)的SiRNA序列，SiRNA人慢病毒表 達(dá)載體，SiRNA復(fù)制缺陷型人慢病毒，SiRNA復(fù)制缺陷型人慢病毒感染MDBK細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明提供一種使牛trims a基因沉默的RNA干擾方法，其干擾牛trims a基因， 下調(diào)牛的trims a表達(dá)從而提高外源基因在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)水平。
[0011] 本發(fā)明的RNA干擾方法使用選自牛trims a基因的特異SiRNA序列 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'、5'-CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'、5'-CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5，-AGAATGATCTGGTCCAAGA-3，，如沈Q ID No. I-No. 4。其中，5，-CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3 ' 干擾trim5a基因的5'-UTR非編碼區(qū)，5'-CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'， 5'-押0：441'〔4161'口'6〔464-3'和5'-46441641'口'6610：4464-3'干擾付11115〇基因的編碼 區(qū)。
[001引 優(yōu)選地，本發(fā)明的RNA干擾方法使用5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'作為SiRNA序 列。
[0013] 本發(fā)明提供一種牛trims a下調(diào)表達(dá)的SiRNA序列，其能夠下調(diào)牛的trims a表 達(dá)從而提高外源基因在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)水平。
[0014] 本發(fā)明提供一種使牛trims a下調(diào)表達(dá)的siRNA，所述SiRNA優(yōu)選選自 牛 trimSa 基因（L0C505265)的特異 SiRNA 序列 5，-CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3，、 5> -CTGTCAAGCCTGTATCACT-3>、5> -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3> 或 5, -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3，。所述 SiRNA 特別優(yōu)選選自 5, -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3，。
[0015] 本發(fā)明還提供所述SiRNA序列用于制備一種trims a基因沉默的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的 用途。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選為牛細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為MDBK細(xì)胞。
[0016] 本發(fā)明還提供一種SiRNA病毒表達(dá)載體，能夠下調(diào)牛的trims a表達(dá)從而提高外 源基因在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)水平。
[0017] 所述SiRNA病毒表達(dá)載體包含牛trims a下調(diào)表達(dá)的SiRNA序列，能夠下調(diào)牛的 trims a表達(dá)從而提高外源基因在MD服細(xì)胞中的表達(dá)水平。所述SiRNA優(yōu)選選自牛trims a 基因的特異 SiRNA 序列 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'、5' -CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'、 5, -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5, -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3，。特別優(yōu)選選自 5> -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3>。
[0018] 進(jìn)一步地，本發(fā)明上述SiRNA病毒表達(dá)載體為慢病毒表達(dá)載體pLV-shRNA-puro、 pLVX-shRNAl、pLVX-shRNA2。優(yōu)選為 pLV-shRNA-puro。
[0019] 進(jìn)一步地，本發(fā)明上述SiRNA病毒表達(dá)載體為pLV-shRNA-trim5 a -337、 pLV-shRNA-trim5 a -480、pLV-shRNA-trim5 a -808、pLV-shRNA-trim5 a -1037。優(yōu)選地 pLV-shRNA-trim5a -337。
[0020] 本發(fā)明還提供一種構(gòu)建上述SiRNA病毒表達(dá)載體的方法，包括W下步驟：
[0021] (1)根據(jù)牛trims a基因（L0C505265)mRNA全序列篩選RNA干擾祀點(diǎn)，設(shè)計(jì)SiRNA 序列和對(duì)照隨機(jī)序列，
[0022] (2)酶切病毒載體，
[0023] (3)合成接頭引物，退火后連接到病毒載體，
[0024] (4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染大腸桿菌感受態(tài)地5 a，培養(yǎng)過(guò)夜，
[00巧](5)挑取克隆進(jìn)行PCR鑒定，獲得測(cè)序正確的克隆，大提質(zhì)粒定量后備用。
[0026] 進(jìn)一步地，上述方法中SiRNA序列優(yōu)選選自牛trims a基因（L0C505265) 的特異 SiRNA 序列 5，-CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3，、5，-CTGTCAAGCCTGTATCACT-3，、 5, -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5, -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3，。特別優(yōu)選選自 5> -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3>。
[0027] 上述構(gòu)建方法中，病毒表達(dá)載體為慢病毒表達(dá)載體，優(yōu)選為人慢病毒表達(dá)載體。優(yōu) 選為 pLV-shRNA-puro、pLVX-shRNAl、pLVX-shRNA2。特別優(yōu)選為 pLV-shRNA-puroo
[0028] 本發(fā)明還提供上述病毒表達(dá)載體在制備trims a基因沉默的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的 用途。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選為牛細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為MDBK細(xì)胞。
[0029] 本發(fā)明還提供一種trims a基因沉默的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0030] 優(yōu)選地，所述trims a基因沉默的細(xì)胞是牛細(xì)胞，更優(yōu)選地MD服。
[0031] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的trim5a基因沉默的細(xì)胞優(yōu)選是Nl、N2、N3和N14。更優(yōu)選 為N14,該細(xì)胞株命名為牛trimSa基因沉默細(xì)胞株BTL2013,已于2014年7月8日保藏 于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中也，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，郵編430072,保藏編號(hào)為CCTCC No. C2014116。
[003引更進(jìn)一步地，本發(fā)明的trims a基因沉默的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是用 SiRNA干擾，SiRNA優(yōu)選自牛trims a基因（L0C505265)的特異SiRNA序列 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'、5'-CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'、5'-CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5' -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3'，特別優(yōu)選地 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'。
[0033] 本發(fā)明的trims a基因沉默的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是用本發(fā)明的SiRNA人慢 病毒載體制備的復(fù)制缺陷性慢病毒感染獲得。所述SiRNA人慢病毒表達(dá)載體 為 pLV-shRNA-trim5 a-337、pLV-shRNA-trim5 a-480、pLV-shRNA-trim5 a-808、 pLV-shRNA trims a -1037。優(yōu)選地，所述trims a基因沉默的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是用 pLV-shRNA-trim5 a -337制備的復(fù)制缺陷性人慢病毒感染獲得。
[0034] 本發(fā)明還提供一種獲得trims a基因沉默的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，其包括用本發(fā) 明的載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選是牛細(xì)胞，更優(yōu)選是MDBK細(xì)胞。
[00巧]本發(fā)明獲得trims a基因沉默的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法包括W下步驟：
[0036] (1)本發(fā)明的SiRNA人慢病毒表達(dá)載體、P化載體和抑2載體H質(zhì)粒與化Iyfect-V 轉(zhuǎn)染試劑（購(gòu)買(mǎi)于北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司）用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞 肥K293T，獲得SiRNA復(fù)制缺陷型人慢病毒。
[0037] (2)MD服細(xì)胞接種到24孔板，用高糖DMEM和重量百分比10%胎牛血清（購(gòu)買(mǎi) 于美國(guó)Hyclone公司）的培養(yǎng)液培養(yǎng)MD服至細(xì)胞匯合度60%。取SiRNA復(fù)制缺陷型人 慢病毒（濃度約為1?5Xl〇7 TU/ml)100y 1，在室溫下融化，加入培養(yǎng)液400y 1，，加入 polybrene(聚凝胺，購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司）至終濃度6]i g/ml，混勻制成SiRNA人慢病毒 感染液，用感染液替換MDBK細(xì)胞培養(yǎng)液。24小時(shí)后棄感染液，換新的含有終濃度7. 5 y g/ ml嘿嶺霉素的DMEM進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。
[003引 （3)維持所述嘿嶺霉素濃度2周直至每孔出現(xiàn)1-2個(gè)細(xì)胞克隆。
[0039] (4)將嘿嶺霉素濃度減到3. 75 y g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)2周后將細(xì)胞克隆挑選到24孔板 繼續(xù)培養(yǎng)。
[0040] (5)待細(xì)胞擴(kuò)增后凍存并檢測(cè)trims a基因表達(dá)。
[0041] 本發(fā)明的目的在于提供一種提高外源基因在MD服細(xì)胞中的表達(dá)水平的方法，其 包括在MD服細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明的人慢病毒載體。
[0042] 本發(fā)明還提供trims a基因沉默的哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為外源基因表達(dá)宿主的用途， 所述MDBK細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明的人慢病毒病毒載體。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選為牛細(xì)胞。更 優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為MD服細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為MD服細(xì)胞Nl、N2、 N3 和 N14,特別優(yōu)選為 N14(CCTCC No. C2014116)。
[0043] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)SiRNA沉默牛trims a基因表達(dá)，有效地提高人病毒載體 在牛腎傳代細(xì)胞MDBK中的基因表達(dá)。導(dǎo)入本發(fā)明SiRNA序列的細(xì)胞克隆中trims a基因抑 制效果明顯，mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著下降，N14細(xì)胞中trims a的mRNA表達(dá)被下調(diào)了 60%。 用本發(fā)明N14細(xì)胞感染GFP人慢病毒載體的感染效率提高了 4倍（P<0. 05)，表達(dá)效率提高 80倍（(P<0. 01)。本發(fā)明為牛病毒病相關(guān)基因功能和轉(zhuǎn)基因牛培育的研究提供新的技術(shù)支 持。
[0044] 本發(fā)明涉及的牛trims a基因沉默細(xì)胞株BTL2013已于2014年7月8日保藏 于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中也，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，郵編430072,保藏編號(hào)為CCTCC No. C2014116。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045] 圖1為本發(fā)明的trims a基因沉默表達(dá)慢病毒載體的示意圖。SiRNA ds oligo 插入到載體中BamHl和EcoRl之間，由III類(lèi)RNA聚合酶啟動(dòng)子U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生ShRNA, 經(jīng)剪切后產(chǎn)生成熟SiRNA,產(chǎn)生干擾效果。嘿嶺霉素（Puromycin)抗性基因可W用于篩選 trims a基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞株。
[0046] 圖2實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)不同SiRNA序列的細(xì)胞克隆中trims a mRNA相對(duì)表達(dá) 水平。
[0047] 圖3實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)第45代的N14細(xì)胞中trims a的表達(dá)水平。
[004引圖4英光顯微鏡檢測(cè)MOI 100的CMV-GFP-L V慢病毒感染N14細(xì)胞后GFP英光表 達(dá)水平。
[004引圖5英光顯微鏡檢測(cè)MOI 100的CMV-GFP-L V慢病毒感染N14細(xì)胞后GFP基因轉(zhuǎn) 移效率。
[0050] 圖6-1流式細(xì)胞儀檢測(cè)MOI 100的CMV-GFP-L V慢病毒感染N14細(xì)胞后GFP表達(dá) 呈陽(yáng)性的細(xì)胞百分比；
[0051] 圖6-2流式細(xì)胞儀檢測(cè)基因MOI 100的CMV-GFP-L V慢病毒感染N14細(xì)胞后的 GFP基因轉(zhuǎn)移效率和表達(dá)強(qiáng)度。

【具體實(shí)施方式】
[0052] 實(shí)施例1.構(gòu)建帶有編碼特異性沉默trims a基因的SiRNA的DNA的人慢病毒載 體
[0053] 1、篩選編碼trims a基因的SiRNA的DNA序列
[0054] 利用生物信息學(xué)檢索NCBI GeneBank得到牛trims a基因（L0C505265) mRNA 全序列作為siRNA設(shè)計(jì)的碑!序列。在相應(yīng)的siRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站化ttp: //rnaidesigner. Iifetechnologies. com/rnaiexpress/)上進(jìn)行初步設(shè)計(jì)與篩選，找出具有SiRNA功能的可 能祀序列與其對(duì)應(yīng)編碼SiRNA的DNA序列。然后將所選定的正義鏈序列和反義鏈序列與 GeneBank(ht1:p://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)中已知同物種的基因序列進(jìn)行比較，優(yōu) 選出具有SiRNA功能的可能祀序列，分別命名為SiRNA-I至SiRNA-4.包括：
[00巧] (1) trims a -siRNA-1 :
[0056] 5, -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3，
[0057] 3' -TTGTCTTGACTTCTGCCAG-5'
[0058] 似；trims a-siRNA-2
[0059] 5, -CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'
[0060] 3' -AGTGATACAGGCTTGACAG-5'
[0061] 做 trims a -siRNA-3 :
[0062] 5, -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3'
[0063] 3' -TCTGCAGACATGATTGGAG-5'
[0064] (4) trims a -siRNA-4 :
[00巧]5, -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3'
[0066] 3' -TCTTGGACCAGATCATTCT-5'
[0067] 根據(jù)祀序列設(shè)計(jì)編碼SiRNA的DNA序列和隨機(jī)對(duì)照序列，該些序列為
[0068] (1) trims a -337 ;(對(duì)應(yīng)祀序列 SiRNA-I) 5, -3，
[0069] 沈Q ID NO. 5: S
[0070] gatcGCTGGCAGAAGTCAAGACAATTCAAGAGATTGTCTTGACTTCTGCCAGTTTTTTg
[0071] 沈 QIDN0.6:R
[0072] aattcAAAAAACTGGCAGAAGTCAAGACAATCTCTTGAATTGTCTTGACTTCTGCCAGC
[0073] (2) trim5 a -480 ;(對(duì)應(yīng)祀序列 SiRNA-2) 5，-3，
[0074] 沈Q ID NO. 7: S
[00巧]gatcGCTGTCAAGCCTGTATCACTTTCAAGAGAAGTGATACAGGCTTGACAGTTTTTTg
[0076] 沈Q ID NO. 8: R
[0077] aattcAAAAAACTGTCAAGCCTGTATCACTTCTCTTGAAAGTGATACAGGCTTGACAGC
[0078] (3) trims a -808 ;(對(duì)應(yīng)祀序列 siRNA-3) 5, -3，
[0079] SEQ ID NO. 9: S
[0080] gatcGCTCCAATCATGTCTGCAGATTCAAGAGATCTGCAGACATGATTGGAGTTTTTTg
[0081] 沈Q ID NO. 10: R
[0082] aattcAAAAAACTCCAATCATGTCTGCAGATCTCTTGAATCTGCAGACATGATTGGAGC
[0083] (4) trims a -1037 ;(對(duì)應(yīng)祀序列 siRNA-4) 5, -3，
[0084] 沈Q ID NO. 11: S
[0085] gatccAGAATGATCTGGTCCAAGATTCAAGAGATCTTGGACCAGATCATTCTTTTTTTg
[0086] 沈Q ID NO. 12: R
[0087] aattcAAAAAAAGAATGATCTGGTCCAAGATCTCTTGAATCTTGGACCAGATCATTCTg
[0088] (5)隨機(jī)對(duì)照序列 Control ;5, -3'
[0089] 沈Q ID NO. 13: S
[0090] gatccATCGACTAGCCACTTAGACTTCAAGAGAGTCTAAGTGGCTAGTCGATTTTTTTg
[0091] 沈Q ID NO. 14: R
[0092] aattcAAAAAAATCGACTAGCCACTTAGACTCTCTTGAAGTCTAAGTGGCTAGTCGATg
[0093] 2、將上述siRNA的DNA序列和隨機(jī)對(duì)照序列送Invitrogen公司合成，并退火生成 雙鏈寡核巧酸ds OligOo
[0094] 在0. 2ml的PCR擴(kuò)增管中建立下列10 U 1反應(yīng)體系：
[0095] 1 U g/ U 1 的正義鏈；0. 4 y 1
[0096] 1 U g/ U 1 的反義鏈；0. 4 y 1
[0097] 退火緩沖液；9. 2yl
[0098] 95°C賠育上述反應(yīng)體系4min，然后放置室溫下退火5-lOmin。短暫離也后，移出 Iyl反應(yīng)液稀釋至適當(dāng)濃度備用。剩余的SOyM ds oligo儲(chǔ)存于-20°C。
[0099] 3、EcoRl、BamHl雙酶切線性化人慢病毒載體pLV-shRNA-puro (內(nèi)切酶購(gòu)買(mǎi)于肥B 公司，pLV-shRNA-puro載體購(gòu)于北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司）。將ds oligo片段與線 性化的pLV-shRNA-puro載體連接，構(gòu)建重組pLV-shRNA-puro。在室溫下，0. 2ml的PCR擴(kuò) 增管中依次加入下列試劑建立10 U 1連接反應(yīng)體系：
[0100] 上述2稀釋好的ds oligo ;1 y 1
[0101] 經(jīng)酶切純化后的載體：1 U 1
[0102] IOX連接緩沖液：1 Ul
[0103] T4 DNA 連接酶（Promega) : 1 y 1
[0104] 雙蒸水；6 Ul
[0105] 16 C過(guò)夜連接，反應(yīng)終止后-2(TC保存。
[0106] 4、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染大腸桿菌感受態(tài)地5 a。37C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取克隆用引物U6F、U6R 進(jìn)行PCR鑒定。引物序列如下：
[0107] U6F ：GACTATCATATGCTTACCGTAACT
[0108] U6R ：GGTGGATGTGGAATGTGTG
[0109] 5、PCR鑒定正確的克隆用引物U6F測(cè)序（引物合成和測(cè)序由北京中美泰和 生物技術(shù)有限公司完成），將測(cè)序正確的質(zhì)粒分別命名為pLV-shRNA-trim5 a -337、 pLV-shRNA-trim5 a-480、pLV-shRNA-trim5 a-808、pLV-shRNA trims a-1037 和 pLV-shRNA-control。pLV-shRNA-trim5a-337 測(cè)序結(jié)果見(jiàn) SEQ ID No. 17。測(cè)序正確的克 隆用Qiagen Plasmid Plus Maxi Kit質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，定量后保存?zhèn)溆谩?br> [0110] 實(shí)施例2. MD服細(xì)胞trims a基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞株篩選
[0111] 1、MD服細(xì)胞嘿嶺霉素使用濃度測(cè)試
[011引 （I)MD服細(xì)胞W 5X IO^孔接種到24孔板。24小時(shí)后加入嘿嶺霉素（購(gòu)買(mǎi)于美 國(guó)sigma公司）至下列濃度：
[0113] (2)0. 1 U g/ml ；2. 5 u g/ml ；5 u g/ml ；7. 5 u g/ml ；10 u g/ml〇
[0114] (3)每2天換液一次，并重新添加嘿嶺霉素。
[0115] (4)選擇3-4天全部細(xì)胞死亡的濃度為篩選用藥濃度。
[0116] 2、復(fù)制缺陷型人慢病毒的獲得
[0117] 取實(shí)施例1中制備的5個(gè)重組人慢病毒載體中任一個(gè)、P化載體和P肥載體H質(zhì)粒 與化Iyfect-V轉(zhuǎn)染試劑（購(gòu)買(mǎi)于北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司）用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn) 染人胚腎細(xì)胞肥K293T(購(gòu)買(mǎi)于北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司），4她收獲無(wú)復(fù)制能力的 人慢病毒上清液。4C條件下500g離也5min W去除細(xì)胞碎片，收集含慢病毒的上清-7(TC 保存?zhèn)溆谩EG6000沉淀法純化病毒。采用嘿嶺霉素最小致死量篩選病毒感染細(xì)胞的方法， 進(jìn)行慢病毒滴度測(cè)定。按上述方法制備4個(gè)含SiRNA序列和1個(gè)隨機(jī)對(duì)照序列的復(fù)制缺陷 型人慢病毒。
[0118] 3、復(fù)制缺陷型人慢病毒轉(zhuǎn)染MD服細(xì)胞及嘿嶺霉素篩選
[0119] (I)MD服細(xì)胞接種到24孔板，用高糖DMEM和重量百分比10%胎牛血清（購(gòu)買(mǎi)于 美國(guó)Hyclone公司）的培養(yǎng)液按500 y 1/孔培養(yǎng)MD服至細(xì)胞匯合度60%。任取1個(gè)上述 制備的復(fù)制缺陷型人慢病毒（濃度約為1?5 X l〇7TU/ml) 100 y 1，在室溫下融化，加入培養(yǎng) 液400]i 1，加入polybrene(聚凝胺，購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司）至終濃度6]i g/ml,混勻制成 SiRNA人慢病毒感染液500 。4個(gè)含SiRNA序列和1個(gè)隨機(jī)對(duì)照序列的復(fù)制缺陷型人慢 病毒的感染液均按此種方法配制。將每種感染液替換MDBK細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行感染。24小時(shí) 后棄感染液，換新的含有終濃度7. 5 y g/ml嘿嶺霉素DMEM進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。每種感染液做2 個(gè)24孔板。
[0120] (2)維持所述嘿嶺霉素濃度2周直至每孔出現(xiàn)細(xì)胞克隆。
[0121] (3)將嘿嶺霉素濃度減到3. 75 y g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)2周后將細(xì)胞克隆挑選到24孔板 繼續(xù)培養(yǎng)。
[0122] (4)待細(xì)胞擴(kuò)增后凍存并檢測(cè)trims a基因表達(dá)，將獲得的MD服trims a基因沉 默細(xì)胞克隆分別命名為 N14 (對(duì)應(yīng) trims a -337)、N1 (對(duì)應(yīng) trims a -480)、N2 (trims a -808) 和N3 (trims a -1037)。隨機(jī)對(duì)照序列的細(xì)胞克隆命名為NC。細(xì)胞克隆N14命名為牛trims a 基因沉默細(xì)胞株BTL2013,已于2014年7月8日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中也，保藏號(hào)為 CCTCC No. C2014116。
[0123] 4、不同SiRNA序列的細(xì)胞克隆檢測(cè)
[0124] 用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同SiRNA序列的細(xì)胞克隆中trims a mRNA相對(duì)表達(dá)水平。
[0125] 4.1、提取細(xì)胞總RNA
[0126] (1)將上述不同細(xì)胞克隆接入6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%密度，去除培養(yǎng)基，力口 入Iml Trizol/孔。反復(fù)吹吸使細(xì)胞脫落。將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至1. 5ml離也管中。
[0127] (2)室溫賠育5分鐘，加入0. 2ml氯仿，震蕩混勻，室溫賠育3分鐘。
[012引（3)41：，12000巧111 離也 15 分鐘。
[0129] (4)將上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移到新的離也管，加入0. 5ml異丙醇。充分混勻。室溫賠育 10分鐘。
[0130] 巧）4°C 12000巧m 離也 10 分鐘。
[0131] (6)去除上清。
[0132] (7)加入Iml 75%己醇，漂洗RNA沉淀，4°C 7000巧m離也5分鐘。
[0133] (8)去除上清，室溫?fù)]發(fā)干凈殘余液體，加入20 y 1無(wú)RNA酶的水溶解RNA沉淀。 用紫外分光光度計(jì)定量后備用。
[0134] 4. 2反轉(zhuǎn)錄
[0135] (1)在冰上配制如下反應(yīng)物：
[013引 總 RNA Iug
[0137] oligodT primer Iul
[013引加水補(bǔ)足 12 Ul
[013引 似將配好的反應(yīng)物混勻，短暫離也，65C賠育5分鐘，立刻冰浴。
[0140] 0)加入如下試劑：
[0141]

【權(quán)利要求】
1. 一種使牛trim5a基因沉默的RNA干擾方法，其特征在于通過(guò)干擾牛trim5a基因， 下調(diào)牛trim5 a表達(dá)從而提高外源基因在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)水平。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的的方法，其特征在于通過(guò)siRNA序列實(shí)現(xiàn)干擾，所述 siRNA 序列選自 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'、5' -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5' -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3'。
3. -種使牛trim5 a基因沉默的siRNA，其特征在于所述siRNA干擾牛trim5 a基因， 下調(diào)牛的trim5 a表達(dá)從而提高外源基因在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)水平。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的siRNA，其特征在于所述siRNA選 白 5> -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3>、5> -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3> 或 5' -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3'。
5. -種包含權(quán)利要求3或4所述的siRNA的病毒表達(dá)載體，所述病毒表達(dá)載體為 pLV-shRNA-trim5 a -337> pLV-shRNA-trim5 a -808> pLV-shRNA-trim5 a -1037〇
6. 構(gòu)建權(quán)利要求5所述的siRNA病毒表達(dá)載體的方法，包括以下步驟： (1) 根據(jù)牛trim5 a基因 mRNA全序列篩選RNA干擾靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)siRNA序列和對(duì)照隨機(jī) 序列， (2) 酶切病毒載體， (3) 合成接頭引物，退火后連接到病毒載體， (4) 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染大腸桿菌感受態(tài)dH5 a，培養(yǎng)過(guò)夜， (5) 挑取克隆進(jìn)行PCR鑒定，獲得測(cè)序正確的克隆，提質(zhì)粒定量后備用。
7. -種trim5 a基因沉默的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其特征在于所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入根據(jù)權(quán) 利要求5所述的siRNA病毒表達(dá)載體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞是牛腎細(xì)胞MDBK，所述細(xì)胞是 N14,命名為牛trim5a基因沉默細(xì)胞株BTL2013,已于2014年7月8日保藏于中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC No. C2014116。
9. 一種提高外源基因在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)水平的方法，其特征在于所述方法包括在 MDBK細(xì)胞中導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求5所述的siRNA病毒表達(dá)載體。
10. 權(quán)利要求3或4所述的siRNA或權(quán)利要求5所述的siRNA病毒表達(dá)載體在制備 trim5 a基因沉默的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/86GK104357444SQ201410539364
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】劉艷紅, 尚佑軍, 孫德惠, 劉湘濤, 殷宏, 龔真莉, 祁淑蕓, 李勇 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所