一種食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的hda引物及其應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的HDA引物及其應(yīng)用方法，所述HDA引物為：上游引物：如SEQ ID NO：1所示；下游引物：如SEQ ID NO：2所示。本發(fā)明應(yīng)用該HDA引物對產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行檢測，是一種簡便、快速的檢測方法，操作簡單，覆蓋面廣，能應(yīng)用在檢驗的一線，能夠準(zhǔn)確、快速檢測出該食品在衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍內(nèi)是否存在產(chǎn)氣莢膜梭菌，可節(jié)約大量的人力物力，不僅可取得可觀的經(jīng)濟(jì)效益，更為重要的是對進(jìn)出口食品安全的意義特別重大。
【專利說明】-種食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的HDA引物及其應(yīng)用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的HDA引物及其應(yīng)用方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國當(dāng)前主要的食品安全問題是致病微生物污染食品引起的食源性疾病，其中微 生物性食物中毒在影響我國食品安全因素中排名第一，兒童、孕婦、年老體弱者和免疫力低 下的人群更容易成為受害者。產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens)是臨床上氣性壞疽病原菌中 最多見的一種梭菌，因能分解肌肉和結(jié)締組織中的糖，產(chǎn)生大量氣體，導(dǎo)致組織嚴(yán)重氣腫， 繼而影響血液供應(yīng)，造成組織大面積壞死，加之本菌在體內(nèi)能形成莢膜，故名產(chǎn)氣夾膜梭 菌。
[0003] 產(chǎn)氣莢膜梭菌的傳統(tǒng)檢測方法繁瑣、耗時長，一般3-5天才能檢出病原菌。隨著分 子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，PCR等核酸擴(kuò)增技術(shù)以其快速靈敏和特異的優(yōu)勢，不僅日益取 代了傳統(tǒng)的檢測方法，而且使以往無法完成的檢測成為了可能。許多針對特異性病原體的 檢測方法，已經(jīng)開發(fā)為試劑盒并應(yīng)用于常規(guī)檢測，取代了病原體體外培養(yǎng)等傳統(tǒng)的微生物 檢測方法。然而，PCR技術(shù)始終無法擺脫依賴精良儀器設(shè)備的局限，使得以PCR為基礎(chǔ)的核 酸擴(kuò)增技術(shù)無法更為廣泛地推廣和應(yīng)用。
[0004] 隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，以核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)近年來 得到了迅猛的發(fā)展。多種機(jī)制的等溫技術(shù)不僅誕生，而且有些技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，完成了從 實(shí)驗室到實(shí)際應(yīng)用的過渡，正逐步在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的運(yùn)用。特別 是在現(xiàn)場快速檢測技術(shù)方面，核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)顯示了其突出的優(yōu)越性。更為重要的是，核 酸等溫擴(kuò)增技術(shù)由于不需要溫度變化的時間過程且擺脫了對精良儀器設(shè)備的依賴，使病原 體的檢測實(shí)現(xiàn)了快速、簡便和高通量。在實(shí)際操作和儀器要求方面，這些等溫技術(shù)都比PCR 技術(shù)更為簡單和廉價，從而更容易被開發(fā)成現(xiàn)場檢測的應(yīng)用產(chǎn)品。因此，等溫擴(kuò)增技術(shù)是核 酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展方向，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0005] 依賴解旋酶 DNA 等溫擴(kuò)增技術(shù)（Helicase-Dependent isothermal DNA Amplification,簡稱HDA)是由美國NEB公司研究人員Vincent等于2004年發(fā)明一種新型 核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)模擬體內(nèi)DAN在恒溫下復(fù)制的自然過程，在恒溫條件下利用生 物復(fù)制系統(tǒng)的關(guān)鍵組分實(shí)現(xiàn)DNA的體外擴(kuò)增。主要是利用解旋酶在恒溫下解開DNA雙鏈， 同時DNA單鏈結(jié)合蛋白（SSB)穩(wěn)定解開的單鏈為引物提供結(jié)合模板，然后由DNA聚合酶催 化合成互補(bǔ)鏈。新合成的雙鏈在解旋酶的作用下又形成單鏈，并作為下一輪合成的模板進(jìn) 入循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)靶序列的指數(shù)增長。
[0006] HDA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：等溫擴(kuò)增，在一個恒定溫度就能完成擴(kuò)增反應(yīng)，不需要像 PCR那樣循環(huán)的溫度變化；原理簡單，HDA技術(shù)模擬自然界DNA的合成方式，原理清晰易懂； 操作簡便，HDA對引物的設(shè)計與PCR相似，不需要復(fù)雜的引物設(shè)計。對于其他組分也不需要 做任何特殊處理，只需要一個恒溫裝置即可進(jìn)行反應(yīng)；設(shè)備簡單，HDA不需要復(fù)雜的設(shè)備， 只需要一個簡單的恒溫器，如果選用室溫可以進(jìn)行反應(yīng)的酶，甚至不需要恒溫器就可進(jìn)行 反應(yīng)。因此，HDA技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的HDA引物及其應(yīng)用 方法，檢測靈敏度高，耗時短，特異性強(qiáng)。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0009] -種食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的HDA引物，所述HDA引物為：
[0010] 上游引物：如SEQIDN0 :1所示；
[0011] 下游引物：如SEQIDN0 :2所示。
[0012] 一種利用上述HDA引物的產(chǎn)氣莢膜梭菌的HDA檢測方法，采用一步法，使用的反應(yīng) 體系包括：
[0013] 5 μ LlO X 緩沖液，0· 04 μ mol dNTPs, 0. 16 μ mol ATP, IOU Bst ploymerase, 0· 10 ?0· 30 μ g UvrD helicase，I. 0 ?5. 0 μ g T4gp32 或 I. 0 ?6. 0 μ g RecA 蛋白，25 μ M 海藻糖，2 μ L模板DNA，上游引物和下游引物各20pmol，用CldH2O補(bǔ)至50 μ L ;所述IOX緩 沖液包括IOOmM二硫蘇糖醇、350mM Tris-HAcUOOmM MgSOdP lmg/mLBSA ;將反應(yīng)體系放入 65°C恒溫金屬浴中恒溫擴(kuò)增2h。
[0014] 作為本發(fā)明的一種改進(jìn)，反應(yīng)結(jié)束后，吸取5 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電 泳，電泳條件為120V，80mA，電泳時間45min，置凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。
[0015] 作為本發(fā)明的一種改進(jìn)，反應(yīng)體系中，UvrD helicase的濃度為0. 1 μ g。
[0016] 作為本發(fā)明的一種改進(jìn)，反應(yīng)體系中，T4gp32的濃度為5.0 μ g，或者RecA蛋白的 濃度為3. 0μ g。
[0017] 作為本發(fā)明的一種改進(jìn)，反應(yīng)體系中還包括2U?IOU的Phi29嗜溫聚合酶。
[0018] 作為本發(fā)明的一種改進(jìn)，Phi29嗜溫聚合酶的濃度為10U。
[0019] 采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：
[0020] 本發(fā)明是一種簡便、快速的檢測方法，操作簡單，覆蓋面廣，能應(yīng)用在檢驗的一線， 能夠準(zhǔn)確、快速檢測出該食品在衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍內(nèi)是否存在產(chǎn)氣莢膜梭菌，可節(jié)約大 量的人力物力，不僅可取得可觀的經(jīng)濟(jì)效益，更為重要的是對進(jìn)出口食品安全的意義特別 重大。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是實(shí)施例2中產(chǎn)氣莢膜梭菌HDA法檢出限檢測結(jié)果；圖中，泳道I :100bp ladder marker，泳道 2 :10°CFU/g，泳道 3 : K^CFU/g，泳道 4 :102CFU/g，泳道 5 :103CFU/g，泳 道 6 :104CFU/g，泳道 7 :105CFU/g，泳道 8 :106CFU/g。
[0022] 圖2是實(shí)施例2中產(chǎn)氣莢膜梭菌HDA法特異性試驗結(jié)果；圖中，泳道I :100bp ladder marker，泳道2 :產(chǎn)氣莢膜梭菌（22949)，泳道3 :金黃色葡萄球菌（23478);泳道 4 :阪崎克羅諾桿菌（21548);泳道5 :乙型溶血性鏈球菌（10373);泳道6 :蠟樣芽胞桿菌 (10041);泳道7 :腸炎沙門氏菌（21482)，泳道8 :福氏志賀氏菌（21534)。
[0023] 圖3是實(shí)施例2中反應(yīng)體系中UvrD helicase的優(yōu)化結(jié)果；圖中，泳道I: IOObp ladder marker，泳道 2 :0· 30 μ g，泳道 3 :0· 25 μ g，泳道 4 :0· 20 μ g，泳道 5 :0· 15 μ g，泳道 6 :0· 10μ g，泳道 7 :0· 05μ g。
[0024] 圖4是實(shí)施例2中反應(yīng)體系中T4gp32的優(yōu)化結(jié)果；圖中，泳道I: IOObp ladder marker,泳道 2 :6. 0 μ g，泳道 3 :5. 0 μ g，泳道 4 :4. 0 μ g，泳道 5 :3. 0 μ g，泳道 6 :2. 0 μ g，泳 道 7 :1· 0μ g。
[0025] 圖5是實(shí)施例2中反應(yīng)體系中Phi29嗜溫聚合酶提高聚合速率的試驗結(jié)果；圖 中，泳道I: IOObp ladder marker ;泳道2 :Phi29嗜溫聚合酶濃度為2U擴(kuò)增結(jié)果；泳道3 : Phi29嗜溫聚合酶濃度為4U擴(kuò)增結(jié)果；泳道4 :Phi29嗜溫聚合酶濃度為6U擴(kuò)增結(jié)果；泳道 5 :Phi29嗜溫聚合酶濃度為8U擴(kuò)增結(jié)果；泳道6 :Phi29嗜溫聚合酶濃度為IOU擴(kuò)增結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0027] 本發(fā)明各實(shí)施例中所使用的實(shí)驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。并且各實(shí)施 例中所用的材料及試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028] 本發(fā)明各實(shí)施例中部分材料為：DNA Marker，ATP，dNTPs，均購自大連寶生物工程 公司；海藻糖購自Sigma公司；大腸桿菌UvrD解旋酶購自上海富眾生物科學(xué)有限公司；Bst polymerase、MutL protein、T4gp32均購自New England公司；引物（正向引物、反向引物） 由大連寶生物工程公司合成；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購自生物工程（上海） 有限公司。
[0029] 所采用的菌株均購自于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心：產(chǎn)氣莢膜梭菌（22949)、 金黃色葡萄球菌（23478)、阪崎克羅諾桿菌（21548)、乙型溶血性鏈球菌（10373)、蠟樣芽胞 桿菌（10041)、腸炎沙門氏菌（21482)、福氏志賀氏菌（21534)。
[0030] 本發(fā)明各實(shí)施例中部分儀器為：金屬浴為上海東升儀器有限公司生產(chǎn)的6400 型恒溫金屬浴，電泳儀為北京市六一廠生產(chǎn)DXY-33A型電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)為UVP GelDoc-IT凝膠成像系統(tǒng)。
[0031] 實(shí)施例1 :產(chǎn)氣莢膜梭菌HDA引物的設(shè)計
[0032] 引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，2條引物序列見表1。
[0033] 表1產(chǎn)氣莢膜梭菌HDA引物序列表
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的HDA引物，其特征在于：所述HDA引物為： 上游引物：如SEQIDNO :1所示； 下游引物：如SEQIDNO :2所示。
2. -種利用如權(quán)利要求1所述HDA引物的產(chǎn)氣莢膜梭菌的HDA檢測方法，其特征在于： 所述HDA檢測方法采用一步法，使用的反應(yīng)體系包括： 5. L10 X 緩沖液，0? 04u moldNTPs，0? 16u molATP，lOUBst ploymerase，0? 10 ? 0? 30 u gUvrDhelicase，1. 0 ?5. 0 u gT4gp32 或 1. 0 ?6. 0 u gRecA 蛋白，25 u M海藻糖，2 u L 模板DNA，上游引物和下游引物各20pmol，用ddH20補(bǔ)至50 y L ;所述10 X緩沖液包括lOOmM 二硫蘇糖醇、350mMTris-HAc、100mMMgS04 和 lmg/mLBSA ; 將反應(yīng)體系放入65°C恒溫金屬浴中恒溫擴(kuò)增2h。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌的HDA檢測方法，其特征在于：反應(yīng)結(jié)束后，吸 取5 ii L擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為120V，80mA，電泳時間45min，置凝膠 成像系統(tǒng)觀察并拍照。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌的HDA檢測方法，其特征在于：反應(yīng)體系中， UvrDhelicase 的濃度為 0? 1 u g。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌的HDA檢測方法，其特征在于：反應(yīng)體系中， T4gp32的濃度為5. 0 y g，或者RecA蛋白的濃度為3. 0 y g。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌的HDA檢測方法，其特征在于：反應(yīng)體系中還 包括2U?10U的Phi29嗜溫聚合酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌的HDA檢測方法，其特征在于：Phi29嗜溫聚合 酶的濃度為10U。
【文檔編號】C12Q1/68GK104372078SQ201410577781
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】周巍, 張巖, 張薇, 王贊, 章晶晶, 王爽, 劉 東, 李強(qiáng) 申請人:河北省食品檢驗研究院