檢測鼠金黃色葡萄球菌的lamp引物、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP引物、試劑盒及方法，是通過金黃色葡萄球菌aroE基因序列設計LAMP引物，建立適用于臨床樣品檢測、特異性強、靈敏度高的鼠金黃色葡萄球菌可視化檢測方法；可通過觀測綠色熒光的有無快速準確的檢測出金黃色葡萄球菌的存在，最低檢測限為8.1拷貝數(shù)/反應，本發(fā)明設計和篩選的4條引物對靶序列的特異序列區(qū)的識別，保證了LAMP擴增的高度特異性，擴增效率大大提高，耗時短，適合基層現(xiàn)場應用。
【專利說明】檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP引物、試劑盒及方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學微生物檢測【技術領域】，涉及一種檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP 引物及檢測方法。

【背景技術】
[0002] 金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性，無芽孢，鞭毛，大多數(shù)無莢膜，乳酸發(fā)酵，兼性厭氧 的球狀細菌。金黃色葡萄球菌常見于皮膚表面及上呼吸道黏膜。作為機會致病菌，金黃色 葡萄球菌為表皮正常菌群，常造成伺機性感染，并且該菌的耐藥株對抗菌素治療帶來了更 大的難度，為實驗用嚙齒動物的常見健康監(jiān)控指標之一。
[0003]目前常用的金黃色葡萄球菌檢測方法包括使用監(jiān)測拭子直接鋪板法及顯色培養(yǎng) 基法和常規(guī)PCR法/熒光定量PCR法，均可以有效地檢測。但細菌培養(yǎng)法較其他方法存在 難以標準化，耗時長，培養(yǎng)基，操作步驟或培養(yǎng)條件在不同實驗室差別較大等缺點，故結果 可能不一致或出現(xiàn)假陰/陽性。常規(guī)PCR法和熒光定量PCR法，需經過變性，退火，延伸，力口 上DNA提取整個過程大概需要2?4個小時才能出結果，并且需要精密昂貴的儀器和試劑， 對基層開展快速簡便的分子診斷不利。
[0004]Notomi等人于2000年發(fā)明環(huán)介導等溫擴增（LAMP)技術，經過逐步改進，該技術借 助6條特異性引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，可在等溫條件下快速，高特異和靈 敏的擴增靶序列。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP引物、試劑盒及方法。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：
[0007] 檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP引物，包括以下2對引物：外引物F3和B3以及內 引物FIP和BIP;FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0. 2 所示，F(xiàn)3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 4所示。
[0008] 檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP試劑盒，該試劑盒包括40iimol.I71的FIP1. 0iiL， 40iimol.L-1 的BIP1. 0iiL，10iimol.L-1 的F30. 5iiL以及 10iimol.L-1 的B30. 5iiL;F3 和 B3為外引物，F(xiàn)IP和BIP為內引物，F(xiàn)IP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 1所示，BIP的核苷酸 序列如SEQ.ID.NO. 2所示，F(xiàn)3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ. ID.NO. 4 所示。
[0009] 所述試劑盒還包括2X反應緩沖液12. 5iiL，8U/iiLBst聚合酶1iiL，25mMdNTP 1.51^以及熒光染料11^。
[0010] 所述熒光染料為質量分數(shù)〇. 5%的鈣黃綠素水溶液。
[0011] 檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP方法，包括以下步驟：
[0012] 1)提取待檢測對象（例如大鼠、小鼠）的DNA;
[0013] 2)將以下組份進行混合，構建包括2對引物F3和B3以及FIP和BIP的25iiLLAMP 反應體系：
[0014] 2\反應緩沖液12.51^，4011111〇1.171的卩1?1.0111，4011111〇1.17 1的81?1.0111， 10iimol.I71 的F30. 5iiL，10iimol.I71 的B30. 5iiL，8U/iiLBst聚合酶 1iiL，25mMdNTP 1. 5yL，待檢測對象的DNA2yL，熒光染料1yL，超純水補足至25yL;FIP的核苷酸序列 如SEQ.ID.NO. 1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 2所示，F(xiàn)3的核苷酸序列如SEQ. ID.NO. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 4所示；
[0015] 3)將LAMP反應體系在63°C加熱40min，然后在85°C加熱5min，反應完成；
[0016] 4)待反應完成后通過以下方式進行結果的判定：
[0017]反應完成后觀察LAMP反應體系是否有顏色的變化，若LAMP反應體系顏色發(fā)生變 化則為陽性反應，表明在待檢測對象中檢測到金黃色葡萄球菌；若LAMP反應體系顏色未發(fā) 生變化則為陰性反應，表明在待檢測對象中未檢測到金黃色葡萄球菌。
[0018] 所述待檢測對象的DNA的提取方法為：
[0019] 將待檢測對象的血液、組織液或化膿液接種于肉湯培養(yǎng)基中，然后在37°C條件下 培養(yǎng)24h得菌液，取菌液離心，將離心得到的上清用DNA試劑盒提取DNA。
[0020] 在檢測時還分別設立陽性對照和陰性對照，以金黃色葡萄球菌基因組DNA為陽性 對照，以超純水為陰性對照；在進行結果的判定時，還與陽性對照和陰性對照比較，若待檢 測對象所對應的LAMP反應體系以及陽性對照所對應的LAMP反應體系均呈綠色，則判定待 檢測對象的檢測結果為陽性反應，若待檢測對象所對應的LAMP反應體系以及陰性對照所 對應的LAMP反應體系均呈橘黃色，則判定待檢測對象的檢測結果為陰性反應。
[0021] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果：
[0022] 本發(fā)明采用金黃色葡萄球菌aroE基因作為檢測目標并合成LAMP引物，實現(xiàn)了對 金黃色葡萄球菌簡便、快捷、準確的檢測；該基因經NCBIBLAST搜索后，在金黃色葡萄球菌 種屬間變異率低且兼顧不同血清型之間的保守序列，與其他種屬細菌的同源性非常低，因 此可以作為通用性基因檢測金黃色葡萄球菌。
[0023] 本發(fā)明提供的檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP方法，其特異性強：所檢測的陰性對 照和大小鼠基因組均無陽性結果。
[0024] 本發(fā)明提供的檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP方法，其檢測靈敏度高：常規(guī)PCR檢 測方法靈敏度為l〇〇pg/reaction(100copy number/reaction)數(shù)量級，采用本發(fā)明檢測方 法，檢測下限為5. 8fg/反應（8. 1拷貝數(shù)/反應）。
[0025] 本發(fā)明提供的檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP方法，其檢測迅速、出結果方便：常 規(guī)PCR整個過程在2?4個小時才能出結果，熒光定量PCR也需要1?1. 5個小時，本發(fā)明 提供的檢測方法在約50分鐘即可出現(xiàn)陽性結果。并且操作簡便，對儀器要求低，僅需要普 通水浴鍋，并可以通過染料直接觀測結果，省去了電泳的步驟，可在基層檢測鼠金黃色葡萄 球菌的實踐中有廣泛的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為陽性反應和陰性反應的顏色特異性示意圖；
[0027] 圖2為LAMP特異性實驗結果示意圖；
[0028] 圖3為梯度稀釋后的LAMP檢測結果示意圖；
[0029] 圖中：Pos表示陽性對照的檢測結果，USa表示待檢測對象（感染金黃色葡萄 球菌）的檢測結果，H20表示陰性對照的檢測結果，S. A表示金黃色葡萄球菌基因組DNA 的檢測結果，P. a表示綠膿桿菌基因組DNA的檢測結果，rat表示大鼠基因組DNA的檢 測結果，mouse表示小鼠基因組DNA的檢測結果，A表示8. lX105copies/ii L的檢測結 果，8表示8.1父104(3(^168/1^的檢測結果，（：表示8.1\103(3(^168/1^的檢測結果，0 表示8. lX102copies/li L的檢測結果，E表示8. lXlOcopies/ii L的檢測結果，F(xiàn)表示 8. lcopies/y L的檢測結果，G表示8. IX KTicopies/ii L的檢測結果，H表示陰性對照的檢 測結果。

【具體實施方式】
[0030] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限 定。
[0031] 本發(fā)明公開了一種檢測實驗用鼠金黃色葡萄球菌的LAMP方法，該檢測方法基于 環(huán)介導等溫擴增來進行的。
[0032] 本發(fā)明針對金黃色葡萄球菌保守基因aroE特異堿基序，設計了包括外引物，內引 物的特異性引物。只需在建立的LAMP反應體系加入樣品即可通過觀測綠色熒光的有無快 速準確的檢測出金黃色葡萄球菌的存在，最低檢測限為8. 1拷貝數(shù)/反應，為快速檢測大小 鼠金黃色葡萄球菌提供了 一個適合基層的便捷方法。
[0033] 1、引物設計與合成：
[0034] 考慮到檢測的特異性和準確性，根據(jù)文獻報道，選擇金黃色葡萄球菌保守基因 aroE特異堿基序作為檢測目標，設計并合成LAMP引物，aroE基因在金黃色葡萄球菌種屬間 變異率低且兼顧不同血清型之間的保守序列，與其他種屬細菌的同源性非常低，因此可以 作為通用性基因檢測金黃色葡萄球菌。
[0035] 采用引物設計軟件Primer Explorer 4. 0,針對金黃色葡萄球菌aroE基因的保守 區(qū)設計了 4條LAMP引物，包括正向/反向內引物FIP/BIP，正向/反向外引物F3/B3，所述 引物與aroE(基因登錄號：NC_002745. 2)基因362?591位的核酸序列的一部分或其互補 鏈互補。具體的引物序列見表1。
[0036] 表1LAMP方法檢測鼠金黃色葡萄球菌用引物序列
[0037]

【權利要求】
1. 檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP引物，其特征在于：包括以下2對引物：外引物F3 和B3以及內引物FIP和BIP ;FIP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，BIP的核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 2所示，F(xiàn)3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4 所示。
2. 檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括40 y mol噸4的 FIP 1. 0 ii L，40 ii mol ? I71 的 BIP 1. 0 ii L，10 ii mol ? I71 的 F3 0? 5 ii L 以及 10 ii mol ? I71 的 B3 0. 5 ii L ;F3和B3為外引物，F(xiàn)IP和BIP為內引物，F(xiàn)IP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所 示，BIP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示，F(xiàn)3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，B3的核 苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
3. 如權利要求2所述檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP試劑盒，其特征在于：所述試劑盒 還包括2 X反應緩沖液12. 5 ii L，8U/ ii L Bst聚合酶1 ii L，25mM dNTP 1. 5 ii L以及熒光染 料 1 y L。
4. 如權利要求3所述檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP試劑盒，其特征在于：所述熒光染 料為質量分數(shù)〇. 5 %的鈣黃綠素水溶液。
5. 檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 提取待檢測對象的DNA ; 2) 將以下組份進行混合，構建包括2對引物F3和B3以及FIP和BIP的25 ii L LAMP反 應體系： 2 X 反應緩沖液 12.5 iiL，的 FIP 1.0 iiL，的 BIP 1.0 iiL， 10 ii mol .171 的 F3 0? 5 ii L，10 ii mol .171 的 B3 0? 5 ii L，8U/ ii L Bst 聚合酶 1 ii L，25mM dNTP 1. 5 y L，待檢測對象的DNA 2 y L，熒光染料1 y L，超純水補足至25 y L ;FIP的核苷酸序列 如SEQ. ID. NO. 1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示，F(xiàn)3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示； 3) 將LAMP反應體系在63°C加熱40min，然后在85°C加熱5min，反應完成； 4) 待反應完成后通過以下方式進行結果的判定： 反應完成后觀察LAMP反應體系是否有顏色的變化，若LAMP反應體系顏色發(fā)生變化則 為陽性反應，表明在待檢測對象中檢測到金黃色葡萄球菌；若LAMP反應體系顏色未發(fā)生變 化則為陰性反應，表明在待檢測對象中未檢測到金黃色葡萄球菌。
6. 如權利要求5所述檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP方法，其特征在于：所述待檢測對 象的DNA的提取方法為： 將待檢測對象的血液、組織液或化膿液接種于肉湯培養(yǎng)基中，然后在37°C條件下培養(yǎng) 24h得菌液，取菌液離心，將離心得到的上清用DNA試劑盒提取DNA。
7. 如權利要求5所述檢測鼠金黃色葡萄球菌的LAMP方法，其特征在于：在檢測時還分 別設立陽性對照和陰性對照，以金黃色葡萄球菌基因組DNA為陽性對照，以超純水為陰性 對照；在進行結果的判定時，還與陽性對照和陰性對照比較，若待檢測對象所對應的LAMP 反應體系以及陽性對照所對應的LAMP反應體系均呈綠色，則判定待檢測對象的檢測結果 為陽性反應，若待檢測對象所對應的LAMP反應體系以及陰性對照所對應的LAMP反應體系 均呈橘黃色，則判定待檢測對象的檢測結果為陰性反應。
【文檔編號】C12N15/11GK104328173SQ201410582971
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權日:2014年10月27日
【發(fā)明者】師長宏, 路凡, 陳新雨, 張海, 趙勇, 白冰, 張彩勤 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學