產(chǎn)生乳制品的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用具有乳糖酶活性的酶產(chǎn)生乳制品的方法。
【專利說明】產(chǎn)生乳制品的方法
[0001] 本申請是申請日為2008年12月2日，申請?zhí)枮?200880125837. 1"（國際申請?zhí)?為"PCT/EP2008/066624"），名稱為"產(chǎn)生乳制品的方法"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 涉及序列表
[0003] 本申請包含序列表。

【技術(shù)領域】
[0004] 本申請涉及使用具有乳糖酶活性的酶產(chǎn)生乳制品的方法。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 乳糖耐受性可能是美國和世界上其它地區(qū)最廣為人知的食物敏感性。據(jù)估計，世 界人群中約70%具有遺傳控制的受限的消化乳糖的能力。因此，為了幫助不能消化乳品的 人食用乳制食品，對于不包含乳糖或只包含較低水平乳糖的乳制食品的需要一直在增長。
[0007] 乳糖酶在商業(yè)上用于分解乳中的乳糖以產(chǎn)生乳制品，該乳制品適合于乳糖不耐受 的人們和/或具有更甜的口味。因為葡萄糖和半乳糖比乳糖更甜，所以乳糖酶產(chǎn)生的口味 更好。乳糖酶也用于冰激凌的生產(chǎn)中。乳糖在冰激凌的低溫結(jié)晶，而葡萄糖和半乳糖保持 為液體并使質(zhì)地更光滑。乳糖酶也用于將乳清變成糖漿轉(zhuǎn)化中。乳糖酶也用于生產(chǎn)煉乳 (condensed milk)〇
[0008] 已經(jīng)從各種生物體，包括微生物中分離到了乳糖酶。乳糖酶經(jīng)常是微生物如克 魯維酵母屬（Kluyveromyces)和芽孢桿菌屬（Bacillus)的胞內(nèi)成分?？唆斁S酵母，特別 是脆壁克魯維酵母（K.fragilis)和乳酸克魯維酵母（K. Iactis)，和其它真菌如念珠菌 屬（Candida)、圓酵母屬（Torula)和球擬酵母屬（Torulopsis)的真菌，是真菌乳糖酶的 通常來源，而凝結(jié)芽孢桿菌（B. coagulans)和環(huán)狀芽孢桿菌（B. circulans)是細菌乳糖 酶的公知來源。提供源自這些生物體的幾種商業(yè)乳糖酶制備物，如Lactozym?i (可由 Novozymes, Denmark 獲得），HA-乳糖酶（可由 Chr. Hansen, Denmark 獲得）和 Maxilact?i (可由DSM，the Nether lands獲得），其全部來自乳酸克魯維酵母。所有這些乳糖酶也稱作 中性乳糖酶，其最適pH為pH 6-pH 8。當在例如低乳糖酸奶的生產(chǎn)中使用這種乳糖酶時，必 須在發(fā)酵前在單獨的步驟中進行酶處理，或者必須使用高酶劑量，因為它們的活性在發(fā)酵 過程中隨pH下降而下降。此外，這些乳糖酶不適于在高溫進行的乳中乳糖的水解，在某些 情況下這對于保持低的微生物計數(shù)有益，并且因此確保良好的乳品質(zhì)。
[0009] 已經(jīng)描述了幾種最適pH更低的胞外乳糖酶，參見，例如，美國專利5, 736, 374描述 了這種乳糖酶的實例，所述酶由米曲霉（Aspergillus oryzae)產(chǎn)生。
[0010] 已經(jīng)描述了具有高轉(zhuǎn)半乳糖基活性的來自雙歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)的乳糖酶，全長形式的和特別是從C-末端截短的（參見，例如，J0rgensen等 (2001)，Appl. Microbiol. Biotechnol.，57:647-652 或 EP 專利 1，283, 876)。
[0011] 本發(fā)明的一個目的是提供通過使用乳糖酶產(chǎn)生具有低乳糖水平的乳制品的方法， 例如發(fā)酵乳制品，如酸奶。另一個目的是提供通過使用乳糖酶產(chǎn)生低乳糖飲料乳的方法，其 中與已知方法相比，所述方法形成的異味（off-flavour)和/或棕色（brown color)較少。 根據(jù)本發(fā)明待使用的乳糖酶應有效地水解乳糖，并且任選地允許幾乎完全水解乳糖。特別 地，這種乳糖酶應具有高的乳糖酶對轉(zhuǎn)半乳糖基酶活性的比例。為了用于發(fā)酵乳制品的生 產(chǎn)，乳糖酶應在寬的pH范圍內(nèi)有活性。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本發(fā)明的發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，來自雙歧雙歧桿菌的胞外乳糖酶的C-末端截 短片段，其由于能由乳糖得到大量半乳寡糖（galactooligosaccharides)的能力而最初得 到分離并請求專利保護，它能非常成功地用于水解乳中的乳糖。當在37°C在水+100g/l乳 糖中測試時，如現(xiàn)有技術(shù)所述，酶高效地產(chǎn)生半乳寡糖。然而，當在乳中測試時，水解活性與 轉(zhuǎn)半乳糖基活性的比例顯著變化，導致有效水解并產(chǎn)生非常低水平的半乳寡糖。
[0014] 因此，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0015] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0016] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 1的氨基酸 28-1931或其片段至少70 %相同的氨基酸序列。
[0017] 在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0018] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0019] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 2的氨基酸 28-1331至少70 %相同的氨基酸序列。
[0020] 此外，發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)在使用來自雙歧雙歧桿菌的乳糖酶時，與常用于乳 處理的其它乳糖酶相比，可以獲得非常低水平的乳糖。使用來自雙歧雙歧桿菌的乳糖酶的 另一個令人預料不到的優(yōu)勢是酶在高溫有活性，允許在，例如52°c，處理乳，由此減少微生 物技術(shù)并從而改進乳的質(zhì)量。
[0021] 因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0022] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0023] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
[0024] 其中步驟b)在至少50°C進行。
[0025] 在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟b)在至少52°C進行。
[0026] 此外，發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，來自雙歧雙歧桿菌的乳糖酶在寬的pH范圍內(nèi)有活 性。
[0027] 因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0028] a)提供包含乳糖的乳基的底物；和
[0029] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中乳糖酶活性在37°C的最適pH 為pH 5以上，并且在37°C測定時，其中酶在pH 5的乳糖酶活性是其在pH 6的乳糖酶活性 的至少50%。
[0030] 使用在寬的pH范圍內(nèi)有活性的乳糖酶對于發(fā)酵乳制品的產(chǎn)生特別有用，其中其 允許低酶劑量，因為酶在發(fā)酵過程中和之后仍有活性。此外，可以使用這種酶達到發(fā)酵乳制 品中非常低水平的乳糖。
[0031] 因此，在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生低乳糖的發(fā)酵乳制品的方法，其包 括
[0032] a)提供包含乳糖的乳基底物，
[0033] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中乳糖酶活性在37°C的最適pH 為pH 5以上，并且在37°C測定時，其中酶在pH 5的乳糖酶活性時是在pH 6的乳糖酶活性 的至少50%，和
[0034] c)用微生物發(fā)酵所述底物。
[0035] 本發(fā)明的發(fā)明人還令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在貨架期（shelf life)延長的低乳糖飲料乳 的生產(chǎn)中，乳糖水解優(yōu)選在高溫進行，如在至少60°C的溫度。優(yōu)選地，這種生產(chǎn)可以包括同 時的低巴氏滅菌和乳糖酶處理。因此，在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方 法，其包括
[0036] a)提供包含乳糖的乳基底物，和
[0037] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
[0038] 其中步驟b)在62°C -64°C的溫度進行10分鐘-4小時。
[0039] 在一個更優(yōu)選的方面，所述方法中的步驟b)之后為冷卻至KTC以下而不進行進 一步的熱處理。這允許酶在乳冷卻后（即，在保存期間）仍然有活性。在另一個更優(yōu)選的 方面，所述方法中的步驟b)之后為UHT處理。
[0040] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，乳基底物中至少70%的乳糖被水解。更優(yōu)選地，乳基 底物中至少80%，如至少85%，至少90%，至少95 %或至少98 %的乳糖被水解。
[0041] 在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0042] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0043] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 3或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0044] 在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0045] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0046] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID N0:4或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0047] 在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0048] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0049] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 5或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0050] 在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0051] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0052] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 6或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0053] 在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0054] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0055] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 7或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0056] 具體地，本發(fā)明涉及如下各項：
[0057] 1.用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0058] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0059] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 2的氨基酸 28-1331至少70 %相同的氨基酸序列。
[0060] 2.用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0061] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0062] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 1的氨基酸 28-1931或其片段至少70 %相同的氨基酸序列。
[0063] 3.用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0064] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0065] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 3-4中任一 序列或這些序列中任一個的片段至少70%相同的氨基酸序列。
[0066] 4.前述項中任一項的方法，其中所述酶源自雙歧桿菌屬（Bifidobacterium)的微 生物。
[0067] 5.用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0068] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0069] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 5-7中任一 序列或這些序列中任一個的片段至少70%相同的氨基酸序列。
[0070] 6.前述項中任一項的方法，其中在37°C乳糖酶活性的最適pH為pH 5以上，并且 其中在37°C測定時，酶在pH 5的乳糖酶活性為在pH 6時其乳糖酶活性的至少50%。
[0071] 7.用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0072] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0073] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中在37°C乳糖酶活性的最適pH 為pH 5以上，并且其中在37°C測定時，酶在pH 5的乳糖酶活性為在pH 6時其乳糖酶活性 的至少50%。
[0074] 8.前述項中任一項的方法，其中步驟b)在至少50°C的溫度進行。
[0075] 9.用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0076] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0077] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
[0078] 其中步驟b)在至少50°C的溫度進行。
[0079] 10.前述項中任一項的方法，其中在pH 6. 5測定時，酶在52°C的溫度的乳糖酶活 性是其在38°C的溫度的乳糖酶活性的至少70%。
[0080] 11.前述項中任一項的方法，其中向乳基底物以所述乳基底物中小于30LAU每g乳 糖的濃度加入酶。
[0081] 12.前述項中任一項的方法，其中向乳基底物以小于1000LAU每升乳基底物的濃 度加入酶。
[0082] 13.前述項中任一項的方法，其中在水解乳基底物中的乳糖時，所述酶的乳糖酶與 轉(zhuǎn)半乳糖基酶的活性比例大于1:1。
[0083] 14.前述項中任一項的方法，其進一步包括如下步驟
[0084] c)用微生物發(fā)酵所述底物，
[0085] 其中所述乳制品是發(fā)酵乳制品。
[0086] 15.項14的方法，其中所述發(fā)酵的乳制品是酸奶。
[0087] 16.項14-15中任一項的方法，其中步驟b)和步驟c)基本上同時進行。
[0088] 17.項14-16中任一項的方法，其中步驟b)的酶和步驟c)的微生物基本上同時加 入所述乳基底物。
[0089] 18.項14-17中任一項的方法，其中在發(fā)酵兩小時后少于80%的乳糖已被水解，并 且其中在最終的發(fā)酵乳制品中多于90%的乳糖已被水解。
[0090] 19.項14-18中任一項的方法，其中在步驟c)完成時少于80%的乳糖已被水解， 并且其中在最終的發(fā)酵乳制品中多于90%的乳糖已被水解。
[0091] 20.項1-13中任一項的方法，其中步驟b)在至少60°C的溫度進行。
[0092] 21.項20的方法，其中所述乳基底物是生乳，其在步驟b)前未進行巴氏滅菌。
[0093] 22.項20-21中任一項的方法，其中步驟b)在62°C -64°C的溫度進行10分鐘-4 小時，并且其中步驟b)之后為冷卻至KTC以下而不進一步加熱處理。
[0094] 23.項20-22中任一項的方法，其中在步驟b)完成時少于80%的乳糖已被水解， 并且其中在一周后多于90 %的乳糖已被水解。
[0095] 24.項20-21中任一項的方法，其中步驟b)在62°C -64°C的溫度進行10分鐘-4 小時，并且其中步驟b)之后為UHT處理。
[0096] 發(fā)明詳述
[0097] 乳某底物
[0098] 術(shù)語"乳"，在本發(fā)明的背景中，應理解為對任何哺乳動物如牛、綿羊、山羊、水?；?駱駝擠奶而獲得的乳狀分泌物。
[0099] 在本發(fā)明的上下文中，"乳基底物"可以是任何生的和/或加工的乳材料。有用的 乳基底物包括，但不限于包含乳糖的任何乳或乳樣產(chǎn)品的溶液/懸浮液，如全脂或低脂乳、 脫脂乳、酪乳、復原乳粉（reconstituted milk powder)、煉乳、干乳的溶液（solutions of dried milk)、UHT乳、乳清、乳清滲透液（whey permeate)、酸性乳清（acid whey)或乳脂 (cream)〇
[0100] 優(yōu)選地，乳基底物是乳或脫脂乳粉的水溶液。
[0101] 乳基底物可以比生乳更濃縮的。
[0102] 在一個實施方案中，乳基底物中蛋白質(zhì)與乳糖的比例為至少0. 2,優(yōu)選至少0. 3， 至少0. 4,至少0. 5,至少0. 6或者，最優(yōu)選地，至少0. 7。
[0103] 乳基底物可以根據(jù)本領域公知的方法均質(zhì)化和巴氏滅菌。
[0104] "均質(zhì)化"在本文使用時表示充分混合以獲得可溶的懸浮液或乳液?？梢赃M行均質(zhì) 化而將乳脂分解成更小的尺寸，使其不再與乳分離。這可以通過迫使乳在高壓通過小孔而 完成。
[0105] "巴氏滅菌"在本文使用時表示減少或消除乳基底物中活生物體（如微生物）的存 在。優(yōu)選地，通過將特定溫度保持特定時間而獲得巴氏滅菌。通常通過加熱而獲得特定的 溫度。可以選擇溫度和持續(xù)時間，從而殺死或失活某些細菌，如有害的細菌，和/或失活乳 中的酶。然后可以進行快速冷卻步驟。
[0106] gLffel 丨品
[0107] 在本發(fā)明的上下文中，"乳制品"可以是任何食品，其中主要成分之一為乳基成分。 優(yōu)選地，主要成分為乳基成分。更優(yōu)選地，主要成分是乳基底物，其已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的方法 用具有乳糖酶活性的酶處理。在本發(fā)明的上下文中，"主要成分之一"表示該成分具有占乳 制品總干物質(zhì)的超過20%，優(yōu)選超過30%或超過40%的干物質(zhì)，而"主要成分"表示構(gòu)成該 成分具有占乳制品總干物質(zhì)的超過50 %，優(yōu)選超過60 %或超過70 %的干物質(zhì)。
[0108] 根據(jù)本發(fā)明的乳制品可以是，例如，脫脂乳、低脂乳、全脂乳、乳脂、UHT乳、具有延 長的貨架期的乳品、發(fā)酵乳制品、乳酪、酸奶、奶油、乳質(zhì)涂抹料（dairy spread)、酪乳、酸化 乳飲料、酸奶油、乳清基飲料、冰激淋、煉乳、乳糖楽（dulce de Ieche)或調(diào)味乳飲料。乳制 品可以由本領域已知的任何方法生產(chǎn)。
[0109] 乳制品可以另外包括非乳成分，例如植物成分如，例如，植物油、植物蛋白和/或 植物糖。乳制品還可以進一步包括添加劑如，例如，酶、調(diào)味劑、微生物培養(yǎng)物如益生培養(yǎng) 物，鹽、甜味劑、糖、酸、水果、果汁或本領域已知可作為乳制品成分或添加劑的任何其它成 分。
[0110] 在本發(fā)明的一個實施方案中，一種或多種乳成分（milk components)和/或乳級 分（milk fractions)占乳制品的至少50% (重量/重量），如至少70%，例如至少80%, 優(yōu)選至少90%。
[0111] 在本發(fā)明的一個實施方案中，已根據(jù)本發(fā)明的方法用具有乳糖酶活性的酶處理的 一種或多種乳基底物，占乳制品的至少50% (重量/重量），如至少70%，例如至少80%， 優(yōu)選至少90%。
[0112] 在本發(fā)明的一個實施方案中，乳制品是未通過加入半乳寡糖而富集的乳制品。
[0113] 在本發(fā)明的一個實施方案中，用酶處理的乳基底物在作為乳制品的成分使用之前 未干燥。
[0114] 在本發(fā)明的一個實施方案中，乳制品是冰激凌。在本上下文中，冰激凌可以是任何 種類的冰激凌，如全脂冰激凌、低脂冰激凌或基于酸奶或其它發(fā)酵乳制品的冰激凌。冰激凌 可以通過本領域任何已知方法生產(chǎn)。
[0115] 在本發(fā)明的一個實施方案中，乳制品是乳或煉乳。
[0116] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，乳制品是UHT乳。在本發(fā)明的上下文中， UHT乳是已經(jīng)進行了滅菌過程的乳品，所述滅菌過程意欲殺死所有微生物，包括細菌孢子。 UHT(超高溫）處理可以是，例如，在130°C熱處理30秒，或在145°C熱處理一秒。
[0117] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，乳制品是ESL乳。在本發(fā)明的上下文中，ESL 乳是由于微濾和/或熱處理而具有延長的貨架期的乳品，并且其能在2-5°C在貨架上保持 新鮮至少15天，優(yōu)選至少20天。
[0118] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，乳制品是發(fā)酵乳制品，例如，酸奶。
[0119] 發(fā)酵乳制品
[0120] 在本發(fā)明的上下文中，"發(fā)酵乳制品"應理解為任何乳制品，其中任何類型的發(fā)酵 形成生產(chǎn)過程的一部分。發(fā)酵乳制品的實例是產(chǎn)品如酸奶、酪乳、鮮奶油（crSme fraiche)、 酸奶酪（quark)和鮮奶酪（fromage frais)。發(fā)酵乳制品可以由本領域任何已知的方法產(chǎn) 生。
[0121] 在本發(fā)明的方法中，"發(fā)酵"表示通過微生物的作用而將糖轉(zhuǎn)化成醇或酸。優(yōu)選地， 本發(fā)明的方法中的發(fā)酵包括將乳糖轉(zhuǎn)化成乳酸。
[0122] 在本發(fā)明的上下文中，"微生物"可以包括能發(fā)酵乳底物的任何細菌或真菌。
[0123] 用于大多數(shù)發(fā)酵乳品的微生物選自通常稱為乳酸細菌的細菌組。如本文所 使用的，術(shù)語"乳酸細菌"指革蘭氏陽性、微嗜氧或厭氧細菌，其發(fā)酵糖并產(chǎn)生酸，包 括乳酸作為主要產(chǎn)生的酸，以及乙酸和丙酸。工業(yè)上最有用的乳酸細菌可在乳桿菌 目（Lactobacillales)中找到，其中包括乳球菌屬菌種（Lactococcus spp·)、鏈球菌 屬菌種（Streptococcus spp.)、乳桿菌屬菌種（Lactobacillus spp.)、明串珠菌屬 菌種（Leuconostoc spp.)、假明串珠菌屬菌種（Pseudoleuconostoc spp.)、片球菌 屬菌種（Pediococcus spp.)、短桿菌屬菌種（Brevibacterium spp.)、腸球菌屬菌種 (Enterococcus spp.)和丙酸菌屬菌種（Propionibacterium spp·)。此外，乳酸細菌組中 通常包括屬于厭氧細菌雙歧桿菌，即雙歧桿菌屬菌種（Bifidobacterium spp.)的組的乳酸 產(chǎn)生細菌，其常單獨用作食品培養(yǎng)物或與乳酸細菌組合。
[0124] 乳酸細菌通常以冷凍或凍干培養(yǎng)物形式供應給乳業(yè)，用于生產(chǎn)用起子增殖（bulk starter propagation)或者所謂的"直投式"（DVS)培養(yǎng)物，意欲直接接種入發(fā)酵容器或桶 中用于產(chǎn)生發(fā)酵乳制品。這種培養(yǎng)物通常稱作"起子培養(yǎng)物"或"起子"。
[0125] 常用的乳酸細菌的起子培養(yǎng)物菌株通常分成嗜常溫生物體（其最適生長溫度 約30°C )，和嗜熱生物體（其最適生長溫度在約40至約45°C的范圍內(nèi)）。屬于嗜常溫組 的典型生物體包括乳酸乳球菌（Lactococus Iactis)、乳酸乳球菌干釀亞種（Lactococus lactis subsp. cremoris)、腸膜狀明串珠菌干釀亞種（Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris)、腸膜狀假明串珠菌干釀亞種（Pseudoleuconostoc mesenteroides subsp. cremoris)、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酉先 生物突變株（Lactococus lactis subsp. lactis biovar.diacetylactis)、干釀乳桿菌 干釀亞種（Lactococus casei subsp. casei)和副干釀乳桿菌副干釀亞種（Lactococus paracasei subsp. paracasei)。嗜熱乳酸細菌菌種包括例如嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)、屎腸球菌（Enterococcus faecium)、德氏乳桿菌乳酸亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis)、瑞士 乳桿菌（Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿 菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)和嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)。
[0126] 屬于雙歧桿菌屬的厭氧細菌，包括雙岐雙歧桿菌、動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis)和長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)，也常用作乳品起子培養(yǎng)物，并且通常 包括在乳酸細菌組中。此外，丙酸桿菌屬的菌種可用作乳品起子培養(yǎng)物，特別是在奶酪的生 產(chǎn)中。此外，屬于雙歧桿菌屬的生物體通常用作食物起子培養(yǎng)物。
[0127] 另一組微生物起子培養(yǎng)物是真菌培養(yǎng)物，包括酵母培養(yǎng)物和絲狀真菌的培養(yǎng)物， 其特別用于某些類型的奶釀和飲料的生產(chǎn)中。真菌的實例包括婁地青霉（Penicillium roqueforti)、白青霉（Penicillium candidum)、白地霉（Geotrichum candidum)、開菲爾圓 酵母（Torula kefir)、開菲爾酵母（Saccharomyces kefir)和釀酒酵母。
[0128] 在本發(fā)明的一個實施方案中，用于乳基底物發(fā)酵的微生物是干酪乳桿菌或嗜熱鏈 球菌和德氏乳酸桿菌保加利亞亞種的混合物。
[0129] 本發(fā)明的方法中使用的發(fā)酵方法是公知的，并且本領域的技術(shù)人員了解如何選擇 合適的工藝條件，如溫度、氧、微生物的量和性質(zhì)、添加劑如糖、調(diào)味劑、礦物質(zhì)、酶，和處理 時間。明顯地，可以選擇發(fā)酵條件以支持本發(fā)明的實現(xiàn)。
[0130] 作為發(fā)酵的結(jié)果，乳基底物的pH降低。本發(fā)明的發(fā)酵乳制品的pH可以是，例如， 在3. 5-6的范圍中，如在3. 5-5的范圍中，優(yōu)選在3. 8-4. 8的范圍中。
[0131] 在一個優(yōu)選的實施方案中，發(fā)酵的乳制品是酸奶。
[0132] 用于產(chǎn)牛乳制品的方法
[0133] 如上所述，本發(fā)明在一個方面涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0134] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0135] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 1的氨基酸 28-1931或其片段至少70 %相同的氨基酸序列。
[0136] 在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0137] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0138] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 2的氨基酸 28-1331至少70 %相同的氨基酸序列。
[0139] 在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0140] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0141] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID N0:3或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0142] 在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0143] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0144] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID N0:4或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0145] 在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0146] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0147] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 5或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0148] 在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0149] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0150] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 6或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0151] 在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0152] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0153] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID N0:7或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0154] 在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0155] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0156] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
[0157] 其中步驟b)在至少50°C進行。
[0158] 在另一個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0159] a)提供包含乳糖的乳基底物，
[0160] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中乳糖酶活性在37°C的最適pH 為pH 5以上，并且在37°C測定時，其中酶在pH 5的乳糖酶活性是其在pH 6的乳糖酶活性 的至少50%。
[0161] 技術(shù)人員了解如何確定乳糖酶在不同pH的活性，并且從而確定酶的最適pH。通 過測定乳糖在37°C水解30分鐘，可以確定乳糖酶在不同pH的活性，優(yōu)選在包含琥珀酸、 HEPES、CHES、KCl、CaCl2和MgCl2的緩沖液中，例如通過使用本申請的實施例中所述方法進 行測定。為免存疑，HEPES是緩沖劑，為4-(2-羥乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸，CHES是緩沖劑， 為N-環(huán)己基-2-氨基乙烷磺酸。
[0162] 用酶處理的乳基底物可以可選地與其它成分混合以獲得乳制品。在本發(fā)明的一個 實施方案中，用酶處理的乳基底物與其它成分混合以獲得乳制品。
[0163] 在本發(fā)明的一個實施方案中，乳制品是乳。在另一個實施方案中，乳制品是煉乳。 在另一個實施方案中，乳制品是冰激凌。在另一個實施方案中，乳制品是UHT乳。在另一個 實施方案中，乳制品是ESL乳。在另一個實施方案中，乳制品是發(fā)酵的乳制品，例如，酸奶。
[0164] 優(yōu)選地，乳制品是低乳糖乳制品。"低乳糖"，在本發(fā)明的上下文中，表示乳制品如 發(fā)酵的乳制品中的乳糖量已經(jīng)降低至少70 %，優(yōu)選80 %，90 %，95 %，98 %，99 %或99. 5 %。
[0165] 用于產(chǎn)牛低乳糖的發(fā)酵乳制品的方法
[0166] 本發(fā)明的一個實施方案涉及用于產(chǎn)生低乳糖發(fā)酵乳制品的方法，其包括
[0167] a)提供包含乳糖的乳基底物，
[0168] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中在37°C測定時，其中酶在pH 5的乳糖酶活性是其在pH 6的乳糖酶活性的至少50%，和
[0169] c)用微生物發(fā)酵所述底物。
[0170] 本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于產(chǎn)生低乳糖發(fā)酵乳制品的方法，其包括
[0171] a)提供包含乳糖的乳基底物，
[0172] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7 或這些序列中 任一個的片段至少70%相同的氨基酸序列，和
[0173] c)用微生物發(fā)酵所述底物。
[0174] 優(yōu)選地，在這些實施方案中，步驟b)和步驟c)基本上同時進行。
[0175] 在本發(fā)明方法的上下文中，"基本上同時"表示酶處理和發(fā)酵不作為單獨的步驟進 行，即，用酶溫育乳基底物不是在用微生物接種之前以單獨的步驟進行。而是可以基本上在 同時向乳基底物加入酶和微生物，即，可以在即將用微生物接種之前向乳基底物中加入酶。 "即將…之前"在本文表示無用于酶水解的單獨溫育步驟?？蛇x地，可以在即將加酶之前加 入微生物，或者微生物和酶可以同時加入。在本發(fā)明方法的上下文中，"基本上同時"可以表 示酶在步驟c)的全部過程中是活性的。
[0176] "基本上同時"不表示當發(fā)酵完成時，即當pH降至可防止微生物起子培養(yǎng)物進一步 發(fā)酵活性的水平時，乳基底物中乳糖的酶水解就完成。
[0177] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，酶在完成步驟c)后仍有活性。在一個更優(yōu)選的 實施方案中，與加至乳基底物時的酶活性相比，在完成步驟c)后，酶保持至少20%，如至少 30%，至少40%，至少50%，至少60 %或至少70 %的乳糖酶活性。
[0178] 在步驟c)完成后可以表示下述條件中至少一個條件為真：
[0179] -溫度降至低于30°C
[0180] -pH 達到 4. 55
[0181] -pH下降不再超過0. 2單位每小時。
[0182] 在另一個優(yōu)選實施方案中，在發(fā)酵兩小時后，少于80%，如少于70%，少于60%， 少于50%，少于40%，少于30%，或者少于20%的乳糖已被水解。在本發(fā)明的上下文中，"發(fā) 酵兩小時后"表示在已經(jīng)接種微生物后，在發(fā)酵過程合適的溫度溫育乳基底物兩小時。
[0183] 在另一個優(yōu)選實施方案中，當乳基底物的pH降至pH 5時，少于80%，如少于 70 %，少于60 %，少于50 %，少于40 %，少于30 %，或者少于20 %的乳糖已被水解。
[0184] 在另一個優(yōu)選實施方案中，當步驟c)完成時，少于80%，如少于70%，少于60%， 少于50 %，少于40 %，少于30 %，或者少于20 %的乳糖已被水解。
[0185] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在發(fā)酵開始后兩天，即48小時，乳基底物中超過70%， 如超過80 %，超過90 %，超過95 %，超過97 %，超過98 %或者超過99 %的乳糖已被水解。 "發(fā)酵開始"是用微生物接種乳基底物并在發(fā)酵過程適合的溫度溫育時。
[0186] 在另一個優(yōu)選實施方案中，在步驟c)完成后兩天，即48小時，乳基底物中超過 70%，如超過80%，超過90%，超過95%，超過97%，超過98%或者超過99%的乳糖已被水 解。
[0187] 在另個優(yōu)選實施方案中，在最終的發(fā)酵乳制品中，乳基底物中的超過70 %，如超 過80 %，超過90 %，超過95 %，超過97 %，超過98 %或者超過99 %乳糖已被水解。"最終的 發(fā)酵乳制品"是作為銷售給顧客的產(chǎn)品的發(fā)酵乳制品。
[0188] 在本發(fā)明的實施方案中，其中將乳基底物發(fā)酵，優(yōu)選在發(fā)酵過程中在乳基底物的 天然PH進行酶處理，S卩，pH將逐漸從未發(fā)酵的乳基底物的天然pH降至發(fā)酵乳基底物的pH。 在這一方面，優(yōu)選在發(fā)酵過程適合的溫度進行酶處理。
[0189] 用于產(chǎn)牛具有延長的貨架期的低乳糖飲料乳制品的方法
[0190] 本發(fā)明的一個實施方案涉及用于產(chǎn)生低乳糖乳制品的方法，其包括
[0191] a)提供包含乳糖的乳基底物，和
[0192] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
[0193] 其中步驟b)在至少60°C的溫度進行。
[0194] 在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟b)在至少62°C，如至少63°C，更優(yōu)選在至少64,如 至少65°C，至少67°C或者至少70°C，并且最優(yōu)選在至少75°C的溫度進行。
[0195] 低乳糖乳制品可以是具有比新鮮乳品更長的貨架期的飲料乳，新鮮乳品通常的貨 架期為4-7天。與其它具有延長的貨架期的低乳糖飲料乳制品相比，其可以具有改進的質(zhì) 量。其可以，例如，具有更少的微生物計數(shù)，更淡的苦味和/或更淺的棕色。
[0196] 優(yōu)選地，乳制品是ESL乳。更優(yōu)選地，乳制品是UHT乳。
[0197] 在一個優(yōu)選的方面，乳基底物是生乳。在另一個優(yōu)選的方面，乳基底物，優(yōu)選生乳， 在步驟b)前未經(jīng)巴氏滅菌。
[0198] 在一個優(yōu)選的方面，在步驟b)后不對經(jīng)酶處理的乳基底物進行巴氏滅菌。
[0199] 在一個優(yōu)選的方面，在步驟b)前進行乳基底物的微濾。在這種情況下，酶應該優(yōu) 選是無菌的。在另一個優(yōu)選的方面，在步驟b)后對經(jīng)酶處理的乳基底物進行微濾。
[0200] 在一個優(yōu)選的方面，步驟b)在62°C -64°C的溫度進行10分鐘至4小時。在一個 更優(yōu)選的方面，步驟b)在62°C -64°C的溫度進行20分鐘至2小時。在甚至更優(yōu)選的方面， 步驟b)在約63°C的溫度進行20分鐘至60分鐘，如約30分鐘。對例如生乳的這種同時低 溫巴氏滅菌和乳糖酶處理所產(chǎn)生的低乳糖飲料乳與在低溫進行乳糖酶處理（例如在5°C處 理多至24小時，如乳品業(yè)常用的）所產(chǎn)生的低乳糖飲料乳相比，具有更高的質(zhì)量。
[0201] 在一個更優(yōu)選的方面，步驟b)之后為冷卻至KTC以下而不進一步熱處理。這將允 許酶在乳品冷卻后，即在保存期間，仍保持活性。優(yōu)選地，當步驟b)完成時，少于80%的乳 糖已被水解，并且在一周后超過90%的乳糖已被水解。更優(yōu)選地，當步驟b)完成時，少于 60 %的乳糖已被水解，并且在一周后超過95 %的乳糖已被水解。
[0202] 在另一個更優(yōu)選的方面，步驟b)之后為UHT處理。
[0203] 具有乳糖酶活件的酶
[0204] 在本發(fā)明方法的步驟b)中，用具有乳糖酶活性的酶處理乳基底物。
[0205] 本發(fā)明上下文中，乳糖酶是能將二糖乳糖水解成成分半乳糖和葡萄糖單體的任何 糖苷水解酶。乳糖酶組包括但不限于指定為亞類EC 3.2. 1.108的酶。指定為其它亞類如， 例如，EC 3. 2. 1. 23的酶也可以是本發(fā)明上下文中的乳糖酶。本發(fā)明上下文中的乳糖酶可 以具有乳糖水解活性之外的其它活性，如轉(zhuǎn)半乳糖基活性。在本發(fā)明的上下文中，乳糖酶的 乳糖水解活性可稱為其乳糖酶活性或其β-半乳糖苷酶活性。
[0206] 本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶可以是動物、植物或微生物來源的。優(yōu) 選的酶獲得自微生物來源，特別是來自絲狀真菌或酵母，或來自細菌。
[0207] 酶可以，例如，源自如下屬或種的菌株：蘑燕屬（Agaricus)，例如雙孢蘑燕 (A. bisporus) ;Ascovaginospora ;曲霉屬，例如黑曲霉，泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉， 米曲霉；念珠菌屬（Candida);毛殼菌屬（Chaetomium) ;Chaetotomastia ;網(wǎng)柄菌屬 (Dictyostelium),例如盤基網(wǎng)柄菌（D.discoideum);克魯維酵母屬（Kluveromyces), 例如脆壁克魯維酵母（K.fragilis)，乳酸克魯維酵母（K. Iactis);毛霉屬（Mucor),例 如爪睡毛霉（M.javanicus)，高大毛霉（M.mucedo)，細抱毛霉（M.subtilissimus);脈 孢菌屬（Neurospora)，例如粗糙脈孢菌（N. crassa);根毛霉屬（Rhizomucor)，例如微 小根毛霉（R.pusiIlus);根霉屬（Rhizopus),例如少根根霉（R.arrhizus)，日本根霉 (R. japonicus)，匍枝根霉（R. stolonifer);核盤霉屬（Sclerotinia)，例如白腐核盤 霉（S. Iibertiana);球擬酵母屬（Torulopsis);毛癬菌屬（Trichophyton),例如紅色毛 癬菌（T.rubrum);維氏核盤菌屬（Whetzelinia),例如W.sclerotiorum;芽孢桿菌屬， 例如凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，B. novalis，枯草芽孢桿菌，短小芽孢 桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌；雙歧桿菌屬（Bifidobacterium)，例如長雙歧 桿菌，雙歧雙歧桿菌，動物雙歧桿菌；金黃桿菌屬（Chryseobacterium);朽 1檬酸桿菌屬 (Citrobacter)，例如弗氏朽1檬酸桿菌（C.freundii);梭菌屬（Clostridium),例如產(chǎn)氣莢 膜梭菌（C.perfringens);色二孢屬（Diplodia)，例如棉色二孢（D.gossypina);腸桿菌屬 (Enterobacter)，例如產(chǎn)氣腸桿菌（E.aerogenes)，陰溝腸桿菌（E. cloacae);愛德華氏菌 屬（Edwardsiella),遲鈍愛德華菌（E. tarda);歐文氏菌屬（Erwinia),例如草生歐文氏菌 (E.herbicola);埃希氏菌屬（Escherichia),例如大腸桿菌；克雷伯氏菌屬（Klebsiella), 例如肺炎克雷伯氏菌（K. pneumoniae) ;Miriococcum;Myrothesium;毛霉屬；脈孢菌屬， 例如粗糙脈孢菌；變形菌屬（Proteus),例如普通變形菌（P. vulgaris);普羅維登斯菌 屬（Providencia)，例如斯氏普羅維登斯菌（P. stuartii);密孔菌屬（Pycnoporus)，例 如朱紅密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus)，血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus);瘤 胃球菌屬（Ruminococcus)，例如扭鏈瘤胃球菌（R. torques);沙門氏菌（Salmonella), 例如鼠傷寒沙門氏菌（S. typhimurium);沙雷氏菌屬（Serratia)，例如液化沙雷氏菌 (S. Iiquefasciens),粘質(zhì)沙雷氏菌（S.marcescens);志賀氏桿菌（Shigella),例如弗氏 志賀菌（S.flexneri);鏈霉菌屬（Streptomyces),例如抗生鏈霉菌（S.antibioticus)， 栗色球抱鏈霉菌（S. Castaneoglobisporus),紫紅鏈霉菌（S.violeceoruber);栓菌屬 (Trametes);木霉屬（Trichoderma)，例如里氏木霉（T.reesei)，綠色木霉（T.viride);耳 爾森氏菌屬（Yersinia),例如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Y.enterocolitica)。
[0208] 在一個優(yōu)選的實施方案中，酶是來自細菌，例如來自雙歧桿菌科，如來自雙歧桿菌 屬，如來自雙歧雙歧桿菌、動物雙歧桿菌或長雙歧桿菌的菌株的乳糖酶。在一個更優(yōu)選的實 施方案中，酶是來自雙歧雙歧桿菌的乳糖酶。優(yōu)選的酶是包含序列的乳糖酶，所述序列與 SEQ ID NO: 1的氨基酸28-1931或其乳糖酶活性片段至少50%，如至少60%，至少70%，至 少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。SEQ ID NO: 1的這種乳糖酶活性片段可以 是SEQ ID NO: 1具有乳糖酶活性的任何片段。SEQ ID NO: 1的乳糖酶活性片段可以是，例 如，SEQ ID NO: 1的氨基酸28-979,氨基酸28-1170,氨基酸28-1323,氨基酸28-1331，或氨 基酸 28-1600。
[0209] 在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸 序列，所述序列與SEQ ID N0:2的氨基酸28-1331至少50%相同。在一個更優(yōu)選的實施方 案中，酶包含氨基酸序列，其與SEQ ID N0:2的氨基酸28-1331至少60%，如至少70%，至 少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0210] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基 酸序列，所述序列與SEQ ID N0:2的氨基酸28-1331至少50%相同。在一個更優(yōu)選的實施 方案中，酶包含氨基酸序列，其與SEQ ID N0:2的氨基酸28-1331至少60%，如至少70%， 至少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0211] 在另一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序 列，所述序列與SEQ ID N0:3至少50%相同。優(yōu)選地，酶包含氨基酸序列，其與SEQ ID N0:3 至少60%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0212] 在另一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序 列，所述序列與SEQ ID N0:4至少50%相同。優(yōu)選地，酶包含氨基酸序列，其與SEQ ID N0:4 至少60%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0213] 在另一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序 列，所述序列與SEQ ID N0:5至少50%相同。優(yōu)選地，酶包含氨基酸序列，其與SEQ ID N0:5 至少60%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0214] 在另一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序 列，所述序列與SEQ ID N0:6至少50%相同。優(yōu)選地，酶包含氨基酸序列，其與SEQ ID N0:6 至少60%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0215] 在另一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序 列，所述序列與SEQ ID N0:7至少50%相同。優(yōu)選地，酶包含氨基酸序列，其與SEQ ID N0:7 至少60%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0216] 就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一丨生程度通過Needleman-Wunsch算法 (Needleman 和 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)使用 EMBOSS 軟件包（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等（2000)Trends in Genetics 16:276-277)的Needle程序來測定，優(yōu)選3. 0.0或更高的版本。使用的可選參數(shù)為缺口罰 分（gap penalty) 10,缺口延伸罰分（gap extension penalty)?！?5 和 EBL0SUM62 取代矩陣 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版）。使用 Needle 標記為"最高同一性（longest identity) "的輸出 結(jié)果（使用-no brief選項獲得）作為同一性百分比，并計算如下：
[0217] (相同的殘基X100V(比對長度一比對中缺口的總數(shù)）
[0218] 本發(fā)明的方法中使用的乳糖酶可以是胞外酶。它們可以在其N-末端包含信號序 列，所述信號序列在分泌過程中被切去。
[0219] 本發(fā)明方法中使用的乳糖酶可以源自本文所述的任何來源。術(shù)語"源自"在本上 下文中表示酶可以從天然存在所述酶的生物體分離，即酶的氨基酸序列的身份（identity) 與天然酶相同。術(shù)語"源自"還表示酶可以在宿主生物體中重組產(chǎn)生，其中重組產(chǎn)生的酶具 有與天然酶相同的身份，或具有修飾的氨基酸序列，例如，缺失、插入和/或取代一個或多 個氨基酸，即，重組產(chǎn)生的酶是天然氨基酸序列的突變體和/或片段。天然酶的意義中包含 天然變體。此外，術(shù)語"源自"包括通過例如肽合成而合成產(chǎn)生的酶。術(shù)語"源自"還包括已 經(jīng)通過例如糖基化、磷酸化等在體內(nèi)或體外修飾的酶。對于重組產(chǎn)生的酶，術(shù)語"源自"指 酶的身份而不是重組產(chǎn)生酶的宿主生物體的身份。
[0220] 可以通過使用任何合適的技術(shù)從微生物獲得乳糖酶。例如，乳糖酶制備物可通過 發(fā)酵合適的微生物和之后通過本領域公知的方法從所得的發(fā)酵液或微生物分離乳糖酶制 備物而獲得。乳糖酶還可以通過使用重組DNA技術(shù)而獲得。這種方法通常包括培養(yǎng)用重組 DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，所述載體包含編碼所討論的乳糖酶的DNA序列，并且DNA序列與 合適的表達信號可操作地連接，使其能在允許酶表達的條件下在培養(yǎng)基中表達乳糖酶，并 從培養(yǎng)物回收酶。還可將DNA序列摻入宿主細胞的基因組中。DNA序列可以是基因組、cDNA 或合成來源，或它們的任何組合，并且可以按照本領域公知的方法分離或合成。
[0221] 可純化本發(fā)明的方法中使用的乳糖酶。本文中使用的術(shù)語"純化"包括基本上不 含來自酶的生產(chǎn)生物體的不溶成分的乳糖酶蛋白。術(shù)語"純化"還包括基本上不含來自獲 得酶的天然生物體的不溶組分的乳糖酶蛋白。優(yōu)選地，還可以從酶的來源生物體和培養(yǎng)基 的一些可溶成分分離。更優(yōu)選地，可以通過一種或多種單元操作來進行分離：過濾、沉淀或 色譜/層析。
[0222] 因此，可純化具有乳糖酶活性的酶，即僅存在少量的其它蛋白質(zhì)。表述"其它蛋白 質(zhì)"具體涉及其它酶。本文使用的術(shù)語"純化"還指去除其它成分，特別是（存在于乳糖酶 的來源細胞中的）其它蛋白質(zhì)，最特別是存在于乳糖酶的起源細胞中的其它酶。乳糖酶可 為"基本上純的"，即，不含來自酶的生產(chǎn)生物體（即，例如，用于重組產(chǎn)生乳糖酶的宿主生 物體）的其它成分。優(yōu)選地，乳糖酶是至少40 % (w/w)純，更優(yōu)選至少50%，60%，70%， 80 %或者甚至至少90 %純的酶蛋白制備物。
[0223] 術(shù)語具有乳糖酶活性的酶包括酶的催化活性必需的任何輔助化合物，如，例如，合 適的受體或輔因子，其可以或者可以不天然存在于反應系統(tǒng)中。
[0224] 酶可以是適合于所述用途的任何形式，如，例如，為干粉或顆粒、無塵顆粒、液體、 穩(wěn)定化液體或受保護酶的形式。
[0225] 以合適的量加入酶，以在所選反應條件下實現(xiàn)理想程度的乳糖水解?？梢砸?100-5000LAU每升乳基底物，優(yōu)選小于3000,如小于1500,小于1000,小于750或小于500， LAU每升乳基底物的濃度加入酶。
[0226] 在一個優(yōu)選的實施方案中，以乳基底物中5-100LAU每g乳糖，優(yōu)選乳基底物中小 于50,如小于40,小于30,小于20或小于10, LAU每g乳糖酶的濃度加入酶。
[0227] 在本申請的上下文中，1個乳糖酶單位（ILAU)是在pH 6.5和37°C，乳糖濃度為 4. 75% w/v，在M-緩沖液中每分鐘釋放1微摩爾葡萄糖的酶量。如下制備M-緩沖液：在 4升水中溶解3.988(^ 5恥307-2!120,8.318檸檬酸，0.98 1(2504,2.68 1(2冊04,7.358腿2?04， 5. 45g K0H，4. 15g MgCl2-6H20,3. 75g CaCl2-2H20 和 I. 4g NaHCO3,加入 12. 5ml 4N NaOH，使 用HCl調(diào)至pH 6. 5,并加水至總體積為5升。
[0228] 通過在上述條件下直接測定從乳糖釋放的葡萄糖可以確定特定乳糖酶的以LAU 表示的活性。技術(shù)人員了解如何確定這種活性。可選地，通過使用本申請實施例1中所述 的乳糖酶活性試驗可以確定活性。在此處，通過與用已知活性的乳糖酶獲得的標準曲線進 行比較而獲得活性，并由此計算未知樣品的活性。已知活性的乳糖酶可，例如，是獲得自 Novozymes A/S, Denmark 的 Lacozym0
[0229] 在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法中使用的具有乳糖酶活性的酶在37°C和 pH 5具有的乳糖酶活性是其在37°C和pH 6的乳糖酶活性的至少55%，如至少60%，至少 65%，至少70%或至少75%。
[0230] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶在37°C和 pH 4. 5具有的乳糖酶活性是其在37°C和pH 6的乳糖酶活性的至少10%，如至少20%，至 少30%，至少35%或至少40%。
[0231] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶在37°C的 乳糖酶活性的最適pH為pH 5. 5以上。
[0232] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶在52°C和 pH 6. 5的乳糖酶活性是其在38°C和pH 6. 5的乳糖酶活性的至少50%，如至少55%，至少 60%，至少65%，至少70%，至少75%或至少80%。
[0233] 技術(shù)人員了解如何確定不同在pH和溫度的乳糖酶活性。優(yōu)選通過使用本申請的 實施例中所述的方法確定不同PH和溫度的乳糖酶活性。
[0234] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，具有乳糖酶活性的酶在5°C的Km為25mM以下， 如20mM以下，15mM以下或IOmM以下。在另一個優(yōu)選的實施方案中，具有乳糖酶活性的酶在 37°C的Km為25mM以下，如20mM以下或15mM以下。技術(shù)人員了解如何確定在特定的溫度 時乳糖酶活性的Km。可以通過本申請的實施例中使用的方法確定Km。
[0235] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，水解乳基底物中的乳糖時，酶具有超過1:1，如超過 2:1或超過3:1的乳糖酶與轉(zhuǎn)半乳糖基酶活性的比例。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在酶 的乳糖酶活性高于轉(zhuǎn)半乳糖基酶活性的條件下進行酶處理，如乳糖酶活性為轉(zhuǎn)半乳糖基酶 活性的至少兩倍高或者至少三倍高。乳基底物中乳糖酶活性與轉(zhuǎn)半乳糖基酶活性的比例可 以，例如，由HPLC分析確定。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在水解的乳糖的至少50% (w/ w% )轉(zhuǎn)化成游離半乳糖的條件下進行酶處理。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在水解的乳糖 轉(zhuǎn)化成等量的游離葡萄糖和游離半乳糖的條件下進行酶處理。
[0236] 實施例1
[0237] 在37°C，pH 6. 5,在微量離心管（eppendorf tube)中的乳糖酶活性試驗
[0238] 原理：
[0239] 乳糖酶將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。根據(jù)修正版本的普通葡萄糖氧化酶/過氧 化物酶試驗（Werner, W.等（1970)Z.analyt. Chem. 252:224)測定葡萄糖。
[0240] LAU定義為在37°C，pH 6. 5,在M-緩沖液（M-緩沖液在本專利申請的描述中定 義）中每分鐘釋放1微摩爾葡萄糖的酶量?？蛇x地，對于特定乳糖酶，以LAU表示的活性可 以通過本文所述方法確定。將獲得的數(shù)值與用活性已知的乳糖酶得到的標準曲線進行比 較，并且由此計算未知樣品的活性。已知活性的乳糖酶可以是，例如，獲得自Novozymes A/ S，Denmark 的 Lactozym0
[0241] 溶液:
[0242] 試驗緩沖液：50mM 琥珀酸，50mM HEPES，50mM CHES，150mM KCl，2mM CaCl2, ImM MgCl2,0. 01% Triton X100, pH 6. 5〇
[0243] GOD-Perid 溶液：65mM 磷酸鈉 ，pH 7,0. 4g/l 葡萄糖氧化酶，0. 013g/l HRP (辣根 過氧化物酶），〇· 65g/l ABTS(2, 2'-連氮基-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2, 2'-azi n〇-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)))〇
[0244] 底物:
[0245] 160mM 乳糖，50mM 琥珀酸，50mM HEPES，50mM CHES，150mM KCl，2mM CaCl2, ImM MgCl2, pH 6. 5。
[0246] 標準品：
[0247] 將具有以LAU/g表示的已知活性的Lactozym(可由Novozymes A/S，Denmark獲 得）用作標準品，用試驗緩沖液稀釋至〇. 09-0. 7LAU/g的范圍內(nèi)。
[0248] 樣品：
[0249] 將酶樣品在試驗緩沖液中適當稀釋。
[0250] 討稈：
[0251] 1.將375 μ 1底物在37 °C溫育5分鐘。
[0252] 2.加入在試驗緩沖液中稀釋的25 μ 1酶。
[0253] 3.在30分鐘后通過加入60 μ I IM NaOH而終止反應
[0254] 4.將20 μ 1轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板并加入200 μ I GOD-Perid溶液。在室溫30 分鐘后，在420nm測定吸光度。
[0255] 實施例2
[0256] 通過在91ml離子水中混合9g脫脂乳粉（Kerry)而制得具有約5 %乳糖的IOOrnl 9%脫脂乳溶液。將IOml溶液轉(zhuǎn)移至包含磁力攪棒的試管中并置于37°C的水浴中。15分 鐘后加入酶。測試的酶是Lactozym, -種來自Novozymes A/S, Denmark的商業(yè)上可得到的 乳糖酶（活性為3060LAU/g)，和來自雙歧雙歧桿菌的實驗乳糖酶，其具有SEQ ID N0:2中所 示的編碼序列并且活性為295LAU/g。SEQ ID NO:2的氨基酸1至27是信號序列，其據(jù)推測 可切割，并且氨基酸1332至1341是用于純化實驗酶的標簽。
[0257] 劑量為5640LAU/1乳的Lactozyme和2700LAU/1乳的雙歧桿菌屬乳糖酶。每隔固 定時間取乳樣品，直至4小時，并且通過在熱混合器中加熱至99°C 10分鐘而使酶失活。將 樣品適當稀釋并通過0. 20 μ m濾器過濾。
[0258] 使用配備有 Dionex PAl 柱和 Pulsed Amperiometrisk Detektor (PAD)的 Dionex BioLC測定乳糖水解。通過與乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知標準品比較而鑒定和定量峰。結(jié) 果如下。
[0259] 表1 :用Lactozym或雙歧桿菌屬乳糖酶處理后的復原脫脂乳中的乳糖、葡萄糖和 半乳糖。

【權(quán)利要求】
1. 用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括 a) 提供包含乳糖的乳基底物；和 b) 用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID N0:2的氨基酸 28-1331至少70 %相同的氨基酸序列。
2. 用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括 a) 提供包含乳糖的乳基底物；和 b) 用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 1的氨基酸 28-1931或其片段至少70 %相同的氨基酸序列。
3. 用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括 a) 提供包含乳糖的乳基底物；和 b) 用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 3-4中任一序列 或這些序列中任一個的片段至少70 %相同的氨基酸序列。
4. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述酶源自雙歧桿菌屬（Bifidobacterium)的 微生物。
5. 用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括 a) 提供包含乳糖的乳基底物；和 b) 用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 5-7中任一序列 或這些序列中任一個的片段至少70 %相同的氨基酸序列。
6. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在37°C乳糖酶活性的最適pH為pH 5以上，并 且其中在37°C測定時，酶在pH 5的乳糖酶活性為在pH 6時其乳糖酶活性的至少50%。
7. 用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括 a) 提供包含乳糖的乳基底物；和 b) 用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中在37°C乳糖酶活性的最適pH為pH 5以上，并且其中在37°C測定時，酶在pH 5的乳糖酶活性為在pH 6時其乳糖酶活性的至少 50%。
8. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中步驟b)在至少50°C的溫度進行。
9. 用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括 a) 提供包含乳糖的乳基底物；和 b) 用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性， 其中步驟b)在至少50°C的溫度進行。
10. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在pH 6. 5測定時，酶在52°C的溫度的乳糖酶 活性是其在38°C的溫度的乳糖酶活性的至少70%。
11. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中向乳基底物以所述乳基底物中小于30LAU每g 乳糖的濃度加入酶。
12. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中向乳基底物以小于1000LAU每升乳基底物的 濃度加入酶。
13. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在水解乳基底物中的乳糖時，所述酶的乳糖酶 與轉(zhuǎn)半乳糖基酶的活性比例大于1:1。
14. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其進一步包括如下步驟 C)用微生物發(fā)酵所述底物， 其中所述乳制品是發(fā)酵乳制品。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述發(fā)酵的乳制品是酸奶。
16. 權(quán)利要求14-15中任一項的方法，其中步驟b)和步驟c)基本上同時進行。
17. 權(quán)利要求14-16中任一項的方法，其中步驟b)的酶和步驟c)的微生物基本上同時 加入所述乳基底物。
18. 權(quán)利要求14-17中任一項的方法，其中在發(fā)酵兩小時后少于80%的乳糖已被水解， 并且其中在最終的發(fā)酵乳制品中多于90%的乳糖已被水解。
19. 權(quán)利要求14-18中任一項的方法，其中在步驟c)完成時少于80%的乳糖已被水 解，并且其中在最終的發(fā)酵乳制品中多于90%的乳糖已被水解。
20. 權(quán)利要求1-13中任一項的方法，其中步驟b)在至少60°C的溫度進行。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述乳基底物是生乳，其在步驟b)前未進行巴氏滅菌。
22. 權(quán)利要求20-21中任一項的方法，其中步驟b)在62°C _64°C的溫度進行10分鐘-4 小時，并且其中步驟b)之后為冷卻至KTC以下而不進一步加熱處理。
23. 權(quán)利要求20-22中任一項的方法，其中在步驟b)完成時少于80%的乳糖已被水 解，并且其中在一周后多于90 %的乳糖已被水解。
24. 權(quán)利要求20-21中任一項的方法，其中步驟b)在62°C _64°C的溫度進行10分鐘-4 小時，并且其中步驟b)之后為UHT處理。
【文檔編號】A23C9/12GK104322666SQ201410584773
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2008年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2007年12月3日
【發(fā)明者】漢恩.V.亨里克森, 斯蒂芬.厄恩斯特, 萊因哈德.威爾廷, 杰普.W.塔姆斯, 梅特.O.朗格, 赫勒.S.古爾達格 申請人:諾維信公司, 克爾.漢森公司