一種快速提取植物基因組dna的試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，通過對(duì)傳統(tǒng)CTAB法提取基因組的方法進(jìn)行了優(yōu)化而開發(fā)了一種適用于PCR擴(kuò)增的通用型快速提取植物基因組DNA的試劑盒及方法，可用于多種植物基因組DNA的快速提取，滿足植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究及轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的快速鑒定。試劑盒的組成包括：平衡液、裂解液、DNA結(jié)合液、DNA洗滌液、DNA洗脫液、DNA吸附柱。本發(fā)明利用硅基質(zhì)與DNA在不同鹽離子濃度和PH條件下的結(jié)合程度不同從而達(dá)到分離、純化DNA的目的。本方法操作快速、簡單，15min就能完成DNA的提取，提取過程中無需酚、氯仿抽提，避免了有機(jī)溶劑的污染，采用本發(fā)明方法提取的DNA對(duì)于300-4500bp的植物內(nèi)源基因和外源轉(zhuǎn)入基因均有良好的擴(kuò)增效果。
【專利說明】一種快速提取植物基因組DNA的試劑盒及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，通過對(duì)傳統(tǒng)CTAB法提取基因組的方法進(jìn)行了優(yōu) 化而開發(fā)了一種適用于PCR擴(kuò)增的通用型快速提取植物基因組DNA的試劑盒及方法，可用 于多種植物基因組DNA的快速提取，滿足植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究及轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物 的快速鑒定。

【背景技術(shù)】
[0002] 自1994年世界上首例轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品--耐儲(chǔ)藏轉(zhuǎn)基因番茄在美國獲準(zhǔn)商業(yè)化 生產(chǎn)，投放市場以來，由于轉(zhuǎn)基因作物和轉(zhuǎn)基因食品在作物抗逆性或食物營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味 的改善等方面具有傳統(tǒng)食品無可比擬的優(yōu)勢(shì)，而迅速席卷全球。根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng) 用服務(wù)組織（ISAAA)的報(bào)告，2012年全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積為1.7億公頃，相當(dāng)于中 國的全部耕地面積，涉及到的改良性狀主要有生長發(fā)育、品質(zhì)改良、產(chǎn)量潛力、抗除草劑、抗 病、抗蟲、抗逆境等。據(jù)Cropnosis公司估計(jì)，2012年轉(zhuǎn)基因作物的市場價(jià)值將達(dá)到150億 美元，到2015年將有40個(gè)國家的2000萬農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物，種植面積將達(dá)2億公頃 (C James. 2012. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. ISAAA Brief No. 44. ISAAA: Ithaca, NY)。轉(zhuǎn)基因作物的推廣應(yīng)用在帶來巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益 的同時(shí)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性也引起了人們的極大關(guān)注。包括中國在內(nèi)的很多國家要求企 業(yè)在產(chǎn)品包裝上對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行"強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)"，讓消費(fèi)者擁有獲悉食品是否為轉(zhuǎn)基因食 品的知情權(quán)，以便消費(fèi)者可以自主選擇是否購買、食用轉(zhuǎn)基因食品，鑒于此，國家和食品監(jiān) 督機(jī)構(gòu)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測顯得尤為重要。
[0003] 轉(zhuǎn)基因食品的檢測可以在核酸和蛋白水平上，PCR作為一種在短時(shí)間內(nèi)能夠快速、 靈敏、準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出轉(zhuǎn)基因食品中特定外源基因的核酸檢測法，被廣泛地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因農(nóng) 作物和食品的檢測中。然而DNA樣品制備的速度和質(zhì)量是PCR檢測方法的主要限速因素。傳 統(tǒng)的基因組DNA提取方法如CTAB法和SDS法（JJ Doyle等· 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19， 11 - 15; D Goldenberger 等· 1995. A simple "universal"DNA extraction procedure using SDS and proteinase K is compatible with direct PCR amplification. Genome Research 4，368 - 370)，多是采用離子型表面活性劑（CTAB法和SDS)裂解樣品細(xì)胞，使基 因組釋放出來，再通過苯酚/氯仿/異戊醇的多次抽提去除蛋白，最后經(jīng)過異丙醇或者乙醇 沉淀得到純度高、完整性好的DNA分子。該傳統(tǒng)方法中，存在反復(fù)離心、沉淀的步驟，操作繁 瑣且耗時(shí)長，整個(gè)基因組提取過程需要2-3h。而藥品中苯酚、氯仿和異戊醇的使用，一方面 存在一定毒性，對(duì)操作人員可能造成一定傷害；另一方面可能導(dǎo)致有機(jī)溶劑殘留在基因組 樣品中從而造成下游試驗(yàn)無法順利進(jìn)行，這些因素嚴(yán)重影響了實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，顯然不能滿足快 速檢測的需要。
[0004] 喊裂解法（H Wang 等.1993. A simple method of preparing plant samples for PCR. Nucleic Acids Research 21，4153 - 4154〕直接利用 NaOH 溶液使細(xì)胞膜溶解， 蛋白變性，釋放基因組DNA，再經(jīng)過TE緩沖液稀釋中和之后，就得到了 DNA溶液，可直接用于 PCR擴(kuò)增，是目前最為常見的快速簡便提取基因組DNA的方法。但得到的DNA由于不經(jīng)過任 何純化處理，含量和純度都很低，含有大量色素，蛋白質(zhì)，多糖等可能抑制PCR反應(yīng)的雜質(zhì)， 并且由于NaOH會(huì)打斷DNA片段，所以該方法擴(kuò)增的上限為IOOObp左右的基因，而對(duì)于較長 的基因而言，這種提取方法顯然不適用。
[0005] 目前市場上出現(xiàn)了多種商品化的植物基因組提取純化試劑盒，常見的有北京康為 世紀(jì)生物科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒（CW0553)、Biomega公司提DNA試劑 盒、北京全式金生物技術(shù)有限公司快速提取植物gDNA試劑（AD301)、QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit (69104)、Omega BioTek 公司的 Plant DNA Mini Kit (D3485)、美國 MOBIO 強(qiáng)力植物DNA提取試劑盒Power Plant? DNA Isolation Kit (13200-50)等。不同的植物 DNA提取試劑盒，分離原理也不同。有的利用核酸的分子量差異分離DNA，有的利用特異性 基質(zhì)與DNA結(jié)合從而達(dá)到分離DNA的目的，如磁珠、離子交換柱等。雖然DNA提取試劑盒包 含提取植物DNA所需的試劑和必要的耗材，操作簡單，但其價(jià)格昂貴且提取量較少；有些公 司開發(fā)的試劑盒同樣會(huì)用到氯仿等有機(jī)試劑，無法避免有機(jī)溶劑的污染問題。而且，比如全 式金快速提取植物gDNA試劑的說明書上寫明其擴(kuò)增上限是2000bp，說明其無法保證基因 組的完整性，對(duì)大片段基因 PCR擴(kuò)增的限制作用較為明顯。
[0006] 針對(duì)上述不足，迫切需要一種快速、簡便、高效、經(jīng)濟(jì)、通用性較好且能保證基因組 完整性的DNA提取方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于上述背景，本發(fā)明提供了一種快速、高效提取植物基因組DNA的試劑盒及方 法。
[0008] 本發(fā)明首先提供了一種快速提取植物基因組DNA的試劑盒，其組成包括： (1) Balance Buffer (平衡液）：2mM Tris-HCl，pH 13.00; (2) Lysis Buffer (裂解液）：10% CTAB ; (3) DNA Binding Buffer (DNA 結(jié)合液）：5. OM 鹽酸胍，30% 異丙醇； (4) Wash Buffer (DNA 洗滌液）：20mM NaCl，20mM Tris-HCl，80% ethanol，pH 7.5; (5) Elution Buffer (DNA 洗脫液）：20 μ g/ mL 的 RNA 酶，IOmM Tris-HCl，pH 8. 5 ; (6) DNA吸附柱。
[0009] 所述的鋁盒和小鋼珠購自市場，DNA吸附柱為硅膠柱。
[0010] 本發(fā)明還提供了利用所述試劑盒快速提取植物DNA的方法，依次包括以下步驟： (1) 向DNA吸附柱中加200 μ I Balance Buffer，12000rpm離心30S，對(duì)柱子進(jìn)行預(yù)處 理，以增加其與DNA的結(jié)合率； (2) 取30-50mg植物組織放到2ml的EP管中，加入2粒滅菌的小鋼珠； (3) 將上述樣品直接放入液氮中，待植物組織凍硬后立即撈出放入鋁盒，蓋上蓋，快速 振搖數(shù)下； (4) 重復(fù)步驟（3) 2-3次使植物組織研磨徹底； (5) 加入65°C預(yù)熱的100 μ I Lysis Buffer,輕柔顛倒混勻2min ; (6) 隨后加入600 μ I Binding Buffer,輕柔顛倒混勻； (7) 將EP管倒過來蓋子向下，在蓋子下壓上一塊磁鐵，再輕輕翻過來使小鋼珠被吸到 蓋子上，壓著磁鐵開蓋，將小鋼珠彈入回收盒中（鋼珠洗凈滅菌后可重復(fù)使用）； (8) 將步驟（7)中的混合液，室溫12, OOOrpm離心Imin ; (9) 取上清液加到Balance Buffer預(yù)處理過的DNA吸附柱中，室溫12, OOOrpm離心 30S，棄收集管中的液體； (10) 向DNA吸附柱中加入300 μ I Binding Buffer，室溫12, OOOrpm離心30S，棄收集 管中的液體； (11) 向DNA吸附柱中加入650 μ I Wash Buffer，室溫12, OOOrpm離心30S，棄收集管中 的液體； (12) 重復(fù)步驟（11); (13) 室溫 12, OOOrpm 離心 2min ; (14) 將DNA吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml EP管中，加入65 °C預(yù)熱的Elution Buffer 30μ 1，室溫靜置2min ; (15) 12, OOOrpm 離心 lmin，即得到 DNA 樣品。
[0011] 本發(fā)明利用硅基質(zhì)與DNA在不同鹽離子濃度和PH條件下的結(jié)合程度不同從而達(dá) 到分離、純化DNA的目的。本方法操作快速、簡單，15min就能完成DNA的提取，提取過程中 無需酚、氯仿抽提，避免了有機(jī)溶劑的污染，且后期PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，采用本發(fā)明方法提 取的DNA對(duì)于300-4500bp的植物內(nèi)源基因和外源轉(zhuǎn)入基因均有良好的擴(kuò)增效果。從而解 決了現(xiàn)有提取技術(shù)耗時(shí)長、使用有毒的有機(jī)試劑、提取的DNA片段較短等問題，以滿足植物 原材料尤其是轉(zhuǎn)基因作物快速分子檢測的需要。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為： (1) 在組織破碎步驟中，用小鋼珠取代了研磨桿或研缽研磨，降低了實(shí)驗(yàn)耗時(shí)和成 本，在大幅度降低操作人員工作量的同時(shí)提高了工作效率。使用小鋼珠配套2mL離心管 (印pendorf管)進(jìn)行研磨，同時(shí)兼顧了研磨和水浴操作，省去了原來液氮研磨過程中轉(zhuǎn)移材 料和洗滌研缽的操作； (2) 本發(fā)明使用CTAB作為裂解液，與堿裂解法相比可以更好的保持基因組的完整性， 可擴(kuò)增到更長的基因片段；同時(shí)，較常規(guī)的CTAB法相比，CTAB的用量增加了 5倍，即由2% 增加至10%，可更好的針對(duì)次生代謝產(chǎn)物多的植物樣品； (3) 在DNA分離純化過程中，本發(fā)明使用了硅膠柱，并且增加了柱子的預(yù)處理步驟和加 大了 DNA結(jié)合液的使用量，可明顯增加硅膠柱與DNA的結(jié)合率；另外，通過優(yōu)化洗滌液的配 方，一方面可以充分的去除蛋白、多糖等其他的雜質(zhì)，另一方面由于不使用苯酚、氯仿等有 機(jī)試劑，可避免其對(duì)操作人員造成的毒害和有機(jī)試劑的殘留對(duì)下游試驗(yàn)的抑制作用； (4) 在DNA洗脫的步驟中，通過65?預(yù)熱Elution Buffer,來加快分子的熱運(yùn)動(dòng)，使DNA 分子更容易與硅膠柱分離，最大程度的保證DNA的洗脫效率。
[0013] 本發(fā)明操作簡單、速度快，僅15min就可以完成樣品的提取，提取到的基因組更加 完整且純度高，能更好地滿足分子生物學(xué)的需求。經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提取的基因組對(duì) 植物內(nèi)源基因和外源基因均有良好的擴(kuò)增效果，且與傳統(tǒng)堿裂解法相比，明顯提高了對(duì)于 大片段基因的檢測效率，對(duì)于4500bp的基因，仍可以得到令人滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為使用本發(fā)明的方法提取的多種植物基因組DNA電泳圖譜。圖中樣品依次為： M，全式金公司Transmitted 15K DNA Marker ;1，木瓜；2,馬鈴薯；3,甜菜；4,西紅柿；5,油 菜；6,水稻；7,黃瓜；8,玉米；9,大豆。
[0015] 圖2為多種植物基因組葉綠體23S rDNA的擴(kuò)增結(jié)果。圖中樣品依次為：M，天根公 司DNA DL2, 000 Marker ;1，甜菜；2,油菜；3,木瓜；4,大豆；5,馬鈴薯；6,西紅柿；7,黃瓜； 8,玉米；9,水稻；10,空白對(duì)照。
[0016] 圖3為六種方法提取的基因組DNA電泳圖譜。圖中樣品依次為：M，全式金公司 Transmitted 15K DNA Marker ;1，CTAB 法提取的基因組 DNA ;2, SDS 法提取的基因組 DNA ; 3,堿裂解法提取的基因組DNA ;4,本方法提取的基因組DNA ;5, Biomega公司提DNA試劑盒 方法提取的基因組DNA ;6,康為公司提DNA試劑盒方法提取的基因組DNA。
[0017] 圖4為六種方法提取的基因組DNA 560bp目的片段的擴(kuò)增結(jié)果。圖中樣品依次為： M，天根公司Marker III ;1，空白對(duì)照；2-4, CTAB法為模板PCR產(chǎn)物；5-7, SDS法為模板PCR 產(chǎn)物；8-10,堿裂解法為模板PCR產(chǎn)物；11-13,本方法為模板PCR產(chǎn)物；14-16，Biomega公司 DNA提取試劑盒方法為模板PCR產(chǎn)物；17-19,康為公司DNA提取試劑盒方法為模板PCR產(chǎn) 物。
[0018] 圖5為六種方法提取的基因組DNA 2000bp目的片段的擴(kuò)增結(jié)果。圖中樣品依次 為：M，天根公司Marker III ;1，空白對(duì)照；2-4, CTAB法為模板PCR產(chǎn)物；5-7, SDS法為模板 PCR產(chǎn)物；8-10,堿裂解法為模板PCR產(chǎn)物；11-13,本方法為模板PCR產(chǎn)物；14-16, Biomega 公司DNA提取試劑盒方法為模板PCR產(chǎn)物；17-19,康為公司DNA提取試劑盒方法為模板PCR 產(chǎn)物。
[0019] 圖6為六種方法提取的基因組DNA 4500bp目的片段的擴(kuò)增結(jié)果。圖中樣品依次 為：M，天根公司Marker III ;1，空白對(duì)照；2-4, CTAB法為模板PCR產(chǎn)物；5-7, SDS法為模板 PCR產(chǎn)物；8-10,堿裂解法為模板PCR產(chǎn)物；11-13,本方法為模板PCR產(chǎn)物；14-16, Biomega 公司DNA提取試劑盒方法為模板PCR產(chǎn)物；17-19,康為公司DNA提取試劑盒方法為模板PCR 產(chǎn)物。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，只是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉 例，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上 還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而 由此所引申出的顯而易見的對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換仍處于本發(fā)明的 保護(hù)范圍之中。
[0021] 實(shí)施例1 采用本發(fā)明的方法提取不同農(nóng)作物的基因組DNA 目前，批準(zhǔn)的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物有大豆、玉米、油菜、甜菜、馬鈴薯、水稻、西紅柿、黃 瓜、番木瓜等等。作為一種適用于檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速植物基因組制備方法，我們希望這 種方法，可以具有普適性，因此，我們選擇了目前批準(zhǔn)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物作為我們的檢 測對(duì)象。
[0022] 具體步驟如下： 一、不同農(nóng)作物基因組DNA的提取 (I) 轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻、馬鈴薯葉片為本實(shí)驗(yàn)室保存；油菜、甜菜、西紅柿、黃瓜、 番木瓜購自永輝超市，取可食用部分，放入2ml的EP管中，加入2粒滅菌的小鋼珠后直接放 入液氮中，待植物組織凍硬后立即撈出放入鋁盒，蓋上蓋，快速振搖數(shù)下；重復(fù)此步驟2-3 次使植物組織研磨徹底； (2)加入 65°C預(yù)熱的 100 μ I Lysis Buffer [Lysis Buffer (裂解液):10% CTAB]，溫 育2min，期間輕柔顛倒混勻； (3) 加入 600 μ I Binding Buffer [DNA Binding Buffer (DNA 結(jié)合液）:5. OM 鹽酸狐， 30%異丙醇]，輕柔顛倒混勻； (4) 向 DNA 吸附柱中加 200 μ I Balance Buffer [Balance Buffer (平衡液）：2mM Tris-HCl，pH 13. 00]，12000rpm 離心 30S，對(duì)柱子進(jìn)行預(yù)處理； (5) 將步驟（3)中的混合液，室溫12, OOOrpm離心Imin ; (6) 取上清液加到預(yù)處理過的硅膠柱中，室溫12, OOOrpm離心30S，棄收集管中的液 體； (7) 向娃膠柱中加入300μ1 Binding Buffer,室溫12, OOOrpm離心30S，棄收集管中的 液體； (8) 向硅膠柱中加入 650 μ I Wash Buffer [Wash Buffer (DNA 洗滌液）：20mM NaCl, 20mM Tris-HCl，80% ethanol，pH 7. 5]，室溫 12, OOOrpm 離心 30S，棄收集管中的液體； (9) 重復(fù)步驟（8); (10) 室溫 12, OOOrpm 離心 2min ; (II) 將硅膠柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml EP管中，加入65°C預(yù)熱的Elution Buffer 30 μ 1 [Elution Buffer (DNA 洗脫液）：20 μ g/ mL RNA 酶，IOmM Tris-HCl，pH 8.5]，室溫靜置 2min ； (12) 12, OOOrpm 離心 lmin，即得到 DNA 樣品。
[0023] 二、PCR 檢測 根據(jù)植物葉綠體23S rDNA的序列，設(shè)計(jì)通用引物GFR，對(duì)提取的植物基因組進(jìn)行PCR檢 測。
[0024] 引物序列為： GFR-F: 5' -AGTTGGTGAACTGATGACA-3' GFR-R: 5, -GGTCTGACACAAGGTTAGA-3' PCR擴(kuò)增所用試劑購自TAKARA公司，反應(yīng)的體系為：2. 5μ1 IOXrTaq PCR Buffer (Mg2+plus), 2. 5μ I MgCl2 (25mM), 2 μ I dNTP mix (2. 5mM each),0. 5μ1 GFR-F (10 μ Μ), 0·5μ1 GFR-R (ΙΟμΜ),ΙμΙ 不同樣品的 DNA，0.2yl rTaq Polymerase，PCR_Grade Η20 補(bǔ) 足體積(總體積25 μ I)。
[0025] PCR 反應(yīng)的條件為：94°C 7min - [94°C 30s - 56°C 30s - 72°C 30s] X35cicles - 72°C IOmin - 4°C。
[0026] 三、瓊脂糖凝膠電泳分析 基因組DNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用0. 8%和I. 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，上樣緩沖液 為10 X LoadingBuffer，電泳緩沖液為I X TAE，分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker為DL2，000, EB染色，紫 外凝膠成像儀在312nm下觀察并拍照。
[0027] 結(jié)果表明，以本發(fā)明的方法提取上述樣品，均能得到電泳可見的基因組（圖1);用 通用引物GFR擴(kuò)增葉綠體23S rDNA，所有樣品都能獲得大小約為360bp的目的條帶且亮度 差異不大（圖2)。由此可見，本發(fā)明方法可用于市面上常見轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的檢測，不論是新 鮮的植物組織(如油菜、西紅柿）還是淀粉(如馬鈴薯、大米)、蛋白（如大豆）含量較多的樣品 都可以達(dá)到良好的檢測效果，具有廣泛的適用性。
[0028] 實(shí)施例2 采用本發(fā)明的方法與實(shí)驗(yàn)室常見方法提取的基因組DNA的對(duì)比 在實(shí)施例1中所擴(kuò)增的基因?yàn)榧s360bp的植物內(nèi)標(biāo)基因，因此有較好的擴(kuò)增效果，然而 對(duì)于較大的外源基因，本發(fā)明方法是否有自己的優(yōu)勢(shì)呢？為了比較該方法與實(shí)驗(yàn)室常用的 CTAB提取法、SDS提取法、堿裂解提取法和試劑盒提取法的差異，本例選擇轉(zhuǎn)0sl2g24050基 因轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行檢測。
[0029] 具體步驟如下： 一、采用六種不同方法提取轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA 按照實(shí)施例1的本發(fā)明的方法和CTAB提取法、SDS提取法、堿裂解提取法、Biomega公 司DNA提取試劑盒和康為公司DNA提取試劑盒提取基因組。CTAB法參照（JJ Doyle等. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19，11-15);SDS法參照（D Goldenberger 等· 1995. A simple "universal，'DNA extraction procedure using SDS and proteinase K is compatible with direct PCR amplification. Genome Research 4，368 - 370);喊裂解法參照（H Wang 等· 1993. A simple method of preparing plant samples for PCR. Nucleic Acids Research 21，4153 - 4154〕；Biomega公司DNA提取試劑盒和康為公司DNA提取試劑盒參 照公司說明書。
[0030] 二、六種方法獲得的基因組DNA濃度和純度對(duì)比 (1) 用分光光度計(jì)檢測六種方法所提取核酸的濃度和純度，檢測結(jié)果見表1 ; (2) 用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的目的DNA片段，電泳對(duì)比結(jié)果見圖3。
[0031] 三、六種不同方法對(duì)不同片段大小的基因的擴(kuò)增效果 分別用上述方法提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測。選用的引物 分別為elf，擴(kuò)增片段為560bp ;0sl2g24050-l，擴(kuò)增片段為2000bp ;0sl2g24050-2,擴(kuò)增片 段為 4500bp。
[0032] 引物序列為： elf-F: 5' -TTGTGCTGGATGAAGCTGATG-3' elf-R: 5, -GGAAGGAGCTGGAAGATATCATAGA-3， 0sl2g24050-l-F: 5' -AACTGAAAGAGTATAGGCGGGC-3' 0sl2g24050-l-R: 5' -AGTCATAGCCTTGCGCTGTAAT-3' 0sl2g24050-2-F: 5' -GGCGGGGAAGGTGGAGAAC-3' 0sl2g24050-2-R: 5' -GCCAATGCAGGAGGAAGAG-3'。
[0033] PCR反應(yīng)體系中模板DNA為200ng，反應(yīng)條件中2000bp延伸時(shí)間為2min，4500bp 延伸時(shí)間為5min，其余同實(shí)施例1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖4-圖 6)。
[0034] 表1六種不同方法提取基因組的濃度、純度比較

【權(quán)利要求】
1. 一種快速提取植物基因組DNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的組成包括： (1) 平衡液：2mM Tris-HCl，pH 13. 00 ; (2) 裂解液：10% CTAB ; (3) DNA結(jié)合液：5. 0M鹽酸胍，30%異丙醇； (4) DNA 洗滌液：20mM NaCl，20mM Tris-HCl，80% 乙醇，pH 7.5 ; (5) DNA 洗脫液：20 ii g/ mL RNA 酶，10mM Tris-HCl，pH 8. 5 ; (6) DNA吸附柱。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速提取植物基因組DNA的試劑盒，其特征在于，所述DNA吸 附柱為娃I父柱。
3. -種利用權(quán)利要求1或2所述試劑盒快速提取植物DNA的方法，其特征在于：依次 包括以下步驟： (1) 向DNA吸附柱中加200 ill平衡液，12000rpm離心30s ; (2) 取30-50mg植物組織放到2ml的EP管中，加入2粒滅菌的小鋼珠后直接放入液氮 中，待植物組織凍硬后立即撈出放入鋁盒，蓋上蓋，快速振搖數(shù)下；重復(fù)此步驟2-3次使植 物組織研磨徹底； (3) 加入65°C預(yù)熱的100 ii 1裂解液，溫育2min,期間輕柔顛倒混勻，隨后加入600 ii 1 DNA結(jié)合液，輕柔顛倒混勻； (4) 將EP管倒過來蓋子向下，在蓋子下壓上一塊磁鐵，再輕輕翻過來使小鋼珠被吸到 蓋子上，壓著磁鐵開蓋，將小鋼珠彈入回收盒中后，室溫12, OOOrpm離心lmin ; (5) 取上清液加到平衡液預(yù)處理過的DNA吸附柱中，室溫12, OOOrpm離心30s，棄收集 管中的液體； (6) 向DNA吸附柱中加入300 ill DNA結(jié)合液，室溫12, OOOrpm離心30s，棄收集管中的 液體； (7) 向DNA吸附柱中加入650 ill DNA洗滌液，室溫12, OOOrpm離心30s，棄收集管中的 液體；重復(fù)此步驟1次后，室溫12, OOOrpm離心2min ; (8) 將DNA吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml EP管中，加入65°C預(yù)熱的DNA洗脫液 30 y 1，室溫靜置2min后，12, OOOrpm離心lmin,即得到DNA樣品。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104404030SQ201410611816
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】張煜隆, 楊靚, 吳祖建, 唐雅君, 劉小娟, 吳康承 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)