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      單核細胞增生李斯特氏菌實時濁度lamp檢測方法

      文檔序號:493943閱讀:259來源:國知局
      單核細胞增生李斯特氏菌實時濁度lamp檢測方法
      【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種單核細胞增生李斯特氏菌的實時濁度LAMP快速檢測方法,從而彌補現(xiàn)有技術的不足。本發(fā)明首先提供一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引物組,其核苷酸序列為SEQ ID NO:1-4。本發(fā)明針對單核細胞增生李斯特氏菌的溶血素基因設計一套LAMP引物,利用實時濁度儀對單核細胞增生李斯特氏菌進行檢測,并驗證檢測方法的特異性和靈敏度,從而建立快速、特異、靈敏的單核細胞增生李斯特氏菌LAMP檢測方法。
      【專利說明】單核細胞增生李斯特氏菌實時濁度LAMP檢測方法

      【技術領域】
      [0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測【技術領域】,具體涉及一種單核細胞增生李斯特氏菌的實時 濁度LAMP快速檢測方法。

      【背景技術】
      [0002] 單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是一類兼性細胞內生長的 革蘭陽性細菌,致病力較強,能引起人和動物的李斯特菌病,是重要的食源性人畜共患病原 菌。單增李斯特氏菌營養(yǎng)要求不高,環(huán)境適應性強,既可在2?4°C下生長,也可在-18°C下 存活,甚至在反復凍融的條件下仍可存活。近年來,歐美國家因食用李斯特菌污染的食品的 病患呈上升趨勢,世界衛(wèi)生組織(WHO)已將其列為20世紀90年代以來食品中四大致病菌 之一,成為許多國家食品衛(wèi)生安全的必檢項目。
      [0003] 目前,對單核細胞增生李斯特氏菌的檢測仍以傳統(tǒng)方法為主,不但檢驗周期長 (4?7d)、操作繁瑣,且準確性和靈敏性低,不利于食源性疾病的快速檢測。因此,有必要提 供一種更有效的檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法。


      【發(fā)明內容】

      [0004] 本發(fā)明的目的是提供一種單核細胞增生李斯特氏菌的實時濁度LAMP快速檢測方 法,從而彌補現(xiàn)有技術的不足。
      [0005] 本發(fā)明首先提供一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引物組,引物信 息如下:
      [0006] LM0-F3 :ATCGATCACTCTGGAGGA (SEQ ID N0:1)
      [0007] LM0-B3 :AAGCTAAACCAGTGCATTC (SEQ ID NO :2)
      [0008] LMO-FIP (SEQ ID NO :3):
      [0009] TGAACAATTTCGTTACCTTCAGGATTACGTTGCTCAATTCAACATCT
      [0010] LMO-BIP(SEQ ID NO:4):
      [0011] GGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTGCGTAAACATTAATATTTCTTGCG。
      [0012] 本發(fā)明還提供一種利用上述的LAMP引物組檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方 法,包括有如下的步驟:
      [0013] 1)待檢測基因組DNA的提?。河眉毦蚪MDNA提取試劑盒(上海生工)提取細 菌 DNA ;
      [0014] 2)環(huán)介導等溫擴增步驟:根據(jù)本發(fā)明設計的單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引 物,加入反應體系中各組分,擴增溫度為62. 5°C,實時濁度儀中反應60min,80°C,5minJ* 止反應;
      [0015] 3)結果檢測:直接通過實時濁度儀觀察或擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
      [0016] 本發(fā)明針對單核細胞增生李斯特氏菌的溶血素基因設計一套LAMP引物,利用實 時濁度儀對單核細胞增生李斯特氏菌進行檢測,并驗證檢測方法的特異性和靈敏度,從而 建立快速、特異、靈敏的單核細胞增生李斯特氏菌LAMP檢測方法。

      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0017] 圖I :LAMP特異性試驗結果圖,其中曲線為單核細胞增生李斯特氏菌擴增曲線,其 余11株其他菌株均未出現(xiàn)擴增曲線。
      [0018] 圖2 :LAMP靈敏度試驗結果圖,其中1?6為10-1?10-6濃度級稀釋菌液,7為 空白對照。

      【具體實施方式】
      [0019] 下面結合實施例對本發(fā)明的方法進行詳細的描述。
      [0020] -、用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引物組的設計
      [0021] 本發(fā)明根據(jù)GeneBank中公布的單核細胞增生李斯特氏菌hlyA基因,進行序列 的保守性分析,從中篩選出溶藻膠弧菌的高度保守序列,用Primer Explorer V4.0軟件 (http://primer-explore;r· jp/e/v4_manual/index. heml)進行引物設計。設計合適的引物 是進行LAMP反應的關鍵,通過考慮堿基組成,GC含量,二級結構的形成,Tm值等因素來設計 溶藻膠弧菌LAMP反應的引物。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物如表1所 示:
      [0022] 表1用于擴增單核細胞增生李斯特氏菌hlyA基因的LAMP引物序列
      [0023]

      【權利要求】
      1. 一種LAMP引物組,其特征在于,所述的引物組的序列信息如下: LM0-F3 :ATCGATCACTCTGGAGGA、 LM0-B3 :AAGCTAAACCAGTGCATTC、 LMO-FIP : TGAACAATTTCGTTACCTTCAGGATTACGTTGCTCAATTCAACATCT LMO-BIP : GGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTGCGTAAACATTAATATTTCTTGCGo
      2. 權利要求1所述的引物組在檢測單核細胞增生李斯特氏菌中的應用。
      3. -種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的試劑盒,其特征在于,所述的試劑盒包含 有權利要求1所述的LAMP引物組。
      4. 權利要求3所述的試劑盒在檢測單核細胞增生李斯特氏菌中的應用。
      5. -種檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法,其特征在于,所述的方法包括有如下的 步驟: 1) 待檢測基因組DNA的提取:用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA ; 2) 環(huán)介導等溫擴增步驟:將權利要求1所述的LAMP引物組加入反應體系,擴增溫度為 62. 5°C,實時濁度儀中反應6〇1^11,8〇1:,5111111,終止反應; 3) 結果檢測:直接通過實時濁度儀觀察或擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
      【文檔編號】C12Q1/68GK104313173SQ201410632370
      【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月11日 優(yōu)先權日:2014年11月11日
      【發(fā)明者】黃朱梁, 薛超波, 王萍亞 申請人:舟山市質量技術監(jiān)督檢測研究院
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