一種檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量rt-pcr檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒用于臨床及科研領(lǐng)域，可以廣泛用于BVDV的快速檢測(cè)，特別是對(duì)BVDV感染的快速檢測(cè)及其對(duì)牛源原材料、豬瘟弱毒活疫苗中是否污染BVDV的快速監(jiān)測(cè)。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒感染的熒光定量RT-PCR方法，該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，具有特異性高，靈敏度高，重復(fù)性好，擴(kuò)增與檢測(cè)一步完成，操作更簡(jiǎn)單，檢測(cè)可在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)完成的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】-種檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑 盒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量 RT-PCR檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV),又稱牛病毒性腹 瀉-粘膜病病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVD_MDV)，屬于黃病毒 科（Flavivixidae)、癌病毒屬（Pestivirus)的成員。該病毒與豬癌病毒（Classical swine fever virus，CSFV)為同一個(gè)屬。牛血清、冷凍胚胎、牛精液等牛源產(chǎn)品都可能污染BVDV， 造成BVDV的傳播。在獸用疫苗生產(chǎn)中，常使用牛血清、牛睪丸細(xì)胞、胰酶等牛源材料作為原 材料。因此，一旦這些原材料中若有BVDV病原，會(huì)導(dǎo)致疫苗污染，尤其是豬用疫苗污染后， 會(huì)導(dǎo)致免疫豬感染BVDV，造成自身類似豬瘟的臨床癥狀給豬瘟的診斷帶來困難外，還會(huì)成 為BVDV的污染源。
[0003] 國(guó)內(nèi)對(duì)于豬瘟苗原材料中檢測(cè)BVDV的方法主要有Vero傳代細(xì)胞檢測(cè)法、致細(xì)胞 病變和紅細(xì)胞吸附外源病毒檢驗(yàn)法、熒光抗體檢測(cè)法、微量血清中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試 驗(yàn)、PCR技術(shù)等。常規(guī)的檢測(cè)方法存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力，靈敏度低等缺點(diǎn)。隨著生物技術(shù)水平的 發(fā)展，熒光定量RT-PCR方法的出現(xiàn)，為BVDV的檢測(cè)提供了一種有力的工具。而熒光定量 RT-PCR與普通RT-PCR相比具有靈敏性更強(qiáng)、特異性更好、污染幾率小、自動(dòng)化高、高通量等 優(yōu)勢(shì)，因而成為一種越來越重要的檢測(cè)技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光 定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒能夠快速準(zhǔn)確的對(duì)牛病毒性腹瀉病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑 盒的應(yīng)用，包括臨床及科研中對(duì)于牛病毒性腹瀉病毒感染的快速定量檢測(cè)盒對(duì)牛血清及豬 瘟弱毒活疫苗等生物制品中是否污染牛病毒性腹瀉病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量 RT-PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括一對(duì)BVDV的特異性引物及一條特異性探針，其中所 述引物對(duì)的上游序列（BVDV-P1)為 5 ' -GGG (A/G/T) AGTCGTCA (A/G) TGGTTCG-3 '，下游序列 (BVDV-P2)為 5 ' -CCTATCAGGC TGT (A/G) T (C/T) C (A/G) TA (A/G) C-3 '，所述的特異性探針序列 (BVDV-MGB)為 5' -FAM-CGTCCAC(A/G)TGGCATCTCGAG-NFQ-MGB-3'。
[0007] 進(jìn)一步地，所述RT-PCR反應(yīng)液包括以下組分：2XRT-PCR Buffer緩沖液、DNA聚合 酶、反轉(zhuǎn)錄酶、上游引物BVDV-P1、下游引物BVDV-P2、特異性探針、Total RNA、RNase Free dH20。
[0008] 作為最優(yōu)方案，所述RT-PCR反應(yīng)液的總體積為25 μ L，所述RT-PCR反應(yīng)液包括以 下組分：2X0ne st印 RT-PCR BufTerIII:12.5yL;5U/yL Takara Ex Taq HS:0.5yL; PrimeScript RT enzyme MixII :0·5μ L ;10μ M上游引物 BVDV-Pl :1. 5μ L ;10μ M下游引 物 BVDV-P2 :1. 5 μ L ;特異性探針：1 μ L ;Total RNA :5 μ L、RNase Free dH20 :2. 5 μ L。
[0009] 所述試劑盒還包括陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。
[0010] 所述的檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，該試劑盒 使用時(shí)包括如下步驟：
[0011] SI.提取待檢樣品的RNA ;
[0012] S2. -步法PCR，利用反轉(zhuǎn)錄過程將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR ;
[0013] S3.對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、判定檢測(cè)結(jié)果；
[0014] 其中，所述應(yīng)用不用于診斷目的。
[0015] 本發(fā)明所述的RNA提取是指商品化病毒RNA試劑盒提取RNA。
[0016] 本發(fā)明中最優(yōu)反應(yīng)程序是指1個(gè)循環(huán)反轉(zhuǎn)錄42°C，5min ;40個(gè)循環(huán)95°C，IOsec ; 95°C，5sec ;60°C，30sec，于60°C進(jìn)行熒光信號(hào)采集。
[0017] 本發(fā)明所述的結(jié)果判定：點(diǎn)擊PCR儀分析界面，取3?15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)為基線。 閾值為閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照品的擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，無 Ct值并且與陽性對(duì)照的 指數(shù)期相交為準(zhǔn)。當(dāng)檢測(cè)樣Ct值< 35. 0,且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，結(jié)果可直接判定為 陽性；當(dāng)檢測(cè)樣35〈Ct值〈40,需重檢一次，若Ct值仍〈40,且擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng) 期，可判定結(jié)果為陽性，否則為陰性；檢測(cè)結(jié)果無 Ct值或Ct值為40,結(jié)果判定為陰性。
[0018] 用于檢測(cè)BVDV的方法，包括應(yīng)用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)待測(cè)樣本中是否存在 BVDV的RNA步驟，其中所述RT-PCR方法應(yīng)用了以下引物對(duì)和探針：序列為5' -GGG(A/G/ T)AGTCGTCA(A/G)TGGTTCG-3' 的上游引物，序列為 5' -CCTATCAGGC TGT(A/G)T(C/T)C(A/G) TA(A/G)C-3' 的下游引物，以及序列為 5' -FAM-CGTCCAC(A/G)TGGCATCTCGAG-NFQ-MGB-3' 的 探針，所述用于檢測(cè)BVDV的方法不用于診斷目的。
[0019] 用于檢測(cè)BVDV的方法，包括應(yīng)用上述熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)待測(cè)樣本 中是否存在BVDV的RNA的步驟。
[0020] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明根據(jù)GenBank中的牛病毒性腹瀉病毒和豬瘟病毒的 基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)BVDV的特異性引物，通過對(duì)熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化， 具有較好的重復(fù)性、靈敏度和特異性，可以廣泛用于BVDV的快速檢測(cè)，特別是對(duì)BVDV感染 的快速檢測(cè)及其對(duì)牛源原材料、豬瘟弱毒活疫苗中是否污染BVDV的快速監(jiān)測(cè)；本發(fā)明采用 探針法熒光定量RT-PCR方法其假陽性率低于SYBR Green染料法，其檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，與 普通的PCR檢測(cè)方法相比，本發(fā)明的方法具有特異性高，靈敏度高，重復(fù)性好，擴(kuò)增與檢測(cè) 一步完成，操作更簡(jiǎn)單，檢測(cè)可在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明方法特異性的動(dòng)力學(xué)曲線。圖中a是BVDV，b-g分別是豬圓環(huán)病 毒2型（PCV2)、豬偽狂犬病病毒（PRV)、豬胃腸炎病毒（TGEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)、CSFV和陰性對(duì)照；
[0022] 圖2為本發(fā)明方法重復(fù)性的動(dòng)力學(xué)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以 下所述。
[0024] 實(shí)施例1 :檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒
[0025] 1 · 一對(duì)BVDV的特異性引物：引物對(duì)的上游序列（BVDV-P1)為5 ' -GGG (A/G/T) AGTCGTCA (A/G) TGGTTCG-3 '，下游序列（BVDV-P2)為 5 ' -CCTATCAGGC TGT (A/G) T (C/T) C (A/ G)TA(A/G)C-3,；
[0026] 2. -條特異性探針：特異性探針序列（BVDV-MGB)為5 ' -FAM-CGTCCAC (A/G) TGGCATCTCGAG-NFQ-MGB-3,；
[0027] 3. RT-PCR反應(yīng)液組分（總體積為25 μ L):
[0028] 2 X One step RT-PCR Buffer III ： 12. 5 μ L ；
[0029] 5U/ μ L Takara Ex Taq HS ：0. 5 μ L ；
[0030] PrimeScript RT enzyme Mix II :0· 5 μ L ;
[0031] ΙΟμΜ上游引物 BVDV-Pl :1.5yL;
[0032] 10 μ M 下游引物 BVDV-P2 :1. 5 μ L ;
[0033] 特異性探針：IyL ;
[0034] Total RNA ：5μ L>
[0035] RNase Free dH20 :2· 5 μ L。
[0036] 4.陽性對(duì)照：BVDV C24V毒株MDBK細(xì)胞系產(chǎn)物，其病毒滴度為106 5TCID5Q/ml，滅 活提取RNA分裝。
[0037] 5.陰性對(duì)照：MDBK細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物，滅活提取RNA分裝。
[0038] 實(shí)施例2 :牛病毒性腹瀉病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立
[0039] 1.材料
[0040] 根據(jù)BVDV核苷酸序列，利用DNAStar軟件進(jìn)行序列分析，利用Oligo 6. 0引物設(shè) 計(jì)軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物及探針用于鑒定BVDV及CSFV病毒。引物由上海英駿公司合成，探針 由 ABI 公司合成。One Step PrimeScript? RT-PCR Kit (Perfect Real Time)購置寶生物 (大連）有限公司；病毒RNA提取試劑盒購置天根生化科技（北京）有限公司。
[0041] 2.方法與結(jié)果
[0042] (1)最佳反應(yīng)條件的確立
[0043] 為了確定引物的最佳反應(yīng)體系，對(duì)引物和探針的濃度進(jìn)行了相應(yīng)的優(yōu)化。反應(yīng)程 序?yàn)椋?2°C，5min (-個(gè)循環(huán)）；95°C，10sec ;95°C，5sec ;60°C，30sec，反應(yīng)進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)， 于60 °C進(jìn)行突光信號(hào)米集。反應(yīng)25 μ L體系如表1所不：
[0044] 表1 :最佳反應(yīng)體系表
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述 試劑盒包括一對(duì)BVDV的特異性引物及一條特異性探針，其中所述引物對(duì)的上游序列 (BVDV-Pl)為 5' - GGG (A/G/T)AGTCGTCA (A/G)TGGITCG-3'，下游序列（BVDV-P2)為5'-〇7^11^66(：161'仏/6)1'((：/1')(：仏/6)了六仏/6)(：-3'，所述的特異性探針序列（8￥0￥-]\?^)為 5' -FAM-CGTCCAC(A/G)TGGCATCTCGAG -NFQ-MGB-3'。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其 特征在于所述引物對(duì)和探針被包括在RT-PCR反應(yīng)液中，所述RT-PCR反應(yīng)液包括以下組分 ： 2X RT-PCR Buffer緩沖液、DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、上游引物BVDV-P1、下游引物BVDV-P2、 特異性探針、Total RNA、RNase Free dH20。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其 特征在于所述RT-PCR反應(yīng)液的總體積為25 ii L，所述RT-PCR反應(yīng)液包括以下組分：2XOne step RT-PCR Buffer III ： 12. 5 u L ；5U/u L Takara Ex Taq HS ：0. 5 u L ；PrimeScript RT enzyme Mix II :0? 5 ii L ; 10 ii M 上游引物 BVDV-Pl : I. 5 ii L ; 10 ii M 下游引物 BVDV-P2 : I. 5 ii L ;特異性探針：1 ii L ;Total RNA :5 ii L、RNase Free dH20 :2. 5 ii L。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的一種檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑 盒，其特征在于所述試劑盒還包括陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試 劑盒的應(yīng)用，其特征在于該試劑盒使用時(shí)包括如下步驟：
51. 提取待檢樣品的RNA ;
52. -步法PCR，利用反轉(zhuǎn)錄過程將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR ;
53. 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、判定檢測(cè)結(jié)果； 其中，所述應(yīng)用不用于診斷目的。
6. 用于檢測(cè)BVDV的方法，其特征在于，包括應(yīng)用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)待測(cè)樣本 中是否存在BVDV的RNA步驟，其中所述RT-PCR方法應(yīng)用了以下引物對(duì)和探針：序列為5'_ GGG (A/G/T)AGTCGTCA (A/G)TGGITCG-3' 的上游引物，序列為 5'- CCTATCAGGC TGT(A/G) T (C/T)C(A/G)TA(A/G)C-3,的下游引物，以及序列為 5' -FAM-CGTCCAC(A/G)TGGCATCTCGAG -NFQ-MGB-3'的探針，所述用于檢測(cè)BVDV的方法不用于診斷目的。
7. 用于檢測(cè)BVDV的方法，其特征在于，包括應(yīng)用權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的熒光定量 RT-PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)待測(cè)樣本中是否存在BVDV的RNA的步驟。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK104313192SQ201410658803
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】徐宏軍, 岳豐雄, 黃杰, 張奕強(qiáng), 柏菊, 王潔清, 胡來根, 王家福 申請(qǐng)人:成都天邦生物制品有限公司