一種融合蛋白及其載體的構建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種融合蛋白及其載體的構建方法和應用，旨在建立一種使TALEN技術作為細胞株更加科學有效的融合載體的構建方法；其技術要點：該融合蛋白結構為EGFP-_mODC_NLS；其表達載體包含一個EGFP-_mODC_NLS融合蛋白及其一對切割NLS的TALEN質粒對；該融合蛋白用于切割NLS信號的TALEN質粒對以及原核表達EGFP_mODC_NLS_TALEN_R蛋白和EGFP_mODC_NLS_TALEN_R蛋白，也可以用于驗證TALEN質粒對的轉染效率以及在細胞中的活性；屬于生物【技術領域】。
【專利說明】一種融合蛋白及其載體的構建方法和應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明公開了一種融合蛋白，具體地說，是一種用于驗證TALEN質粒對的轉染效率以及在細胞中的活性及其驗證其它質粒的轉染效率的融合蛋白，本發(fā)明還公開了該融合蛋白的構建方法和應用。

【背景技術】
[0002]小鼠鳥氨酸脫羧酶(MODC)的中部和C-末端的氨基酸包含兩個PEST序列的降解域，這兩個降解域促進該蛋白的降解，使蛋白的半衰期很短，該特點在基因功能研究上有很大的應用。
[0003]類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcript1n act ivator-like effectornuclease, TALEN)技術是一種嶄新的分子生物學工具。TALEN技術目前已經(jīng)廣泛應用于基因修飾。
[0004]尤其是動物模型和細胞模型的建立。但是，在制作細胞模型，或者敲除細胞某一個基因的時候。都需要把TALEN質粒對通過Lipo2000或者病毒的形式轉到細胞中去，但是由于缺乏一個對照，TALEN的轉染效率和切割活性存在一個未知數(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述問題，本發(fā)明的目的在于建立一種使TALEN技術作為細胞株更加科學有效的融合蛋白及其載體的構建方法。
[0006]為此，本發(fā)明提供的前一個技術方案是這樣的:該融合蛋白結構為EGFP__mODC_NLS。
[0007]本發(fā)明提供的另一個技術方案是這樣的:該融合蛋白的表達載體包含一個EGFP-_mODC_NLS融合蛋白及其一對切割NLS的TALEN質粒對。
[0008]進一步的，上述的融合蛋白載體的結構為CMV-EGFP_mODC_NLS。
[0009]本發(fā)明的另一個目的是提供該融合蛋白的表達載體的制備方法，該方法依次包括下述步驟:
[0010]A)構建 CMV-EGFP_mODC_NLS 表達載體:
[0011]I)用引物 GFP_F: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 和引物 Gfp_R:GGCTCAGCTATGATTCTCACTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA 去擴展 EGFP，回收 PCR 片段；
[0012]2)用引物 mODC_F: TCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAGTGAGAATCATAGCTGAGCCA 和引物mODC_R:TCAATCAATTAGACTTTTCTCTTTTTCTTTGGTACCTTCCTCTTCTTTTTGGGCACATTGATCCTAGCAGAAGCAC擴展mODC片段；
[0013]3)融合步驟I)制備的PCR片段和步驟2)制備的mODC片段后，克隆到慢病毒表達載體上。
[0014]B)用Gold gate的方法構建針對NLS的TALEN質粒對
[0015]I) TALEN_F 識別的序列是:TCTGCTAGGATCAATGTGCC ；
[0016]2)識別的序列是
[0017]0慢病毒載體的制備
[0018]將沾慢病毒表達載體和輔助質粒轉染到293細胞，然后制備汕慢病毒；同時制備表達I'釓冊」7和I'釓冊」?的慢病毒。
[0019]0)穩(wěn)定表達細胞系的制備
[0020]汕慢病毒感染細胞?:5786胚胎干細胞；
[0021〕 ￡) 05786.26？？穩(wěn)定表達2即？的細胞株感染I從冊」7和I從冊」?質粒對。
[0022]本發(fā)明提供的融合蛋白用于切割13信號的質粒對以及原核表達郎--—
蛋白和蛋白。
[0023]本發(fā)明提供的融合蛋白用于驗證1^12^質粒對的轉染效率以及在細胞中的活性。
[0024]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的技術方案制備方法簡單，使用該方法或者制備的穩(wěn)定表達的細胞株可以很好的用于對照實驗，使得I'從別技術做細胞株更加科學有效，該方法不僅可以用于基因功能研究的對照實驗，也可以用于藥物靶點篩選。
具體實施例
[0025]下面結合具體實施例，對本發(fā)明的權利要求做進一步的詳細說明，但不構成對本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權利要求保護范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權利要求保護范圍之內(nèi)。
[0026]實施例1
[0027]本發(fā)明提供的一種融合蛋白結構為￡(
[0028]其制備方法是:
[0029]將帶有重組質粒的大腸桿菌8121菌種擴大培養(yǎng)，在12-181經(jīng)1？16過夜誘導，收集所得到的蛋白菌體，經(jīng)過高壓破碎后離心獲得可溶性的上清，進行附柱親和層析；待目的蛋白與附柱結合之后，先用漂洗液洗滌，在用洗脫緩沖液洗滌，在用脫鹽柱將洗脫組分中的高鹽緩沖液置換成含有20%甘油的？83溶液，之后進行的檢測，所得即為純化的蛋白。
[0030]本發(fā)明提供的一種融合蛋白的表達載體，包含一個融合蛋白及其一對切割13的I'釓別質粒對；其結構為
[0031]上述的融合蛋白的表達載體的制備方法，依次包括下述步驟:
[0032]八)構建表達載體:
[0033]1)用引物即?」7: ^166X6^60^66606^66^ 和引物: 66010^601^16^11010^010001X6X^0^60X06X00^X6006^ 去擴展 2即？，回收？邙片段；
[0034]2)用引物 11100(:3: 10660^X66^06^60X6X^0^666^6X6^6^X0^X^60X6^600^ 和引物111000,^:10^10^11^6^01111010111110111661^00110010110111116660^0^116^1001^60^6^60^0擴展000(:片段；
[0035]3)融合步驟1)制備的？⑶片段和步驟2)制備的000(:片段后，克隆到慢病毒表達載體上。
[0036]8)用職仏的方法構建針對13的I從冊質粒對
[0037]1)其中I從冊」7識別的序列是； 1^120識別的序列是:
[0038]0汕慢病毒載體的制備
[0039]將沾慢病毒表達載體和輔助質粒轉染到293細胞，然后制備汕慢病毒；同時制備表達I'釓冊」7和I'釓冊」?的慢病毒。
[0040]0)汕穩(wěn)定表達細胞系的制備
[0041〕 汕慢病毒感染細胞?:5786胚胎干細胞；
[0042]￡) 05786.26？？穩(wěn)定表達2即？的細胞株感染I從冊」7和I從冊」?質粒對。
[0043]穩(wěn)定表達26？？的單克隆挑選出來后，擴大培養(yǎng)制備成穩(wěn)定表達(^?的05786細胞株，然后感染和質粒對。6個小時后，觀察發(fā)現(xiàn)定位在細胞質里面，而細胞核沒有(^--。
[0044]該融合蛋白用于切割13信號的I從冊質粒對以及原核表達
I'八[冊」?蛋白和蛋白或者用于驗證I'釓別質粒對的轉染效率以及在細胞中的活性。
[0045]具體方法為:
[0046]對細胞內(nèi)源性基因以0？4與(1^5的敲除，用的05786細胞株作為對照。
[0047]首先設計細胞內(nèi)源性基因(1^5的I從別質粒對，I從冊-?:0？5」？。
[0048]制備I從冊立，1^12^-001^5^ 慢病毒。
[0049]用打靶13序列的I從冊慢病毒感染穩(wěn)定表達的05786細胞；用I從冊立，1^12^-001^5^慢病毒感染另外的05786細胞。感染24小時后，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達的05786細胞⑶？從細胞核轉移到細胞質。同時收集細胞，提取轉染I從冊立，1^12^-001^5^慢病毒的細胞基因組，利用引物
？1: 0X600X0060X0X^0X0^0X661 與(^咫―1？1:^11001666^6^6^060^0^0)擴增含有打靶位點的片段，作測序驗證，結果顯示，使用該方法從冊-(05立，1^12^-001^5^對細胞內(nèi)源基因001？5有切割活性，該方法可以成功用于對照實驗。
【權利要求】
1.一種融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白結構為EGFP-_mODC_NLS。
2.一種融合蛋白的表達載體，其特征在于，該表達載體包含一個權利要求1所述的EGFP-_mODC_NLS融合蛋白及其一對切割NLS的TALEN質粒對。
3.根據(jù)權利要求2所述的融合蛋白載體，其特征在于，所述的表達載體結構為CMV-EGFP_mODC_NLS。
4.制備權利要求2所述的融合蛋白的表達載體的方法，其特征在于，依次包括下述步驟: A)構建CMV-EGFP_mODC_NLS 表達載體: 1)用引物GFP_F:ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 和引物 Gfp_R:GGCTCAGCTATGATTCTCACTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA 擴展 EGFP，回收 PCR 片段； 2)用引物mODC_F:TCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAGTGAGAATCATAGCTGAGCCA 和引物mODC_R:TCAATCAATTAGACTTTTCTCTTTTTCTTTGGTACCTTCCTCTTCTTTTTGGGCACATTGATCCTAGCAGAAGCAC擴展mODC片段； 3)融合步驟I)制備的PCR片段和步驟2)制備的mODC片段后，克隆到慢病毒表達載體上。 B)用Goldgate的方法構建針對NLS的TALEN質粒對: 1)TALEN_F識別的序列是:TCTGCTAGGATCAATGTGCC ； 2)TALEN_R 識別的序列是:TTTTCTCTTTTTCTTTGGTA。 C)pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS慢病毒載體的制備 將pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS慢病毒表達載體和輔助質粒轉染到293細胞，然后制備pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS慢病毒；同時制備表達TALEN_F和TALEN_R的慢病毒。 D)pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS穩(wěn)定表達細胞系的制備 pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS慢病毒感染細胞C57B6胚胎干細胞； E)C57B6_EGFP穩(wěn)定表達EGFP的細胞株感染TALEN_F和TALEN_R質粒對。
5.權利要求1所述的融合蛋白用于切割NLS信號的TALEN質粒對以及原核表達EGFP_mODC_NLS_TALEN_R 蛋白和 EGFP_mODC_NLS_TALEN_R 蛋白。
6.權利要求1所述的融合蛋白用于驗證TALEN質粒對的轉染效率以及在細胞中的活性。
【文檔編號】C12N15/867GK104497146SQ201410719532
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月1日 優(yōu)先權日:2014年12月1日
【發(fā)明者】霍依然, 李紅梅, 覃啟紅, 黃龍 申請人:廣州古藤蘭生物科技有限公司