含有甲?；亩嗫仔暂d體、使用該多孔性載體的吸附體以及它們的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及含有甲?；亩嗫仔暂d體的制造方法，其包括：向具有甲?；亩嗫仔粤Ｗ又袑?dǎo)入間隔團(tuán)，然后利用過碘酸和/或過碘酸鹽對上述間隔團(tuán)部分進(jìn)行氧化，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榧柞；?，其中，?dǎo)入間隔團(tuán)后的多孔性粒子的甲?；繛椋好?mL多孔性粒子中的甲?；繛?μmol以下。此外，本發(fā)明還涉及吸附體的制造方法，其包括：將含有氨基的配位體固定化于所述含有甲?；亩嗫仔暂d體上。根據(jù)本發(fā)明，可以提供吸附量大、強(qiáng)度高且配位體洗脫少的含有甲?；亩嗫仔暂d體，以及提供使用上述多孔性載體的吸附體。
【專利說明】含有甲?；亩嗫仔暂d體、使用該多孔性載體的吸附體以及它們的制造方法
[0001]本申請是國際申請日為2009年12月3日的申請?zhí)枮?00980148503.0的中國發(fā)明專利申請“含有甲?；亩嗫仔暂d體、使用該多孔性載體的吸附體以及它們的制造方法”的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及各種吸附體，特別是治療用(醫(yī)療用)吸附體和抗體醫(yī)藥品精制用吸附體。
【背景技術(shù)】
[0003]多孔性載體已被廣泛用作各種吸附體，例如各種色譜法用吸附體及親和吸附體。其中，親和吸附體可以高效率地精制目標(biāo)物，并且能夠降低無用物的濃度，因此已越來越多地被用作醫(yī)療用吸附體和抗體醫(yī)藥品精制用吸附體。特別是，作為用于治療風(fēng)濕、血友病、擴(kuò)張型心肌病的治療用(醫(yī)療用)吸附體，受到關(guān)注的是將作為親和配位體的蛋白質(zhì)A固定化于多孔性載體而得到的吸附體(例如，非專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2)。
[0004]另一方面，作為能夠特異性地吸附、洗脫免疫球蛋白(IgG)的吸附體，備受矚目的是將作為親和配位體的蛋白質(zhì)A固定化于多孔性載體而得到的吸附體(抗體醫(yī)藥品精制用吸附體)。作為將以蛋白質(zhì)A為 代表的各種親和配位體固定化于多孔性載體的方法，可以從例如非專利文獻(xiàn)3的表8.1和圖8.15中所示的溴化氰法、三氯三嗪法、環(huán)氧法、三氟乙烷磺酰氯法等各種固定化方法中選擇。其中，從安全性的觀點(diǎn)、以及固定化反應(yīng)的容易程度、能夠使用可通過較容易的方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)、肽等理由來看，工業(yè)上優(yōu)選將多孔性載體的甲?；c親和配位體的氨基之間的反應(yīng)應(yīng)用于固定化。
[0005]作為向多孔性載體導(dǎo)入甲?；姆椒ǎ梢粤信e通過過碘酸氧化法使具有連位(^ ^ )羥基的多糖凝膠氧化、從而在糖鏈上生成甲?；姆椒?以下簡稱為糖鏈開裂型)(例如非專利文獻(xiàn)4)。通過該方法得到的吸附體具有配位體洗脫少的優(yōu)點(diǎn)。
[0006]此外，還可以列舉如非專利文獻(xiàn)3的圖8.15、或非專利文獻(xiàn)5所示地，介由通過使戊二醛發(fā)生作用的方法、使環(huán)氧基開環(huán)得到的甘油基與過碘酸鹽作用的方法等得到的各種間隔團(tuán)導(dǎo)入甲?；姆椒?以下簡稱為間隔團(tuán)型)。使用了上述含有間隔團(tuán)型甲?；亩嗫仔暂d體的吸附體，具有目標(biāo)物吸附量較大的傾向。此外，在專利文獻(xiàn)I中公開了下述制造方法:向多孔性粒子的環(huán)氧基中導(dǎo)入氨基糖，并在該氨基糖部分經(jīng)氧化開裂而生成的甲?；瞎潭ɑ邪被呐湮惑w。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)1:日本特開昭62-15300
[0010]非專利文獻(xiàn)
[0011]非專利文獻(xiàn)I:Annals of the New York Academy of Sciences, 2005, Vol.1051,P635-646
[0012]非專利文獻(xiàn)2:American Heart Journal, Vol.152 (4), 2006
[0013]非專利文獻(xiàn)3:親和色譜法，笠井獻(xiàn)一等著，東京化學(xué)同人，1991年
[0014]非專利文獻(xiàn)4 Jmmunology, Vol.20，pl061, 1971
[0015]非專利文獻(xiàn)5 !Immobilized Affinity Ligand Techniques, Greg T.Hermanson etal., Academic Press, 1992

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]發(fā)明要解決的問題
[0017]然而，對于含有糖鏈開裂型甲?；亩嗫仔暂d體而言，糖鏈會(huì)因強(qiáng)氧化反應(yīng)而開裂，導(dǎo)致多孔性載體的強(qiáng)度變?nèi)酰赡茈y以在高線速下使用。另外，就抗體醫(yī)藥品精制用吸附體而言，具有對目標(biāo)物抗體的吸附量小的傾向，難以高速地進(jìn)行抗體精制。另一方面，對于含有間隔團(tuán)型甲酰基的多孔性載體而言，如果甲?；膶?dǎo)入量少，則在治療過程中及精制目標(biāo)物的過程中，可能發(fā)生親和配位體洗脫而混入到患者血液或精制產(chǎn)品的情況，因此從安全性和純度的觀點(diǎn)來看不優(yōu)選。
[0018]此外，雖然在通常的親和色譜領(lǐng)域的文獻(xiàn)(例如非專利文獻(xiàn)3和非專利文獻(xiàn)5)及活性化載體的產(chǎn)品目錄中沒有明確記載，但本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn):在專利文獻(xiàn)I所述方法中，對多孔性粒子進(jìn)行環(huán)氧化時(shí)，無論如何都會(huì)發(fā)生環(huán)氧基自動(dòng)開環(huán)而副產(chǎn)甘油基的情況。這樣，在使氨基糖發(fā)生氧化開裂而導(dǎo)入甲?；鶗r(shí)，由所述環(huán)氧基開環(huán)得到的甘油基也同時(shí)被氧化，從而會(huì)導(dǎo)入與間隔團(tuán)型相同的甲酰基，可能使親和配位體變得容易洗脫。
[0019]本發(fā)明是鑒于現(xiàn)有 技術(shù)存在的上述問題而完成的，目的在于提供可以提高治療和精制的安全性、實(shí)現(xiàn)高速化、并進(jìn)一步提高精制產(chǎn)品的純度的含有甲?；亩嗫仔暂d體、使用該多孔性載體的吸附體、它們的制造方法、以及使用它們的精制方法。
[0020]解決問題的方法
[0021]為了解決上述問題，本發(fā)明人等進(jìn)行深入地研究，結(jié)果完成了本發(fā)明。
[0022]即，本發(fā)明涉及含有甲?；亩嗫仔暂d體的制造方法，其包括:向具有甲酰基的多孔性粒子中導(dǎo)入間隔團(tuán)，然后利用過碘酸和/或過碘酸鹽對上述間隔團(tuán)部分進(jìn)行氧化，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榧柞；?，其中，?dǎo)入間隔團(tuán)后，多孔性粒子的甲?；繛?每ImL多孔性粒子中的甲?；繛? μ mol以下。
[0023]此外，本發(fā)明涉及含有甲?；亩嗫仔暂d體的制造方法，其包括:在加入酸而將pH調(diào)節(jié)至I~6范圍的液體中，使過碘酸或其鹽與多孔性載體或與導(dǎo)入了間隔團(tuán)的多孔性載體發(fā)生作用。
[0024]此外，本發(fā)明涉及含有甲?；亩嗫仔暂d體的制造方法，其包括:使過碘酸和/或過碘酸鹽與多孔性載體或與導(dǎo)入了間隔團(tuán)的多孔性載體在0°c以上且10°C以下的溫度下發(fā)生作用。
[0025]此外，本發(fā)明涉及通過上述任意一種含有甲?；亩嗫仔暂d體的制造方法得到的含有甲酰基的多孔性載體。
[0026]此外，本發(fā)明涉及吸附體的制造方法，其包括:將含有氨基的配位體固定化于所述的含有甲?；亩嗫仔暂d體上。[0027]此外，本發(fā)明涉及吸附體的制造方法，其中，在含有下述水溶液的反應(yīng)液中，將含有氨基的配位體固定化于含有甲?；亩嗫仔暂d體，所述水溶液包含選自羧酸鹽、金屬鹵化物及硫酸鹽中的I種以上化合物，且以羧酸鹽為必要成分。
[0028]此外，本發(fā)明涉及吸附體的制造方法，其中，在含有檸檬酸鹽和/或硫酸鹽的反應(yīng)液中，將含有氨基的配位體固定化于含有甲?；亩嗫仔暂d體。
[0029]此外，本發(fā)明涉及吸附體的制造方法，其包括:通過亞氨基化及其還原反應(yīng)這兩步反應(yīng)來進(jìn)行將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體，并在亞氨基化反應(yīng)之后實(shí)施穩(wěn)定化操作。
[0030]此外，本發(fā)明涉及吸附體的制造方法，其中，在將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體時(shí)，通過有機(jī)硼烷絡(luò)合物，使配位體的固定化鍵穩(wěn)定化并同時(shí)使其余的甲?；g化。
[0031]此外，本發(fā)明涉及吸附體，其中，含有氨基的配位體的導(dǎo)入量為:每ImL多孔性載體中導(dǎo)入含有氨基的配位體Img以上且500mg以下。
[0032]此外，本發(fā)明涉及吸附體，其中，含有氨基的配位體的導(dǎo)入量為:每ImL多孔性載體中導(dǎo)入含有氨基的配位體0.01 μ mol以上且15 μ mol以下。
[0033]此外，本發(fā)明涉及吸附體的制造方法，其中，所述含有氨基的配位體是蛋白質(zhì)A。
[0034]此外，本發(fā)明涉及吸附體，其中，從吸附體洗脫到目標(biāo)物中的配位體濃度的第一次精制?第三次精制的平均值為50ppm以下。
[0035]此外，本發(fā)明涉及吸附體，其在壓縮5%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.0lMPa以上且IMPa以下，壓縮10%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.03MPa以上且3MPa以下，以及壓縮15%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.06MPa以上且5MPa以下。
[0036]此外，本發(fā)明涉及吸附體的制造方法、按照上述制造方法得到的吸附體以及使用上述吸附體的精制方法。
[0037]此外，本發(fā)明涉及精制方法，其中，使用直徑為0.5cm以上且高度為3cm以上的柱。
[0038]此外，本發(fā)明涉及精制方法，其包括以lOOcm/h以上且lOOOcm/h以下的線速進(jìn)行通液的工序。
[0039]發(fā)明的效果
[0040]根據(jù)本發(fā)明，可以提供高強(qiáng)度的含有甲?；亩嗫仔暂d體。本發(fā)明的含有甲?；亩嗫仔暂d體可以適用于吸附體，可以得到目標(biāo)物吸附量大、且配位體的泄漏少的吸附體。此外，通過本發(fā)明的吸附體，可以提高治療和精制的安全性，并提供治療和精制的高速化及
高純度化。
[0041]發(fā)明的【具體實(shí)施方式】
[0042]本發(fā)明的含有甲?；亩嗫仔暂d體的制造方法中，向具有甲酰基的多孔性粒子中導(dǎo)入間隔團(tuán)，然后利用過碘酸和/或過碘酸鹽對上述間隔團(tuán)部分進(jìn)行氧化，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榧柞；渲?，?dǎo)入間隔團(tuán)后，多孔性粒子的甲?；繛?每ImL多孔性粒子中的甲酰基含量為3μπι01以下。通過該方法，在導(dǎo)入親和配位體后的吸附體中，配位體的洗脫量少，且可以抑制批次間偏差，并且，可以得到目標(biāo)物吸附量大的吸附體。
[0043]為了抑制配位體的泄漏，通常會(huì)針對配位體固定化后的還原反應(yīng)加以研究，而除此之外，本發(fā)明人還著眼于在用于導(dǎo)入配位體的含有甲?；嗫仔暂d體的前驅(qū)體階段，即在向具有甲?；亩嗫仔粤Ｗ訉?dǎo)入間隔團(tuán)之后，對于反應(yīng)中未使用的多孔性粒子的甲酰基的處理。即，本發(fā)明人猜測，未經(jīng)處理而殘留的多孔性粒子的甲酰基可能是導(dǎo)致洗脫(溶出)發(fā)生的原因。
[0044]對于向具有甲酰基的多孔性粒子中導(dǎo)入間隔團(tuán)后，對間隔團(tuán)導(dǎo)入反應(yīng)中未使用的多孔性粒子的甲酰基的處理方法進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在導(dǎo)入間隔團(tuán)后，得到的多孔性載體中不存在甲?；?、或者存在下述含量的甲?；?每ImL載體中的甲酰基含量為3 μ mol以下。而使用這樣的導(dǎo)入了間隔團(tuán)的多孔性載體制造含有甲酰基的多孔性載體時(shí)，獲得了出乎意料的結(jié)果:在導(dǎo)入親和配位體后的吸附體中，配位體的洗脫量少，且批次間偏差得到了抑制。由此，可以減輕精制后工序的繁瑣程度，此外，在用于精制抗體醫(yī)藥品的情況下，可以提聞抗體醫(yī)藥品的安全性。
[0045]導(dǎo)入了間隔團(tuán)的載體中的甲酰基的含量優(yōu)選為:每ImL載體中的甲?；繛?br> 0μ mol以上且3 μ mol以下,進(jìn)一步優(yōu)選O μ mol以上且2 μ mol以下,更優(yōu)選O μ mol以上且
1μ mol以下,特別優(yōu)選O μ mol以上且0.5 μ mol以下,最優(yōu)選O μ mol以上且0.3 μ mol以下。
[0046]可以作為間隔團(tuán)被導(dǎo)入至本發(fā)明的多孔性載體及吸附體的化合物，可以沒有特別限定地使用，為了進(jìn)一步減少配位體的洗脫量，優(yōu)選具有環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。作為具有環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，沒有特別限定，可以列舉例如:以環(huán)戊烷或環(huán)己烷等為代表的僅由碳構(gòu)成的5元環(huán)或6元環(huán)，以呋喃糖或吡喃糖等為代表的糖或糖類似物。其中，基于容易獲得等理由，優(yōu)選糖或糖類似物。此外，從多孔性載體和親和配位體的之間的成鍵更加堅(jiān)固和/或親和配位體難以解離的觀點(diǎn)來看，更加優(yōu)選上述糖為還原糖。
[0047]本發(fā)明的多孔性載體中，作為間隔團(tuán)而被導(dǎo)入的化合物可以沒有特別限定地使用，采用過碘酸氧化法等作為導(dǎo)入甲?；姆椒ǖ那闆r下，優(yōu)選具有平伏位具有羥基的碳原子連續(xù)存在的部分，所述平伏位具有羥基的碳原子的連續(xù)個(gè)數(shù)為2或3。
[0048]作為向本發(fā)明的多孔性載體中導(dǎo)入間隔團(tuán)的方法，優(yōu)選利用含有甲?；亩嗫仔粤Ｗ雍妥鳛殚g隔團(tuán)而被導(dǎo)入的化合物的官能團(tuán)之間的反應(yīng)。對于含有甲?；亩嗫仔粤Ｗ拥墓倌軋F(tuán)以及作為間隔團(tuán)而被導(dǎo)入的化合物的官能團(tuán)，各自并無特別限定，優(yōu)選采用適于相互反應(yīng)的組合，也優(yōu)選使二者之間經(jīng)由其它其它化合物進(jìn)行反應(yīng)。利用含有甲酰基的多孔性粒子的甲?；那闆r下，作為間隔團(tuán)而被導(dǎo)入的化合物優(yōu)選具有能夠與甲?；磻?yīng)的官能團(tuán)。作為與甲?；磻?yīng)的官能團(tuán)，只要能夠與甲?；磻?yīng)即可，沒有特別限定，通常優(yōu)選氨基。即，作為間隔團(tuán)而被導(dǎo)入到本發(fā)明的多孔性載體中的化合物含有氨基；作為間隔團(tuán)被導(dǎo)入的化合物是糖的情況下，更加優(yōu)選為氨基糖。
[0049]此外，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn):在pH7~11的范圍使具有1，2-二醇結(jié)構(gòu)的伯胺或仲胺與含有甲?；亩嗫仔粤Ｗ涌s合，和任選地，通過對形成的鍵實(shí)施還原反應(yīng)使其穩(wěn)定化時(shí)，出乎意料的是，可以高效率地將1，2-二醇結(jié)構(gòu)導(dǎo)入至載體。上述pH的范圍更優(yōu)選為8~10，pH特別優(yōu)選8.5~9.5。
[0050]作為可作為間隔團(tuán)而被導(dǎo)入到本發(fā)明的多孔性粒子中的含有氨基的糖(氨基糖)，并無特別限定，可以列舉選自下組中的一種以上或者它們的鹽酸鹽等鹽等:葡糖胺、半乳糖胺、7 ^ ^ >、乳糖胺、巖藻糖胺、甘露糖胺、葡甲胺、阿洛糖胺、阿卓糖胺、核糖胺、阿拉伯糖胺、古洛糖胺、艾杜糖胺、塔羅糖胺、木糖胺、來蘇糖胺、山梨糖胺、塔格糖胺、阿洛酮糖胺、果糖胺、亞氨基環(huán)多醇(iminocyclitol)、黏多醣類、糖蛋白類、透明質(zhì)酸、肝素、軟骨素、4-硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、以及它們的D構(gòu)型體、L構(gòu)型體、消旋體等、含有這些糖作為構(gòu)成成分的多糖、聚合物、糖脂等。其中，作為間隔團(tuán)而被導(dǎo)入到本發(fā)明的多孔性載體中的糖，更優(yōu)選為葡糖胺及其衍生物。
[0051]作為可作為間隔團(tuán)而被導(dǎo)入到本發(fā)明的多孔性載體中的葡糖胺，并無特別限定，更優(yōu)選為D構(gòu)型體。此外，對于可用于本發(fā)明的葡糖胺的制造方法，并無特別限定，可以通過將葡萄糖等進(jìn)行化學(xué)修飾而得到，也可以使用甲殼類等的甲殼、幾丁質(zhì)、殼聚糖等來源的物質(zhì)；用于精制抗體醫(yī)藥品時(shí)，優(yōu)選為能夠由植物性化合物等獲得的葡糖胺，例如，協(xié)和發(fā)酵公司制造的被稱作發(fā)酵葡糖胺的公知的物質(zhì)等。此外，從溶解性的觀點(diǎn)來看，可用于本發(fā)明的葡糖胺還優(yōu)選為鹽酸鹽等鹽。
[0052]此外，作為可作為間隔團(tuán)而被導(dǎo)入到本發(fā)明的多孔性載體中的糖或糖類似物的導(dǎo)入量，優(yōu)選每ImL多孔性載體中，糖或糖類似物的導(dǎo)入量為I μ mol以上且500 μ mol以下。若每ImL多孔性載體中糖或糖類似物的導(dǎo)入量為I μ mol以上，則將該多孔性載體用于吸附體時(shí)，目標(biāo)物的吸附量變大，因此優(yōu)選；若每ImL多孔性載體中糖或糖類似物的導(dǎo)入量為500 μ mol以下，則可以抑制本發(fā)明的多孔性載體的制造成本，因此優(yōu)選。進(jìn)一步優(yōu)選每ImL多孔性載體中糖或糖類似物的導(dǎo)入量為2 μ mol以上且250 μ mol以下，更優(yōu)選4 μ mol以上且125 μ mol以下，特別優(yōu)選6 μ mol以上且50 μ mol以下，最優(yōu)選8 μ mol以上且25 μ mol以下?？梢酝ㄟ^在導(dǎo)入反應(yīng)終止后對反應(yīng)溶液中的糖或糖類似物的減少量進(jìn)行測定的方法、對反應(yīng)后的多孔性載體進(jìn)行滴定的方法(非水滴定等)、元素分析法等求出糖或糖類似物的導(dǎo)入量。
[0053]此外，向含有甲?；亩嗫仔粤Ｗ又袑?dǎo)入可以作為間隔團(tuán)而被導(dǎo)入的化合物時(shí)，對于作為間隔團(tuán)而被導(dǎo)入的化合物的用量并無特別限定，為了達(dá)到更適合的導(dǎo)入量，優(yōu)選為多孔性載體中該官能團(tuán)含量的0.01摩爾倍以上，和/或，從廢液處理和效率的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選100摩爾倍以下；進(jìn)一步優(yōu)選0.1摩爾倍以上且50摩爾倍以下；更優(yōu)選0.5摩爾倍以上且20摩爾倍以下；特別優(yōu)選I摩爾倍以上且10摩爾倍以下。
[0054]對于向多孔性粒子中導(dǎo)入作為間隔團(tuán)而被導(dǎo)入的化合物時(shí)的溶劑，并無特別限定，可以使用水、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、二氧雜戊環(huán)等常用的有機(jī)溶劑，乙醇、甲醇、丙醇等醇，以及選自上述中的2種以上的混合溶劑。
[0055]此外，對反應(yīng)液的pH并無特別限定，從反應(yīng)效率的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選在PH3以上進(jìn)行反應(yīng)，基于官能團(tuán)的失活、對多孔性載體的損害少的理由，優(yōu)選PH為13以下，進(jìn)一步優(yōu)選pH為4以上且12以下，特別優(yōu)選pH為6以上且11以下，最優(yōu)選pH為7以上且11以下。
[0056]此外，對導(dǎo)入可以作為間隔團(tuán)而被導(dǎo)入的化合物時(shí)的溫度并無特別限定，基于對反應(yīng)速度有利的理由，優(yōu)選為o°c以上，從安全性和對載體的損害的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選為100°C以下，基于官能團(tuán)不易失活的理由，進(jìn)一步優(yōu)選70°C以下，進(jìn)一步優(yōu)選4°C以上且500C以下，更優(yōu)選4°C以上且30°C以下，特別優(yōu)選10°C以上且25°C以下，最優(yōu)選12°C以上且18°C以下。
[0057]此外，優(yōu)選一邊攪拌或振動(dòng)一邊進(jìn)行導(dǎo)入反應(yīng)，對于每I分鐘的轉(zhuǎn)速或次數(shù)并無特別限定，基于可以均勻攪拌且不對載體產(chǎn)生物理損害的理由，優(yōu)選I次以上且1000次以下，進(jìn)一步優(yōu)選10次以上且500次以下，更優(yōu)選30次以上且300次以下，特別優(yōu)選50次以上且200次以下，最優(yōu)選75次以上且150次以下，特別優(yōu)選結(jié)合各原料的比重之差及載體的強(qiáng)度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。
[0058]對于向多孔性載體中導(dǎo)入可作為間隔團(tuán)而被導(dǎo)入的化合物的反應(yīng)時(shí)間并無特別限定，基于反應(yīng)性和對載體的損害較少的理由，優(yōu)選0.2小時(shí)以上且100小時(shí)以下，進(jìn)一步優(yōu)選0.5小時(shí)以上且50小時(shí)以下，更優(yōu)選I小時(shí)以上且24小時(shí)以下，特別優(yōu)選2小時(shí)以上且15小時(shí)以下，最優(yōu)選3小時(shí)以上且10小時(shí)以下，優(yōu)選結(jié)合反應(yīng)性、pH及反應(yīng)溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0059]此外，通過向具有甲?；亩嗫仔粤Ｗ又袑?dǎo)入間隔團(tuán)后對反應(yīng)中未使用的多孔性粒子的甲?；M(jìn)行處理，可以得到本發(fā)明的多孔性載體。
[0060]作為向具有甲?；亩嗫仔粤Ｗ又袑?dǎo)入間隔團(tuán)后對反應(yīng)中未使用的多孔性粒子的甲?；M(jìn)行處理的方法，并無特別限定，可以列舉使用還原劑進(jìn)行處理的方法、熱處理方法、使用堿進(jìn)行處理的方法、使用抗粘連劑進(jìn)行處理的方法等。
[0061]作為使用還原劑進(jìn)行處理的方法，并無特別限定，優(yōu)選使四氫硼酸鈉等四氫硼酸鹽發(fā)揮作用從而進(jìn)行處理的方法。作為進(jìn)行還原處理時(shí)的溶劑，并無特別限定，可以使用水、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、二氧雜戊環(huán)等常用的有機(jī)溶劑，乙醇、甲醇、丙醇等醇，以及選自上述中的2種以上的混合溶劑。
[0062]對于進(jìn)行還原處理時(shí)的pH并無特別限定，從安全性的問題來看，優(yōu)選pH為7以上。此外，為了減輕對載體及間隔團(tuán)的損害，優(yōu)選pH為12以下，進(jìn)一步優(yōu)選pH為9以上且12以下，更優(yōu)選pH為11以上且12以下。
[0063]此外，對于還原處理溫度并無特別限定，從有利于反應(yīng)速度的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選為(TC以上，從安全性以及對載體和間隔團(tuán)的損害的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選為100°C以下。更優(yōu)選4°C以上且70°C以下，特別優(yōu)選10°C以上且50°C以下，最優(yōu)選10°C以上且40°C以下。
[0064]對于還原處理的時(shí)間并無特別限定，基于官能團(tuán)的失活和載體的損害少的理由，優(yōu)選0.01小時(shí)以上且50小時(shí)以下，進(jìn)一步優(yōu)選0.1小時(shí)以上且25小時(shí)以下，更優(yōu)選0.25小時(shí)以上且10小時(shí)以下，特別優(yōu)選0.25小時(shí)以上且5小時(shí)以下，最優(yōu)選0.5小時(shí)以上且2小時(shí)以下，優(yōu)選結(jié)合反應(yīng)性、PH及反應(yīng)溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0065]對于還原次數(shù)并無特別限定，從向具有甲酰基的多孔性粒子中導(dǎo)入間隔團(tuán)后對反應(yīng)中未使用的多孔性粒子的甲?；M(jìn)行完全處理的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選I次以上。此外，在20次以下時(shí)，可減輕對載體和間隔團(tuán)的損害。進(jìn)一步優(yōu)選2次以上且15次以下，更優(yōu)選2次以上且10次以下，最優(yōu)選3次以上且7次以下。
[0066]對還原劑的濃度并無特別限定，從對甲酰基的處理效率的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選0.0001M以上，從安全性的問題來看，優(yōu)選2M以下，進(jìn)一步優(yōu)選0.0OlM以上且IM以下，更優(yōu)選0.0lM以上且0.5M以下，特別優(yōu)選0.02M以上且0.25M以下，最優(yōu)選0.05M以上且0.1M以下。
[0067]作為向具有甲酰基的多孔性粒子中導(dǎo)入間隔團(tuán)后對反應(yīng)中未使用的多孔性粒子的甲?；M(jìn)行熱處理的方法，并無特別限定，從對反應(yīng)速度有利的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選50°C以上，從對載體和間隔團(tuán)的損害的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選150°C以下，進(jìn)一步優(yōu)選50°C以上且130°C以下，更優(yōu)選80°C以上且130°C以下。
[0068]作為向具有甲?；亩嗫仔粤Ｗ又袑?dǎo)入間隔團(tuán)后利用堿對反應(yīng)中未使用的多孔性粒子的甲?；M(jìn)行處理的方法，對于PH并無特別限定，由于當(dāng)pH為10以上時(shí)可實(shí)現(xiàn)高效率地處理，因此優(yōu)選。為了減輕對載體和間隔團(tuán)的損害，pH優(yōu)選為13以下。更優(yōu)選pH為10以上且12以下，特別優(yōu)選pH為11以上且12以下。
[0069]作為向具有甲?；亩嗫仔粤Ｗ又袑?dǎo)入間隔團(tuán)后利用封閉劑(封止剤)對反應(yīng)中未使用的多孔性粒子的甲?；M(jìn)行處理的方法，并無特別限定，但優(yōu)選封閉劑為含有與多孔性載體上的活性基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)的低分子化合物。越是低分子化合物，則空間位阻越小，因此可以高效率地進(jìn)行封閉反應(yīng)(封止反応)。其中，優(yōu)選使用含有氨基的低分子化合物，作為這類低分子化合物的一例，可以列舉賴氨酸、甘氨酸、單乙醇胺和三(羥甲基)氨基甲燒等。
[0070]作為向本發(fā)明的多孔性粒子中導(dǎo)入間隔團(tuán)后向所述間隔團(tuán)上導(dǎo)入甲?；姆椒?，可以列舉過碘酸氧化法。
[0071]對于可用于本發(fā)明的過碘酸和/或過碘酸鹽等并無特別限定，優(yōu)選使過碘酸鈉或過碘酸鉀等過碘酸鹽發(fā)揮作用，從而導(dǎo)入甲?；?。
[0072]此外，作為本發(fā)明的多孔性載體的甲?；?，每ImL多孔性載體中的甲?；績?yōu)選0.5 μ mol以上且100 μ mol以下。每ImL多孔性載體中的甲?；繛?.5 μ mol以上時(shí)，可以高效率地將親和配位體固定化，將其用作吸附體的情況下，對目標(biāo)物的吸附量變大，因此優(yōu)選。此外，盡管理由還不明確，令人意料之外的是，每ImL多孔性載體中的甲?；繛棣│苔笑搔夕┮韵聲r(shí)，對目標(biāo)物的吸附量較易變大，因此優(yōu)選。此外，采用使過碘酸和/或過碘酸鹽發(fā)揮作用而導(dǎo)入甲?；姆椒ǖ那闆r下，每ImL多孔性載體中的甲?；繛棣│苔笑搔夕┮韵聲r(shí)，多孔性載體的強(qiáng)度較易變大，因此優(yōu)選。
[0073]每ImL多孔性載體中的甲?；康母鼮閮?yōu)選的范圍是I μ mol以上且50 μ mol以下，更優(yōu)選I μ mol以上且25 μ mol以下,特別優(yōu)選I μ mol以上且10 μ mol以下,最優(yōu)選
2μ mol以上且7μπι01以下。甲酰基含量并無特別限定，例如，可根據(jù)導(dǎo)入甲?；磻?yīng)的時(shí)間、溫度、過碘酸和/或過碘酸鹽等的甲?；瘎┑臐舛鹊?，來調(diào)節(jié)甲?；暮俊?br> [0074]甲?；康臏y定可通過下述方法進(jìn)行:向含有甲?；嗫仔暂d體中加入苯肼溶液，在40°C下攪拌I小時(shí)，通過UV測定反應(yīng)后的上清液的吸收光譜，由苯肼的校正曲線測定苯肼的減少量，從而可求出甲?；暮俊?br> [0075]盡管理由還不確定，本發(fā)明人等經(jīng)過深入研究后發(fā)現(xiàn)了下述結(jié)果，并基于該結(jié)果完成了本發(fā)明:在加入酸而將PH調(diào)節(jié)至I?6范圍的液體中，使過碘酸或其鹽發(fā)揮作用而得到含有甲?；亩嗫仔暂d體，并將含有氨基的配位體固定化于所得含有甲?；亩嗫仔暂d體來獲得吸附體時(shí)，令人感到意外的是，目標(biāo)物的吸附量變大，此外，含有氨基的配位體的泄漏量變小。
[0076]S卩，本發(fā)明提供吸附體的制造方法，該方法包括:在加入酸而將pH調(diào)節(jié)至I?6范圍的液體中，使過碘酸或其鹽發(fā)揮作用而得到含有甲酰基的多孔性載體，在將含有氨基的配位體固定化于上述得到的含有甲?；亩嗫仔暂d體。
[0077]作為上述過碘酸的鹽，并無特別限定，優(yōu)選使用過碘酸鈉或過碘酸鉀等。
[0078]此外，對于可用于本發(fā)明的上述酸并無特別限定，可以使用鹽酸、硫酸、硝酸等無機(jī)酸或其鹽等。此外，使用檸檬酸、乙酸、酒石酸、鄰苯二甲酸、富馬酸、油酸、乳酸、月桂酸等有機(jī)酸或其鹽時(shí)，可以獲得反應(yīng)液的PH緩沖效果，因此更加優(yōu)選。
[0079]上述使過碘酸或其鹽發(fā)揮作用的pH的范圍優(yōu)選為2?5。進(jìn)一步優(yōu)選為pH2?4.5，特別優(yōu)選為pH2?4。
[0080]上述過碘酸或其鹽的濃度優(yōu)選為5mM以上且300mM以下。濃度在5mM以上時(shí)，較容易向載體中導(dǎo)入甲?；?，此外，濃度在300mM以下時(shí)，多孔性載體的強(qiáng)度不易減小，因此優(yōu)選。上述過碘酸或其鹽的濃度進(jìn)一步優(yōu)選為5mM以上且250mM以下，更優(yōu)選為5mM以上且150mM以下。
[0081]盡管理由還不確定，本發(fā)明人等經(jīng)過深入研究后發(fā)現(xiàn)了下述令人意外的結(jié)果:通過使過碘酸和/或過碘酸鹽在(TC以上且10°C以下的溫度發(fā)揮作用而得到含有甲?；亩嗫仔暂d體，并將含有氨基的配位體固定化于所得含有甲?；亩嗫仔暂d體來制造吸附體，利用該制造方法制造的吸附體對目標(biāo)物的吸附量變大。上述溫度進(jìn)一步優(yōu)選為o°c以上且8°C以下。
[0082]本發(fā)明的多孔性載體的材質(zhì)并無特別限定，可以列舉例如:多糖類、聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、以及它們的衍生物等。上述材質(zhì)還可以涂層，所述涂層為甲基丙烯酸羥乙酯等具有羥基的高分子材料或由具有聚氧乙烯鏈的單體與其它聚合性單體形成的共聚物這樣的接枝共聚物等。其中，由于容易向載體表面導(dǎo)入活性基團(tuán)，因此優(yōu)選使用多糖類、聚乙烯醇等。
[0083]其中，本發(fā)明的多孔性載體進(jìn)一步優(yōu)選含有多糖類。多糖類容易在工業(yè)中獲得，另夕卜，對生物體的安全性高，因此優(yōu)選。對于可用于本發(fā)明的多孔性載體的多糖類并無特別限定，可以列舉例如:瓊脂糖、纖維素、糊精、殼聚糖、幾丁質(zhì)、以及它們的衍生物等。
[0084]此外，本發(fā)明的多孔性載體進(jìn)一步優(yōu)選含有纖維素和/或纖維素衍生物。由于含有纖維素或纖維素衍生物的多孔性載體的機(jī)械強(qiáng)度較高且堅(jiān)韌，因此被破壞而生成微粒等的情況較少，將其填充至柱中時(shí)，即使以高線速流通液體，也比較不易發(fā)生壓緊化，因此優(yōu)選。此外，從強(qiáng)度和成本的觀點(diǎn)來看，本發(fā)明的多孔性載體的最優(yōu)選材質(zhì)為纖維素。
[0085]多孔性載體被廣泛用作以治療用(醫(yī)療用)吸附體為首的各種色譜法用吸附體和親和吸附體，特別是在抗體醫(yī)藥品精制領(lǐng)域，伴隨著抗體醫(yī)藥品市場的不斷擴(kuò)張，精制的大規(guī)模化以及高線速化正積極展開。而伴隨著精制的大規(guī)?；约案呔€速化，有時(shí)需要增加精制所使用的吸附體、即多孔性載體(或多孔性粒子)的強(qiáng)度。作為增加多孔性載體(或多孔性粒子)強(qiáng)度的方法，并無特別限定，優(yōu)選增加多孔性載體(或多孔性粒子)的基質(zhì)含量(例如樹脂含量)的方法等，從多孔性載體(或多孔性粒子)的細(xì)孔徑不易變小的優(yōu)點(diǎn)來看，進(jìn)一步優(yōu)選使交聯(lián)劑發(fā)揮作用，以增大多孔性載體(或多孔性粒子)的強(qiáng)度。換言之，本發(fā)明的多孔性載體(或多孔性粒子)優(yōu)選經(jīng)過交聯(lián)。
[0086]交聯(lián)劑和交聯(lián)反應(yīng)條件并無特別限定，可以使用公知的技術(shù)進(jìn)行交聯(lián)。例如，可以通過使環(huán)氧氯丙烷、環(huán)氧溴丙烷、二氯丙醇等鹵代醇，間苯二酚二縮水甘油醚、新戊二醇二縮水甘油醚、1，6-己二醇二縮水甘油醚、氫化雙酚A 二縮水甘油醚、甘油二縮水甘油醚、三羥甲基丙烷二縮水甘油醚、對苯二甲酸二縮水甘油酯、鄰苯二甲酸二縮水甘油酯、乙二醇二縮水甘油醚、二乙二醇二縮水甘油醚、丙二醇二縮水甘油醚等雙官能以上的環(huán)氧化合物發(fā)揮作用來進(jìn)行交聯(lián)。
[0087]使用上述交聯(lián)劑增加多孔性載體(或多孔性粒子)的強(qiáng)度的方法并無特別限定，從反應(yīng)效率的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選在堿性條件下，使上述交聯(lián)劑對載體發(fā)揮作用。交聯(lián)劑的投料方法并無特別限定，可以在反應(yīng)初期就投入全部用量，也可以將其分為數(shù)次重復(fù)反應(yīng)，此夕卜，還可以使用滴液漏斗等一點(diǎn)點(diǎn)地投入交聯(lián)劑，或者將多孔性載體投入添加了交聯(lián)劑的反應(yīng)容器中。
[0088]對交聯(lián)反應(yīng)的溶劑并無特別限定，可以使用水、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、二氧雜戊環(huán)等常用的有機(jī)溶劑，乙醇、甲醇、1-丙醇等醇類，或者上述中2種以上的混合溶劑。此夕卜，為了提高反應(yīng)效率，進(jìn)一步優(yōu)選與硼氫化鈉等還原劑共存。
[0089]對交聯(lián)反應(yīng)時(shí)的溫度并無特別限定，基于對反應(yīng)速度有利的理由，優(yōu)選0°C以上，和/或，從安全性以及對多孔性載體(或多孔性粒子)的損害的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選100°c以下，基于官能團(tuán)不易失活的理由，進(jìn)一步優(yōu)選70°C以下。
[0090]優(yōu)選一邊攪拌或振動(dòng)一邊進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，對于其每I分鐘的轉(zhuǎn)速或次數(shù)并無特別限定，基于可以均勻攪拌且不對多孔性載體(或多孔性粒子)產(chǎn)生物理損害的理由，優(yōu)選每I分鐘I次以上且1000次以下，進(jìn)一步優(yōu)選10次以上且500次以下，更優(yōu)選30次以上且300次以下，特別優(yōu)選50次以上且200次以下，最優(yōu)選75次以上且150次以下，優(yōu)選結(jié)合各原料的比重之差及多孔性載體(或多孔性粒子)的強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0091]對交聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間并無特別限定，基于官能團(tuán)失活以及對載體損害少的理由，使用鹵代醇的情況下，優(yōu)選I小時(shí)以上且8小時(shí)以下，使用雙官能以上的環(huán)氧化合物的情況下，優(yōu)選I小時(shí)以上且低于15小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選結(jié)合交聯(lián)劑的反應(yīng)性、pH及反應(yīng)溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0092]此外，本發(fā)明優(yōu)選在下述水溶液中，將含有氨基的配位體固定化于含有甲?；亩嗫仔暂d體，所述水溶液包含選自羧酸鹽、金屬鹵化物及硫酸鹽中的I種以上化合物，且以羧酸鹽為必要成分。
[0093]作為上述羧酸鹽并無特別限定，可以使用例如乙酸鈉、乳酸鈉、乳酸鈣、檸檬酸鈉、酒石酸氫鉀、油酸鉀、月桂酸鈉、苯二甲酸鈉、苯二甲酸鉀、富馬酸鈉、富馬酸鉀、酒石酸鈉、酒石酸鉀等，特別優(yōu)選檸檬酸鈉。
[0094]上述羧酸鹽在水溶液中的濃度并無特別限定，優(yōu)選0.0lM以上且5M以下。若在0.0lM以上，則容易增大配位體的固定化量，因此優(yōu)選；從制造成本的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選5M以下。上述羧酸鹽水溶液的濃度進(jìn)一步優(yōu)選0.05M以上且3M以下，更優(yōu)選0.1M以上且1.5M以下，特別優(yōu)選0.25M以上且IM以下，最優(yōu)選0.4M以上且0.8M以下。
[0095]對上述金屬鹵化物并無特別限定，優(yōu)選使用例如氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂等。此外，對上述金屬鹵化物在水溶液中的濃度并無特別限定，優(yōu)選0.00IM以上且IM以下。若在0.005M以上，則目標(biāo)物的吸附量變大，因此優(yōu)選；從成本的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選在IM以下。上述金屬鹵化物在水溶液中的濃度進(jìn)一步優(yōu)選為0.0lM以上且0.75M以下，更優(yōu)選0.05M以上且0.5M以下，特別優(yōu)選0.075M以上且0.5M以下。
[0096]此外，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn):作為更優(yōu)選的實(shí)施方式，在含有檸檬酸鹽和/或硫酸鹽的反應(yīng)液中，將含有氨基的配位體固定化于含有甲?；亩嗫仔暂d體上時(shí)，與使用不含有檸檬酸鹽和/或硫酸鹽的反應(yīng)液的情況相比，含有氨基的配位體的固定化量和/或固定化率變大。這一點(diǎn)可適用于本發(fā)明。
[0097]對于可用于本發(fā)明的檸檬酸鹽或硫酸鹽并無特別限定，作為檸檬酸鹽，可以列舉例如檸檬酸單鈉、檸檬酸單鉀等檸檬酸單堿金屬鹽，檸檬酸二鈉、檸檬酸二鉀等檸檬酸二堿金屬鹽，檸檬酸三鈉、檸檬酸三鉀等檸檬酸三堿金屬鹽，檸檬酸單鐵鈉、檸檬酸鐵、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鉀、異檸檬酸或其鹽等，其中，上述化合物可以單獨(dú)使用I種，也可以使用2種以上，此外，還可以使用其水合物、酸酐。
[0098]作為硫酸鹽，可以使用例如硫酸鋰、硫酸鈉、硫酸鉀等堿金屬硫酸鹽，此外，還可以使用其水合物、酸酐。
[0099]此外，在含有上述檸檬酸鹽和/或硫酸鹽的反應(yīng)液中，還可以其它包含其它物質(zhì)，作為其它物質(zhì)，可以列舉例如:氯化鈉、氯化鉀、碳酸鹽、磷酸鹽、乙酸、乙酸鈉等乙酸鹽、三乙胺等胺類等。
[0100]此外，在本發(fā)明的制造方法中，對上述反應(yīng)液中的檸檬酸和/或硫酸鹽的濃度沒有特別限定，優(yōu)選為0.01?2M。檸檬酸和/或硫酸鹽的濃度在0.0lM以上時(shí)，配位體的固定化量和/或固定化率變大，因此優(yōu)選。此外，檸檬酸和/或硫酸鹽的濃度在2M以下時(shí)，可縮減成本并且使反應(yīng)液的粘度降低，因此優(yōu)選。檸檬酸和/或硫酸鹽的濃度進(jìn)一步優(yōu)選為0.05?1.9M,更優(yōu)選0.1?1.7M,特別優(yōu)選0.25?1.5M,最優(yōu)選0.4?1M。
[0101]此外，對上述含有檸檬酸鹽和/或硫酸鹽的反應(yīng)液中可以含有的其它所述其它物質(zhì)的濃度并無特別限定，優(yōu)選為0.001?1M。上述其它物質(zhì)的濃度在0.0OlM以上時(shí)，吸附體的各種性能均改善，因此優(yōu)選。此外，上述其它物質(zhì)的濃度在IM以下，可縮減成本并且使反應(yīng)液的粘度降低，另外還容易顯示出檸檬酸和/或硫酸鹽所帶來的效果，因此優(yōu)選。上述其它物質(zhì)的濃度進(jìn)一步優(yōu)選為0.005?0.7M，更優(yōu)選0.01?0.5M，特別優(yōu)選0.05?0.5M，最優(yōu)選0.1?0.25M。
[0102]此外，在本發(fā)明的制造方法中，上述反應(yīng)液的pH并無特別限定，優(yōu)選為7?13。上述反應(yīng)液的PH為7以上時(shí)，配位體的固定化量和/或固定化率增大，因此優(yōu)選。此外，上述反應(yīng)液的PH在13以下時(shí)，對吸附體的基體材料及配位體的損害較少，因此優(yōu)選。
[0103]此外，在pH為11.5以上且低于13.0的反應(yīng)液中將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體時(shí)，可使含有氨基的配位體的固定化量和/或固定化率變大，因此進(jìn)一步優(yōu)選。PH更優(yōu)選為11.5以上且低于12.6，特別優(yōu)選11.5以上且低于12.3，最優(yōu)選
11.6以上且低于12.1?？梢允褂糜蓀H為3?5、6?7、9?10的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行3點(diǎn)校正的PH計(jì)來進(jìn)行pH的測定。
[0104]此外，本發(fā)明人等經(jīng)過深入研究，還發(fā)現(xiàn)了下述的令人意外的結(jié)果:在通過亞氨基化及其還原反應(yīng)這兩步反應(yīng)來進(jìn)行將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體時(shí)，與未實(shí)施穩(wěn)定化操作的情況相比，在亞氨基化反應(yīng)之后實(shí)施穩(wěn)定化操作的情況下，在用作吸附體時(shí)能夠增大對目標(biāo)物的吸附量。
[0105]即，本發(fā)明還提供一種吸附體的制造方法，其包括:通過亞氨基化及其還原反應(yīng)這兩步反應(yīng)來進(jìn)行將含有氨基的配位體固定化于含有甲?；亩嗫仔暂d體，并在亞氨基化反應(yīng)之后實(shí)施穩(wěn)定化操作。
[0106]本發(fā)明中的亞氨基化反應(yīng)之后的穩(wěn)定化操作，是指:在亞氨基化反應(yīng)之后，將反應(yīng)液的PH調(diào)節(jié)為還原反應(yīng)的pH±l以內(nèi)，并在不加入還原劑的情況下進(jìn)行攪拌、振蕩或放置。
[0107]此外，對上述穩(wěn)定化操作的時(shí)間并無特別限定，優(yōu)選為I小時(shí)以上且48小時(shí)以內(nèi)。穩(wěn)定化時(shí)間在I小時(shí)以上時(shí)，可進(jìn)一步增大吸附體對目標(biāo)物的吸附量，因此優(yōu)選；穩(wěn)定化時(shí)間在48小時(shí)以內(nèi)時(shí)，從制造成本的觀點(diǎn)考慮更為優(yōu)選。穩(wěn)定化時(shí)間進(jìn)一步優(yōu)選在I小時(shí)以上且24小時(shí)以內(nèi)，更優(yōu)選I小時(shí)以上且15小時(shí)以內(nèi)，特別優(yōu)選2小時(shí)以上且15小時(shí)以內(nèi)。
[0108]此外，所述亞氨基化反應(yīng)后的穩(wěn)定化操作，優(yōu)選在pH為2?10的條件下實(shí)施。穩(wěn)定化操作的PH為2以上時(shí)，從制造裝置的耐久性和安全性的觀點(diǎn)來看優(yōu)選，pH為10以下時(shí)，可進(jìn)一步增大吸附體對目標(biāo)物的吸附量，因此優(yōu)選。穩(wěn)定化操作的pH進(jìn)一步優(yōu)選為2?9，更優(yōu)選2?8。
[0109]此外，從pH穩(wěn)定性的觀點(diǎn)來看，本發(fā)明的亞氨基化反應(yīng)、穩(wěn)定化操作、還原反應(yīng)優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行。對可以在本發(fā)明中使用的緩沖液并無特別限定，優(yōu)選使用現(xiàn)有公知的緩沖液。
[0110]此外，上述緩沖液優(yōu)選含有至少I種以上能夠具有二價(jià)以上陰離子的鹽。盡管理由還不確定，但令人感到意外的是，當(dāng)本發(fā)明的亞氨基化反應(yīng)、穩(wěn)定化操作、還原反應(yīng)在含有至少I種以上能夠具有二價(jià)以上陰離子的鹽的緩沖液中進(jìn)行時(shí)，可使含有氨基的配位體的固定化量進(jìn)一步增加，因此優(yōu)選。作為能夠具有二價(jià)以上陰離子的鹽，并無特別限定，可以使用例如:檸檬酸鹽、草酸鹽、苯二甲酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、乙二胺四乙酸鹽等多元羧酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽等。
[0111]對緩沖液中能夠具有二價(jià)以上陰離子的鹽的濃度并無特別限定，優(yōu)選0.0lM以上且5M以下。當(dāng)其濃度在0.0lM以上時(shí)，容易增大配位體的固定化量，因此優(yōu)選；當(dāng)其濃度在5M以下，從制造成本的觀點(diǎn)來看優(yōu)選。上述羧酸鹽在水溶液中的濃度進(jìn)一步優(yōu)選為0.05M以上且3M以下，更優(yōu)選0.1M以上且1.5M以下，特別優(yōu)選0.25M以上且IM以下，最優(yōu)選0.4M以上且0.8M以下。
[0112]此外，上述緩沖液進(jìn)一步優(yōu)選含有多元羧酸鹽和/或中性鹽。作為中性鹽，沒有特另IJ限定，可以列舉例如:硫酸鈉、氯化鈉、硝酸鈉、氯化鉀、氯化鋰、氯化鎂、氯化鈣等。
[0113]此外，上述緩沖液更優(yōu)選含有檸檬酸鹽。作為檸檬酸鹽，并無特別限定，可以列舉例如檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸鋰等。
[0114]此外，上述含有檸檬酸鹽的緩沖液優(yōu)選含有金屬鹵化物和硫酸鹽中的至少一種以上。對上述金屬鹵化物并無特別限定，優(yōu)選使用例如氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂等。此外，對上述金屬鹵化物和/或硫酸鹽在緩沖液中的濃度并無特別限定，優(yōu)選0.0OlM以上且IM以下。當(dāng)濃度為0.0OlM以上時(shí)，對目標(biāo)物的吸附量增大，因此優(yōu)選，當(dāng)濃度為IM以下時(shí)，從成本的觀點(diǎn)來看優(yōu)選。進(jìn)一步優(yōu)選為0.0lM以上且0.5M以下，更優(yōu)選0.05M以上且0.75M以下，特別優(yōu)選0.075M以上且0.5M以下，最優(yōu)選0.1M以上且0.3M以下。
[0115]此外，本發(fā)明人等還發(fā)現(xiàn)了下述令人意外的結(jié)果:在將含有氨基的配位體固定化于含有甲?；亩嗫仔暂d體時(shí)，如果通過有機(jī)硼烷絡(luò)合物使配位體的固定化鍵穩(wěn)定化并同時(shí)使其余的甲?；g化，則吸附體對目標(biāo)物的吸附量增大。
[0116]S卩，本發(fā)明還涉及吸附體的制造方法，其中，在將含有氨基的配位體固定化于含有甲酰基的多孔性載體時(shí)，通過有機(jī)硼烷絡(luò)合物，使配位體的固定化鍵穩(wěn)定化并同時(shí)使其余的甲?；g化。這里，所述其余的甲?；?，是指多孔性載體上的甲?；校诠潭ɑ邪被呐湮惑w時(shí)未被使用的殘留的甲?；Ｈ羲銎溆嗟募柞；幢烩g化，則在將多孔性載體用作吸附體時(shí)，可能會(huì)引起非特異吸附。
[0117]盡管本發(fā)明中使用了通常作為較弱還原劑使用的有機(jī)硼烷絡(luò)合物，但本發(fā)明的特征在于:即使未使用在使用弱還原劑時(shí)通常被用作鈍化劑的含有氨基的低分子量化合物(例如，單乙醇胺、甘氨酸、三(羥甲基)氨基甲烷等)、所謂的抗粘連劑，也能夠使其余的甲
酰基鈍化。
[0118]此外，在含有羧酸鹽的反應(yīng)液中實(shí)施通過上述有機(jī)硼烷絡(luò)合物使配位體的固定化鍵穩(wěn)定化并同時(shí)使其余的甲?；g化的操作時(shí)，能夠進(jìn)一步促進(jìn)配位體的固定化鍵的穩(wěn)定化以及其余的甲酰基的鈍化，因此優(yōu)選。
[0119]對于可用于本發(fā)明的羧酸鹽并無特別限定，可以列舉例如:乙酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽、苯二甲酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、乙二胺四乙酸鹽等，作為這些羧酸鹽的陽離子種類，并無特別限定，可以使用例如:鋰、鈉、鉀、鎂、鈣等。其中，從成本的觀點(diǎn)來看，可優(yōu)選使用檸檬酸鹽，特別是檸檬酸的堿金屬鹽。此外，對羧酸鹽在反應(yīng)液中的濃度并無特別限定，當(dāng)其濃度在0.0lM以上時(shí)，可以進(jìn)一步促進(jìn)配位體的固定化鍵的穩(wěn)定化以及其余的甲?；拟g化，因此優(yōu)選。此外，當(dāng)羧酸鹽的濃度在2M以下時(shí)，不僅可以降低成本，而且可以降低反應(yīng)液的粘度，此外，從操作性方面來看，也更為優(yōu)選。羧酸鹽的濃度進(jìn)一步優(yōu)選為0.05?1.9M，更優(yōu)選0.1?1.7M，特別優(yōu)選0.25?1.5M，最優(yōu)選0.4?IM0
[0120]此外，上述應(yīng)液中可以含有除羧酸鹽以外的其它物質(zhì)，例如，優(yōu)選含有金屬鹵化物和硫酸鹽中的至少一種以上。對上述金屬鹵化物并無特別限定，可優(yōu)選使用例如:氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂等。此外，對上述金屬鹵化物和/或硫酸鹽在緩沖液中的濃度并無特別限定，優(yōu)選為0.0OlM以上且IM以下。當(dāng)其濃度在0.0OlM以上時(shí)，對目標(biāo)物的吸附量變大，因此優(yōu)選，當(dāng)其濃度在IM以下時(shí)，從成本的觀點(diǎn)來看優(yōu)選。其濃度進(jìn)一步優(yōu)選為0.0lM以上且0.5M以下，更優(yōu)選為0.05M以上且0.75M以下，特別優(yōu)選為0.075M以上且0.5M以下，最優(yōu)選為0.1M以上且0.3M以下。
[0121]此外，通過上述有機(jī)硼烷絡(luò)合物使配位體的固定化鍵穩(wěn)定化并同時(shí)使其余的甲酰基鈍化的操作，優(yōu)選實(shí)施I小時(shí)以上且48小時(shí)以下。上述操作實(shí)施I小時(shí)以上時(shí)，可進(jìn)一步促進(jìn)配位體的固定化鍵穩(wěn)定化以及其余的甲?；拟g化，因此優(yōu)選；從制造成本的觀點(diǎn)來看，上述操作優(yōu)選實(shí)施48小時(shí)以下。上述操作時(shí)間進(jìn)一步優(yōu)選為2小時(shí)以上且24小時(shí)以下，更優(yōu)選3小時(shí)以上且20小時(shí)以下，特別優(yōu)選4小時(shí)以上且15小時(shí)以下，最優(yōu)選5小時(shí)以上且10小時(shí)以下。
[0122]此外，作為可用于本發(fā)明的上述有機(jī)硼烷絡(luò)合物，并無特別限定，盡管理由尚不明確，令人感到意外的是:上述有機(jī)硼烷絡(luò)合物為胺合硼烷絡(luò)合物(包括氨基硼烷)時(shí)，更容易促進(jìn)其余的甲?；g化，因此優(yōu)選。作為可用于本發(fā)明的氨基硼烷絡(luò)合物，并無特別限定，可以列舉例如:4-( 二甲基氨基)吡啶硼烷、N-乙基二異丙基胺合硼烷、N-乙基嗎啉硼烷、N-甲基嗎啉硼烷、N-苯基嗎啉硼烷、二甲基吡啶硼烷、三乙胺硼烷、或三甲基胺合硼烷、4-( 二甲基胺)吡啶硼烷、N-乙基二異丙基胺合硼烷、N-乙基嗎啉硼烷、N-甲基嗎啉硼烷、N-苯基嗎啉硼烷、二甲基吡啶硼烷、硼烷氨、二甲胺硼烷、吡啶硼烷、4-甲基吡啶硼烷、N’，N-二乙基苯胺硼烷、N’，N-二異丙基乙基胺硼烷、2，6-二甲基吡啶硼烷、硼烷合胺、三(二甲基氨基)硼烷、三甲基氨基硼烷、環(huán)硼氮烷、1，3，5-三甲基環(huán)硼氮烷、2，4，6-三甲基環(huán)硼氮烷、六甲基環(huán)硼氮烷等。
[0123]其中，從在反應(yīng)液中的溶解性和安全性的觀點(diǎn)來看，特別優(yōu)選二甲胺硼烷。
[0124]此外，本發(fā)明的亞氨基化反應(yīng)、穩(wěn)定化操作、還原反應(yīng)的操作溫度優(yōu)選為-10?40°C。上述操作溫度在-10°C以上時(shí)，從反應(yīng)液的流動(dòng)性的觀點(diǎn)來看進(jìn)一步優(yōu)選；上述操作溫度在40°C以下時(shí)，親和配位體和多孔性載體的甲?；灰资Щ?，因此進(jìn)一步優(yōu)選。操作溫度進(jìn)一步優(yōu)選為-5?35°C，更優(yōu)選為O?30°C。
[0125]此外，每ImL多孔性載體中，本發(fā)明吸附體中的親和配位體的導(dǎo)入量優(yōu)選為Img以上且500mg以下。每ImL多孔性載體的親和配位體的導(dǎo)入量為Img以上時(shí)，對目標(biāo)物的吸附量增大，因此優(yōu)選；在500mg以下時(shí)，可使生產(chǎn)成本得到抑制，因此優(yōu)選。每ImL多孔性載體的親和配位體的導(dǎo)入量進(jìn)一步優(yōu)選為2mg以上且120mg以下，更優(yōu)選為3mg以上且60mg以下，特別優(yōu)選為4mg以上且30mg以下,最優(yōu)選為4mg以上且15mg以下。
[0126]此外，每ImL多孔性載體中，本發(fā)明吸附體中的親和配位體的導(dǎo)入量優(yōu)選為0.01 μ mo I以上且15 μ mo I以下。每ImL多孔性載體的親和配位體的導(dǎo)入量為0.01 μ mo I以上時(shí)，對精制目標(biāo)物的吸附量增大，因此優(yōu)選；在15 μ mol以下時(shí)，可使生產(chǎn)成本得到抑制，因此優(yōu)選。每ImL多孔性載體的親和配位體的導(dǎo)入量進(jìn)一步優(yōu)選為0.03 μ mol以上且5 μ mol以下，更優(yōu)選0.05 μ mol以上且2 μ mol以下，特別優(yōu)選0.1 μ mol以上且0.75 μ mol以下，最優(yōu)選0.1 μ mol以上且0.5 μ mol以下。
[0127]通過測定固定化反應(yīng)后的反應(yīng)液上清液中來自親和配位體的吸光度，可以求出親和配位體的導(dǎo)入量。此外，可以采用元素分析法求出親和配位體的導(dǎo)入量。例如，對于含有氨基的親和配位體而言，通過對吸附體進(jìn)行N含量分析，可以測定親和配位體的導(dǎo)入量。
[0128]作為用于治療用(醫(yī)療用)吸附體或抗體醫(yī)藥品精制用吸附體等情況下的親和配位體，并無特別限定，可以列舉例如:對抗體顯示高度特異性的抗原或蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)G、L或其變異體、具有抗體結(jié)合活性的肽等。特別是，作為可以特異性地吸附、洗脫免疫球蛋白(IgG)等的吸附體，受到關(guān)注的是將蛋白質(zhì)A作為親和配位體固定化于載體而得到的吸附體。備受關(guān)注的是將固定化有蛋白質(zhì)A的吸附體用作風(fēng)濕病、血友病、擴(kuò)張型心肌病的治療用吸附體。此外，在抗體醫(yī)藥精制領(lǐng)域，期待一種能夠以大規(guī)模、高速以及低成本實(shí)現(xiàn)對IgG等抗體的精制的吸附體。由上述觀點(diǎn)來看，本發(fā)明的吸附體優(yōu)選為導(dǎo)入了作為親和配位體的蛋白質(zhì)A的吸附體。
[0129]對于可用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)A并無特別限定。可以不受限制地使用天然物、基因重組物等。此外，還可以使用含有抗體結(jié)合位點(diǎn)及其變異體、融合蛋白等。此外，也可以使用由菌體提取物或培養(yǎng)上清液、通過組合使用和/或重復(fù)進(jìn)行下述精制法而之比的蛋白質(zhì)A，所述精制法選自利用了下述技術(shù)的分子量分級、分級沉淀法等方法:離子交換色譜法、疏水性相互作用色譜法、凝膠過濾色譜法、羥基磷灰石層析法等各種色譜法以及膜分離技術(shù)。特別優(yōu)選通過國際公開專利公報(bào)W02006/004067、美國專利公報(bào)US5151350中所述方法得到的蛋白質(zhì)A。
[0130]此外，使用本發(fā)明的吸附體進(jìn)行精制時(shí)，從吸附體洗脫到目標(biāo)物中的配位體濃度的第一次精制?第三次精制的平均值優(yōu)選為50ppm以下。當(dāng)洗脫到目標(biāo)物中的配位體濃度的第一次精制?第三次精制的平均值在50ppm以下時(shí)，可以提高治療和精制的安全性，還可以提高目標(biāo)物的純度，而且可以減輕精制中后續(xù)工序的繁瑣程度，因此優(yōu)選。洗脫到目標(biāo)物中的配位體濃度進(jìn)一步優(yōu)選為Oppm以上且40ppm以下，更優(yōu)選Oppm以上且30ppm以下，特別優(yōu)選Oppm以上且25ppm以下，最優(yōu)選Oppm以上且20ppm以下。洗脫到目標(biāo)物中的配位體濃度可以按照Steindl F.et al., Journal of ImmunologicalMethods, Vol.235 (2000)，61-69 中記載的方法求出。[0131]為了進(jìn)一步減少本發(fā)明的吸附體中含有氨基的配位體的泄漏量，優(yōu)選對吸附體進(jìn)行清洗。對清洗劑和清洗方法并無特別限定，優(yōu)選使用含有選自水、乙酸、醇、各種有機(jī)溶劑、pH2?5的液體、pH8?13的液體、氯化鈉、氯化鉀、乙酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、緩沖劑、表面活性劑、尿素、胍、胍鹽酸鹽、其它再生劑等中的至少I種溶液等進(jìn)行通液，或者投入上述溶液等并進(jìn)行攪拌。此外，使用同種或者不同溶液進(jìn)行數(shù)次清洗時(shí)，可以進(jìn)一步減少配位體的泄漏量，因此優(yōu)選。
[0132]此外，每ImL吸附體中，本發(fā)明吸附體對目標(biāo)物的吸附量優(yōu)選為Img以上。若每ImL吸附體對目標(biāo)物的吸附量在Img以上，則可以實(shí)現(xiàn)高效率的精制，因此優(yōu)選。此外，若每ImL吸附體對目標(biāo)物的吸附量在IOOmg以下，則吸附的目標(biāo)物容易從吸附體上洗脫，因此優(yōu)選。每ImL吸附體中，吸附體對目標(biāo)物的吸附量進(jìn)一步優(yōu)選為5mg以上且90mg以下，更優(yōu)選IOmg以上且80mg以下，特別優(yōu)選20mg以上且70mg以下，最優(yōu)選30mg以上且60mg以下。
[0133]可以按照下述方法求出目標(biāo)物的吸附量。作為求算目標(biāo)物吸附量的方法，并無特別限定，可以通過靜態(tài)吸附量或動(dòng)態(tài)吸附量求出。例如，測定靜態(tài)吸附量的情況下，對于以PH7.4的磷酸緩沖液(Sigma公司制造)置換的吸附體0.5mL,使其與將70mg的目標(biāo)物溶解于35mL的pH7.4的磷酸緩沖液(Sigma公司制造)中而得到的溶液接觸，并在25°C攪拌2小時(shí)，然后通過測定上清液中目標(biāo)物的減少量來求算目標(biāo)物的吸附量。
[0134]優(yōu)選本發(fā)明的吸附體在壓縮5%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.0lMPa以上且IMPa以下、壓縮10%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.03MPa以上且3MPa以下、壓縮15%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.06MPa以上且5MPa以下。
[0135]當(dāng)吸附體壓縮5%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.0lMPa以上、壓縮10%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.03MPa以上、以及壓縮15%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.06MPa以上時(shí)，容易獲得在高線速進(jìn)行通液時(shí)也不會(huì)產(chǎn)生壓緊化的吸附體，因此優(yōu)選。此外，若吸附體壓縮5%時(shí)的壓縮應(yīng)力為IMPa以下、壓縮10%時(shí)的壓縮應(yīng)力為3MPa以下、以及壓縮15%時(shí)的壓縮應(yīng)力為5MPa以下，則其脆性提高，可以抑制微粒子的產(chǎn)生，因此優(yōu)選。
[0136]此外，壓縮應(yīng)力進(jìn)一步優(yōu)選為:壓縮5%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.02MPa以上且IMPa以下、壓縮10%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.06MPa以上且3MPa以下、以及壓縮15%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.09MPa以上且5MPa以下。壓縮應(yīng)力最優(yōu)選為:壓縮5%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.04MPa以上且IMPa以下、壓縮10%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.08MPa以上且3MPa以下、壓縮15%時(shí)的壓縮應(yīng)力為
0.1lMPa以上且5MPa以下。
[0137]這里，所述壓縮5%時(shí)的壓縮應(yīng)力，是指吸附體被壓縮至體積較初始體積減少5%時(shí)的應(yīng)力；所述壓縮10%時(shí)的壓縮應(yīng)力，是指吸附體被壓縮至體積較初始體積減少10%時(shí)的應(yīng)力；所述壓縮15%時(shí)的壓縮應(yīng)力，是指吸附體被壓縮至體積較初始體積減少15%時(shí)的應(yīng)力。所述初始體積是指，對含有吸附體的漿料施以振動(dòng)的同時(shí)，使其發(fā)生沉降填充，直至達(dá)到吸附體的體積不再減少的狀態(tài)時(shí)的體積。
[0138]此外，對于本發(fā)明吸附體的單位填充體積中的樹脂含量并無特別限定，優(yōu)選2%以上且50%以下。當(dāng)單位填充體積的樹脂含量為2%以上時(shí)，可以得到即使以大規(guī)模、高線速進(jìn)行精制也不會(huì)產(chǎn)生壓緊化的吸附體，因此優(yōu)選。此外，單位填充體積的樹脂含量在50%以下時(shí)，可以確保能夠使精制目標(biāo)物通過的充分的孔，因此優(yōu)選。此外，單位填充體積的樹脂含量進(jìn)一步優(yōu)選的范圍是3%以上且25%以下，更優(yōu)選4%以上且15%以下。
[0139]對于單位填充體積的樹脂含量而言，通過調(diào)節(jié)多孔性載體的量，使其沉降并填充直至多孔性載體的體積不再減少時(shí)，多孔性載體的體積為lmL。將該載體在105°C干燥12小時(shí)，可以由ImL凝膠的干燥重量(g)求出ImL凝膠的干燥重量百分比，即樹脂含量。
[0140]此外，對于本發(fā)明的吸附體，其體積平均粒徑優(yōu)選為20μπι以上且ΙΟΟΟμπι以下。多孔性載體的體積平均粒徑在20 μ m以上時(shí)，不易產(chǎn)生壓緊化，因此優(yōu)選，體積平均粒徑在IOOOym以下時(shí)，用于吸附體時(shí)對目標(biāo)物的吸附量變大，因此優(yōu)選。多孔性載體的體積平均粒徑進(jìn)一步優(yōu)選的范圍是30 μ m以上且250 μ m以下，更優(yōu)選40 μ m以上且125 μ m以下，特別優(yōu)選50 μ m以上且100 μ m以下，最優(yōu)選60 μ m以上且85 μ m以下?？梢酝ㄟ^測定隨機(jī)選取的100個(gè)多孔性載體的粒徑來求算體積平均粒徑。各個(gè)多孔性載體的粒徑，可以通過下述方法測定:拍攝各個(gè)多孔性載體的顯微鏡照片，以電子數(shù)據(jù)的形式保存，并利用粒徑測定軟件(Media Cybernetics公司制造的Image-Pro Plus)進(jìn)行測定。
[0141]通過本發(fā)明的吸附體和/或本發(fā)明的制造方法制造的吸附體，可以用于使用親和色譜法對各種目標(biāo)物進(jìn)行的精制、非專利文獻(xiàn)3中公開的各種精制方法、以及治療用(醫(yī)療用)吸附體。精制方法和治療方法并無特別限定，優(yōu)選使用非專利文獻(xiàn)1、2、3以及其它公知方法。
[0142]此外，本發(fā)明的吸附體可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的大規(guī)模、高速且低成本地精制。因此，使用本發(fā)明的吸附體進(jìn)行精制或治療時(shí)，優(yōu)選使用直徑為0.5cm以上且高度為3cm以上的柱。柱的直徑為0.5cm以上且高度為3cm以上時(shí)，可以高效率地進(jìn)行精制或治療。此外，從精制或治療的精度和效率的觀點(diǎn)來看，柱的大小優(yōu)選直徑為2000cm以下且高度為5000cm以下。
[0143]柱的大小進(jìn)一步優(yōu)選直徑為2cm以上且200cm以下、高度為5cm以上且300cm以下，更優(yōu)選直徑為5cm以上且IOOcrn以下以及高度為8cm以上且150cm以下，特別優(yōu)選直徑為IOcm以上且85cm以下以及高度為12cm以上且85cm以下，最優(yōu)選直徑為20cm以上且85cm以下以及高度為14cm以上且35cm以下。
[0144]此外，使用本發(fā)明的吸附體進(jìn)行治療或精制時(shí)，優(yōu)選包括以lOOcm/h以上的線速進(jìn)行通液的工序。若具有以100cm/h以上的線速進(jìn)行通液的工序，則可以聞效率地進(jìn)行治療或精制，因此優(yōu)選。此外，從治療或精制的精度和裝置的耐久性的觀點(diǎn)來看，使用本發(fā)明的吸附體進(jìn)行治療或精制時(shí)，優(yōu)選以lOOOcm/h以下的線速進(jìn)行。精制的線速進(jìn)一步優(yōu)選為150cm/h以上且800cm/h以下，更優(yōu)選250cm/h以上且750cm/h以下，特別優(yōu)選300cm/h以上且700cm/h以下，最優(yōu)選350cm/h以上且700cm/h以下。
[0145]與未使用本發(fā)明技術(shù)方案的情況相比，本發(fā)明的多孔性載體、使用該多孔性載體的吸附體、它們的制造方法以及使用它們的精制方法，可以實(shí)現(xiàn)高速的精制，提供純度高且安全性高的精制產(chǎn)品。
實(shí)施例
[0146]以下，針對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。需要說明的是，對于反應(yīng)投料時(shí)的多孔性粒子以及多孔性載體的體積，若無特別記載，是指自然沉降體積。自然沉降體積是指，將由多孔性載體和RO水形成的漿料投入計(jì)量容器中，在無振動(dòng)的狀態(tài)下靜置2小時(shí)以上，直至體積不再減少時(shí)的體積。此外，對于官能團(tuán)含量中的多孔性載體的體積，若無特別記載，是指將由多孔性載體和RO水形成的漿料投入計(jì)量容器中，施以振動(dòng)的同時(shí)使其沉降，直至體積不再減少時(shí)的狀態(tài)下的體積。
[0147](甲酰基含量的測定)
[0148]甲?；渴侵?，使以pH8的0.1M磷酸緩沖液置換后的多孔性載體(或多孔性粒子)2mL與溶解了苯肼的pH8的0.1M磷酸緩沖液溶液2mL接觸，在40°C攪拌I小時(shí)，通過UV測定對反應(yīng)液的上清液在278nm附近最大吸收處的吸光度進(jìn)行測定，由此可估算出苯肼在多孔性載體(或多孔性粒子)的吸附量。此時(shí)，使苯肼的投料量為預(yù)想的甲?；康?摩爾倍，而在多孔性載體(或多孔性粒子)中的吸附量為苯肼投料量的15%以下或45%以上的情況下，要重新調(diào)整苯肼的投料量，再次進(jìn)行測定。
[0149](壓縮應(yīng)力的測定)
[0150]向內(nèi)徑為15mm的玻璃制量筒中投料多孔性粒子或吸附體占50vol%的漿料。對多孔性粒子或吸附體的量進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得在邊對玻璃制量筒施以振動(dòng)邊使?jié){料發(fā)生沉降填充直至多孔性粒子或吸附體的體積不再減少時(shí)，多孔性粒子或吸附體的體積達(dá)到4mL。將此時(shí)的體積視為初始體積。將金屬制活塞(加工成不會(huì)與量筒的內(nèi)壁發(fā)生摩擦、且不會(huì)使多孔性粒子或吸附體洗脫的形態(tài))安裝在裝載有20N用負(fù)載傳感器的自動(dòng)繪圖儀(SHIMADZU制EZ-TEST)上。使活塞的底面與相當(dāng)于多孔性粒子或吸附體的120vol%的位置對齊。為了不產(chǎn)生氣泡，以5mm/min的試驗(yàn)速度使活塞下降，壓縮多孔性粒子或吸附體使其體積減少，以測定任意點(diǎn)的壓縮應(yīng)力。
[0151](葡糖胺固定化量的定量)
[0152]將多孔性載體ImL轉(zhuǎn)移至玻璃過濾器(TOP公司制造的3G_2)，使用凝膠3倍量的
0.0lN氫氧化鈉溶液置換3次，使用凝膠3倍量的RO水清洗6次。然后，進(jìn)行5分鐘抽吸過濾(抽吸干燥)，用乙酸(和光純藥工業(yè)制造)進(jìn)行置換。使用非水滴定用乙酸(和光純藥工業(yè)制造)將置換后的凝膠轉(zhuǎn)移至50mL燒杯中，并稀釋{an、至30mL。使用電位差自動(dòng)滴定裝置(KEM公司制造AT-610)，以0.004N高氯酸/乙酸(使用非水滴定用乙酸對
0.1M高氯酸/乙酸溶劑進(jìn)行稀釋:和光純藥工業(yè)制造)對其滴定，求出葡糖胺固定化量。
[0153](動(dòng)態(tài)吸附量、以及泄漏到目標(biāo)物中的配位體濃度的測定)
[0154](I)制備溶液
[0155]以pH7.4的磷酸緩沖液(Sigma公司制造)作為A液、以pH3.5的35mM乙酸鈉作為B液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的乙酸、乙酸鈉和RO水配制而成)、以IM乙酸(使用和光純藥工業(yè)公司制造的乙酸和RO水配制而成)作為C液、以lmg/mL的人多克隆IgG溶液(使用Baxter公司制造的Gammagard與A液配制而成)作為D液、以6M尿素作為E液、以添加了相對于A液為0.2vol%的表面活性劑(和光純藥工業(yè)公司制造的聚氧乙烯(20)失水山梨醇單月桂酸酯)的溶液作為F液、制備2M的三(羥甲基)氨基甲烷(使用Sigma公司制造的三(羥甲基)氨基甲烷和RO水配制而成)作為中和液，并在使用前對各溶液實(shí)施脫泡。
[0156](2)填充、準(zhǔn)備
[0157]使用AKTAexplorerlOO (GE Healthcare Bioscienc 公司制造)作為柱色譜法用裝置，在直徑0.5cm、高度15cm的柱中安裝22 μ m的網(wǎng)篩，分別裝入本發(fā)明的吸附體3mL，以450cm/h的線速通液20%的乙醇水溶液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的乙酸和RO水配制而成)1小時(shí)進(jìn)行填充。在餾分收集器中設(shè)置15mL的采樣用試管，預(yù)先在溶出液的采樣用試管中裝入中和液。
[0158](3) IgG 的精制
[0159]以300cm/h的線速通液A液9mL，然后，邊監(jiān)測UV邊以300cm/h的線速通液D液，直至10%的IgG穿透(破過)。然后，以300cm/h的線速通液A液30mL，以300cm/h的線速通液B液30mL，使IgG洗脫。然后以300cm/h的線速通液C液9mL，并以300cm/h的線速通液E液9mL。繼續(xù)重復(fù)進(jìn)行2次吸附體填充終止后的操作2次，由此求出溶出液中的IgG量和向IgG中泄漏的配位體濃度。
[0160](制造例I)
[0161 ] 使用90 μ m的網(wǎng)篩(NONAKA RIKAKI制，線徑63 μ m)和分級機(jī)(筒井理化學(xué)器械公司制造的300-MM)，對體積平均粒徑為92 μ m、樹脂含量為6%、分子量排阻極限為5000萬的多孔性纖維素粒子(Chisso公司制造的CK-A)進(jìn)行濕式分級2小時(shí)，得到體積平均粒徑為83 μ m的多孔性粒子A。
[0162]向2.3L的多孔性粒子A中加入RO水，使其體積為2.78L，再將其轉(zhuǎn)移至可拆卸式燒瓶中。向其中加入4N NaOH(使用和光純藥工業(yè)公司制造和RO水進(jìn)行調(diào)整)0.246L。此夕卜，加入硼氫化鈉3.3g，并在水槽中升溫至40°C。向其中加入含有作為交聯(lián)劑的丙三醇多縮水甘油醚的Denacol EX314 (Nagase Chemtex公司制造)1.64L,在40°C攪拌5小時(shí)。反應(yīng)終止后，一邊在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上進(jìn)行抽濾，一邊用多孔性粒子20倍體積量的RO水清洗，得到交聯(lián)多孔性粒子。該交聯(lián)多孔性粒子在壓縮5%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.020MPa、壓縮10%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.049MPa、壓縮15%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.080MPa。
[0163]向得到的交聯(lián)多孔性粒子中加入RO水，使其總量為交聯(lián)多孔性粒子的2倍體積量，加入到玻璃制燒杯(IL)中，以2片鋁箔封口，使用高壓釜(Sakura公司制造的高壓滅菌器Neoclave)在120°C加溫40分鐘。自然冷卻至室溫后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上以多孔性粒子5倍體積量的RO水進(jìn)行清洗，得到環(huán)氧基轉(zhuǎn)變成了甘油基的交聯(lián)多孔性粒子。
[0164]然后，向上述經(jīng)過高壓釜加溫后的多孔性粒子2.3L中加入RO水至體積為2.78L，將其轉(zhuǎn)移至可拆卸式燒瓶中。向其中加入4N-NaOH (使用和光純藥工業(yè)公司制造與RO水進(jìn)行調(diào)整)0.246L。此外，加入硼氫化鈉3.3g，在水槽中升溫至40°C。向其中加入DenacolEX314 (Nagase Chemtex公司制造)1.64L，在40°C攪拌5小時(shí)。反應(yīng)終止后，一邊在玻璃過濾器(TOP公司制造26G-2)上進(jìn)行抽濾，一邊用多孔性粒子20倍體積量的RO水清洗，得到交聯(lián)多孔性粒子。該交聯(lián)多孔性粒子在壓縮5%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.020MPa、壓縮10%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.049MPa、壓縮15%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.080MPa。
[0165]向得到的交聯(lián)多孔性粒子中加入RO 7JC,使其總量為交聯(lián)多孔性粒子的2倍體積量，加入到玻璃制燒杯(IL)中，以2片鋁箔封口，使用高壓釜(Sakura公司制造的高壓滅菌器Neoclave)在120°C加溫40分鐘。自然冷卻至室溫后，在玻璃過濾器(TOP公司制造26G-2)所以多孔性粒子5倍體積量的RO水進(jìn)行清洗，得到多孔性粒子B。
[0166](實(shí)施例1)
[0167]向制造例I的多孔性粒子B523mL中加入RO水，使其總量為784.5mL，加入到2L的可拆卸式燒瓶中，并將該燒瓶安裝在25°C的恒溫槽(Tomas科學(xué)公司制造的恒溫水浴鍋T-2S)中。然后，將過碘酸鈉(和光純藥工業(yè)制造)溶解于RO水中，制備11.5mg/mL的過碘酸鈉水溶液523mL，將該溶液加入可拆卸式燒瓶中，在25°C以120rpm的轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上以RO水進(jìn)行清洗，直至濾液的電導(dǎo)率達(dá)到5 μ S/cm以下。隨后向得到的多孔性粒子中加入RO水，使其總量為784.5mL，將其加入到可拆卸式燒瓶中，并將該可拆卸式燒瓶安裝在25°C恒溫槽(Tomas科學(xué)公司制造的恒溫水浴鍋T-2S)中。然后，將過碘酸鈉(和光純藥工業(yè)制造)溶解在RO水中，制備11.5mg/mL的過碘酸鈉水溶液，將523mL該溶液加入到可拆卸式燒瓶中，在25°C以120rpm的轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)(Mazela Z)。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上進(jìn)行清洗，直至清洗濾液的電導(dǎo)率達(dá)到5 μ S/cm以下，從而得到多孔性粒子C。使用電導(dǎo)率計(jì)(EUTECH INSTRUMENTS制造的ECTestrlOpure+)測定清洗濾液的電導(dǎo)率。利用上述方法測定所得多孔性粒子C的甲?；浚Y(jié)果顯示:每ImL多孔性粒子C中的甲?；繛?8 μ mol。
[0168]然后，在可拆卸式燒瓶的1042mL處做標(biāo)記，并使用RO水將所得多孔性粒子C521mL轉(zhuǎn)移。將其安裝在15°C的恒溫槽(Tomas科學(xué)公司制造恒溫水浴鍋T-2S、投入冷卻裝置ADVANTEC TBC120DA)中，放置反應(yīng)溶液直至達(dá)到15°C。確認(rèn)反應(yīng)液到達(dá)15°C后，向其中加入多孔性粒子C的甲?；康?0摩爾倍的發(fā)酵葡糖胺K (協(xié)和發(fā)酵公司制造)，并加入氫氧化鈉溶液使其pH達(dá)到11。然后，一邊使用4N氫氧化鈉微調(diào)pH至11, 一邊加入RO水,使反應(yīng)液的總體積達(dá)到1042mL，在15°C以120rpm的轉(zhuǎn)速攪拌5小時(shí)。
[0169]隨后，加入2.96g硼氫化鈉(和光純藥工業(yè)公司制造)，攪拌I小時(shí)同時(shí)使其反應(yīng)。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上以多孔性粒子20倍體積量的RO水進(jìn)行清洗。將清洗后的凝膠加入可拆卸式燒瓶中，補(bǔ)足RO水直至達(dá)到可拆卸式燒瓶的1042mL標(biāo)記處，加入2.96g硼氫化鈉，在25°C攪拌I小時(shí)。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上以凝膠的20倍體積量的RO水進(jìn)行清洗。然后，再重復(fù)進(jìn)行2次在25°C下進(jìn)行的I小時(shí)的硼氫化鈉的反應(yīng)，并使用RO水進(jìn)行清洗，直至最后清洗時(shí)玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)中的濾液的電導(dǎo)率達(dá)到5 μ S/cm以下，從而得到葡糖胺化多孔性載體。
[0170]該多孔性載體中的葡糖胺導(dǎo)入量為:每ImL多孔性載體中導(dǎo)入了 17μπι01葡糖胺。此外，未經(jīng)還原劑處理完全的葡糖胺固定化后的甲?；繛?每ImL多孔性載體中為
Oμ mol ο
[0171]向所得葡糖胺化多孔性載體109mL中加入RO水直至體積為163.5mL,并轉(zhuǎn)移至500mL的可拆卸式燒瓶中。然后，制備11.5mg/mL的過碘酸鈉水溶液,并將109mL的該過碘酸鈉水溶液加入到可拆卸式燒瓶中，在25°C以120rpm的轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上以RO水進(jìn)行清洗，直至濾液的電導(dǎo)率達(dá)到5 μ S/cm以下，從而得到含有甲?；亩嗫仔暂d體D。對于得到的含有甲?；亩嗫仔暂d體D，壓縮5%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.028MPa、壓縮10%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.067MPa、壓縮15%時(shí)的壓縮應(yīng)力為
0.109MPa。每ImL多孔性載體D中的甲?；繛?.2 μ mol。
[0172](實(shí)施例2)
[0173]向制造例I的多孔性粒子B435mL中加入RO水，使其總量為652mL，加入到2L的可拆卸式燒瓶中，并將該燒瓶安裝在25°C的恒溫槽(Tomas科學(xué)公司制造的恒溫水浴鍋T-2S)中。然后，將過鵬Ife納(和光純藥工業(yè)制造)溶解在RO水中，制備46.0mg/mL的過鵬酸納(和光純藥工業(yè)制造)，將217.5mL該溶液加入可拆卸式燒瓶中，在25°C以120rpm的轉(zhuǎn)速攪拌15分鐘。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上以RO水進(jìn)行清洗，直至濾液的電導(dǎo)率為5 μ S/cm以下，得到多孔性粒子E。測定所得多孔性粒子E的甲?；?，結(jié)果顯示:每ImL多孔性粒子E中甲?；繛?5.6 μ mol。
[0174]然后，在可拆卸式燒瓶的820mL處做標(biāo)記，并使用RO水將所得多孔性粒子E410mL轉(zhuǎn)移。將其安裝在15°C的恒溫槽(Tomas科學(xué)公司制造的恒溫水浴鍋T-2S、投入冷卻裝置ADVANTEC TBC120DA)中，放置反應(yīng)溶液直至達(dá)到15°C。確認(rèn)反應(yīng)液到達(dá)15°C后，向其中加入多孔性粒子E的甲?；康?0摩爾倍的發(fā)酵葡糖胺K(協(xié)和發(fā)酵公司制造)，并加入4N氫氧化鈉溶液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的氫氧化鈉和RO水進(jìn)行調(diào)整)使其pH達(dá)到11。然后，一邊使用4N氫氧化鈉微調(diào)pH至11, 一邊加入RO水，使反應(yīng)液的總體積達(dá)到820mL，在15°C以120rpm的轉(zhuǎn)速攪拌5小時(shí)。
[0175]隨后，加入2.33g硼氫化鈉(和光純藥工業(yè)公司制造)，攪拌I小時(shí)同時(shí)使其反應(yīng)。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上以多孔性粒子20倍體積量的RO水進(jìn)行清洗。將清洗后的凝膠加入可拆卸式燒瓶中，補(bǔ)足RO水直至達(dá)到可拆卸式燒瓶的820mL標(biāo)記處，加入2.33g硼氫化鈉，在25°C攪拌I小時(shí)。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上以凝膠的20倍體積量的RO水進(jìn)行清洗。然后，再重復(fù)進(jìn)行5次在25°C下進(jìn)行的I小時(shí)的硼氫化鈉的反應(yīng)，并使用RO水進(jìn)行清洗，直至最后清洗時(shí)玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)中的濾液的電導(dǎo)率達(dá)到5 μ S/cm以下，從而得到葡糖胺化多孔性載體。
[0176]該多孔性載體中的葡糖胺導(dǎo)入量為:每ImL多孔性載體中導(dǎo)入了 ΙΙ.ΟμπιοΙ/mL葡糖胺。此外，未經(jīng)還原劑處理完全的葡糖胺固定化后的甲?；繛?每ImL多孔性載體中為
0.4 μ mol ο
[0177]向所得葡糖胺化多孔性載體80mL中加入RO水直至體積為120mL，并轉(zhuǎn)移至可拆卸式燒瓶中。然后，制備11.5mg/mL的過碘酸鈉水溶液，并將40mL的該水溶液加入到可拆卸式燒瓶中，在25°C以150rpm的轉(zhuǎn)速攪拌30分鐘(Mazela Z)。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上以RO水進(jìn)行清洗，直至濾液的電導(dǎo)率達(dá)到5 μ S/cm以下，從而得到含有甲?；亩嗫仔暂d體。每ImL多孔性載體中的甲酰基含量為3.4 μ mol。
[0178](實(shí)施例3)
[0179]在葡糖胺固定化后的還原反應(yīng)中，將在15°C、1小時(shí)的反應(yīng)進(jìn)行I次、在25°C、1小時(shí)的反應(yīng)進(jìn)行6次變更為:在15°C、1小時(shí)的反應(yīng)進(jìn)行I次、在37°C、I小時(shí)的反應(yīng)進(jìn)行2次，除此之外，按照與實(shí)施例2相同的方法得到了葡糖胺化多孔性載體，隨后得到了含有甲?；亩嗫仔暂d體。需要說明的是，每ImL葡糖胺化多孔性載體中，葡糖胺的導(dǎo)入量為9.6ymol/mL。此外，未經(jīng)還原劑處理完全的葡糖胺固定化后的甲?；繛?每ImL多孔性載體中為0.3 μ mol。此外，每ImL含有甲?；亩嗫仔暂d體中，甲?；繛?.3 μ mol。
[0180](實(shí)施例4)
[0181]在葡糖胺固定化后的還原反應(yīng)中，將在15°C、1小時(shí)的反應(yīng)進(jìn)行I次、在25°C、1小時(shí)的反應(yīng)進(jìn)行6次變更為:在15°C、1小時(shí)的反應(yīng)進(jìn)行I次、在50°C、1小時(shí)的反應(yīng)進(jìn)行I次，除此之外，按照與實(shí)施例2相同的方法得到了葡糖胺化多孔性載體和含有甲酰基的多孔性載體。需要說明的是，每ImL葡糖胺化多孔性載體中，葡糖胺的導(dǎo)入量為8.7 μ mol/mL。此外，未經(jīng)還原劑處理完全的葡糖胺固定化后的甲?；繛?每ImL多孔性載體中為
0.4 μ mol。此外，每ImL含有甲?；亩嗫仔暂d體中，甲?；繛?.3 μ mol。[0182](實(shí)施例5)
[0183]利用pHll的0.5M檸檬酸鈉(和光純藥工業(yè)制造)+0.15M食鹽(和光純藥工業(yè)制造)的緩沖液327mL，置換實(shí)施例1中得到的甲?；嗫仔暂d體109mL。使用pHll的
0.5M檸檬酸鈉+0.15M食鹽緩沖液將置換后的含有甲?；亩嗫仔暂d體轉(zhuǎn)移至在197.6mL處做了標(biāo)記的可拆卸式燒瓶中。向其中加入含有蛋白質(zhì)A的溶液(鐘化公司制造的PNXL30) 16.5mL，該含有蛋白質(zhì)A的溶液中的蛋白質(zhì)A的濃度為52.85mg/mL，且其中的蛋白質(zhì)A根據(jù)國際公開專利公報(bào)W02006/004067中所述方法制備得到。使用4N NaOH(使用和光純藥工業(yè)公司制造和RO水進(jìn)行調(diào)整)調(diào)節(jié)pH至11，使反應(yīng)液面與197.6mL處標(biāo)記對齊，在恒溫槽中(Tomas科學(xué)公司制造的恒溫水浴鍋T-2S、投入冷卻裝置ADVANTEC TBC120DA)，于4°C下、以150rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行12小時(shí)攪拌以使其反應(yīng)(Mazela Z)。
[0184]反應(yīng)后，使用4M鹽酸(使用和光純藥工業(yè)公司制造的鹽酸和RO水進(jìn)行調(diào)整)調(diào)節(jié)反應(yīng)液的PH至6.8，然后加入硼氫化鈉(和光純藥工業(yè)制造)0.309g,在4°C緩慢攪拌I小時(shí)以使其反應(yīng)。反應(yīng)后，測定反應(yīng)液在277nm附近最大吸收處的吸光度，由此可知:每ImL多孔性載體中，親和配位體即蛋白質(zhì)A的導(dǎo)入量為7.2mg。
[0185]在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以多孔性載體20倍體積量的RO水對反應(yīng)后的多孔性載體進(jìn)行清洗，將清洗后的載體加入到可拆卸式燒瓶中，向其中加入RO水直至到達(dá)197.6mL標(biāo)記處，加入0.309g硼氫化鈉，在25°C攪拌I小時(shí)。反應(yīng)后，以20倍量的RO水進(jìn)行清洗。然后，用3倍體積量的0.0lM鹽酸(使用和光純藥工業(yè)公司制造鹽酸和RO水進(jìn)行調(diào)整)置換，向置換后的多孔性載體中加入0.0lM鹽酸使其總量達(dá)到220mL，并將該溶液加入至可拆卸式燒瓶中，在室溫下攪拌30分鐘的同時(shí)實(shí)施酸清洗。
[0186]酸清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以多孔性載體20倍體積量的RO水進(jìn)行清洗,然后,用3倍體積量的0.05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的氫氧化鈉、硫酸鈉和RO水配制而成)置換。然后，向置換后的多孔性載體中加入0.05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液使其總量達(dá)到220mL，并將該溶液加入至可拆卸式燒瓶中，在室溫下攪拌20分鐘的同時(shí)實(shí)施堿清洗。
[0187]堿清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造26G-2)上，以多孔性載體20倍體積量的RO水對多孔性載體進(jìn)行清洗。然后，使用多孔性載體3倍量的pH7.4的PBS(SIGMA公司制造)進(jìn)行置換，然后使用RO水進(jìn)行清洗，直至清洗濾液的電導(dǎo)率達(dá)到5 μ S/cm以下，得到固定化了目標(biāo)蛋白質(zhì)A的吸附體。使用電導(dǎo)率計(jì)(EUTECH INSTRUMENTS制造的ECTestrlOpure+)測定清洗濾液的電導(dǎo)率。
[0188]選擇人多克隆IgG(Baxter公司制造的Gammagard)作為所得吸附體的目標(biāo)物，求出動(dòng)態(tài)吸附量和洗脫至目標(biāo)物中的配位體的量，結(jié)果顯示，IgG動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamicbinding capacity)為:第I次37mg、第2次37mg、第3次38mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為:第I次38ppm、第2次20ppm、第3次19ppm。
[0189](實(shí)施例6)
[0190]使用實(shí)施例2中得到的甲酰基多孔性載體，按照與實(shí)施例5相同的方法，得到固定化了蛋白質(zhì)A的吸附體。求出所得吸附體的動(dòng)態(tài)吸附量和洗脫至目標(biāo)物中的配位體的量，結(jié)果顯示，IgG 動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamic binding capacity)為:第 I 次 37mg、第 2 次 38mg、第3次39mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為:第I次23ppm、第2 次 19ppm、第 3 次 19ppm。
[0191](實(shí)施例7)
[0192]使用實(shí)施例3中得到的甲酰基多孔性載體，按照與實(shí)施例5相同的方法，得到固定化了蛋白質(zhì)A的吸附體。求出所得吸附體的動(dòng)態(tài)吸附量和洗脫至目標(biāo)物中的配位體的量，結(jié)果顯示，IgG 動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamic binding capacity)為:第 I 次 34mg、第 2 次 35mg、第3次36mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為:第I次27ppm、第2 次 24ppm、第 3 次 16ppm。
[0193](實(shí)施例8)
[0194]使用實(shí)施例4中得到的甲?；嗫仔暂d體，按照與實(shí)施例5相同的方法，得到固定化了蛋白質(zhì)A的吸附體。求出所得吸附體的動(dòng)態(tài)吸附量和洗脫至目標(biāo)物中的配位體的量，結(jié)果顯示，IgG 動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamic binding capacity)為:第 I 次 31mg、第 2 次 32mg、第3次32mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為:第I次16ppm、第
2次 16ppm、第 3 次 8ppm。
[0195](實(shí)施例9)
[0196]除了將蛋白質(zhì)A的固定化溫度由4°C改變?yōu)?1°C以外，按照與實(shí)施例7相同的方法得到吸附體。求出所得吸附體的動(dòng)態(tài)吸附量和洗脫至目標(biāo)物中的配位體的量，結(jié)果顯示，IgG 動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamic binding capacity)為 34mg。
[0197](實(shí)施例10)
[0198]在固定化蛋白質(zhì)A后加入硼氫化鈉時(shí)，不直接加入其粉末，而是變更為將同量的硼氫化鈉溶解于RO水中，制備17mg/mL的硼氫化鈉溶液12.4mL,在I小時(shí)內(nèi)分25次將其總量加入，除此以外，按照與實(shí)施例7相同的方法得到吸附體。求出所得吸附體的動(dòng)態(tài)吸附量，結(jié)果顯示，IgG動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamic binding capacity)為:第I次39mg、第2次38mg、第 3 次 39mg。
[0199](實(shí)施例11)
[0200]在固定化蛋白質(zhì)A后加入硼氫化鈉時(shí)，不直接加入其粉末，而是變更為加入17mg/mL的硼氫化鈉溶液0.5mL，除此以外，按照與實(shí)施例7相同的方法得到吸附體。求出所得吸附體的動(dòng)態(tài)吸附量和洗脫至目標(biāo)物中的配位體的量，結(jié)果顯示，IgG動(dòng)態(tài)吸附量(5%DynamiCbinding capacity)為:第 2 次 39mg、第 3 次 39mg。
[0201](實(shí)施例12)
[0202]在固定化蛋白質(zhì)A后，不是一次性加入硼氫化鈉，而是加入與硼氫化鈉等摩爾量的二甲胺硼烷粉末，除此以外，按照與實(shí)施例7相同的方法得到吸附體。求出所得吸附體的動(dòng)態(tài)吸附量，結(jié)果顯示，IgG動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamic binding capacity)為:第I次36mg、第3次38mg。
[0203](比較例I)
[0204]除了在固定化葡糖胺后未進(jìn)行還原反應(yīng)以外，按照與實(shí)施例1相同的方法，得到葡糖胺化多孔性載體和含有甲?；亩嗫仔暂d體F。每ImL多孔性載體中的葡糖胺導(dǎo)入量為20.2μπιΟ1。此外，未經(jīng)還原劑處理完全的葡糖胺固定化后的甲?；繛?μπι01。此外，每ImL多孔性載體F中，含有甲酰基的多孔性載體中甲?；暮繛?4.5 μ mol。
[0205]使用所得甲?；嗫仔暂d體，按照與實(shí)施例5相同的方法，得到固定化了蛋白質(zhì)A的吸附體。求出所得吸附體的動(dòng)態(tài)吸附量和洗脫至目標(biāo)物中的配位體的量，結(jié)果顯示，IgG動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamic binding capacity)為:第 I 次 37mg、第 2 次 38mg、第 3 次 38mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為:第1次87ppm、第2次47ppm、第
3次 56ppm。
[0206](比較例2)
[0207]向制造例I的多孔性粒子B64mL中加入RO水，使其總量為96mL，加入到可拆卸式燒瓶中，并將該燒瓶安裝在25°C的恒溫槽(Tomas科學(xué)公司制造的恒溫水浴鍋T-2S)中。然后，將過碘酸鈉(和光純藥工業(yè)制造)溶解在RO水中，制備1.44mg/mL的過碘酸鈉水溶液，將64mL該溶液加入可拆卸式燒瓶中，在25°C以120rpm的轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)(Mazela Z)。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上以RO水進(jìn)行清洗，直至濾液的電導(dǎo)率達(dá)到5 μ S/cm以下，得到含有甲酰基的多孔性載體G。測定所得含有甲?；亩嗫仔暂d體G的甲酰基含量，結(jié)果顯示:每ImL多孔性載體中的甲酰基含量為5.9 μ mol。
[0208]在玻璃過濾器(TOP公司制造的25G-2)上，以pH為11的0.5M磷酸(和光純藥工業(yè)制造)+0.15M食鹽(和光純藥工業(yè)制造)的緩沖液165mL，置換上述酰基多孔性載體54.5mL。向置換后的含有甲?；亩嗫仔暂d體中加入pHll的0.5M磷酸(和光純藥工業(yè)制造)+0.15M食鹽(和光純藥工業(yè)制造)的緩沖液，使其總量達(dá)到90.5mL，并轉(zhuǎn)移至可拆卸式燒瓶中，向其中加入含有蛋白質(zhì)A的溶液(鐘化公司制造的PNXL30)8.25mL，該含有蛋白質(zhì)A的溶液中的蛋白質(zhì)A的濃度為52.85mg/mL,且其中的蛋白質(zhì)A根據(jù)國際公開專利公報(bào)W02006/004067中所述方法制備得到，在恒溫槽中(Tomas科學(xué)公司制造恒溫水浴鍋T-2S、投入冷卻裝置ADVANTEC TBC120DA)，于4°C下、以150rpm的轉(zhuǎn)速使進(jìn)行12小時(shí)攪拌以使其反應(yīng)(Mazela Z)。
[0209]反應(yīng)后，使用4M鹽酸(使用和光純藥工業(yè)公司制造鹽酸和RO水進(jìn)行調(diào)整)將反應(yīng)液的PH調(diào)節(jié)為8，然后加入硼氫化鈉(和光純藥工業(yè)制造)0.155g，于4°C緩慢攪拌I小時(shí)以使其反應(yīng)。反應(yīng)后，測定反應(yīng)液在2`76nm附近最大吸收處的吸光度，由此可知--每ImL多孔性載體中，親和配位體即蛋白質(zhì)A的導(dǎo)入量為6.7mg。
[0210]在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以多孔性載體20倍體積量的RO水對反應(yīng)后的多孔性載體進(jìn)行清洗，向清洗后的載體加入RO水至達(dá)到109mL，并轉(zhuǎn)移到可拆卸式燒瓶中，加入0.155g硼氫化鈉，在25°C攪拌I小時(shí)。反應(yīng)后，以20倍量的RO水進(jìn)行清洗。然后，用3倍體積量的0.01M鹽酸(使用和光純藥工業(yè)公司制造鹽酸和RO水進(jìn)行調(diào)整)置換，向置換后的多孔性載體中加入0.01M鹽酸使其總量達(dá)到109mL，并將該溶液加入至可拆卸式燒瓶中，在室溫下攪拌30分鐘的同時(shí)實(shí)施酸清洗。
[0211]酸清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以多孔性載體20倍體積量的RO水進(jìn)行清洗,然后,用3倍體積量的0.05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的氫氧化鈉、硫酸鈉和RO水配制而成)置換。然后，向置換后的多孔性載體中加入0.05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液使其總量達(dá)到109mL，并將該溶液加入至可拆卸式燒瓶中，在室溫下攪拌20分鐘的同時(shí)實(shí)施堿清洗。
[0212]堿清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以多孔性載體20倍體積量的RO水對多孔性載體進(jìn)行清洗。然后，使用多孔性載體3倍量的pH7.4的PBS (SIGMA公司制造)進(jìn)行置換，然后使用RO水進(jìn)行清洗，直至清洗濾液的電導(dǎo)率達(dá)到5 μ S/cm以下，得到固定化了目標(biāo)蛋白質(zhì)A的吸附體。使用電導(dǎo)率計(jì)(EUTECH INSTRUMENTS制ECTestrlOpure+)測定清洗濾液的電導(dǎo)率。
[0213]求出所得吸附體的動(dòng)態(tài)吸附量和洗脫至目標(biāo)物中的配位體的量，結(jié)果顯示，IgG動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamic binding capacity)為:第 I 次 35mg、第 2 次 35mg、第 3 次 35mg。此夕卜，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為:第I次>100ppm、第2次>100ppm、第 3 次 >100ppm。
[0214](比較例3)
[0215]除了未對Chisso公司制造的CK-A分級以外，按照與制造例I相同的方法制得交聯(lián)多孔性粒子。然后，向該交聯(lián)多孔性粒子IlmL中加入RO水使其總量達(dá)到12.6mL，將其加入離心沉降管(巖城硝子公司制造50mL)，再向其中加入2M氫氧化鈉水溶液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的氫氧化鈉和RO水配制而成)3.7mL,在40°C加溫30分鐘。將液溫加溫至40°C后，加入環(huán)氧氯丙烷(和光純藥工業(yè)公司制造)1.3mL，使用恒溫振蕩機(jī)(Tomas科學(xué)公司制造的恒溫水浴鍋T-25)，在40°C以100次/分振蕩2小時(shí)以使其反應(yīng)。
[0216]反應(yīng)終止后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的17G-2)上，以多孔性粒子20倍體積量的RO水進(jìn)行清洗，得到每ImL多孔性粒子中環(huán)氧基含量為5.7 μ mol的環(huán)氧化多孔性粒子。在玻璃過濾器(TOP公司制造的17G-2)上，使用pH為10的0.5M碳酸緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的碳酸氫鈉、碳酸鈉和RO水配制而成)30mL,將上述環(huán)氧化多孔性粒子9.5mL置換。向置換后的環(huán)氧化多孔性粒子中加入pH為10的0.5M碳酸緩沖液,使其總量為19mL，將其加入離心沉降管(巖城硝子公司制造50mL)中，再向其中加入D (+)-葡糖胺鹽酸鹽(和光純藥工業(yè)公司制造)0.18g，使用恒溫振蕩機(jī)(Tomas科學(xué)公司制造的恒溫水浴鍋T-25)，在50°C以100次/分振蕩一晚上以使其反應(yīng)。
[0217]反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造17G-2)上，以多孔性載體20倍體積量的RO水進(jìn)行清洗，得到每ImL多孔性載體中的葡糖胺含量為1.4 μ mol的葡糖胺化多孔性載體。向所得葡糖胺化多孔性載體IOmL中加入RO水，使其總量達(dá)到15mL，并將其裝入離心沉降管(巖城硝子公司制造50mL)中。然后,將115mg過碘酸鈉(和光純藥工業(yè)公司制造)溶解于IOmL RO水中，將所述過碘酸鈉水溶液加入離心沉降管中，在恒溫箱(巖城玻璃公司制造的恒溫箱LOW-TEMP ICB-151L)中，使用混合轉(zhuǎn)子(井內(nèi)盛榮堂公司制造的Variable MixRotor VMR-5)，在25°C以100次/分振蕩I小時(shí)，使其反應(yīng)。
[0218]反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造17G-2)上，以多孔性載體20倍體積量的RO水進(jìn)行清洗，得到含有甲?；亩嗫仔暂d體。按照上述方法，對得到的含有甲?；亩嗫仔暂d體的甲?；窟M(jìn)行測定，結(jié)果為每ImL多孔性載體中的甲?；繛?.9 μ mol。
[0219]在玻璃過濾器(TOP公司制造17G-2)上，以pH為10的0.5M磷酸+0.15M食鹽的緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的磷酸氫二鈉、氯化鈉、氫氧化鈉和RO水配制而成)30mL，對上述含有甲?；亩嗫仔暂d體7.1mL進(jìn)行置換。向置換后的含有甲酰基的多孔性載體中加入PH為10的0.5M磷酸+0.15M食鹽的緩沖液，使其總量達(dá)到11.8mL,并轉(zhuǎn)移至離心沉降管(巖城硝子公司制造50mL)中，向其中加入含有蛋白質(zhì)A的溶液(鐘化公司制造的PNXL30) 1.08mL，該含有蛋白質(zhì)A的溶液中的蛋白質(zhì)A的濃度為52.6mg/mL，且其中的蛋白質(zhì)A根據(jù)國際公開專利公報(bào)W02006/004067中所述方法制備得到，在恒溫箱(巖城玻璃公司制造的恒溫箱LOW-TEMP ICB-151L)，使用混合轉(zhuǎn)子(井內(nèi)盛榮堂公司制造的VariableMix Rotor VMR-5)，于4°C下、以100次/分振蕩12小時(shí)，以使其反應(yīng)。
[0220]使用4M鹽酸(使用和光純藥工業(yè)公司制造的鹽酸和RO水進(jìn)行調(diào)整)調(diào)節(jié)反應(yīng)后的反應(yīng)液的pH至8，然后加入硼氫化鈉0.02g，在4°C緩慢振蕩I小時(shí)以使其反應(yīng)。反應(yīng)后，測定反應(yīng)液在277nm附近最大吸收處的吸光度，結(jié)果可知:每ImL多孔性載體中，親和配位體即蛋白質(zhì)A的導(dǎo)入量為4.7mg。
[0221]在玻璃過濾器(TOP公司制造的17G-2)上，用RO水清洗反應(yīng)后的多孔性載體，直至清洗濾液的電導(dǎo)率達(dá)到5 μ S/cm以下，得到固定化了目標(biāo)蛋白質(zhì)A的吸附體。
[0222]選擇人多克隆IgG(Baxter公司制造的Gammagard)作為所得吸附體的目標(biāo)物，按照下述方法求出動(dòng)態(tài)吸附量和洗脫至目標(biāo)物中的配位體的量，結(jié)果顯示，IgG動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamic binding capacity)為:第 I 次 22mg、第 2 次 23mg、第 3 次 27mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體在IgG中所占的濃度為:第I次297ppm、第2次214ppm、第3次198ppm。
[0223](制造例2)
[0224]按照與制造例I相同的方法制備多孔性粒子B，并向該多孔性粒子BlOOmL中加入RO水，使其總量為150mL，加入到可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中。然后，將2.30g的過碘酸鈉(和光純藥工業(yè)公司制造)溶解于50mL RO水中，將該過碘酸鈉水溶液加入可拆卸式燒瓶中，在25°C、以150次/分?jǐn)嚢?5分鐘的同時(shí)使其反應(yīng)。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造26G-2)上，以多孔性粒子20倍體積量的RO水進(jìn)行清洗，得到多孔性粒子
H。按照上述方法對得到的含有甲酰基的多孔性粒子的甲?；窟M(jìn)行測定，結(jié)果顯示:每ImL多孔性粒子中的甲?；繛?7 μ mol。
[0225](實(shí)施例13)
[0226]按照與制造例2相同的方法制備多孔性粒子H，并將99mL的該多孔性粒子H與99mL的RO水以1:1制備漿料，將該漿料調(diào)節(jié)至15°C，然后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上抽濾(抽吸干燥)15分鐘。將得到的抽吸干燥后的多孔性粒子I全部投入到玻璃制可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中。然后，向該可拆卸式燒瓶中加入3.3g葡糖胺鹽酸鹽(協(xié)和發(fā)酵公司制造的發(fā)酵葡糖胺K)。隨后，一邊使葡糖胺鹽酸鹽溶解，一邊加入15°C的RO水，調(diào)節(jié)溶解后的反應(yīng)液總量為180mL。將反應(yīng)液調(diào)節(jié)至15°C后，使用4N的氫氧化鈉水溶液和RO水，調(diào)節(jié)至pH為10、反應(yīng)液的總量為198mL。接著，在15°C以150次/分?jǐn)嚢?小時(shí)。然后，添加硼氫化鈉(和光純藥工業(yè)公司制造)0.56g，在15°C以150次/分?jǐn)嚢?0分鐘。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以多孔性載體40倍體積量的RO水進(jìn)行清洗。
[0227]將下述“”內(nèi)的操作共進(jìn)行2次，得到目標(biāo)多孔性載體:“接著，將清洗后的多孔性載體全部投入到玻璃制可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，加入RO水，調(diào)節(jié)其總量至198mL。然后，添加硼氫化鈉(和光純藥工業(yè)公司制造)0.56g，在15°C以150次/分?jǐn)嚢?0分鐘。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以多孔性載體40倍體積量的RO水進(jìn)行清洗?！?。通過非水滴定測定該多孔性載體中的葡糖胺固定化量，結(jié)果顯示:每ImL載體中的葡糖胺固定化量為10 μ mol。
[0228](實(shí)施例14)
[0229]除了在添加葡糖胺鹽酸鹽后實(shí)施pH調(diào)節(jié)時(shí)，將pH設(shè)定為9以外，按照與實(shí)施例13相同的方法制備了目標(biāo)多孔性載體。每ImL載體中的葡糖胺固定化量為ΙΟμπιοΙ。[0230](實(shí)施例15)
[0231]除了在添加葡糖胺鹽酸鹽后實(shí)施pH調(diào)節(jié)時(shí)，將pH設(shè)定為8以外，按照與實(shí)施例13相同的方法制備了目標(biāo)多孔性載體。每ImL載體中的葡糖胺固定化量為ΙΟμπιοΙ。
[0232](實(shí)施例16)
[0233]使用ρΗ3的0.0lM檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物、RO水配制而成)280mL對實(shí)施例13中制備的多孔性載體94mL進(jìn)行置換，加入該緩沖液，使其總量為141mL，并加入至可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中。然后，將0.54g過碘酸鈉(和光純藥工業(yè)公司制造)溶解在94mL RO水中，并將該過碘酸鈉水溶液加入可拆卸式燒瓶中，在5°C以150次/分使其攪拌40分鐘以使其反應(yīng)。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造26G-2)上，以多孔性載體40倍體積量的RO水進(jìn)行清洗，得到含有甲?；亩嗫仔暂d體。按照上述方法測定制得的載體的甲?；?，結(jié)果顯示:每ImL多孔性載體中的甲酰基含量為4 μ mol。
[0234]在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以0.6M檸檬酸三鈉+0.2M食鹽的緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、氯化鈉和RO水制備)280mL對92.SmL的上述含有甲酰基的多孔性載體進(jìn)行置換。向置換后的該多孔性載體中加入0.6M檸檬酸三鈉+0.2M食鹽的緩沖液，使其總量為132mL，并將其加入可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中。向其中加入含有蛋白質(zhì)A的溶液(鐘化公司制造的PNXL30) 14.06mL，該含有蛋白質(zhì)A的溶液中的蛋白質(zhì)A的濃度為52.8mg/mL,且其中的蛋白質(zhì)A根據(jù)國際公開專利公報(bào)W02006/004067中記載的方法制備得到，加入0.08M的氫氧化鈉水溶液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的氫氧化鈉和RO水配制而成)，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至12，在4°C以150次/分?jǐn)嚢?小時(shí)以使其反應(yīng)。
[0235]使用0.1M檸檬酸(使用和光純藥工業(yè)公司制造的檸檬酸一水合物與RO水配制而成)調(diào)節(jié)反應(yīng)后的反應(yīng)液pH至7，然后加入二甲胺硼烷408mg，以150次/分，分別在40°C攪拌I小時(shí)、然后在25°C攪拌8小時(shí)，以使其反應(yīng)。反應(yīng)后，測定反應(yīng)液在277nm附近最大吸收處的吸光度，結(jié)果可知:每ImL多孔性載體中，親和配位體即蛋白質(zhì)A的固定化量為
7.6mg。
[0236]在玻璃過濾器(TOP公司制造26G-2)上，以多孔性載體10倍體積量的RO水對反應(yīng)后的多孔性載體進(jìn)行清洗，然后，用3倍體積量的0.1M檸檬酸(使用和光純藥工業(yè)公司制造的檸檬酸一水合物和RO水配制而成)置換。然后向置換后的多孔性載體中加入0.1M檸檬酸，使其總量為186mL，并加入至可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，以150次/分在25°C振蕩30分鐘的同時(shí)實(shí)施酸清洗。
[0237]酸清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造26G-2)上，以3倍體積量的0.05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的氫氧化鈉、硫酸鈉和RO水配制而成)置換多孔性載體。然后，向置換后的多孔性載體中加入0.05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液，使其總量為186mL，將其全部加入至可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，以150次/分在25°C振蕩20分鐘的同時(shí)實(shí)施堿清洗。
[0238]堿清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造26G-2)上，以pH為6的0.5M檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物和RO水配制而成)278mL置換多孔性載體，然后使用RO水進(jìn)行清洗，直至清洗濾液的電導(dǎo)率為5 μ S/cm以下。
[0239]接著，使用20%乙醇水溶液(使用日本藥局方的乙醇和RO水配制而成)置換多孔性載體，然后，使用20%乙醇水溶液將其加入到250mL的塑料容器(V容器)(Sanplatec公司制造)中，得到固定化了目標(biāo)蛋白質(zhì)A的吸附體。使用電導(dǎo)率計(jì)(EUTECH INSTRUMENTS制造的ECTestrlOpure+)測定清洗濾液的電導(dǎo)率。
[0240]選擇人多克隆IgG(Baxter公司制造的Ga_agard)作為所得吸附體的目標(biāo)物，按照下述方法求出動(dòng)態(tài)吸附量和洗脫至目標(biāo)物中的配位體的量，結(jié)果顯示，IgG動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamic binding capacity)為每ImL載體中37mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為24ppm。按照上述方法測定所得吸附體中甲酰基的含量，結(jié)果顯示 每ImL多孔性載體中為0.2 μ mol ο
[0241](實(shí)施例17)
[0242]除了使用實(shí)施例14中制備的多孔性載體以外，按照與實(shí)施例16相同的操作，得到目標(biāo)吸附體。該IgG動(dòng)態(tài)吸附量為:每ImL載體中為37mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為22ppm。
[0243](實(shí)施例18)
[0244]除了使用實(shí)施例15中制備的多孔性載體以外，按照與實(shí)施例16相同的操作，得到目標(biāo)吸附體。該IgG動(dòng)態(tài)吸附量為:每ImL載體中為37mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為26ppm。
[0245](實(shí)施例19)
[0246]除了使用pH為2的檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物和RO水配制而成)來代替pH為3的檸檬酸緩沖液以外，按照與實(shí)施例17相同的操作來制備吸附體。此時(shí)，含有甲?；亩嗫仔暂d體的甲?；繛?每ImL多孔性載體中為6 μ mo I，親和配位體即蛋白質(zhì)A的固定化量為:每ImL多孔性載體中為
7.2mg。此外，IgG動(dòng)態(tài)吸附量為35mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為38ppm。
[0247](實(shí)施例20)
[0248]除了使用pH為5的檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物和RO水配制而成)來代替pH為3的檸檬酸緩沖液以外，按照與實(shí)施例17相同的操作來制備吸附體。此時(shí)，含有甲酰基的多孔性載體的甲?；繛?每ImL多孔性載體中為4 μ mo I，親和配位體即蛋白質(zhì)A的固定化量為:每ImL多孔性載體中為6.5mg。此外，IgG動(dòng)態(tài)吸附量為35mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為42ppm。
[0249](實(shí)施例21)
[0250]在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以0.5M檸檬酸三鈉+0.15M食鹽的緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、氯化鈉和RO水配制而成)278mL，置換按照與實(shí)施例1相同的方法制備的92.SmL的含有甲酰基的多孔性載體。向置換后的含有甲酰基的多孔性載體中加入0.5M檸檬酸三鈉+0.15M食鹽的緩沖液，使其總量為130mL，并將其加入可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中。向其中加入含有蛋白質(zhì)A的溶液(鐘化公司制造的PNXL30) 14.04mL，該含有蛋白質(zhì)A的溶液中的蛋白質(zhì)A的濃度為52.85mg/mL，且其中的蛋白質(zhì)A根據(jù)國際公開專利公報(bào)W02006/004067中記載的方法制備得到，加入4M的氫氧化鈉水溶液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的氫氧化鈉和RO水配制而成),調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至11。然后，使用pH為11的0.5M檸檬酸三鈉+0.15M食鹽的緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、氯化鈉、氫氧化鈉和RO水配制而成)調(diào)節(jié)反應(yīng)液的總量為168mL，在4°C以150次/分?jǐn)嚢?2小時(shí)以使其反應(yīng)。
[0251]反應(yīng)后，使用4M鹽酸(使用和光純藥工業(yè)公司制造的鹽酸和RO水配制而成)調(diào)節(jié)反應(yīng)液的PH至6.8，然后加入硼氫化鈉263mg，在4°C以150次/分?jǐn)嚢鐸小時(shí)以使其反應(yīng)。反應(yīng)后,測定反應(yīng)液在277nm附近最大吸收處的吸光度，由此可知:每ImL多孔性載體中，親和配位體即蛋白質(zhì)A的導(dǎo)入量為7.2mg。
[0252]在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以多孔性載體10倍體積量的RO水對反應(yīng)后的多孔性載體進(jìn)行清洗，然后將其全部裝入可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，向其中加入RO水調(diào)節(jié)反應(yīng)液總量為168mL，然后，加入263mg的硼氫化鈉，在25°C以150次/分?jǐn)嚢鐸小時(shí)以使其反應(yīng)。反應(yīng)后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以多孔性載體10倍體積量的RO水進(jìn)行清洗，然后，用3倍體積量的0.0lM鹽酸(使用和光純藥工業(yè)公司制造鹽酸和RO水配制而成)置換，然后，向置換后的多孔性載體中加入0.0lM鹽酸使其總量為168mL，將其加入至可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，在25°C以150次/分振蕩30分鐘的同時(shí)實(shí)施酸清洗。
[0253]酸清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造26G-2)上，以多孔性載體10倍體積量的RO水對多孔性載體進(jìn)行清洗，然后，用3倍體積量的0.05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的氫氧化鈉、硫酸鈉和RO水配制而成)置換。然后，向置換后的多孔性載體中加入0.05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液使其總量為168mL，將其全部加入至可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，在25°C以150次/分振蕩20分鐘的同時(shí)實(shí)施堿清洗。
[0254]堿清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以pH為6的0.0lM檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物和RO水配制而成)278mL對多孔性載體進(jìn)行置換，然后，使用RO水進(jìn)行清洗，直至清洗濾液的電導(dǎo)率達(dá)到5μ S/cm以下。接著,使用20%乙醇水溶液(使用日本藥局方的乙醇和RO水配制而成)置換多孔性載體，然后，使用20%乙醇水溶液將其加入至250mL的塑料容器(Sanplatec公司制造)中，得到固定化了目標(biāo)蛋白質(zhì)A的吸附體。使用電導(dǎo)率計(jì)(EUTECH INSTRUMENTS制造的ECTestrlOpure+)測定清洗濾液的電導(dǎo)率。
[0255]選擇人多克隆IgG(Baxter公司制造的Gammagard)作為所得吸附體的目標(biāo)物，求出動(dòng)態(tài)吸附量和洗脫至目標(biāo)物中的配位體的量，結(jié)果顯示，IgG動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamicbinding capacity)為:第I次36mg、第2次36mg、第3次37mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為:第I次69ppm、第2次47ppm、第3次36ppm。
[0256](實(shí)施例⑵
[0257]除了使用0.025M磷酸+1.5M硫酸鈉的緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的12水合磷酸氫二鈉、硫酸鈉和RO水配制而成)來代替0.5M檸檬酸三鈉+0.15M食鹽的緩沖液，并使用PH為11的0.025M磷酸+1.5M硫酸鈉的緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的12水合磷酸氫二鈉、硫酸鈉、氫氧化鈉和RO水配制而成)來代替pH為11的0.5M檸檬酸三鈉+0.15M食鹽的緩沖液以外，按照與實(shí)施例21相同的操作來制備吸附體。按照與實(shí)施例2相同的方法求出親和配位體即蛋白質(zhì)A的固定化量，結(jié)果為:每ImL多孔性載體中為7.4mg。[0258](實(shí)施例23)
[0259]除了在實(shí)施例21中調(diào)節(jié)pH為11的操作中，將pHll改變?yōu)閜H12.5以外，按照與實(shí)施例21相同的方法來制備吸附體。蛋白質(zhì)A的固定化量為:每ImL多孔性載體中6.0mg, IgG動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamic binding capacity)為:第 I 次 33mg、第 2 次 33mg、第 3 次 33mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體的濃度為:第I次35ppm。
[0260](實(shí)施例24)
[0261]除了在實(shí)施例21中調(diào)節(jié)pH為11的操作中，將pHll改變?yōu)閜H13以外，按照與實(shí)施例21相同的方法來制備吸附體。蛋白質(zhì)A的固定化量為:每ImL多孔性載體中4.0mg, IgG動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamic binding capacity)為:第 I 次 28mg、第 2 次 33mg、第 3 次 33mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體的濃度為:第I次23ppm。
[0262](實(shí)施例25)
[0263]除了將實(shí)施例21中的調(diào)節(jié)pH為11的操作改變?yōu)閜HIO以外，按照與實(shí)施例21相同的方法來制備吸附體。蛋白質(zhì)A的固定化量為:每ImL多孔性載體中4.0mg, IgG動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamic binding capacity)為 29mg0
[0264](實(shí)施例26)
[0265]在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以0.6M檸檬酸三鈉+0.2M食鹽的緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造檸檬酸三鈉二水合物、氯化鈉和RO水配制而成)280mL,置換按照與實(shí)施例1相同的方法制備的92.SmL的含有甲酰基的多孔性載體。向置換后的多孔性載體F中加入0.6M檸檬酸三鈉+0.2M食鹽的緩沖液，使其總量為132mL，并加入到可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中。向其中加入含有蛋白質(zhì)A的溶液(鐘化公司制造的PNXL30) 14.06mL，該含有蛋白質(zhì)A的溶液中的蛋白質(zhì)A的濃度為52.8mg/mL，且其中的蛋白質(zhì)A根據(jù)國際公開專利公報(bào)W02006/004067中記載的方法制備得到，加入0.08M的氫氧化鈉水溶液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的氫氧化鈉和RO水配制而成)，調(diào)節(jié)反應(yīng)后的反應(yīng)液pH至12，在4°C以150次/分?jǐn)嚢?小時(shí)以使其反應(yīng)。使用0.1M檸檬酸(使用和光純藥工業(yè)公司制造檸檬酸一水合物和RO水配制而成)調(diào)節(jié)反應(yīng)后的反應(yīng)液pH至7。在同溫度下繼續(xù)攪拌I小時(shí)后，加入二甲胺硼烷408mg，然后以150次/分分別在4°C攪拌I小時(shí)、然后在25°C攪拌5小時(shí)，同時(shí)使其反應(yīng)。
[0266]在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以多孔性載體10倍體積量的RO水對反應(yīng)后的多孔性載體進(jìn)行清洗，然后，用3倍體積量的0.1M檸檬酸(使用和光純藥工業(yè)公司制造的檸檬酸一水合物和RO水配制而成)置換，然后，向置換后的多孔性載體中加入0.1M檸檬酸使其總量為186mL，將其加入可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，以150次/分在25°C振蕩30分鐘的同時(shí)實(shí)施酸清洗。
[0267]酸清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造的26G-2)上，以3倍體積量的0.05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液(使用和光純藥工業(yè)公司制造氫氧化鈉、硫酸鈉和RO水配制而成)置換多孔性載體。然后，向置換后的多孔性載體中加入0.05M氫氧化鈉+IM硫酸鈉水溶液使其總量為186mL，將其全部加入至可拆卸式燒瓶(TOP公司制造500mL)中，以150次/分在25°C振蕩20分鐘的同時(shí)實(shí)施堿清洗。
[0268]堿清洗后，在玻璃過濾器(TOP公司制造26G-2)上，以pH為6的0.5M檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物和RO水配制而成)278mL置換多孔性載體。然后，使用RO水進(jìn)行清洗，直至清洗濾液的電導(dǎo)率達(dá)到5 μ S/cm以下。接著，使用20%乙醇水溶液(使用日本藥局方的乙醇和RO水配制而成)置換多孔性載體，然后，使用20%乙醇水溶液將其加入到250mL的塑料容器(Sanplatec公司制造)中，得到固定化了目標(biāo)蛋白質(zhì)A的吸附體。使用RO水進(jìn)行清洗，直至清洗濾液的電導(dǎo)率達(dá)到5 μ S/cm以下。接著，使用20%乙醇水溶液(使用日本藥局方的乙醇和RO水配制而成)置換多孔性載體，然后，使用20%乙醇水溶液將其加入到250mL的塑料容器(Sanplatec公司制造)中，得到固定化了目標(biāo)蛋白質(zhì)A的吸附體。使用電導(dǎo)率計(jì)(EUTECH INSTRUMENTS制造的ECTestrlOpure+)測定清洗濾液的電導(dǎo)率。
[0269]選擇人多克隆IgG(Baxter公司制造的Gammagard)作為所得吸附體的目標(biāo)物，求出動(dòng)態(tài)吸附量和洗脫至目標(biāo)物中的配位體的量，結(jié)果顯示，IgG動(dòng)態(tài)吸附量(5%Dynamicbinding capacity)為:每ImL載體中為34mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為30ppmo
[0270](實(shí)施例27)
[0271]除了在使用0.1M檸檬酸調(diào)節(jié)pH至7后，將在同溫度下繼續(xù)攪拌的時(shí)間設(shè)定為2小時(shí)以外，按照與實(shí)施例26相同的操作得到吸附體。所得吸附體的IgG動(dòng)態(tài)吸附量為:每ImL載體中為36mg。
[0272](實(shí)施例28)
[0273]除了在使用0.1M檸檬酸調(diào)節(jié)pH至7后，將在同溫度下繼續(xù)攪拌的時(shí)間設(shè)定為4小時(shí)以外，按照與實(shí)施例26相同的操作得到吸附體。所得吸附體的IgG動(dòng)態(tài)吸附量為:每ImL載體中為37mg,泄漏至精制IgG中的配位體濃度為22ppm。
[0274](實(shí)施例29)
[0275]除了在使用0.1M檸檬酸調(diào)節(jié)pH至7后，將在同溫度下繼續(xù)攪拌的時(shí)間設(shè)定為6小時(shí)以外，按照與實(shí)施例26相同的操作得到吸附體。所得吸附體的IgG動(dòng)態(tài)吸附量為:每ImL載體中為36mg,泄漏至精制IgG中的配位體濃度為45ppm。
[0276](實(shí)施例3O)
[0277]除了使用0.1M檸檬酸調(diào)節(jié)pH至7后，將在同溫度下繼續(xù)攪拌的時(shí)間設(shè)定為15小時(shí)以外，按照與實(shí)施例26相同的操作得到吸附體。所得吸附體的IgG動(dòng)態(tài)吸附量為:每ImL載體中為37mg。
[0278](實(shí)施例31)
[0279]在pH12的條件下使蛋白質(zhì)A反應(yīng)后，使用1.6M檸檬酸將pH調(diào)節(jié)為3，然后將在同溫度下繼續(xù)攪拌的時(shí)間設(shè)定為4小時(shí)，除此之外，按照與實(shí)施例26相同的操作得到吸附體。所得吸附體的IgG動(dòng)態(tài)吸附量為:每ImL載體中為36mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為 30ppm。
[0280](實(shí)施例32)
[0281]除了在剛剛使用0.1M檸檬酸調(diào)節(jié)pH至7之后加入二甲胺硼烷以外，按照與實(shí)施例26相同的操作得到吸附體。所得吸附體的IgG動(dòng)態(tài)吸附量為:每ImL載體中31mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為22ppm。
[0282](實(shí)施例33)
[0283]使用pH為3的檸檬酸緩沖液(使用和光純藥工業(yè)公司制造的檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物和RO水配制而成)282mL，對在制造例I中制備的多孔性粒子B進(jìn)行置換，使用該緩沖液調(diào)節(jié)液體量，此外，將過碘酸鈉設(shè)定為0.16g，除此之外，按照與實(shí)施例32相同的操作得到吸附體。此時(shí)，多孔性載體E中甲?；暮繛?每ImL多孔性載體中7 μ mol,親和配位體即蛋白質(zhì)A的固定化量為:每ImL多孔性載體中為5.0mg。此外，IgG的動(dòng)態(tài)吸附量為31mg，泄漏至精制IgG中的配位體濃度為36ppm。所得吸附體中甲酰基的含量為--每ImL多孔性載體中為0.2 μ mol。
[0284](比較例4)
[0285]不使用二甲胺硼烷，按照與實(shí)施例16相同的操作得到吸附體。所得吸附體中甲?；暮繛?每ImL多孔性載體中為2 μ mol。此外，IgG的動(dòng)態(tài)吸附量為:每ImL載體中為27mg,泄漏至精制IgG 中的配位體濃度為615ppm。
【權(quán)利要求】
1.一種吸附體的制造方法，其包括: 通過亞氨基化及其還原反應(yīng)這兩步反應(yīng)來進(jìn)行，將含有氨基的配位體固定化于含有甲?；亩嗫仔暂d體，并在亞氨基化反應(yīng)之后，實(shí)施將反應(yīng)液的PH調(diào)節(jié)為還原反應(yīng)的pH土 I以內(nèi)，并在不加入還原劑的情況下進(jìn)行攪拌、振蕩或放置的穩(wěn)定化操作。
2.權(quán)利要求1所述的吸附體的制造方法，其中，亞氨基化反應(yīng)之后的穩(wěn)定化操作實(shí)施I小時(shí)以上。
3.權(quán)利要求1所述的吸附體的制造方法，其中，亞氨基化反應(yīng)之后的穩(wěn)定化操作在pH2~10條件下實(shí)施。
4.權(quán)利要求1所述的吸附體的制造方法，其中，亞氨基化反應(yīng)之后的穩(wěn)定化操作在緩沖液中實(shí)施。
5.權(quán)利要求4所述的吸附體的制造方法，其中，緩沖液中含有至少一種以上的能具有二價(jià)以上陰離子的鹽。
6.權(quán)利要求4所述的吸附體的制造方法，其中，緩沖液中含有多元羧酸鹽和/或中性鹽。
7.權(quán)利要求4所述的吸附體的制造方法，其中，緩沖液中含有檸檬酸鹽。
8.權(quán)利要求4所述的吸附體的制造方法，其中，緩沖液中含有選自金屬鹵化物和硫酸鹽中的至少I種以上。·
9.權(quán)利要求4所述的吸附體的制造方法，其中，在將含有氨基的配位體固定化于含有甲?；亩嗫仔暂d體時(shí)，通過有機(jī)硼烷絡(luò)合物，使配位體的固定化鍵穩(wěn)定化并同時(shí)使其余的甲酰基鈍化。
10.權(quán)利要求9所述的吸附體的制造方法，其在含有緩沖液的溶劑中實(shí)施。
11.權(quán)利要求9所述的吸附體的制造方法，其中，上述通過有機(jī)硼烷絡(luò)合物使配位體的固定化鍵穩(wěn)定化并同時(shí)使其余的甲?；g化的操作，實(shí)施I小時(shí)以上且48小時(shí)以下。
12.權(quán)利要求9所述的吸附體的制造方法，其中，有機(jī)硼烷絡(luò)合物是硼烷-胺絡(luò)合物。
13.權(quán)利要求1所述的吸附體的制造方法，其中，操作溫度為-10~40°C。
14.一種吸附體，其通過權(quán)利要求1~13中任一項(xiàng)所述的制造方法制得。
15.權(quán)利要求14所述的吸附體，其中，含有氨基的配位體的導(dǎo)入量為:每ImL多孔性載體中導(dǎo)入含有氨基的配位體Img以上且500mg以下。
16.權(quán)利要求14或15所述的吸附體，其中，含有氨基的配位體的導(dǎo)入量為:每ImL多孔性載體中導(dǎo)入含有氨基的配位體0.01 μ mol以上且15μηιο1以下。
17.權(quán)利要求14所述的吸附體，其中，所述含有氨基的配位體是蛋白質(zhì)Α。
18.權(quán)利要求14所述的吸附體，其中，從吸附體洗脫到目標(biāo)物中的配位體濃度的第一次精制~第三次精制的平均值為50ppm以下。
19.權(quán)利要求14所述的吸附體，其中，精制目標(biāo)物的吸附量為:每ImL吸附體中精制目標(biāo)物的吸附量為Img以上且IOOmg以下。
20.權(quán)利要求14所述的吸附體，其在壓縮5%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.01MPa以上且IMPa以下，壓縮10%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.03MPa以上且3MPa以下，以及壓縮15%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.06MPa以上且5MPa以下。
21.權(quán)利要求14所述的吸附體，其在壓縮5%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.02MPa以上且IMPa以下，壓縮10%時(shí)的壓縮應(yīng)力為0.06MPa以上且3MPa以下，以及壓縮15%時(shí)的壓縮應(yīng)力為·0.09MPa以上且5MPa以下。
22.權(quán)利要求14所述的吸附體，其樹脂含量為2%以上且50%以下。
23.權(quán)利要求14所述的吸附體，其體積平均粒徑為20μ m以上且1000 μ m以下。
24.一種精制方法，其中使用了權(quán)利要求14~23中任一項(xiàng)所述的吸附體。
25.權(quán)利要求24所述的精制方法，其中，使用直徑為0.5cm以上且高度為3cm以上的柱。
26.權(quán)利要求24所述的精制方法，其包括以100cm/h以上且1000cm/h以下的線速進(jìn)行通液的 工序。
【文檔編號】B01D15/08GK103816870SQ201410042852
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2008年12月3日
【發(fā)明者】河井義和, 川嵜宏明, 川原直美 申請人:株式會(huì)社鐘化, Jnc株式會(huì)社