檢測黃牛 Notch1 基因 SNP 位點的 RFLP 方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測黃牛Notch1基因SNP位點的RFLP方法及試劑盒，以黃牛血液全基因組DNA為模板，PCR擴增黃牛Notch1基因NICD區(qū)的一段序列，用限制性內(nèi)切酶HhaI消化PCR擴增產(chǎn)物，再對酶切后的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定Notch1基因NICD區(qū)單核苷酸多態(tài)性。該SNP位于功能非常重要的Notch1基因的NICD區(qū)，并且與黃牛多種重要經(jīng)濟性狀相關(guān)，本發(fā)明提供的檢測方法為Notch1基因的SNP與生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，可用于黃牛生長性狀的標記輔助選擇，以便于快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
【專利說明】檢測黃牛Notchl基因 SNP位點的RFLP方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及基于RFLP(限制性片段長度多態(tài)性）的 Notch跨膜受體家族1基因單核苷酸多態(tài)性（SNP)快速檢測。

【背景技術(shù)】
[0002] 單核苷酸多態(tài)性（SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸（A/T/C/G)的替 換而引起的多態(tài)性。SNP屬于第三代分子標記，具有密度高、雙等位基因、易實現(xiàn)自動化檢測 等優(yōu)點，由于SNP具有其它標記無法比擬的優(yōu)點，所以它作為一種研究工具已經(jīng)在生命科 學(xué)的各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
[0003] 近年來，人們發(fā)展了許多用于探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構(gòu)象多 態(tài)技術(shù)（SSCP)、直接測序技術(shù)和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁瑣、耗時長，結(jié)果受操作者主觀 因素影響大，而直接測序技術(shù)成本又較高。PCR-RFLP方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā) 現(xiàn)SNP位點后使用限制性內(nèi)切酶進行酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分析，就能準確地鑒 別SNP位點。PCR-RFLP方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、 假陽性的缺點，而且對所檢測的序列位點無特殊性要求。
[0004] Notch基因最早于1917年由Thomas Hunt Morgan在果蠅中發(fā)現(xiàn).因其功能部分 缺失會在果蠅翅膀的邊緣造成切跡而命名。Notch信號通路在細胞間的交流，形態(tài)發(fā)生，保 持穩(wěn)態(tài)，再生等方面起到至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。Notch信號的產(chǎn)生是通過相鄰細胞的Notch 配體與受體相互作用，Notch蛋白經(jīng)過三次剪切，由NI⑶(Notch細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域）釋放入胞 質(zhì)，并進入細胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，形成NI⑶/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而激活HES、HEY、 HERP等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basichelix-loop-helix, bHLH)轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的革巴基 因，發(fā)揮生物學(xué)作用。這些轉(zhuǎn)錄因子促進或抑制下游基因表達，從而促進細胞增殖和抑制細 胞分化。
[0005] 在成肌細胞中，降低內(nèi)源NI⑶可導(dǎo)致肌細胞標志基因表達增加，肌管融合加強， 促進肌細胞分化。對于黃牛育種來講，分析Notchl基因在牛肌肉分化中的機制，對于提高 黃牛的生長效率、提高肉產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的理論意義。
[0006] 目如國內(nèi)外未見關(guān)于牛Notchl基因遺傳變異的研究，由于Notchl基因功能涉及 肌肉分化和發(fā)育等重要生長性狀。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測黃牛Notchl基因 SNP位點的RFLP方法及試劑 盒。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0009] 檢測黃牛Notchl基因 SNP位點的RFLP方法，包括以下步驟：
[0010] 以黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，在Taq DNA聚合酶、Buffer (緩 沖環(huán)境）、Mg2+、dNTPs存在的情況下，進行PCR擴增，然后利用限制性內(nèi)切酶HhaI酶切PCR 擴增產(chǎn)物，再對酶切后片段進行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)分析電泳后片段大小， 鑒定黃牛Notchl基因單核苷酸多態(tài)性：
[0011] 電泳后片段為120bp時為AA基因型，電泳后片段為96bp和24bp時為GG基因型， 電泳后片段為120bp、96bp和24bp時為AG基因型，24bp因分子量太小而不可見，但不影響 基因型鑒定；
[0012] 所述的引物對P為：
[0013] 上游引物 F(SEQ. ID.N0. I) :5' -TGCATGGTGCCACCCTGGGCG-3'
[0014] 下游引物 R(SEQ. ID. NO. 2) :5' -TGGTGCTGGGCTTGCGGGCCTTCT-3，。
[0015]
[0016] 所述的PCR擴增的反應(yīng)體系為：25 μ L反應(yīng)體系包括0. 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 2.0yL(MBI，F(xiàn)ermentas)，10XBuffer 2.5yL(MBI，F(xiàn)ermentas)，25mmol/L MgCl2L 5 μ L (MBI, Fermentas)，2. 5mmol/L dNTPs 2· 5 μ L，50ng/μ L DNA 模板 1.0 μ L， 10 μ mol/L的上、下游引物各0. 25 μ L和滅菌超純水15. 0 μ L。
[0017] 所述的PCR擴增的反應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s， 72°C延伸40s，33個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0018] 所述的酶切在10 μ L HhaI酶切體系中進行，HhaI酶切體系包括5 μ L的PCR擴增 產(chǎn)物，I. 0 μ L 的 10 X T Buffer，I. 0 μ L 的 0· 1 % BSA，0· 5 μ L 的 IOU/ μ L 限制性內(nèi)切酶 HhaI 以及2. 5 μ L的ddH20,酶切條件為：37°C恒溫培養(yǎng)箱中消化5?8h。
[0019] 所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3. 0 %。
[0020] 檢測黃牛Notchl基因 SNP位點的試劑盒，包括lOymol/L的上、下游引物各 0. 25 μ L ：
[0021] 上游引物（SEQ. ID. NO. 1) :5，-TGCATGGTGCCACCCTGGGCG-3，
[0022] 下游引物（SEQ. ID. NO. 2) :5，-TGGTGCTGGGCTTGCGGGCCTTCT-3，。
[0023]
[0024] 所述試劑盒還包括 0· 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 2. 0 μ L (MBI, Fermentas)， IOXBuffer 2. 5 μ L(MBI, Fermentas), 25mmol/L MgCl2L 5 μ L(MBI, Fermentas), 2. 5mmol/L dNTPs 2. 5 μ L和滅菌超純水15. 0 μ L。
[0025] 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0026] 本發(fā)明提供的檢測方法為Notchl基因的SNP與中國黃牛生長性狀關(guān)系的建立奠 定了基礎(chǔ)，以便用于中國黃牛生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種 群。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為秦川牛Notchl基因48250SNP位點測序圖，箭頭所示為突變位點。
[0028] 圖2為PCR擴增產(chǎn)物HhaI酶切3. 0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，泳道1為 Marker (M);泳道2為AA基因型，表現(xiàn)為120bp ;泳道3為GG基因型，表現(xiàn)為96bp和24bp ; 泳道4為AG基因型，表現(xiàn)為120bp、96bp和24bp。

【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明，以使公眾對
【發(fā)明內(nèi)容】
有整體和充 分的了解，而并非對本發(fā)明保護范圍的限定。
[0030] 本發(fā)明根據(jù)Notchl基因 NI⑶區(qū)的序列設(shè)計引物，以包含50頭秦川?；蚪M樣本 的DNA池為模板，進行PCR擴增，測序后發(fā)現(xiàn)Notchl基因第48250位存在單核苷酸多態(tài)性， 參見圖1。當(dāng)Notchl基因第48250位的A突變?yōu)镚時形成錯義密碼子突變，即第13780位 氨基酸由His突變?yōu)锳rg。針對上述SNP位點，本發(fā)明通過設(shè)計引物進行PCR擴增，利用特 定的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，能夠簡單、快速、成本低、精確地檢測其單核苷酸的多態(tài)性。本 發(fā)明對448頭秦川牛的SNP基因型進行了檢測和基因頻率分析，對上述SNP位點與黃牛重 要生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該位點能夠作為提高黃牛生長性狀的分子標記。
[0031] 本發(fā)明利用PCR-RFLP方法對黃牛Notchl基因第48250位的單核苷酸多態(tài)性進行 檢測，下面對本發(fā)明做進一步的詳細說明。
[0032] 1.秦川牛血液樣本的采集
[0033] 本發(fā)明以地方黃牛品種秦川牛的種群作為檢測對象，具體采集樣本見表1 :
[0034] 表1秦川牛樣本的采集
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 檢測黃牛Notchl基因 SNP位點的RFLP方法，其特征在于：包括以下步驟： 以黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，進行PCR擴增，然后利用限制性內(nèi)切 酶Hhal酶切PCR擴增產(chǎn)物，再對酶切后片段進行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)分析 電泳后片段大小，鑒定黃牛Notchl基因單核苷酸多態(tài)性： 電泳后片段為120bp時為AA基因型，電泳后片段為96bp和24bp時為GG基因型，電泳 后片段為120bp、96bp和24bp時為AG基因型； 所述的引物對P為： 上游引物：5' -TGCATGGTGCCACCCTGGGCG-3' 下游引物：5' -TGGTGCTGGGCTTGCGGGCCTTCT-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測黃牛Notchl基因 SNP位點的RFLP方法，其特征在于：所 述的PCR擴增的反應(yīng)體系包括0.5U/iiL Taq DNA聚合酶2.0iiL，10XBuffer 2.5iiL， 25mmol/L MgCl2 1. 5 u L, 2. 5mmol/L dNTPs 2. 5 u L，50ng/ u L DNA 模板 1. 0 u L，10 u mol/L 的上、下游引物各0. 25 ii L和滅菌超純水15. 0 ii L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測黃牛Notchl基因 SNP位點的RFLP方法，其特征在于：所 述的PCR擴增的反應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸40s， 33個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測黃牛Notchl基因 SNP位點的RFLP方法，其特征在于：所 述的酶切在10 U L Hhal酶切體系中進行，Hhal酶切體系包括5 ii L的PCR擴增產(chǎn)物，1. 0 ii L 的 10XT Buffer，1. Oil L 的 0? 1% BSA，0. L 的 10U/ii L 限制性內(nèi)切酶 Hhal 以及 2. L 的ddH20,酶切條件為：37°C恒溫培養(yǎng)箱中消化5?8h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測黃牛Notchl基因 SNP位點的RFLP方法，其特征在于：所 述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3. 0 %。
6. 檢測黃牛Notchl基因 SNP位點的試劑盒，其特征在于：包括10 ii mol/L的上、下游 引物各0.25 iiL: 上游引物：5' -TGCATGGTGCCACCCTGGGCG-3' 下游引物：5' -TGGTGCTGGGCTTGCGGGCCTTCT-3'。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述檢測黃牛Notchl基因 SNP位點的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括〇.5"1^139〇嫩聚合酶2.〇1^，10\81^€612.5111，25臟〇1/1 MgCl2l. 5 ii L，2. 5mmol/L dNTPs 2. 5 ii L 和滅菌超純水 15. 0 ii L。
【文檔編號】C12Q1/68GK104498611SQ201410810765
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月22日
【發(fā)明者】陳宏 , 張晨歌 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)