專利名稱：一種rt-pcr檢測(cè)基因的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及RT-PCR檢測(cè)基因的處理與分析。
背景技術(shù)：
本發(fā)明是一種關(guān)于RT-PCR檢測(cè)基因的處理分析方法。適用于RT-PCR檢測(cè)基因相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)研究或基礎(chǔ)生物學(xué)研究。RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無(wú) 論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無(wú)RNA酶和基因組DNA的污染。用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT及基因特異性引物中的一種。對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可。由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA (cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)來(lái)完成。隨后，DNA的另一條鏈通過(guò)脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互補(bǔ)DNA。RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測(cè)某種RNA的含量。RT-PCR的關(guān)鍵步驟在是RNA的反轉(zhuǎn)錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。常用的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即鳥類成髓細(xì)胞性白細(xì)胞病毒(avian myeloblastosisvirus, AMV)反轉(zhuǎn)錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒(moloney murine leukemia vrius, MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶。RT-PCR有時(shí)候也會(huì)指代實(shí)時(shí)PCR (real-time PCR)。為了與逆轉(zhuǎn)錄PCR相區(qū)別，通常被寫作“定量 PCR”(quantitative PCR)或者 RTQ-PCR (real-time quantitative PCR)。本發(fā)明找到了一種RT-PCR檢測(cè)基因的分析的生物信息學(xué)方法，可直接針對(duì)RT-PCR檢測(cè)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以便于進(jìn)一步的深入挖掘其生物信息學(xué)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)對(duì)RT-PCR檢測(cè)基因進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理、層次聚類分析、差異基因篩選等生物信息學(xué)分析，形成一套用于RT-PCR檢測(cè)基因的分析方法，其基本流程如下步驟一基因檢測(cè)及原始數(shù)據(jù)的獲?。徊襟E二 層次聚類分析；步驟三對(duì)原始數(shù)據(jù)的預(yù)處理和均一化；步驟四差異表達(dá)基因的篩選；步驟五差異表達(dá)基因的pathway通路分析。


圖I 一種RT-PCR檢測(cè)基因分析的流程圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將以小鼠純合子、雜合子、野生型樣品為實(shí)例，介紹本發(fā)明的具體實(shí)施步驟。步驟一基因檢測(cè)及原始數(shù)據(jù)的獲取。小鼠樣品，分純合子、雜合子，野生型三個(gè)組，每組8個(gè)樣品，用RT-PCR檢測(cè)三組樣品kIT信號(hào)相關(guān)的32個(gè)基因的表達(dá)，每個(gè)基因3次重復(fù)。第一個(gè)基因(Actb)是內(nèi)參。獲得原始數(shù)據(jù)。步驟二 層次聚類分析。所有的基因表達(dá)值換算為2-ACt，作為層次聚類算法的輸入。其中距離(distance)米用 Euclidean distance,連接(linkage)米用 average。 步驟三對(duì)原始數(shù)據(jù)的預(yù)處理和均一化。軟件使用BioConductor(http://www.bioconductor.org/)。Actb作為對(duì)照,計(jì)算ACt。每個(gè)基因3次重復(fù)取平均值。最后基因相對(duì)表達(dá)量(fold change)換算為2-Δ ACt0步驟四差異表達(dá)基因的篩選。對(duì)于所有基因，利用ANOVA分析，篩選在組間有差異，組內(nèi)平行性良好的基因。篩選標(biāo)準(zhǔn)P<0.01。差異表達(dá)基因5個(gè)。步驟五差異表達(dá)基因的pathway通路分析。建立信號(hào)通路和生物功能網(wǎng)絡(luò)，將差異基因與相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行比較、整合，找出基因之間的相互關(guān)系。信號(hào)通路數(shù)據(jù)取自KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome, jp/keg/pathway, html)。一共涉及 7 個(gè) pathway。以上是對(duì)本發(fā)明的描述而非限定，基于本發(fā)明思想的其它實(shí)施方式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明找到了一種RT-PCR檢測(cè)基因的分析的生物信息學(xué)方法，可直接針對(duì)RT-PCR檢測(cè)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以便于進(jìn)一步的深入挖掘其生物信息學(xué)意義。通過(guò)對(duì)RT-PCR檢測(cè)基因進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理、層次聚類分析、差異基因篩選等生物信息學(xué)分析，形成一套用于RT-PCR檢測(cè)基因的分析方法，其基本流程如下 步驟一基因檢測(cè)及原始數(shù)據(jù)的獲取。
步驟二 層次聚類分析。
步驟三對(duì)原始數(shù)據(jù)的預(yù)處理和均一化。
步驟四差異表達(dá)基因的篩選。
步驟五差異表達(dá)基因的pathway通路分析。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)對(duì)RT-PCR檢測(cè)基因進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理、層次聚類分析、差異基因篩選等生物信息學(xué)分析，形成一套用于RT-PCR檢測(cè)基因的分析方法，其基本流程如下步驟一基因檢測(cè)及原始數(shù)據(jù)的獲?。徊襟E二層次聚類分析；步驟三對(duì)原始數(shù)據(jù)的預(yù)處理和均一化；步驟四差異表達(dá)基因的篩選；步驟五差異表達(dá)基因的pathway通路分析。
文檔編號(hào)G06F19/18GK102796809SQ20111013563
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2011年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月24日
發(fā)明者曾華宗 申請(qǐng)人:上海聚類生物科技有限公司