雞γ干擾素表達(dá)基因改造方法、利用該方法改造得到的基因的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種雞γ干擾素表達(dá)基因改造方法以及利用該方法改造得到的基因，上述方法及基因?qū)ｉT(mén)針對(duì)以大腸桿菌為宿主的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的基因改造方法是在雞γ干擾素天然表達(dá)基因的基礎(chǔ)上將其中大腸桿菌的稀有密碼子替換為非稀有密碼子，從而提升了大腸桿菌對(duì)雞γ干擾素及其衍生蛋白的表達(dá)效率。本發(fā)明所提供的基因，其表達(dá)的蛋白作為雞γ干擾素蛋白衍生物具有雞γ干擾素的活性且活性較天然雞γ干擾素高，同時(shí)它以可溶蛋白的形式高效表達(dá)，表達(dá)后最高可占表達(dá)蛋白的50％以上，無(wú)需包涵體變復(fù)性等操作，通過(guò)一步純化后純度可達(dá)到95％；生產(chǎn)周期短，成本低；還具有很好的免疫調(diào)節(jié)活性和抗病毒活性，為該雞γ干擾素的規(guī)?；a(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】雞Y干擾素表達(dá)基因改造方法、利用該方法改造得到的基 因

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雞Y干擾素表達(dá)基因改造方法、利 用該方法改造得到的基因。

【背景技術(shù)】
[0002] 干擾素是一種低分子量的可溶性蛋白，目前一般將干擾素分為I、II、III型，其結(jié) 構(gòu)、受體和來(lái)源有所區(qū)別，活性側(cè)重點(diǎn)也不同。干擾素功能主要有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗腫 瘤。而II型干擾素（IFN-Y)其免疫調(diào)節(jié)能力是I型干擾素的數(shù)百倍，又因其是機(jī)體自身 攜帶不會(huì)出現(xiàn)排異反應(yīng)，所以是理論上十分理想的免疫佐劑。
[0003] ChIFN-Y可增加單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面IgG Fc受體表達(dá)，從而參與免疫復(fù)合 物的清除、吞噬作用和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒（Antibody-dependent cell-mediated cyt〇t〇Xicity，ADCC)作用。ChIFN-γ能使抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)MHC-II類(lèi)抗原的數(shù)量顯著增 力口、增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用，增加輔助T細(xì)胞（T-helper cell，Th)的數(shù)量 和增強(qiáng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)（Delayed type hypersensity，DTH);能增強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞和自然 殺傷（Natural killer，NK)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力；能誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)IL-2受體，從而促進(jìn) T細(xì)胞增殖，進(jìn)一步擴(kuò)大免疫應(yīng)答。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種雞Y干擾素表達(dá)基因改造方法、 利用該方法改造得到的基因，以解決現(xiàn)有技術(shù)中利用大腸桿菌表達(dá)雞雞Y干擾素產(chǎn)率較 低的技術(shù)問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明解決的另一技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)對(duì)雞Y干擾素表達(dá)基因的改進(jìn)從而提升其所 表達(dá)的雞Y干擾素蛋白向胞外分泌的作用。
[0006] 本發(fā)明解決的又一技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)對(duì)雞Y干擾素表達(dá)基因的改進(jìn)從而便于其所 表達(dá)的雞Y干擾素蛋白后期純化。
[0007] 本發(fā)明解決的再一技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)提供利用上述改造基因表達(dá)雞Y干擾素的方 法，以提升表達(dá)效率。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 一種雞Y干擾素表達(dá)基因改造方法，該方法在雞Y干擾素天然表達(dá)基因的基礎(chǔ) 上以大腸桿菌非稀有密碼子替換其中的大腸桿菌稀有密碼子。
[0010] 優(yōu)選的，所述雞Y干擾素表達(dá)基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)N端對(duì)應(yīng)的核苷酸上連接有信 號(hào)肽或利用表達(dá)載體上的信號(hào)肽。
[0011] 優(yōu)選的，所述雞Y干擾素表達(dá)基因末端具有標(biāo)簽蛋白；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)選 的：所述標(biāo)簽蛋白可以是His標(biāo)簽、Arg標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽或GST標(biāo)簽的其中一種。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種利用上述方法改造得到的雞Y干擾素表達(dá)基因，其核苷酸 序列如SEQ ID N02所示。
[0013] 同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種利用該基因表達(dá)雞Y干擾素方法，包括以下步驟：將 該基因插入表達(dá)載體中，而后將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌，以異丙基-β -D-硫代吡喃 半乳糖苷為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)濃度為〇. 1?lmm〇l/L，誘導(dǎo)溫度為16?37°C，誘導(dǎo) 表達(dá)時(shí)間為3?16小時(shí)。
[0014] 優(yōu)選的，所述表達(dá)載體是pBV220、pET系列載體或pQE系列載體的任一種；在此基 礎(chǔ)上更優(yōu)的，所述表達(dá)載體是pET-28a (+)。
[0015] 優(yōu)選的，所述大腸桿菌是大腸桿菌DH5 α、大腸桿菌BL21 (DE3)或大腸桿菌JM109。
[0016] 本發(fā)明提供的方法及基因?qū)ｉT(mén)針對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)，尤其是以大腸桿菌為宿主的表 達(dá)系統(tǒng)，因此本發(fā)明的基因改造方法是在雞Y干擾素天然表達(dá)基因的基礎(chǔ)上將其中大腸 桿菌的稀有密碼子替換為非稀有密碼子，從而提升了大腸桿菌對(duì)雞Y干擾素及其衍生蛋 白的表達(dá)效率。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過(guò)對(duì)雞Y干擾素表達(dá)基因密碼子的取代、添加或缺 失實(shí)現(xiàn)了改造后基因所表達(dá)的蛋白具有雞Y干擾素的生物活性。此外，本發(fā)明通過(guò)在雞Y 干擾素表達(dá)基因上增加信號(hào)肽基因從而使得所表達(dá)蛋白N端連接有信號(hào)肽，進(jìn)而促進(jìn)蛋白 分泌到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中。此外，本發(fā)明通過(guò)在雞Y干擾素表達(dá)基因上增設(shè)標(biāo)簽蛋白基 因從而使得所表達(dá)的蛋白N端或C端連接有標(biāo)簽蛋白，進(jìn)而便于后期分離純化。
[0017] 本發(fā)明提供的序列如SEQ ID Ν02所示的基因與雞Y干擾素天然表達(dá)基因的核苷 酸數(shù)量均為438個(gè)，所表達(dá)的蛋白其氨基酸數(shù)量相同，但二者序列存在一定程度的差異。本 發(fā)明SEQ ID Ν02所示基因表達(dá)的蛋白作為雞γ干擾素蛋白衍生物具有雞γ干擾素的活性 且活性較天然雞Y干擾素高，同時(shí)它以可溶蛋白的形式高效表達(dá)，表達(dá)后最高可占表達(dá)蛋 白的50%以上，無(wú)需包涵體變復(fù)性等操作，通過(guò)一步純化后純度可達(dá)到95% ;生產(chǎn)周期短， 成本低；還具有很好的免疫調(diào)節(jié)活性和抗病毒活性，為該雞Y干擾素的規(guī)模化生產(chǎn)奠定了 良好的基礎(chǔ)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是雞Y干擾素天然表達(dá)基因（ChIFN-Y-N)與本發(fā)明SEQ ID Ν02序列 (ChIFN-γ-0)對(duì)比圖；
[0019] 圖2是天然雞Y干擾素氨基酸序列與本發(fā)明SEQ ID Ν03序列對(duì)比圖；
[0020] 圖3是瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)ChIFN- Y -0基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中M為Marker， LI為PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，L2為陰性對(duì)照；
[0021] 圖4 =SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)后與未經(jīng)誘導(dǎo)的ChIFN-Y-O蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié) 果，其中Ml為非預(yù)染蛋白Marker，M2為預(yù)染蛋白Marker ;L1為未誘導(dǎo)的對(duì)照組，L2為誘導(dǎo) 后菌體的全誘導(dǎo)產(chǎn)物，L3、L4依次為誘導(dǎo)后菌體破碎沉淀和上清；
[0022] 圖5 :SDS_PAGE檢測(cè)ChIFN- Y -0蛋白的陽(yáng)離子交換層析純化結(jié)果，其中M為非預(yù) 染蛋白Marker，Ll為純化前的樣品，L2為上樣流穿液，L3為T(mén)ris-HCl洗滌，L4為0. 2 M NaCl洗滌，L5為0. 5M NaCl洗脫產(chǎn)物（即ChIFN- γ -0蛋白），L6為0. 2 M NaCl洗滌；
[0023] 圖6 :禽流感疫苗和（或）ChIFN- Y -0蛋白免疫后，HI抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果；
[0024] 圖7 :新城疫疫苗和（或）ChIFN- Y -0蛋白免疫后，HI抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果；
[0025] 圖8 :法氏囊滅活疫苗和（或）ChIFN- Y -0蛋白免疫后，HI抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下將對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過(guò)多不必要的細(xì)節(jié)，在 以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0027] 以下實(shí)施例中所使用的近似性語(yǔ)言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情 況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用"大約"、"左右"等語(yǔ)言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn) 確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，"大約"表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十（10%)的 范圍內(nèi)變化，比如，"大約1〇〇"表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在"大約第 一數(shù)值到第二數(shù)值"的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近 似性語(yǔ)言可能與測(cè)量?jī)x器的精度有關(guān)。
[0028] 除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員普遍理解的相同含義。
[0029] 以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果 取平均值；以下實(shí)施例中的％，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 本實(shí)施例描述了本發(fā)明提供的天然的雞Y干擾素（ChIFN- γ -N)基因與優(yōu)化的雞 Y干擾素（ChIFN-γ-Ο)基因的獲得方法。
[0032] 根據(jù)GeneBank中FJ788637的mRNA序列，在去除信號(hào)肽序列后，即為本發(fā)明提供 的天然的雞Y干擾素（ChIFN-Y-N)基因的核苷酸序列（見(jiàn)SEQ ID N01)。
[0033] 通過(guò)大腸桿菌（E. coli)密碼子分析軟件的分析，并根據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼子的偏 愛(ài)性，對(duì)天然的雞Y干擾素（ChIFN-Y-N)基因進(jìn)行了替換稀有密碼子、調(diào)節(jié)GC含量等優(yōu) 化；天然的Y干擾素在C端含有兩個(gè)半胱氨酸，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)半胱氨酸對(duì)干擾素 的生物活性并無(wú)影響。所以優(yōu)化基因，使其突變成性質(zhì)類(lèi)似的絲氨酸。通過(guò)以上優(yōu)化，即獲 得了優(yōu)化后的雞Y干擾素（ChIFN-Y-O)基因（見(jiàn)SEQ ID N01)，使其能夠在大腸桿菌中高 效表達(dá)。
[0034] 實(shí)施例2
[0035] 本實(shí)施例描述了含ChIFN- Y -0基因的重組質(zhì)粒與工程菌的構(gòu)建。
[0036] 一、ChIFN- Y -0 基因的擴(kuò)增
[0037] 根據(jù)上述ChIFN-Y-0基因序列，利用Primer Premire軟件設(shè)計(jì)引物，同時(shí)分別在 引物的5'端引入Nco I酶切位點(diǎn)，3'端引入Hind III酶切位點(diǎn)：
[0038] 上游引物（Fl) :5'-CCATGGGTCATACCGCAAGCAGCCTG-3'（劃線部分為 Nco I 酶切位 點(diǎn)）；
[0039] 下游引物（Rl) :5' -AAGCTTTTAGCTATTGCTACGACGC-3' (劃線部分為 Hind III 酶切 位點(diǎn)）。
[0040] 以合成的ChIFNi -0基因序列為模板，以Fl和Rl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體 系含模板lug，上下游引物各ΙμΜ，總反應(yīng)體系是50μ? ;反應(yīng)條件為：94°C、5min;94°C、 30sec，54°C、30sec，72°C、45sec，30 個(gè)循環(huán)；72°C，10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) L 5%瓊脂糖凝膠電 泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如附圖3所示。其中，M為Marker，Ll為PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，L2號(hào)為陰 性對(duì)照，結(jié)果表明在450bp左右有清晰條帶。
[0041] 二、重組質(zhì)粒及工程菌的構(gòu)建
[0042] 1.使用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。
[0043] 2.用限制性內(nèi)切酶Nco I和Hind III雙酶切已回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn) 物；
[0044] 3.用限制性內(nèi)切酶Nco I和Hind III雙酶切表達(dá)載體pET-28a(+)，利用DNA回 收試劑盒回收載體骨架；
[0045] 4.將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架，用T4 DNA連接酶16°C連接過(guò)夜，即 得到連接產(chǎn)物；
[0046] 5.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR和酶切 鑒定：1)菌落PCR使用引物為Fl和Rl，結(jié)果在450bp左右有清晰單一條帶的菌落為陽(yáng)性菌 落；2)酶切鑒定所用的酶為限制性內(nèi)切酶Nco I和Hind III，同時(shí)在450bp和5300bp左右 有清晰單一條帶的菌落為陽(yáng)性菌落；3)將以上檢定結(jié)果都為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒交由華大基 因進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序正確的即為目的重組質(zhì)粒,命名為ChIFN- γ -pET-28a。
[0047] 6.將重組質(zhì)粒ChIFN- γ -pET-28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，后篩選單菌 落，并進(jìn)行酶切驗(yàn)證。結(jié)果為陽(yáng)性的菌落，即為目的重組工程菌，命名為的宿主菌為 BL21 (DE3)-ChIFN-y-pET-28a(+) 〇
[0048] 實(shí)施例3
[0049] 本實(shí)施例描述了重組工程菌BL21(DE3)-ChIFN-Y-pET-28a(+)的誘導(dǎo)表達(dá)，及其 表達(dá)的重組雞Y干擾素（ChIFN-Y-O)的純化。
[0050] 一、重組工程菌 BL21(DE3)-ChIFN-Y-pET-28a(+)的誘導(dǎo)表達(dá)
[0051] 1.將重組工程菌BL21(DE3)-ChIFN-Y-pET-28a(+)接種于IOOmL含氨芐抗性 (Kan +)的液體LB培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm的搖床上震蕩培養(yǎng)，至OD6c?值為0. 8時(shí)，添加 誘導(dǎo)物IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，終濃度0. 5mM) 180rpm繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo) 時(shí)間為5小時(shí)；同時(shí)設(shè)對(duì)照組，除不加誘導(dǎo)物IPTG外，其他操作相同。
[0052] 2.分別取誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的發(fā)酵培養(yǎng)液各取5mL，8000-10000rpm離心20min收集菌 體。然后加入500 μ L Tris-HCl (PH 7. 9)重懸菌體，超聲破碎后，HOOOg離心lOmin，分別 收集上清與沉淀（沉淀依然使用500 μ L Tris-HCl重懸）。
[0053] 3.取以上4種樣品各60 μ L，分別加入20 μ L 4Χ蛋白上樣緩沖液（含DTT)，混勻 后煮沸5-10分鐘。然后各上樣10 μ L進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖4所示， 誘導(dǎo)后（L2-L4)在16kD左右處出現(xiàn)一條蛋白條帶，與預(yù)期大小相符；ChIFN-γ-O蛋白的表 達(dá)占全部菌體蛋白的50 %左右，可溶性表達(dá)的ChIFN- γ -O蛋白占全部可溶蛋白的47 %左 右。
[0054] 二、重組雞Y干擾素（ChIFN-γ-Ο)的純化
[0055] 1.收集菌體后，每100 mg菌體（濕重）加入1-5 mL Tris-HCl (PH 7. 9)重懸，超 聲裂解菌體。
[0056] 2. 14000g、4°C離心10分鐘，收集離心上清液。
[0057] 3.使用蛋白監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)，以50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)沖洗層析柱至平衡后，即可 開(kāi)始上樣。用50mM Tris-HCKpH = 8. 0)將菌體裂解液等倍稀釋后負(fù)載上柱，流速為2mL/ min〇
[0058] 4.使用50mM Tris-HCl (pH = 8· 0)沖洗柱子，洗去雜蛋白，流速為4mL/min。
[0059] 5.使用 0· 2M NaCl (50mM Tris-HCl，pH = 8. 0)洗滌雜蛋白，流速為 4mL/min。
[0060] 6.使用 0· 5M NaCl (50mM Tris-HCl，pH = 8. 0)洗脫目的蛋白，流速為 4mL/min。 收集洗脫峰。
[0061] 7.使用 IM NaCl (50mM Tri s-HCl，pH = 8. 0)徹底洗凈柱上蛋白。
[0062] 8.純化過(guò)程中每步需各取60yL的樣品，分別加入20yL 4X蛋白上樣緩沖液 (含DTT)，混勻后煮沸5-10分鐘。然后各上樣10 μ L進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，電泳檢測(cè)結(jié) 果如圖5所示。結(jié)果顯示，洗脫收集的ChIFN-Y-O蛋白，純度能夠達(dá)到95%以上（圖5， L5)。
[0063] 實(shí)施例4
[0064] 本實(shí)施例描述了重組雞Y干擾素（ChIFN-Y-O)蛋白的體內(nèi)和體外測(cè)活，顯示了 其對(duì)雞體的免疫功能調(diào)節(jié)，從而增強(qiáng)了多種禽類(lèi)疫苗的免疫效果；同時(shí)也顯示了一定的抗 病毒活性。這些禽類(lèi)疫苗包括禽流感病毒，新城疫病毒，法氏囊病毒。按方差分析法對(duì)數(shù)據(jù) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，顯著水平為Ρ〈〇. 05。
[0065] 一、重組蛋白的體外活性檢測(cè)
[0066] 根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中豬白細(xì)胞干擾素的效價(jià)檢驗(yàn)方 法（細(xì)胞病變抑制法）進(jìn)行生物學(xué)特性的體外活性檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表達(dá)的目的蛋白具 有生物活性。
[0067] 二、重組蛋白的體內(nèi)活性檢測(cè)
[0068] 1.與禽流感二價(jià)苗聯(lián)合免疫
[0069] 禽流感Η5、Η9二價(jià)油苗與重組干擾素聯(lián)合免疫7日齡的SPF雞。將SPF雞分為4 組，每組30只，具體免疫方法見(jiàn)表1，免疫方式為右胸皮下注射。
[0070] 每組分別于免疫后第0、7、14、28、35、42日進(jìn)行翅靜脈采血，分離血清，檢測(cè)血凝 抑制效價(jià)，結(jié)果表明干擾素組可以較早產(chǎn)生抗體，且抗體水平明顯高于疫苗組，維持時(shí)間也 較長(zhǎng)，具體結(jié)果見(jiàn)圖6。
[0071] 免疫后28天（35日齡），通過(guò)點(diǎn)眼途徑攻毒，每只0.5ml毒液，觀察并記錄雞群的 精神狀態(tài)、飲食情況及死亡情況，并對(duì)病死雞進(jìn)行剖檢并記錄病理變化，于攻毒第3日、5日 和7日，采集喉頭和泄殖腔拭子樣本，進(jìn)行病毒分離。
[0072] 表1禽流感免疫試驗(yàn)分組及免疫情況（AIV)
[0073]

【權(quán)利要求】
1. 一種雞Y干擾素表達(dá)基因改造方法，其特征在于：在雞Y干擾素天然表達(dá)基因的 基礎(chǔ)上以大腸桿菌非稀有密碼子替換其中的大腸桿菌稀有密碼子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞Y干擾素表達(dá)基因改造方法，其特征在于：所述雞Y 干擾素表達(dá)基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)N端對(duì)應(yīng)的核苷酸上連接有信號(hào)肽或利用表達(dá)載體上的 信號(hào)肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞Y干擾素表達(dá)基因改造方法，其特征在于：所述雞Y 干擾素表達(dá)基因末端具有標(biāo)簽蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雞Y干擾素表達(dá)基因改造方法，其特征在于所述標(biāo)簽蛋 白為His標(biāo)簽、Arg標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽或GST標(biāo)簽的其中一種。
5. -種利用權(quán)利要求1所述方法改造得到的雞Y干擾素表達(dá)基因，其核苷酸序列如 SEQ ID N02 所示。
6. -種利用權(quán)利要求5所述基因表達(dá)雞Y干擾素方法，其特征在于包括以下步驟：將 該基因插入表達(dá)載體中，而后將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌，以異丙基-3 -D-硫代吡喃 半乳糖苷為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)濃度為〇. 1?lmm〇l/L，誘導(dǎo)溫度為16?37°C，誘導(dǎo) 表達(dá)時(shí)間為3?16小時(shí)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述表達(dá)載體是pBV220、pET系列載體或 PQE系列載體的任一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述表達(dá)載體是pET-28a (+)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述大腸桿菌是大腸桿菌DH5ci、大腸桿菌 BL21(DE3)或大腸桿菌JM109。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104404051SQ201410811261
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月22日
【發(fā)明者】侯偉宏, 王甜, 梁武, 蘇建東, 楊保收 申請(qǐng)人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司