專(zhuān)利名稱(chēng)：Gasci基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新基因，更具體涉及位于人食道鱗狀細(xì)胞中的染色體p23-24區(qū)域的新基因，并通過(guò)這些細(xì)胞的惡變可觀察到所述基因的擴(kuò)增和過(guò)量的基因產(chǎn)物的表達(dá)。
食道癌在全世界癌癥死因中排名第6(Pisani，P.等，Int.J.Cancer，83，18-29(1999))。食道癌組織中所發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)主要組織病理學(xué)類(lèi)型的腫瘤是鱗狀細(xì)胞癌和腺癌。鱗狀細(xì)胞癌在日本和其他國(guó)家一樣是最常見(jiàn)的類(lèi)型(公共福利白皮書(shū)(Public Welfare White Paper)1999)。
已經(jīng)鑒定出有若干種基因修飾涉及食道鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移(包括MYC、EGFR和CCND1的擴(kuò)增)(Lu，S.H.等，Int.J.Cancer，42，502-505(1988)；Jiang，W.等，Cancer Res.，52，2980-2983(1992))。
基于比較基因組雜交技術(shù)(CGH；Kallioniemi等，Science，258，818-821(1992))的最新研究已揭示出食道鱗狀細(xì)胞癌中至少有10個(gè)擴(kuò)增區(qū)域(Pack，S.D.，Genes Chromosomes Cancer，25，160-168(1999)；Shinomiya，T.等，Genes Chromosomes Cancer，24，337-344(1999)；DuPlessis，L.等，Cancer Res.，59，1877-1883(1999))。然而，在那些被檢測(cè)的染色體擴(kuò)增區(qū)域中未鑒定出涉及食道鱗狀細(xì)胞癌的基因。
本發(fā)明人在29種食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中搜索異常DNA拷貝數(shù)，結(jié)果檢測(cè)到數(shù)種新的擴(kuò)增區(qū)域。這些擴(kuò)增區(qū)域在染色體區(qū)域9p23-24中頻繁出現(xiàn)可得到證實(shí)。
另一方面，有報(bào)道染色體區(qū)域9p23-24中的基因組變化與各種惡性腫瘤相關(guān)，如非小細(xì)胞肺癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳腺癌、骨肉瘤以及縱隔B細(xì)胞淋巴瘤(Knuutila，S.等，Am.J.Pathol.，152，1107-1123(1998))。
從此報(bào)告可推斷出不管什么組織類(lèi)型在上述染色體區(qū)域9p23-24中可發(fā)現(xiàn)由于擴(kuò)增激活一個(gè)或幾個(gè)基因作為致癌基因起作用的可能性。
在該說(shuō)明書(shū)中，本發(fā)明的基因(DNA分子)有時(shí)稱(chēng)為“GASC1基因”，由GASC1基因所編碼的蛋白稱(chēng)為“GASC1蛋白”，以及此蛋白的功能活性稱(chēng)為“GASC1活性”。
基于上述研究結(jié)果所開(kāi)發(fā)的本發(fā)明提供了下列主題(1)-(20)(1)包含下列多核苷酸(a)-(d)中一種的被分離的DNA分子。
(a)編碼由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸；(b)與SEQ ID NO2所示核苷酸序列比較具有至少95％同源性的多核苷酸；(c)在嚴(yán)格條件下能與SEQ ID NO2所示的核苷酸序列雜交的多核苷酸；(d)與上述多核苷酸(a)或(b)互補(bǔ)的多核苷酸。
(2)如上(1)所述的被分離的DNA分子，其是編碼由SEQ IDNO1所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸。
(3)如上(2)所述的被分離的DNA分子，其具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
(4)包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的表達(dá)產(chǎn)物。
(5)包含如上(1)或(3)所述的被分離的DNA分子的重組表達(dá)載體。
(6)內(nèi)含如上(5)所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
(7)一種GASC1檢測(cè)用探針，其具有包含來(lái)自SEQ ID NO2所示核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
(8)如上(7)所述的GASC1檢測(cè)用探針，其具有包含來(lái)自SEQ ID NO2所示核苷酸序列的至少30個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
(9)癌癥診斷劑，其包含如上(7)或(8)所述的探針作為活性成分。
(10)癌癥診斷試劑盒，其包含如上(7)或(8)所述的探針。
(11)抗體或抗體片段，其能與如上(1)所述的被分離的DNA分子的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合。
(12)診斷癌癥的方法，其包含下列步驟制備生物樣品，制備如上(11)所述的抗體或其片段，以及將上述樣品與上述抗體或片段進(jìn)行免疫反應(yīng)并且檢測(cè)樣品中的免疫反應(yīng)產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供下列主題(13)-(20)
(13)能表達(dá)如上(4)所述的表達(dá)產(chǎn)物的克隆的cDNA及其等價(jià)物，例如，對(duì)上述表達(dá)產(chǎn)物的修飾進(jìn)行編碼的cDNA，所述修飾通過(guò)在表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列中缺失、替換或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而衍生并與上述表達(dá)產(chǎn)物具有相同的活性，以及與這種cDNA具有某種水平的同源性的同系物。
(14)一種序列的反義核苷酸，該序列包含來(lái)自SEQ ID NO2所示核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。
(15)如上(14)所述的反義核苷酸，其反義于一種序列，該序列包含來(lái)自SEQ ID NO2所示核苷酸序列的至少30個(gè)連續(xù)核苷酸。
(16)基因治療劑，其包含如上(14)或(15)所述的反義核苷酸作為活性成分。
(17)(a)包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的蛋白或(b)包含修飾的氨基酸序列的蛋白，所述修飾的氨基酸序列通過(guò)缺失、替換或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而衍生自SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述蛋白在活性上等價(jià)于包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白。
(18)篩選一種或多種物質(zhì)(激動(dòng)劑和/或拮抗劑)的方法，所述一種或多種物質(zhì)能與如上(1)所述的被分離的DNA分子的表達(dá)產(chǎn)物相互作用，所述方法包含下列步驟在含有待篩選的測(cè)試物質(zhì)的培養(yǎng)基中對(duì)含有如上(1)所述的被分離的DNA分子的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后定量如上(1)所述的被分離的DNA分子的表達(dá)產(chǎn)物。
(19)如上(1)所述的被分離的DNA分子的同源染色體，其分離自選自人、狗、猴、馬、豬、羊和貓物種的哺乳動(dòng)物。
(20)用于癌癥的治療劑，其包含有效量的如上(11)所述的抗體或其片段以及可藥用載體。
說(shuō)明書(shū)中氨基酸、肽、核苷酸序列、核酸(核苷酸)等以縮寫(xiě)表示，與IUPAC-IUB建議的規(guī)則、“專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中核苷酸序列和/或氨基酸序列撰寫(xiě)指南(Guideline for drafting patent specifications etc.relativeto nucleotide sequences and/or amino acid sequences)”(日本專(zhuān)利局編寫(xiě))以及本領(lǐng)域中有關(guān)密碼或符號(hào)用途的慣例一致。
本發(fā)明人采用29種食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系實(shí)施了CGH(比較基因組雜交(comparative genomic hybridization))，結(jié)果證實(shí)在這些細(xì)胞系中的染色體區(qū)域9p23-24出現(xiàn)了新腫瘤相關(guān)的基因。
本發(fā)明人還以YAC(酵母人工染色體)和PAC(P1人工染色體)為探針進(jìn)行了熒光原位雜交(FISH)以及DNA印跡分析，為9p23-24擴(kuò)增子(擴(kuò)增區(qū)域)繪制基因圖譜。
本發(fā)明人進(jìn)一步進(jìn)行了RNA印跡分析用于篩選擴(kuò)增子或其轉(zhuǎn)錄物中出現(xiàn)的靶基因。以這種方式，本發(fā)明人成功克隆了在若干種食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中擴(kuò)增和過(guò)量表達(dá)的新基因，并因此獲得了GASC1基因的克隆。
在從外科手術(shù)切除的腫瘤中建立了食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(KYSE系列)的CGH之后，本發(fā)明的GASC1基因在染色體區(qū)域9p23-24中顯示了高水平的擴(kuò)增。根據(jù)RNA印跡結(jié)果，僅IMAGE克隆131865(cDNA克隆含有部分GASC1序列)在9p23-24上表現(xiàn)擴(kuò)增的細(xì)胞系中顯示了過(guò)量的表達(dá)。
本發(fā)明GASC1基因的核苷酸序列的確定按下列程序進(jìn)行。從胃癌細(xì)胞系(HSC39)-衍生的RNA中構(gòu)建兩個(gè)cDNA文庫(kù)，使用IMAGE克隆131865作為探針篩選cDNA文庫(kù)，然后確定如此分離的陽(yáng)性克隆的核苷酸序列。
本發(fā)明的GASC1基因指定為具有編碼SEQ ID NO1所示的1056個(gè)氨基酸殘基的可讀框的基因。
根據(jù)由本發(fā)明的GASC1基因編碼的氨基酸序列所計(jì)算的分子量為120.0kDa。
根據(jù)先前報(bào)道，在大范圍的人類(lèi)癌癥包括食道鱗狀細(xì)胞癌中都觀察到染色體區(qū)域9p中的遺傳改變?；谳^早對(duì)食道鱗狀細(xì)胞癌的分子遺傳學(xué)研究的結(jié)果，區(qū)域9p23-24引人關(guān)注。該區(qū)域尤其包括編碼細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)的激酶4/6的抑制劑的MTS1(p16/CDKN2A)，所述細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)的激酶4/6阻遏地調(diào)節(jié)增殖細(xì)胞的G1/S過(guò)渡階段(Tanaka，H.等，Int.J.Cancer，70，437-442(1997))。
使用CGH和FISH(Inazawa，J.等，Jpn J.Cancer Res.，83，1248-1252(1992))的最新研究已表明如同在其他種類(lèi)的腫瘤中，DNA擴(kuò)增也經(jīng)常在食道鱗狀細(xì)胞癌中的區(qū)域9p23-24中出現(xiàn)(Sonoda，G.等，GenesChromosomes Cancer，20，320-328(1997)；Taguchi，T.等，GenesChromosomes Cancer，20，208-212(1997)；Giollant，M.等，Hum.Genet.，98，265-270(1996)；Fischer，U.等，Eur.J.Cancer，30，1124-1127(1994)；Sevelyeva，L.等，Cancer Res.，58，863-866(1998))。
在對(duì)上述區(qū)域9p23-24中的DNA擴(kuò)增的各種報(bào)道及相關(guān)報(bào)道中，有下列發(fā)現(xiàn)和文獻(xiàn)記載等。
人卵巢癌的CGH分析已揭示出9p21-pter是那些位點(diǎn)之一，其中容易出現(xiàn)拷貝數(shù)的增加。該分析的結(jié)果還說(shuō)明九分之一的情況顯示了特異的9p24擴(kuò)增，并進(jìn)一步說(shuō)明上述擴(kuò)增更傾向于在腫瘤的發(fā)展階段頻繁出現(xiàn)(Sonoda，G.等，Genes Chromosomes Cancer，20，320-328(1997))。
在乳腺癌、肺癌、晚期星細(xì)胞瘤以及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中也觀察到了9p23-24區(qū)域擴(kuò)增(Taguchi，T.等，Genes Chromosomes Cancer，20，208-212(1997)；Giollant，M.等，Hum.Genet.，98，265-270(1996)；Fischer，U.等，Eur.J.Cancer，30，1124-1127(1994)；Sevelyeva，L.等，Cancer Res.，58，863-866(1998))。
乳腺癌細(xì)胞系COLO824顯示DNA拷貝數(shù)增加了大約10倍，其出現(xiàn)在p16/CDKN2A終端的9p23-24區(qū)域中(Sevelyeva，L.等，CancerRes.，58，863-866(1998))。此外，在患有乳腺癌的三個(gè)兄弟中報(bào)道了9p23-24區(qū)域的豐余以及BRCA2的突變(Sevelyeva，L.等，Cancer Res.，58，863-866(1998))。
考慮這些報(bào)告暗示區(qū)域9p23-24與多種腫瘤種類(lèi)有關(guān)，并具有至少一種腫瘤相關(guān)基因。
GASC1蛋白具有一個(gè)PX結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)PHD指狀結(jié)構(gòu)。
PX結(jié)構(gòu)域以各種蛋白出現(xiàn)。該基元可參與蛋白-蛋白的相互作用(Lock，P.，EMBO J.，17，4346-4357(1998))。然而，其功用仍未得到充分鑒定。
PHD指狀結(jié)構(gòu)是一種鋅指狀序列，已被廣泛發(fā)現(xiàn)在與染色質(zhì)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)的核蛋白中，如果蠅tr1基因產(chǎn)物和pc1基因產(chǎn)物(Aasland，R.等，Trends Biochem.Sci.，20，56-59(1995))。
近來(lái)，轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白TIF1(轉(zhuǎn)錄中介因子1)、染色質(zhì)-相關(guān)的乙?；D(zhuǎn)移酶MOZ(單核細(xì)胞白血病鋅指蛋白)以及若干種含有皮肌炎特異的自身抗原Mi2的含PHD指狀結(jié)構(gòu)蛋白已被鑒定(Venturini，L.等，18，1209-1217(1999)；Borrow，J.等，Nat.Gene，14m 33-41(1996)；Zhang，Y.，Cell，95，279-289(1998))。
TIF1家族蛋白(α，β，γ)被認(rèn)為在細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用(Venturini，L.等，18，1209-1217(1999))。另一方面，在擁有組蛋白脫乙?；D(zhuǎn)移酶和改變核小體活性的復(fù)合體中發(fā)現(xiàn)了Mi2，并參與了染色質(zhì)改組。Mi2中的PHD指狀結(jié)構(gòu)似乎要求Mi2和組蛋白脫乙?；D(zhuǎn)移酶的直接相互作用(Zhang，Y.，Cell，95，279-289(1998))。
PHD基元也保留在若干原癌基因中。HRX/ALL1/MLL(HRX人trithorax；ALL急性原淋巴細(xì)胞白血??；MLL混合血統(tǒng)白血病)是trx的人同源染色體，經(jīng)常在兒童的急性淋巴細(xì)胞白血病中發(fā)生變化(Tkachuk，D.C.等，Cell，71，691-700(1992))。而且，trx的另一人同源染色體MLL2的擴(kuò)增已在衍生自各種實(shí)體組織的腫瘤細(xì)胞系中被觀察到(Huntsman，D.G.等，Oncogene，18，7975-7984(1999))。
在乳腺癌中始終如一地被觀察到PLU-1的表達(dá)；然而，其表達(dá)在正常組織中受到高度限制(Lu，P.等，J.Biol.Chem.，274，15633-15645(1999))。
在來(lái)自患有自身免疫疾病如APECED(自身免疫的多內(nèi)分泌病-白假絲酵母病-外胚層的營(yíng)養(yǎng)不良)的病人的DNA中已發(fā)現(xiàn)AIRE基因的PHD指狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的突變(The Finnish-German APECED Consortium.Nat.Genet.，17，399-403(1997))。
在急性骨髓白血病的情況下，發(fā)現(xiàn)MOZ基因與CBP基因融合[t(8；16)(p11；p14)](Borrow，J.等，Nat.Genet.，14，33-41(1996))。已有報(bào)道在兒童乳頭狀甲狀腺癌的情況下，RET受體酪氨酸激酶基因與Tif1的融合(Klugbauer，S.，Rabes，H.M.，Oncogene，18，4388-4393(1999))。
具有由本發(fā)明GASC1基因編碼推導(dǎo)的氨基酸序列的GASC1蛋白包含兩個(gè)PHD指狀結(jié)構(gòu)基元。如上所述，由于PHD指狀結(jié)構(gòu)基元存在于染色質(zhì)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄區(qū)域相關(guān)的核蛋白以及許多原癌基因中，因此過(guò)量表達(dá)的GASC1蛋白被認(rèn)為在腫瘤發(fā)生和/或各種腫瘤包括食道鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
進(jìn)一步，根據(jù)以下這些事實(shí)即PHD基元存在于許多原癌基因中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)食道鱗狀細(xì)胞癌中有9p23-24區(qū)域的擴(kuò)增，具有9p23-24區(qū)域擴(kuò)增的傾向，尤其在腫瘤發(fā)展階段是普遍現(xiàn)象，以及如上所述在乳腺癌、肺癌、晚期星細(xì)胞瘤以及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中也觀察到了9p23-24區(qū)域擴(kuò)增，可以認(rèn)為本發(fā)明的GASC1基因編碼含PHD基元的GASC1蛋白，在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。
另外，如本發(fā)明下文所述，GASC1蛋白與鱗狀細(xì)胞癌如食道癌相關(guān)，因此依據(jù)推測(cè)本發(fā)明的基因?qū)儆谂c這些癌癥相關(guān)的基因組別。
本發(fā)明的基因可調(diào)節(jié)各種細(xì)胞或在其中的增殖、分化、腫瘤發(fā)生以及轉(zhuǎn)錄激活等，并且依據(jù)這些活性，其可用于與這些活性相關(guān)疾病如惡性腫瘤的病理學(xué)解釋、診斷和治療等。
本發(fā)明基因的全部或部分可用于生產(chǎn)能夠與基因表達(dá)產(chǎn)物(蛋白)結(jié)合的抗體或其片段。所得的抗體或其片段可用于診斷本發(fā)明基因參與其中的上述疾病。
本發(fā)明基因的反義片段及其表達(dá)產(chǎn)物可用于控制上述疾病(如腫瘤發(fā)生)的發(fā)作。
本發(fā)明基因的全部或部分還可用作探針。通過(guò)使用該探針，診斷癌癥和制備用于癌癥診斷的試劑盒是可能的。
在腫瘤中觀察到本發(fā)明基因的擴(kuò)增和增加表達(dá)，因此，本發(fā)明基因不僅可用于癌癥診斷中而且可用于判斷癌癥是否是惡性的。
本發(fā)明基因另外可用于篩選能夠與GASC1基因或GASC1蛋白相互作用的物質(zhì)。
本發(fā)明基因的例子屬于人癌癥細(xì)胞起源。通過(guò)使用這種基因，獲得各種哺乳動(dòng)物包括人的同源基因也是可能的。進(jìn)一步，利用本發(fā)明基因使得鑒定編碼蛋白的基因成為可能，所述蛋白與具有由本發(fā)明基因編碼的氨基酸序列的蛋白在其C末端結(jié)合。本發(fā)明基因下文將詳細(xì)描述本發(fā)明的基因(DNA分子)。
在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“基因(DNA分子)”不僅包括雙鏈DNA而且包括其組成的單鏈DNA，不管是有義還是無(wú)義，以及其片段。因此，除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明基因”包括含有人基因組DNA的雙鏈DNA、包括cDNA的單鏈DNA(有義鏈)、具有與有義鏈互補(bǔ)的序列的單鏈DNA(反義鏈)以及它們的片段。
本發(fā)明基因可含有前導(dǎo)序列、編碼區(qū)、外顯子和內(nèi)含子。多核苷酸包括RNA和DNA。所述DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成DNA。多肽包括其片段、同源物和突變體。突變體包括天然發(fā)生的等位基因突變體，非天然存在的突變體，含有通過(guò)缺失、替換、添加和/或插入而修飾的氨基酸序列的突變體，以及功能上等同于修飾的氨基酸序列的突變體。
本發(fā)明基因的特定例子是從DNA序列中推導(dǎo)出的基因，下文實(shí)施例章節(jié)中所示的被命名為GASC1的克隆擁有該DNA序列。
在該克隆中摻入的基因(GASC1基因)具有包含3168個(gè)核苷酸以及編碼GASC1蛋白的可讀框(SEQ ID NO2所示的核苷酸序列)，所述GASC1蛋白含有如SEQ ID NO1所示的1056個(gè)氨基酸殘基。從衍生自陽(yáng)性克隆的單向cDNA序列中，含有上述3168個(gè)核苷酸單個(gè)可讀框的4235個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄物得到確認(rèn)。在此轉(zhuǎn)錄物中，翻譯起始的共有序列(“Kozak”規(guī)則)是高度保守的，因此，證實(shí)了起始密碼位于核苷酸第146-148位。此轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
從本發(fā)明的GASC1基因中推導(dǎo)出的表達(dá)產(chǎn)物在其C末端含有兩個(gè)PHD指狀結(jié)構(gòu)基元(殘基第687-749和殘基第807-867)和一個(gè)PX結(jié)構(gòu)域(殘基第950-1047)。
本發(fā)明基因包括具有編碼蛋白的核苷酸序列的DNA分子和這種DNA分子的同源物，所述蛋白具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
上述同源物是多核苷酸，其與編碼具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸比較或與具有SEQ ID NO2所示序列的多核苷酸比較具有至少70％同源性，優(yōu)選至少90％同源性，更優(yōu)選至少95％同源性，最優(yōu)選至少97％同源性。
這些同源基因包括具有核苷酸序列的基因，所述核苷酸序列在嚴(yán)格雜交條件下能夠與具有SEQ ID NO2所示序列的核苷酸第238-638位的序列的DNA雜交，所述嚴(yán)格雜交條件是在含有0.1％ SDS的0.2×SCC中50℃或者在含有0.1％SDS的0.1×SCC中60℃。
具有與本發(fā)明基因同源的序列的DNA分子包括一系列相關(guān)基因，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征、基因表達(dá)模式以及生物功能(包括表達(dá)產(chǎn)物蛋白的功能)與本發(fā)明基因的共同性或相似性，這些相關(guān)基因可識(shí)別為組成一個(gè)基因家族。當(dāng)然，它們包括GASC1基因的等位基因。
具有序列同源性的DNA分子的特定例子是編碼蛋白的基因，所述蛋白對(duì)SEQ ID NO1所示的氨基酸序列進(jìn)行某種修飾并且與含有那種指定氨基酸序列的蛋白具有相同活性。
“某種修飾”在其意思內(nèi)包括“一種或若干種氨基酸序列或多種氨基酸殘基的缺失、替換或添加”。氨基酸缺失、替換或添加的范圍和位點(diǎn)不受特別限制，條件是修飾蛋白可充當(dāng)?shù)韧?，其具有與含有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白(GASC1蛋白)相同的GASC1活性。
具體而言，GASC1活性包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的能力以及調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)錄激活的能力。
氨基酸序列修飾(突變)可自然發(fā)生，例如通過(guò)自發(fā)突變或轉(zhuǎn)錄后修飾。根據(jù)天然基因(例如人GASC1基因)，修飾也可人工誘導(dǎo)。
人工的意思包括例如遺傳工程技術(shù)如位點(diǎn)專(zhuān)一誘變[Methods inEnzymology，154，350，367-382(1987)；ibid，100，468(1983)；NucleicAcids Res.，12，9441(1984)；Zoku Seikagaku Jikken Koza(Experiments inBiochemistry，Second Series)1“Idenshi Kenkyuho(Methods in GeneResearch)II”，Japanese Biochemical Society(編)，第105頁(yè)(1986)]，化學(xué)合成方法如磷酸三酯法和磷酰胺法(phosphoamidite method)[J.Am.Chem.Soc.，89，4801(1967)；同上，91，3350(1969)；Science，150，178(1968)；Tetrahedron Lett.，22，1859(1981)；同上，24，245(1983)]以及這類(lèi)方法的組合。
更具體而言，DNA可由化學(xué)方法如磷酰胺法或磷酸三酯法合成，此合成可在市售的全自動(dòng)寡核苷酸合成儀上實(shí)施。通過(guò)在適當(dāng)條件下合成互補(bǔ)鏈并將這些鏈退火，或通過(guò)加入互補(bǔ)鏈利用適當(dāng)?shù)囊镄蛄泻虳NA聚合酶，雙鏈片段可從化學(xué)合成的單鏈產(chǎn)物中獲得。
本發(fā)明基因包括編碼具有GASC1活性的修飾或突變的氨基酸序列的任何基因(修飾基因)，不管這類(lèi)修飾/突變的理由和手段。
編碼此類(lèi)突變的氨基酸序列的基因包括對(duì)氨基酸替換沉默的基因，即基因的核苷酸序列不影響其所編碼的氨基酸序列，以及包括編碼保守替換的氨基酸殘基的密碼的基因。術(shù)語(yǔ)“保守替換的氨基酸殘基”是指除原始氨基酸殘基以外的替換的氨基酸殘基，在原始氨基酸殘基替換后，具有原始氨基酸殘基的多肽的活性仍將保留。這類(lèi)替換的氨基酸殘基與相應(yīng)的原始氨基酸殘基一起的例子如下顯示。
原始氨基酸殘基 保守替換的氨基酸殘基Ala SerArg LysAsn Gln或HisAsp GluCys SerGln AsnGlu AspGly ProHis Asn或GlnIle Leu或ValLeu Ile或ValLys Arg或GluMet Leu或IlePhe Met、Leu或TyrSer ThrThr SerTrp TyrTyr Trp或PheVal Ile或Leu此外，Cys可被各種氨基酸殘基如Ser、Ala或Val所替換。
在下列情況下，例如，由于組成多肽的氨基酸殘基的替換而產(chǎn)生的多肽一般都可預(yù)期較好地修飾其特征。
a)將例如Leu、Ile、Phe、Val或Ala替換成親水殘基如Ser或Thr；b)將任何其他各種氨基酸替換成Cys或Pro；c)將負(fù)電荷的氨基酸殘基如Val或Asp替換成帶有正電荷側(cè)鏈的氨基酸殘基如Lys、Arg或His；d)將無(wú)側(cè)鏈的氨基酸殘基如Gly替換成帶有龐大側(cè)鏈的氨基酸殘基如Phe。
上述修飾的氨基酸序列具有序列同源性，包括那些在運(yùn)用FASTA或BLAST程序?qū)ζ湔麄€(gè)氨基酸序列檢索后而揭示出的具有至少約45％，優(yōu)選至少約50％的同一性水平的氨基酸序列(Clustal，V.，MethodsMol.Biol.，25，307-318(1994))。對(duì)于PX結(jié)構(gòu)域和PHD基元結(jié)構(gòu)域來(lái)說(shuō)，還包括顯示至少35％，優(yōu)選至少45％的同一性水平的氨基酸序列。
本發(fā)明基因的特定實(shí)施方案是具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的基因。該核苷酸序列的編碼區(qū)代表密碼子的組合的例子，所述密碼子針對(duì)SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中的各自氨基酸殘基。
本發(fā)明基因中密碼子的組合不限于SEQ ID NO2所示的一種。密碼子的任意組合可用于各自的氨基酸殘基。密碼子的選擇可以常規(guī)方式進(jìn)行。例如，參考宿主中密碼子的使用頻率可選擇適當(dāng)?shù)拿艽a子備用[Nucleic Acids Res.，9，43(1981)]。本發(fā)明基因的生產(chǎn)依據(jù)在此公開(kāi)的本發(fā)明基因的序列信息，采用一般的遺傳工程技術(shù)[例如分子克隆第二版(Molecular Cloning 2ndEd)，Cold Spring HarborLab.Press(1989)；Zoku Seikagaku Jikken Koza(Experiments inBiochemistry，Second Series)“Idenshi Kenkyuho(Methods in GeneResearch)I、II、III，Japanese Biochemical Society(ed.)，(1986)]，可容易地生產(chǎn)和分離本發(fā)明基因。
更具體而言，本發(fā)明基因的生產(chǎn)方法是從其中表達(dá)本發(fā)明基因的適當(dāng)來(lái)源中以常規(guī)程序制備cDNA文庫(kù)，并且使用適當(dāng)?shù)奶结樆蛱禺愑诒景l(fā)明基因的抗體從該文庫(kù)中篩選所需的克隆。
這種生產(chǎn)程序可根據(jù)文獻(xiàn)中所述的方法進(jìn)行實(shí)施[例如Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，78，6613(1981)；Science，222，778(1983)]。
適合用作cDNA來(lái)源的是例如表達(dá)本發(fā)明基因的各種細(xì)胞和組織以及從中衍生的培養(yǎng)細(xì)胞。來(lái)自這種來(lái)源的總RNA的分離、mRNA的分離和純化以及cDNA的獲取和克隆也可以常規(guī)方式進(jìn)行。
此外，市售的cDNA文庫(kù)例如從Clotech Lab.公司獲得的各種cDNA文庫(kù)可用于本發(fā)明基因的生產(chǎn)。
從cDNA文庫(kù)生產(chǎn)的本發(fā)明基因，其篩選方法沒(méi)有特別的限制，可應(yīng)用常規(guī)的方法。
篩選方法的例子包括使用針對(duì)由cDNA所產(chǎn)生的蛋白的特異抗體來(lái)篩選相應(yīng)cDNA克隆的免疫篩選方法，使用探針選擇性地與目的DNA序列結(jié)合的方法，如噬菌斑雜交方法或菌落雜交方法，以及這些方法的組合。
作為用于上述方法的探針，一般可使用依據(jù)本發(fā)明基因的核苷酸序列的信息而化學(xué)合成的DNA。已獲得的本發(fā)明基因或其片段也可有利地用作探針。依據(jù)本發(fā)明基因的核苷酸信息而設(shè)計(jì)的有義引物和反義引物可用作篩選的探針。
用作上述探針的核苷酸序列可以是對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2并包含至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選30個(gè)連續(xù)核苷酸，最優(yōu)選50個(gè)連續(xù)核苷酸的部分核苷酸序列。此外，照此具有SEQID NO2所示序列的陽(yáng)性克隆可用作探針。
在獲得本發(fā)明基因中，可有利地使用通過(guò)PCR的DNA/RNA擴(kuò)增[Science，230，1350(1985)]。特別是當(dāng)全長(zhǎng)cDNA幾乎不能從文庫(kù)中得到時(shí)，可有利地使用RACE方法[cDNA末端的快速擴(kuò)增(Rapidamplification of cDNA ends)；Jikken Igaku(Experimental Medicine)，12(6)，35(1994)]，尤其是5’-RACE方法[M.A.Frohman等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，8，8998(1988)]。
用于這些PCR方法中的引物可參考在此公開(kāi)的本發(fā)明基因的序列信息而進(jìn)行明智的設(shè)計(jì)，并可通過(guò)常規(guī)程序而合成。擴(kuò)增的DNA/RNA的分離和純化可以如上所述的常規(guī)方式進(jìn)行，例如通過(guò)凝膠電泳方法。
根據(jù)雙脫氧方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，74，5463(1977)]或Maxam和Gilbert方法[Methods in Enzymology，65，499(1980)]或通過(guò)市售的測(cè)序試劑盒更快速地對(duì)如以上述方式獲得的本發(fā)明基因或其各種DNA片段進(jìn)行測(cè)序。
本發(fā)明基因在單獨(dú)或給定組織中的表達(dá)或非表達(dá)通過(guò)使用部分或全部如上述方式獲得的本發(fā)明基因的核苷酸序列可特異地進(jìn)行檢測(cè)。
上述檢測(cè)可通過(guò)常規(guī)程序進(jìn)行，如通過(guò)RT-PCR[逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；E.S.Kawasaki等，RNA擴(kuò)增。PCR方案，方法和應(yīng)用指南(PCR Protocol，A Guide to Methods and Applications)，Academic Press，Inc.，SanDiego，21-27(1991)]的RNA擴(kuò)增、RNA印跡分析[MolecularCloning，Cold Spring Harbor Lab.(1989)]、通過(guò)例如原位RT-PCR[Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1993)]或原位雜交對(duì)細(xì)胞水平進(jìn)行測(cè)定、NASBA[基于核酸序列的擴(kuò)增(nucleic acid sequence-basedamplification)，Nature，350，91-92(1991)]等?？擅髦堑厥褂肦T-PCR檢測(cè)方法。
當(dāng)選擇PCR方法用于上述檢測(cè)時(shí)，有待使用的引物可以是僅能導(dǎo)致本發(fā)明基因選擇性擴(kuò)增的任何引物，并依據(jù)本發(fā)明基因的序列信息可被巧妙地設(shè)計(jì)和合成。通常，本發(fā)明基因的部分序列長(zhǎng)度約是10-35個(gè)核苷酸，優(yōu)選約15-30個(gè)核苷酸，可用作引物。
因此，本發(fā)明基因包括DNA片段，可用作檢測(cè)本發(fā)明基因的特異引物和/或特異探針。
上述DNA片段可定義成在嚴(yán)格條件下能與具有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的DNA雜交的DNA。上述的嚴(yán)格條件可以是引物或探針在其下使用的普通條件。例如，上述條件即在含有0.1％SDS的0.2×SCC中50℃或者在含有0.1％SDS的0.1×SCC中60℃可被提及。
通過(guò)使用本發(fā)明基因和常規(guī)遺傳工程技術(shù)，方便和穩(wěn)定地大量生產(chǎn)本發(fā)明基因的表達(dá)產(chǎn)物或含有同樣表達(dá)產(chǎn)物的蛋白成為可能。本發(fā)明蛋白及其生產(chǎn)本發(fā)明進(jìn)一步提供由本發(fā)明基因編碼的蛋白；生產(chǎn)該蛋白的載體，例如含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體；用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)本發(fā)明蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
本發(fā)明蛋白的特定實(shí)施方案是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的GASC1蛋白。本發(fā)明蛋白還包括其任何同系物。所述同系物可以是具有氨基酸序列并保留GASC1活性的蛋白，所述氨基酸序列通過(guò)缺失、替換或添加一種或若干種或多種氨基酸而衍生自SEQ ID NO1所示氨基酸序列。同系物的特定例子是SEQ ID NO3所示GASC1基因的同系物的表達(dá)產(chǎn)物(GASC1等同基因包括其等位基因)。
另外，本發(fā)明的GASC1蛋白的同系物包括具有與GASC1蛋白活性或功能相同的蛋白，所述GASC1蛋白具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，如同衍生自人、馬、羊、牛、犬、猿、貓和其他哺乳動(dòng)物物種以及嚙齒動(dòng)物如大鼠、小鼠和兔。
本發(fā)明蛋白可通過(guò)常規(guī)重組DNA技術(shù)[Science，224，1431(1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm.，130，692(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80，5990(1983)]依據(jù)如本發(fā)明所提供的GASC1基因的序列信息來(lái)制備。
更具體而言，本發(fā)明蛋白的生產(chǎn)方法如下構(gòu)建重組DNA(表達(dá)載體)，其允許在宿主細(xì)胞中編碼目的蛋白基因的表達(dá)，通過(guò)向其中轉(zhuǎn)導(dǎo)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使所得的轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)，以及從培養(yǎng)液中收集蛋白。
宿主細(xì)胞可以是任何原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。通常用作原核宿主最多的是大腸桿菌(Escherichia coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等?？捎欣厥褂糜绕浒ㄔ诖竽c桿菌K12菌株的大腸桿菌菌株。真核宿主細(xì)胞包括脊椎動(dòng)物細(xì)胞和酵母，前者包括猿細(xì)胞系COS[Cell，23175(1981)]、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞及其二氫葉酸還原酶-缺陷的細(xì)胞[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，774216(1980)]。后者包括酵母屬的酵母細(xì)胞，但這些不是專(zhuān)有的選擇。
當(dāng)原核細(xì)胞用作宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法是使用在宿主細(xì)胞中可復(fù)制的載體，并在本發(fā)明基因的上游添加啟動(dòng)子和SD(Shine和Dalgarno)序列，以便該基因可在其中表達(dá)，以及可有利地采用對(duì)起始蛋白合成是必須的起始密碼子(例如ATG)。作為上述載體，經(jīng)常使用衍生自大腸桿菌的質(zhì)粒，如pBR322、pBR325、pUC12和pUC13等。然而，這些不是專(zhuān)有的選擇，還可使用各種已知的載體。市售用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的載體的例子包括pGEX-4T(AmershamPharmacia Biotech)、pMAL-C2、pMA1-P2(New England Biolabs)、pET-21、pET-21/lacq(Invitrogen)和pBAD/His(Invitrogen)。
作為用于宿主細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞時(shí)的表達(dá)載體，準(zhǔn)備使用的載體一般在待表達(dá)的本發(fā)明基因的上游具有啟動(dòng)子、RNA剪接位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。如果需要，該載體可進(jìn)一步具有復(fù)制起點(diǎn)。表達(dá)載體的特定例子是具有SV40早期啟動(dòng)子的pSV2dhfr[Mol.Cell.Biol.，1854(1981)]。除上述載體以外，可使用各種市售的已知載體。市售用于動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的載體的例子包括動(dòng)物細(xì)胞的載體，如pEGFP-N、pEGFP-C(Clontech)、pIND(Invitrogen)和pcDNA3.1/His(Invitrogen)等，以及昆蟲(chóng)細(xì)胞的載體，如pFastBac HT(Gibco BRL)、pAcGHLT(PharMingen)、pAc5/V5-His、pMT/V5-His、pMT/Bip/V5-His(全部為Invitrogen)。
pAM82具有酸性磷酸酶基因的啟動(dòng)子[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，801(1983)]，是酵母細(xì)胞用作宿主細(xì)胞時(shí)表達(dá)載體的特定例子。市售酵母細(xì)胞的表達(dá)載體包括pPICZ(Invitrogen)和pPICZα(Invitrogen)。
啟動(dòng)子同樣不受到特別限制，本領(lǐng)域已知的任何一個(gè)啟動(dòng)子均可使用。當(dāng)大腸屬的菌株用作宿主時(shí)，可有利地使用色氨酸(trp)啟動(dòng)子、lpp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、recA啟動(dòng)子、PL/PR啟動(dòng)子等。當(dāng)宿主是芽孢桿菌屬的菌株時(shí)，優(yōu)選使用SP01啟動(dòng)子、SP02啟動(dòng)子、penP啟動(dòng)子等。當(dāng)酵母菌株用作宿主時(shí)，可有利地使用pH05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子等。當(dāng)宿主細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選的啟動(dòng)子包括SV40衍生的啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子以及SRα啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子可單獨(dú)使用，也可它們中的兩個(gè)或多個(gè)組合使用，例如以連接形式。
作為本發(fā)明基因的表達(dá)載體，可有利地使用任何常規(guī)融合蛋白表達(dá)載體。用于表達(dá)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)-融合蛋白的pGENX(Promega)就是這種載體的特定的例子。
將所需的重組DNA(表達(dá)載體)導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中的方法以及相關(guān)的轉(zhuǎn)化方法不受特別限制，可使用各種標(biāo)準(zhǔn)化的方法?？蓪⑺玫霓D(zhuǎn)化子以常規(guī)方式培養(yǎng)，由此本發(fā)明的目的蛋白在轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外或細(xì)胞膜上表達(dá)和產(chǎn)生(積累/分泌)。
準(zhǔn)備用于上述培養(yǎng)的培養(yǎng)基根據(jù)所采用宿主細(xì)胞的種類(lèi)可明智地從各種常規(guī)的培養(yǎng)基中選擇，而且培養(yǎng)也可在有利于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行。
如此獲得的本發(fā)明的重組蛋白通過(guò)各種分離技術(shù)利用其物理和/或化學(xué)特性可被任選分離和純化，例如[″Seikagaku Data Book(Biochemical Data Book)II″，1175-1259，第一版，第一次印刷，1980年6月23日Tokyo Kagaku Dozin K.K.出版；Biochemistry，25(25)，8274(1986)；Eur.J.Biochem.，163，313(1987)等]。
上述技術(shù)具體包括一些常規(guī)方法，如重建處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透壓休克方法、超聲破碎、超濾、各種類(lèi)型的層析如分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、親和層析和高效液相層析(HPLC)、透析以及這些方法的組合。特別優(yōu)選的技術(shù)是使用柱的親和層析，針對(duì)本發(fā)明蛋白的特異抗體已偶聯(lián)到該柱上。
在設(shè)計(jì)編碼本發(fā)明蛋白的目的基因時(shí)，可有利地使用如SEQ IDNO2所示的GASC1基因的核苷酸序列。如果需要，該基因可經(jīng)適當(dāng)選擇和變更指定各自氨基酸殘基的密碼子后才被使用。此外，當(dāng)由GASC1基因編碼的氨基酸序列的任意氨基酸殘基或部分序列通過(guò)替換、缺失或添加而必須被修飾時(shí)，這些修飾可通過(guò)上述的各種方法進(jìn)行，例如通過(guò)位點(diǎn)專(zhuān)一誘變。
根據(jù)SEQ ID NO1所示的氨基酸序列通過(guò)化學(xué)合成的標(biāo)準(zhǔn)方案也可生產(chǎn)本發(fā)明蛋白。該方法包括常規(guī)合成肽的液相方法和固相方法。
更具體而言，合成肽的方法包括所謂的逐步延伸方法，其中為了鏈延長(zhǎng)組成的氨基酸一個(gè)接一個(gè)地被偶聯(lián)，以及片段縮合方法，該方法包括合成片段并將片段偶聯(lián)在一起，各片段預(yù)先由若干氨基酸所組成。本發(fā)明蛋白可通過(guò)上述兩種方法的任一種合成。
用于上述肽合成的縮合的方法也可以是一種常規(guī)方法，包括疊氮化物方法、混合酸酸酐方法、DCC方法、活性酯方法、氧還方法、DPPA(二苯基磷酰疊氮)方法、DCC+添加劑(1-羥基苯并三噻唑，N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二羧酰亞胺等)方法以及伍德瓦德試劑方法。
這些方法中所用的溶劑也可明智地選自本領(lǐng)域熟知的用于這類(lèi)肽形成縮合反應(yīng)的常用溶劑。溶劑的例子包括二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、六甲基磷酰胺、二噁烷、四氫呋喃(THF)、乙酸乙酯等以及它們的混合物。
在進(jìn)行肽合成反應(yīng)中，任何不應(yīng)參與反應(yīng)的氨基酸或片段肽的羧基可預(yù)先被保護(hù)，一般采用酯化以低級(jí)烷酯的形式，如甲酯、乙酯或叔丁酯，或芳烷酯如苯甲酸酯、對(duì)甲氧基苯甲酸酯、對(duì)硝基苯甲酸酯等。
關(guān)于在其側(cè)鏈具有功能基團(tuán)的任意氨基酸，例如酪氨酸殘基的羥基可預(yù)先用例如乙?；?、芐基、芐氧基羰基或叔丁基保護(hù)，盡管此種保護(hù)不是必不可少的。此外，精氨酸殘基的胍基可用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基保護(hù)，如硝基、甲苯磺酰基、對(duì)甲氧基苯磺?；?、亞甲基-2-磺酰基、芐氧基羰基、異龍腦氧基羰基、金剛烷氧基羧基等。
從本發(fā)明的被保護(hù)的氨基酸、肽或終產(chǎn)物蛋白中消除這些保護(hù)性基因的反應(yīng)也可以常規(guī)方式進(jìn)行，例如通過(guò)催化還原或通過(guò)使用液氨/鈉、氟化氫、溴化氫、氯化氫、三氟乙酸、乙酸、甲酸、甲磺酸等。
如此生產(chǎn)的本發(fā)明蛋白可按需要通過(guò)上述各種技術(shù)被純化，例如離子交換樹(shù)脂層析法、分配色譜法、凝膠層析法、逆流分配法以及肽化學(xué)領(lǐng)域中常用的類(lèi)似方法?？贡景l(fā)明蛋白的抗體本發(fā)明蛋白或其片段可有利地用作制備特異抗體的免疫原。使用該免疫原，可提供所需的抗血清(多克隆抗體)和單克隆抗體。
生產(chǎn)抗體的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的，這些常規(guī)程序也可用于操作本發(fā)明[例如Zoku Seikagaku Jikken Koza(Experiments in Biochemistry，second series)″Men-eki SeikagakuKenkyuho(Methods in Immunobiochemistry)″，edited by JapaneseBiochemical Society(1986)]。
如此得到的抗體通過(guò)免疫學(xué)技術(shù)等可有利地用于本發(fā)明蛋白的純化及其測(cè)定或鑒定。更具體而言，由于本發(fā)明基因的擴(kuò)增和增加的表達(dá)已在癌細(xì)胞中得到證實(shí)，因此該抗體可用于癌癥診斷或癌癥是否是惡性的判斷。此外，上述抗體可用于生產(chǎn)包含相同抗體作為活性成分的藥品，例如用于癌癥的診斷劑。本發(fā)明的藥物組合物本發(fā)明進(jìn)一步提供了藥物組合物，例如用于癌癥的治療劑，其包含針對(duì)本發(fā)明蛋白的抗體作為活性成分或其片段，以及生產(chǎn)這種組合物或藥劑的方法。
本發(fā)明的藥物組合物的制備方法是采用包含有效量的針對(duì)本發(fā)明蛋白的抗體或其片段和可藥用載體一起(包括稀釋劑)的形式。
根據(jù)待制備制劑的用途方式、其劑量形式以及其他因素可適當(dāng)選擇能用于該藥物組合物(藥物制劑)中的載體。其包括例如稀釋劑或賦形劑如填充劑、體積構(gòu)件、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、表面活性劑和潤(rùn)滑劑。
最優(yōu)選的是本發(fā)明藥物組合物的制備采用各種成分，這些成分可制成普通的蛋白制劑，如穩(wěn)定劑、生物殺滅劑、緩沖液、等滲劑、螯合劑、pH控制劑以及表面活性劑。
穩(wěn)定劑包括例如人血清白蛋白、普通的L-氨基酸、糖或糖類(lèi)以及纖維素衍生物。這些穩(wěn)定劑可單獨(dú)使用或與表面活性劑等組合使用。特別是與表面活性劑的組合使用可導(dǎo)致活性成分更有效的穩(wěn)定。
L-氨基酸不受到特別地限制，例如可采用甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸的任一種。
糖不受特別限制，其包括單糖如葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖，糖醇如甘露醇、肌醇以及木糖醇；二糖如蔗糖、麥芽糖和乳糖；多糖如葡聚糖、羥丙基淀粉、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸；以及它們的衍生物。
表面活性劑也不受特別限制，離子和非離子的表面活性劑均可被采用。特定的例子是聚乙二醇、山梨聚糖醇烷酯、聚氧乙烯烷基醚、山梨聚糖醇單酰酯以及脂肪酸甘油酯。
可用的纖維素衍生物也不受特別限制，其包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素以及羧甲基纖維素鈉。
糖的添加量為每微克(μg)活性成分不少于約0.0001mg，優(yōu)選在約0.01-約10mg的范圍內(nèi)。表面活性劑的添加量為每μg活性成分不少于約0.00001mg，優(yōu)選在約0.0001-約0.01mg的范圍內(nèi)。人血清白蛋白的添加量為每μg活性成分不少于約0.0001mg，優(yōu)選在約0.001-約0.1mg的范圍內(nèi)。氨基酸使用的量為每μg活性成分約0.001-約10mg的范圍內(nèi)。纖維素衍生物的添加量為每μg活性成分不少于約0.00001mg，優(yōu)選在約0.001-約0.1mg的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的藥物制劑中活性成分的量可不受限制地選自寬的范圍。一般而言，根據(jù)藥物制劑的重量其按重量計(jì)在約0.00001-約70％的范圍內(nèi)，優(yōu)選約0.0001-約5％的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步補(bǔ)充各種添加劑如緩沖液、等滲劑以及螯合劑。緩沖液包括硼酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、ε-氨基己酸、谷氨酸和/或其對(duì)應(yīng)鹽(它們的堿金屬或堿土金屬鹽，如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽和鎂鹽)。等滲劑包括氯化鈉、氯化鉀、糖和甘油等。螯合劑包括乙二胺四乙酸鈉和檸檬酸等。
本發(fā)明的藥物制劑可采用溶液的形式，或從其衍生的凍干形式，以便儲(chǔ)存。這種凍干制劑可臨時(shí)溶解于例如緩沖液中至適當(dāng)?shù)氖┯脻舛?，包括水、生理鹽水等。
包含在藥物制劑及其劑量中的活性成分的量不受特別限制，依據(jù)所期望的治療效果、給藥方法、治療期限、患者背景如年齡和性別以及其他因素，可選自寬的范圍。一般而言，活性成分所推薦的常用劑量是每kg體重約0.01μg-約10mg/天，優(yōu)選約0.1μg-約1mg/天。制劑的施用可每天一次或劑量分開(kāi)兩次-若干次。用于基因治療的反義寡核苷酸和載體本發(fā)明進(jìn)一步提供能產(chǎn)生具有與細(xì)胞內(nèi)mRNA互補(bǔ)的序列的RNA的反義藥物，從而抑制能夠表達(dá)GASC1基因的細(xì)胞中GASC1基因的翻譯和表達(dá)，以及提供使用該反義藥物對(duì)癌癥進(jìn)行基因治療的方法。
治療的基本原理在于抑制靶GASC1基因的表達(dá)。這種表達(dá)抑制例如通過(guò)下列步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生與對(duì)應(yīng)于靶基因的mRNA互補(bǔ)的反義核苷酸，并將同樣的反義核苷酸供給具有靶GASC1基因的癌細(xì)胞。該反義核苷酸結(jié)合到與擁有核苷酸的靶細(xì)胞中的GASC1基因相對(duì)應(yīng)的mRNA上，或插入到靶細(xì)胞的DNA雙螺旋中從而形成三鏈。由此，GASC1基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯受到抑制。通過(guò)抑制GASC1基因的表達(dá)功能，受體細(xì)胞/靶細(xì)胞中的腫瘤或贅生物的增殖可被抑制。
通過(guò)將染色體外地含有核苷酸的載體或質(zhì)粒引入靶細(xì)胞中并在其中保持不變，反義核苷酸可被供給靶細(xì)胞。更具體而言，將反義核苷酸插入到從反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或AAV中衍生的載體中，并用所得的載體感染靶癌細(xì)胞，由此把反義核苷酸供給靶細(xì)胞。在被感染的細(xì)胞中，反義核苷酸過(guò)量表達(dá)從而產(chǎn)生所需的抗腫瘤效應(yīng)。
在包含將反義核苷酸引入具有GASC1基因的細(xì)胞中以抑制GASC1蛋白的表達(dá)的基因治療中，對(duì)于反義核苷酸來(lái)說(shuō)，沒(méi)必要具有與全長(zhǎng)的GASC1基因相對(duì)應(yīng)的序列。其可具有對(duì)應(yīng)于編碼上述某些或其他修飾的基因的序列或具有包含部分GASC1基因的序列，條件是保留與GASC1基因表達(dá)抑制相同的功用。
既為了將目的基因?qū)氚屑?xì)胞又為了染色體外維持該目的基因，可用向其中引入目的基因的起始載體或起源載體對(duì)本領(lǐng)域是已知的。任何這些已知的起始載體可用于本發(fā)明的操作中。合適的起始載體是例如在USP 5,252,479和PCT國(guó)際公開(kāi)說(shuō)明書(shū)WO 93/07282中公開(kāi)的載體(pWP-7A、pWP-19、pWU-1、pWP-8A、pWP-21、pRSVL等)或市售的載體pRC/CMV(Invitrogen)。在下文描述的各種病毒載體也是優(yōu)選的載體。
將目的基因引入這些起始載體中可以常規(guī)方式進(jìn)行。用于給靶細(xì)胞提供目的基因的載體或質(zhì)粒(導(dǎo)入載體)可由如此引入獲得。這些是含有GASC1基因的反義核苷酸拷貝如連接到表達(dá)調(diào)節(jié)元件上的病毒載體或質(zhì)粒載體，并能在靶細(xì)胞中生成反義核苷酸產(chǎn)物。如在上文所述的含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體也可用作導(dǎo)入載體。
作為用于基因治療的導(dǎo)入載體的啟動(dòng)子序列，那些啟動(dòng)子對(duì)各種疾病中待處理的受侵襲組織是固有的，可優(yōu)選采用。
例如對(duì)于肝臟，其特定的例子是白蛋白、α-胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、運(yùn)鐵蛋白和運(yùn)甲狀腺素蛋白的啟動(dòng)子序列。
對(duì)于結(jié)腸，碳酸酐酶和癌胚抗原的啟動(dòng)子序列可如實(shí)施例所敘述。
對(duì)于子宮和胎盤(pán)，雌激素、芳化酶(aromatase)、細(xì)胞色素P450、膽固醇側(cè)鏈切割酶P450以及17α-羥化酶P450的啟動(dòng)子序列可如實(shí)施例所敘述。
對(duì)于前列腺，前列腺抗原、gp91-fox基因以及前列腺特異的激肽釋放酶的啟動(dòng)子序列可如實(shí)施例所敘述。
對(duì)于乳腺，erb-B2、erb-B3、β-酪蛋白、β-乳球蛋白以及乳清蛋白的啟動(dòng)子序列可如實(shí)施例所敘述。
對(duì)于肺，表面活性物質(zhì)蛋白C以及尿球蛋白(uroglobulin)的啟動(dòng)子序列可如實(shí)施例所敘述。
對(duì)于皮膚，K-14-角蛋白、人角蛋白1或6以及l(fā)eucline的啟動(dòng)子序列可如實(shí)施例所敘述。
對(duì)于大腦，膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白、成熟星細(xì)胞特異蛋白、髓磷脂堿性蛋白以及酪氨酸羥化酶的啟動(dòng)子序列可如實(shí)施例所敘述。
對(duì)于胰腺，絨毛蛋白、胰高血糖素以及朗格漢斯小島淀粉狀蛋白多肽的啟動(dòng)子序列可如實(shí)施例所敘述。
對(duì)于甲狀腺，甲狀腺球蛋白和降鈣素的啟動(dòng)子序列可如實(shí)施例所敘述。
對(duì)于骨骼，α1膠原蛋白、骨鈣蛋白以及骨唾液酸糖蛋白的啟動(dòng)子序列可如實(shí)施例所敘述。
對(duì)于腎臟，腎素、肝臟/骨骼/腎臟堿性磷酸酶以及促紅細(xì)胞生成素的啟動(dòng)子序列可如實(shí)施例所敘述。
對(duì)于胰腺，淀粉酶和PAP1的啟動(dòng)子序列可如實(shí)施例所敘述。
此外，依據(jù)如上文所述的本發(fā)明GASC1基因的核苷酸序列的信息，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的遺傳工程技術(shù)，可容易地產(chǎn)生和獲得準(zhǔn)備用于引入載體生產(chǎn)的反義核苷酸(對(duì)應(yīng)于GASC1基因序列的全部或部分互補(bǔ)序列)。
通過(guò)本領(lǐng)域已知的把DNA導(dǎo)入細(xì)胞的各種技術(shù)，可將這種導(dǎo)入載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。其例子是電穿孔、磷酸鈣共沉淀、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)等。
作為導(dǎo)入載體轉(zhuǎn)移的結(jié)果，用GASC1基因的反義核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如同在分離狀態(tài)，也可用作藥物研發(fā)的模型系統(tǒng)和抑制癌癥或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的治療研究模型。
在基因治療中，通過(guò)將該載體局部或全身注射到患者的一個(gè)或多個(gè)腫瘤部位，上述導(dǎo)入載體可被導(dǎo)入患者的腫瘤細(xì)胞中。當(dāng)全身施用的情況下，其可到達(dá)所有腫瘤細(xì)胞，包括可能出現(xiàn)在另一部位或其他部位的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞。一般而言，在以上述方式給藥后，轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因?qū)⒂谰梦赵诟鱾€(gè)靶腫瘤細(xì)胞的染色體中。在不足的情形下，通過(guò)周期性地重復(fù)給藥可保證目的基因的吸收?；蛑委煾鶕?jù)本發(fā)明，基因治療的方法既包括體內(nèi)技術(shù)也包括離體技術(shù)，體內(nèi)技術(shù)包括將用于引入上述反義核苷酸(反義核苷酸導(dǎo)入載體)的物質(zhì)直接施用給身體，離體技術(shù)包括從患者身體中切除一些靶細(xì)胞，身體外將基因轉(zhuǎn)移其中，然后再將細(xì)胞返回到身體中。
根據(jù)本發(fā)明，基因治療的方法也包括基因療法，其包括將GASC1基因的反義核苷酸直接導(dǎo)入細(xì)胞中，并利用核酶，這些核酶是剪切RNA鏈的活性分子。
根據(jù)本發(fā)明，基因治療的藥劑包括含有全部或部分對(duì)應(yīng)于本發(fā)明基因的反義核苷酸的基因?qū)胼d體或者如通過(guò)所述載體的手段而導(dǎo)入的攜帶本發(fā)明基因的反義核苷酸的細(xì)胞作為活性成分。
根據(jù)本發(fā)明，用于基因治療的藥劑主要指明在癌癥情況下，雖然其也可用于治療(處理)其他遺傳性疾病中，例如病毒性疾病如AIDS。根據(jù)本發(fā)明所述的基因治療劑可進(jìn)一步用于標(biāo)記基因目的。
在根據(jù)本發(fā)明所述的基因治療中，反義核苷酸必定要被導(dǎo)入的靶細(xì)胞可依據(jù)基因治療(處理)的目的明智地選擇。靶細(xì)胞不僅包括癌細(xì)胞或腫瘤組織，而且包括淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞以及造血細(xì)胞等。
在上述基因治療中引入反義核苷酸的方法包括病毒導(dǎo)入技術(shù)和非病毒導(dǎo)入技術(shù)。
至于病毒導(dǎo)入技術(shù)，考慮到GASC1基因的反義核苷酸是正常細(xì)胞中表達(dá)的外源物質(zhì)的事實(shí)，可提及例如使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法。其他病毒載體也可使用，并包括腺病毒載體、HIV(人免疫缺陷病毒)載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、單純皰疹病毒(HSV)載體以及EB病毒(EBV)載體等。
非病毒導(dǎo)入方法包括下列方法。
·磷酸鈣共沉淀方法；·膜融合脂質(zhì)體方法；該方法包括通過(guò)使含DNA的脂質(zhì)體與滅活仙臺(tái)病毒融合來(lái)制備膜融合脂質(zhì)體，該滅活仙臺(tái)病毒通過(guò)用紫外線破壞基因制備，直接將該脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合，以及將融合產(chǎn)物導(dǎo)入細(xì)胞中[Kato，K.等，J.Biol.Chem.，266，22071-22074(1991)]；·包含用金包被質(zhì)粒DNA并將該DNA通過(guò)高壓放電手段物理地導(dǎo)入到細(xì)胞中的方法[Yang，N.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，87，9568-9572(1990)]；·裸DNA方法；該方法包括將質(zhì)粒DNA直接注射到體內(nèi)器官或腫瘤中[Wolff，J.A.等，Science，247，1465-1467(1990)]；·陽(yáng)離子脂質(zhì)體方法；該方法包括將包埋在正電荷多層脂質(zhì)體中的基因?qū)氲郊?xì)胞中[Yagi，Kunio，Igaku no Ayumi(Advances inMedicine)，Vol.175，No.9，635-637(1995)]；
·配體-DNA復(fù)合體方法；該方法包括將DNA與配體結(jié)合，所述配體結(jié)合到在靶細(xì)胞中表達(dá)的受體上，以及施用該結(jié)合產(chǎn)物，由此該基因僅被導(dǎo)入到特異的細(xì)胞中而不可能被導(dǎo)入到其他細(xì)胞中[Frindeis等，Trends Biotechnol.，11，202(1993)；Miller等，F(xiàn)ASEB J.，9，190(1995)]。
上述的配體-DNA復(fù)合體方法包括以唾液酸糖蛋白作為配體和例如以肝細(xì)胞中表達(dá)的唾液酸糖蛋白受體作為靶子的方法[Wu等，J.Biol.Chem.，266，14338(1991)；Ferkol等，F(xiàn)ASEB J.，7，1081-1091(1993)]，以及包括以運(yùn)鐵蛋白作為配體和以由腫瘤細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)的運(yùn)鐵蛋白受體作為靶子的方法[Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，87，3410(1990)]等。
基因?qū)牖蜣D(zhuǎn)移方法可存在于一種或多種生物的和/或如上述的一種或多種物理的基因轉(zhuǎn)移方法適當(dāng)?shù)慕M合。在這種組合的例子中，具有一定大小的質(zhì)粒DNA與特異于腺病毒六鄰體蛋白的聚賴(lài)氨酸-結(jié)合的抗體相組合。根據(jù)此方法，抗體復(fù)合體偶聯(lián)到腺病毒載體上，因此，通過(guò)用如此獲得的三分子復(fù)合體感染細(xì)胞來(lái)實(shí)施反義核苷酸導(dǎo)入成為可能。在偶聯(lián)到腺病毒載體上的DNA受到損傷之前，該方法使得有效結(jié)合、整合和核內(nèi)體分解。病毒載體構(gòu)建和基因轉(zhuǎn)移方法構(gòu)建用于反義核苷酸轉(zhuǎn)移的病毒載體的方法以及用于將反義核苷酸轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞或靶組織上的方法現(xiàn)在具體描述。
反轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)由病毒載體和輔助細(xì)胞(包裝細(xì)胞)組成。輔助細(xì)胞指一種細(xì)胞已預(yù)先表達(dá)了編碼反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)蛋白gag(病毒顆粒內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白)、pol(反轉(zhuǎn)錄酶)、env(外殼蛋白)等的基因，但還未形成病毒顆粒。另一方面，病毒載體具有包裝信號(hào)和LTR(長(zhǎng)末端重復(fù)序列)，但缺乏病毒復(fù)制必需的結(jié)構(gòu)基因，如gag、pol、env等。包裝信號(hào)是病毒顆粒的組裝中作為尾起作用的序列。將連接在克隆位點(diǎn)中的選擇性基因(neo、hyg)和目的反義核苷酸(GASC1基因的反義核苷酸的全部或片段)插入以代替病毒基因。為了能獲得高效價(jià)的病毒顆粒，重要的是使用盡可能短的插入，提供廣的包裝信號(hào)，所述包裝信號(hào)包括部分gag基因，并小心使用不遺留gag基因的ATG。
當(dāng)內(nèi)含目的GASC1基因的反義核苷酸的載體DNA被轉(zhuǎn)移給輔助細(xì)胞時(shí)，載體基因組RNA被輔助細(xì)胞所形成的病毒結(jié)構(gòu)蛋白包裝，由此病毒顆粒形成并分泌。病毒顆粒作為重組病毒感染靶細(xì)胞，結(jié)果使從病毒基因組RNA中反轉(zhuǎn)錄的DNA序列整合到細(xì)胞核中，因而插入到載體中的反義基因表達(dá)。
還有可能采用含有細(xì)胞粘著結(jié)構(gòu)域、肝素結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合區(qū)段的纖連蛋白片段的技術(shù)[Hanenberg，H.等，Exp.Hemat.，23，747(1995)]，為增強(qiáng)目的基因轉(zhuǎn)移的效率。
用于上述反轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)中的反轉(zhuǎn)錄病毒載體的例子是衍生自小鼠白血病病毒的反轉(zhuǎn)錄病毒[McLachlin，J.R.等，Proc.Natl.Acad.Res.Molec.Biol.，38，91-135(1990)]。
利用腺病毒載體的方法現(xiàn)在詳細(xì)描述。根據(jù)由Berkner[Berkner，K.L.，Curr.Topics Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992)]、YasuhiroSetoguchi等[Setoguchi，Y.等，Blood，84，2946-2953(1994)]、HiromiKanegae等[Kanegae，H.等，Jikken Igaku(Experimental Medicine)，12，28-34(1994)]和Ketner等[Ketner，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，91，6186-6190(1994)]描述的方法，可構(gòu)建腺病毒載體。
非增殖性腺病毒載體的構(gòu)建可按下列方式進(jìn)行。因此，腺病毒的早期基因區(qū)域E1和/或E3首先被切除。然后，將含有所需外源基因表達(dá)單位(表達(dá)單位由下列成員組成待轉(zhuǎn)移的反義核苷酸，即GASC1基因的反義核苷酸；轉(zhuǎn)錄所述反義核苷酸的啟動(dòng)子；確保被轉(zhuǎn)錄基因穩(wěn)定性的聚腺苷酸(Poly A))和部分腺病毒基因組DNA的質(zhì)粒載體和含有腺病毒基因組的質(zhì)粒用于共轉(zhuǎn)染例如293細(xì)胞。當(dāng)它們之間導(dǎo)致發(fā)生同源性重組以取代E1的基因表達(dá)單位時(shí)，非增殖性腺病毒載體作為內(nèi)含目的GASC1基因的反義核苷酸的載體得到并適合用于根據(jù)本發(fā)明的基因治療。加有末端蛋白的3’-端腺病毒載體也可通過(guò)連接粘粒載體中的腺病毒基因組DNA而構(gòu)建。此外，YAC載體也可用于重組腺病毒載體的構(gòu)建。
現(xiàn)在簡(jiǎn)述腺伴隨病毒(AAV)載體的產(chǎn)生。據(jù)發(fā)現(xiàn)AAV是污染了腺病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的小病毒。關(guān)于該病毒，細(xì)小病毒屬(Parvovirus)和依賴(lài)病毒屬(Dependovirus)的存在已得到鑒定，對(duì)于病毒復(fù)制，細(xì)小病毒屬能在宿主細(xì)胞內(nèi)自主增殖而無(wú)需要求輔助病毒，而依賴(lài)病毒屬需要輔助病毒。該AAV具有廣泛的宿主范圍，是感染各種細(xì)胞的普通病毒之一。該病毒基因組是線性單鏈DNA，由4680個(gè)核苷酸組成，在其兩端帶有145個(gè)核苷酸，具有已知為ITR(末端反向重復(fù)序列)的特征序列。該ITR區(qū)域起著復(fù)制起點(diǎn)的作用并具有引物的作用。該ITR對(duì)包裝病毒顆粒和將AAV整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA中也是必需的。關(guān)于病毒蛋白，基因組的左半部分編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，這是調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ep，控制復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。
利用AAV整合到染色體DNA中的特性可進(jìn)行重組AAV的構(gòu)建，由此能制備目的基因轉(zhuǎn)移載體。更具體而言，該方法包括首先構(gòu)建在野生型AVV的5′-和3′-端保留ITR并內(nèi)含待轉(zhuǎn)移如介入其中的反義核苷酸(GASC1反義核苷酸)的質(zhì)粒(AAV載體質(zhì)粒)。另一方面，對(duì)病毒復(fù)制和病毒顆粒形成必需的病毒蛋白從分開(kāi)的輔助質(zhì)粒中提供。必須保證沒(méi)有共有的核苷酸存在于兩個(gè)質(zhì)粒之間，因此野生型病毒將不出現(xiàn)在DNA重組上。所以，通過(guò)轉(zhuǎn)染將兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到例如293細(xì)胞中，而且進(jìn)一步用腺病毒作為輔助病毒感染細(xì)胞(當(dāng)采用293細(xì)胞時(shí)，該腺病毒可以是非增殖性病毒)，從而生產(chǎn)所需的非增殖性重組AAV。由于該重組AAV存在于細(xì)胞核中，然后將細(xì)胞進(jìn)行凍融和回收，并在56℃加熱使摻雜的腺病毒滅活。另外，如果需要，通過(guò)使用氯化銫超速離心分離和濃縮重組AAV。以此方式，可獲得用于基因轉(zhuǎn)移的所需重組AAV。
EBV載體的生產(chǎn)可例如通過(guò)Shimidzu等的方法[Shimidzu，N.等，Saibo Kogaku(Cell Technology)，14(3)，280-287(1995)]進(jìn)行。
用于轉(zhuǎn)移反義核苷酸的EBV載體的生產(chǎn)現(xiàn)在簡(jiǎn)要描述。
EB病毒(埃巴二氏病毒EBV)是單純皰疹病毒屬家族的病毒，其首先由Epstein和其同事從衍生自非洲淋巴瘤的培養(yǎng)細(xì)胞中分離[Kieff，E.和Liebowitz，D.Virology，2nded.Raven Press，New York，1990，pp.1889-1920]。該EBV具有細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性，為了將其用作基因轉(zhuǎn)移載體，有必要制備缺少這種轉(zhuǎn)化活性的病毒?？扇缦峦瓿纱隧?xiàng)行為。
因此，首先將鄰近靶DNA的EBV基因組克隆，在所述靶DNA中所需外源基因?qū)⒁迦?。然后，將外源基因的DNA片段和藥物抗性基因插入其中，從而構(gòu)建用于制備重組病毒的載體。接著，將用于重組病毒構(gòu)建的載體用適當(dāng)?shù)南拗泼盖谐筠D(zhuǎn)染到EBV陽(yáng)性的Akata細(xì)胞中。通過(guò)抗表面免疫球蛋白處理刺激病毒生產(chǎn)，把由同源重組形成的重組病毒與野生型Akata EBV一起回收。重組病毒感染到EBV陰性Akata細(xì)胞，在藥物存在下選擇抗藥物的克隆子，由此可獲得僅有重組病毒感染而不含野生型EBV的Akata細(xì)胞。進(jìn)一步，通過(guò)在重組病毒感染的Akata細(xì)胞中誘導(dǎo)病毒活性，目的重組病毒載體可大量生產(chǎn)。
無(wú)需使用任何重組病毒載體就能將所需反義核苷酸導(dǎo)入靶細(xì)胞中的非病毒載體可通過(guò)基因轉(zhuǎn)移方法例如使用膜融合脂質(zhì)體來(lái)生產(chǎn)。該方法是將脂質(zhì)體內(nèi)容物通過(guò)與細(xì)胞膜的融合活性直接導(dǎo)入細(xì)胞，如同給定的是膜脂質(zhì)體(具有脂雙層的小細(xì)胞器)。
例如通過(guò)Nakanishi等的方法[Nakanishi，M.等，Exp.Cell.Res.，159，399-499(1985)；Nakanishi，M.等，Gene introduction into animal tissues.InTrends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery(ed.by Lee，V.H.等).Harwood Academic Publishers GmbH，Amsterdam，1995，pp.337-349]，利用上述膜融合脂質(zhì)體可進(jìn)行反義核苷酸的導(dǎo)入。
通過(guò)利用上述膜融合脂質(zhì)體導(dǎo)入反義核苷酸的方法下文簡(jiǎn)要描述。
將其基因用紫外線滅活后的仙臺(tái)病毒和包括所需反義核苷酸和高分子物質(zhì)如表達(dá)蛋白的脂質(zhì)體在37℃下融合在一起。膜融合脂質(zhì)體具有一種結(jié)構(gòu)，其也稱(chēng)為假病毒，其內(nèi)部有脂質(zhì)體衍生的腔，其外部有同樣的刺突作為病毒被膜。通過(guò)蔗糖密度梯度離心進(jìn)一步純化膜融合脂質(zhì)體，然后允許37℃下吸附在靶培養(yǎng)細(xì)胞或組織細(xì)胞上。然后，將溫度提升到37℃，當(dāng)脂質(zhì)體內(nèi)容物導(dǎo)入細(xì)胞后，所需的反義核苷酸就可導(dǎo)入到靶細(xì)胞中。在此制備脂質(zhì)體所用的脂成分由50％(摩爾比率)膽固醇、卵磷脂和帶負(fù)電荷的合成磷脂組成，并且優(yōu)選制備和使用具有直徑為300nm的單層脂質(zhì)體。
使用脂質(zhì)體將反義核苷酸導(dǎo)入靶細(xì)胞中的另一方法是使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體的反義核苷酸導(dǎo)入方法。該方法按照Yagi等的方法[Yagi，K.等，B.B.R.C.，196，1042-1048(1993)]進(jìn)行。留意質(zhì)粒和細(xì)胞是負(fù)電荷的事實(shí)，該方法包括脂質(zhì)體膜的內(nèi)外兩面均帶正電荷，由此憑借靜電引力增加質(zhì)粒的吸收并增強(qiáng)其與細(xì)胞的相互作用。作為在此待用的脂質(zhì)體有用的是陽(yáng)性電荷的多層大泡(MLV)。然而利用大的單層小泡(LUV)或小的單層小泡(SUV)并用質(zhì)粒制備其合成物也是可能實(shí)現(xiàn)目的反義核苷酸的導(dǎo)入。
制備含質(zhì)粒的陽(yáng)離子的MLV的方法現(xiàn)在簡(jiǎn)要描述。首先制備以1∶2∶2摩爾比率含有脂TMAG(N-(α-三甲基銨基乙?；?雙十二烷基D-谷氨酸氯化物)、DLPC(二月桂酰磷脂酰膽堿)和DOPE(二油酰磷脂酰膽堿乙醇胺)的氯仿溶液(脂濃度1mM)。然后，將總量1μmol的脂放置到Spitz測(cè)試試管中，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中通過(guò)減壓去除氯仿來(lái)制備薄的脂膜。進(jìn)一步在減壓下充分去除氯仿干燥膜。再將0.5ml含有Mg和Ca的Dulbecco磷酸緩沖的鹽水與20μg的基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒一起加入，并且在氮?dú)馓鎿Q后，內(nèi)容物用旋渦混合器攪拌2分鐘，由此可獲得陽(yáng)離子MLV的懸浮液以及包括其中的含有目的反義核苷酸的質(zhì)粒。
在用于基因治療以上述方式獲得的包括質(zhì)粒的陽(yáng)離子MLV的實(shí)施例中，將0.6μg(以DNA計(jì)算)含有待表達(dá)的反義核苷酸插入其中的表達(dá)質(zhì)粒包埋在上述的陽(yáng)離子MLV中，從而使脂質(zhì)體的脂總量達(dá)到30nmol。將所得的脂質(zhì)體懸浮在2μl的磷酸緩沖的鹽水中，并把該懸浮液每隔一天施用給從患者中抽提的靶細(xì)胞或患者的一種或多種組織。
根據(jù)日本健康和福利部有關(guān)指導(dǎo)方針中的定義，基因治療是“給人施用基因或其中體內(nèi)導(dǎo)入基因的細(xì)胞來(lái)治療疾病”。除了上述指導(dǎo)方針的定義以外，如本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“基因治療”包括通過(guò)把GASC1基因的反義核苷酸導(dǎo)入到上述靶細(xì)胞中來(lái)治療各種疾病包括癌癥，另還包括通過(guò)將靶基因或其中轉(zhuǎn)入了靶基因的細(xì)胞導(dǎo)入人體中來(lái)治療各種疾病。將本發(fā)明基因?qū)氚屑?xì)胞或靶組織的方法在本發(fā)明的基因治療中把目的基因?qū)氚屑?xì)胞或靶組織的方法包括下列兩個(gè)代表性的方法。
第一種方法包括從待治療的患者中收集靶細(xì)胞，例如在添加白介素-2(IL-2)等的條件下離體生長(zhǎng)細(xì)胞以轉(zhuǎn)移如反轉(zhuǎn)錄病毒中內(nèi)含的目的GASC1基因的反義核苷酸，并重移植所得的細(xì)胞(離體方法)。該方法適合于治療例如ADA缺乏、由缺陷基因?qū)е碌倪z傳疾病、癌癥和AIDS。
第二種方法是直接基因轉(zhuǎn)移法，其包括將目的反義核苷酸(GASC1基因的反義核苷酸)直接注射到患者體內(nèi)或靶部位如腫瘤組織(直接方法)中。
更具體而言，例如可按下列方式實(shí)施第一種方法。因此，將從患者中收集的單核細(xì)胞利用血液分選儀從單核細(xì)胞中分部分離，并將分離細(xì)胞在有IL-2存在下培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基如AIM-V培養(yǎng)基中約72小時(shí)，然后加入待導(dǎo)入的內(nèi)含反義核苷酸(GASC1基因的反義核苷酸)的載體。為提高反義核苷酸的轉(zhuǎn)移效率，可將細(xì)胞在有魚(yú)精蛋白存在下32℃生長(zhǎng)1小時(shí)，2500rpm離心，然后在10％的二氧化碳?xì)怏w下37℃培養(yǎng)24小時(shí)。此程序重復(fù)幾次后，將細(xì)胞進(jìn)一步在有IL-2存在下培養(yǎng)在例如AIM-V培養(yǎng)基中48小時(shí)，然后用生理鹽水洗滌。存活細(xì)胞計(jì)數(shù)，并通過(guò)上述的原位PCR對(duì)目的反義核苷酸的導(dǎo)入效率進(jìn)行評(píng)價(jià)，或者例如當(dāng)對(duì)象是酶活性時(shí)，則通過(guò)測(cè)定這種活性的程度來(lái)評(píng)價(jià)。
為證實(shí)安全性，實(shí)施了安全檢查如在培養(yǎng)的細(xì)胞中培養(yǎng)細(xì)菌和真菌、對(duì)是否存在支原體感染進(jìn)行檢查、搜查內(nèi)毒素等。其后，將用預(yù)測(cè)的有效劑量的反義核苷酸(GASC1基因的反義核苷酸)轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)靜脈內(nèi)滴注返還給患者。間隔數(shù)周或幾個(gè)月重復(fù)上述程序直至完成基因治療。
根據(jù)靶細(xì)胞明智地選擇病毒載體的劑量。通常優(yōu)選的劑量根據(jù)病毒效價(jià)可以是例如每1×108個(gè)靶細(xì)胞1×103cfu-1×108cfu。
可采用上述第一種方法的選擇性版本，其包括共培養(yǎng)具有反轉(zhuǎn)錄病毒載體的產(chǎn)病毒的細(xì)胞和患者的細(xì)胞，所述載體內(nèi)含目的反義核苷酸，由此將反義核苷酸(GASC1基因的反義核苷酸)導(dǎo)入到靶細(xì)胞中。
在實(shí)施第二種基因治療方法(直接方法)中，特別優(yōu)選的是進(jìn)行離體預(yù)備實(shí)驗(yàn)通過(guò)操作載體基因cDNA的PCR或原位PCR以檢查目的反義核苷酸(GASC1基因的反義核苷酸)是否能由基因轉(zhuǎn)移方法真正導(dǎo)入，或者檢查所需的治療效果例如特異活性的升高或靶細(xì)胞的生長(zhǎng)或生長(zhǎng)抑制是否能通過(guò)導(dǎo)入目的反義核苷酸(GASC1基因的反義核苷酸)真正實(shí)現(xiàn)。此外，當(dāng)采用病毒載體時(shí)，通過(guò)執(zhí)行PCR搜索增殖性反轉(zhuǎn)錄病毒等，測(cè)定反轉(zhuǎn)錄酶的活性，或采用PCR技術(shù)監(jiān)控外殼蛋白(env)基因，對(duì)基因治療中導(dǎo)入反義核苷酸的安全性進(jìn)行確認(rèn)當(dāng)然具有重要意義。
尤其當(dāng)癌癥或惡性腫瘤是靶子時(shí)，本發(fā)明基因治療的例子是癌癥治療，其包括從患者中收集癌細(xì)胞，通過(guò)酶處理等建立培養(yǎng)的細(xì)胞系，例如利用反轉(zhuǎn)錄病毒將目的反義核苷酸導(dǎo)入到靶癌癥細(xì)胞中，用G418細(xì)胞實(shí)施篩選，然后測(cè)定IL-12等的表達(dá)量(體內(nèi))，給予輻射處理，以及將細(xì)胞接種至患者的腫瘤或癌旁的(腫瘤相伴的)一個(gè)或多個(gè)部位?；蛑委焺┍景l(fā)明進(jìn)一步提供藥物組合物或制劑(基因治療劑)，其包括本發(fā)明的反義核苷酸轉(zhuǎn)移載體或用反義核苷酸(GASC1基因的反義核苷酸)轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系作為活性成分以藥物有效量與合適的藥物載體或稀釋劑組合。
可用于本發(fā)明基因治療劑的藥物載體包括那些稀釋劑或賦形劑，例如填充劑、容積構(gòu)件、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑等，通常它們的用處取決于制劑所用的形式，并且根據(jù)制劑預(yù)計(jì)的單位劑量形式可選擇性地使用這些載體。
本發(fā)明基因治療劑的單位劑量形式可與本發(fā)明的藥物組合物所述的相同，并根據(jù)治療目的可選擇一種合適形式。
本發(fā)明的基因治療劑例如當(dāng)其含有反義核苷酸轉(zhuǎn)移載體時(shí)，是以所述載體包埋其中的脂質(zhì)體的形式制備或以用內(nèi)含反轉(zhuǎn)錄病毒載體的病毒感染的培養(yǎng)細(xì)胞形式制備，所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體含有所需的反義核苷酸。
藥劑例如可制成磷酸緩沖的鹽水(pH7.4)、林格溶液或胞內(nèi)組合物注射液，或者制成可與有益于基因轉(zhuǎn)移效率提高的物質(zhì)如魚(yú)精蛋白組合施用的這種劑量形式。
施用上述藥物制劑的方法不受特別限制，根據(jù)特定的劑量形式、患者的年齡、性別和其他因素、疾病的嚴(yán)重性等可建立適當(dāng)?shù)姆桨浮?br> 摻入上述藥物制劑的活性成分的量和劑量不受特別限制，根據(jù)期待的治療益處、施用方法、治療期限、患者背景包括年齡和性別以及其他變量，各量可自由選自寬的范圍。
一般而言，內(nèi)含目的反義核苷酸的反轉(zhuǎn)錄病毒載體作為藥物制劑的劑量可以是例如根據(jù)反轉(zhuǎn)錄病毒效價(jià)每kg體重每天約1×103pfu-約1×1015pfu。
在攜帶導(dǎo)入反義核苷酸的細(xì)胞的情況下，劑量可合適地選自約1×104細(xì)胞/個(gè)體-1×1015細(xì)胞/個(gè)體的范圍。
上述制劑的施用可每天一次或一天分幾次劑量或甚至間隔一周或若干周。優(yōu)選可組合施用有益于基因轉(zhuǎn)移效率提高的物質(zhì)如魚(yú)精蛋白或含有同樣物質(zhì)的制劑。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的基因治療適用于癌癥的治療時(shí)，其可以與如上所述的各種基因療法適當(dāng)?shù)慕M合(結(jié)合基因治療)施行和/或以與常規(guī)癌癥化療、放療、免疫治療等組合施行。本發(fā)明的基因治療可參照NIH指導(dǎo)方針包括其安全性方面[Recombinant DNA Advisory Committee，Human Gene Therapy，4，365-389(1993)]進(jìn)行。
本發(fā)明基因的檢測(cè)和癌癥診斷根據(jù)本發(fā)明，為了檢測(cè)GASC1基因是否存在的目的，所述GASC1基因促進(jìn)細(xì)胞的腫瘤發(fā)生，有可能制備生物樣品如血液或血清，任選地抽提核酸并分析其是否存在GASC1敏感的基因。根據(jù)本發(fā)明，還有可能制備具有某種或其他失調(diào)的生物樣品，并分析其是否存在GASC1相關(guān)的贅生物基因，用于檢測(cè)細(xì)胞或組織中的贅生物，惡性前兆的失調(diào)的進(jìn)展和/或其出現(xiàn)作為前兆指數(shù)。利用該方法，對(duì)細(xì)胞或組織中的贅生物、惡性前兆的失調(diào)的發(fā)展或其出現(xiàn)作為前兆指數(shù)進(jìn)行檢測(cè)變?yōu)榭赡?，因此，這些前兆的診斷例如癌癥診斷和癌癥治療效果的判斷及其預(yù)后變?yōu)榭赡堋?br> 例如，上述檢測(cè)方法可包括根據(jù)有關(guān)獲自腫瘤患者樣品的GASC1基因的信息制備GASC1基因的DNA片段，并對(duì)其進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而其可用于對(duì)GASC1基因和/或其擴(kuò)增的篩選。更具體而言，有可能構(gòu)建具有探針特性的DNA片段，所述探針用于噬菌斑雜交、菌落雜交、DNA印跡、RNA印跡等，或用于如由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增而制備GASC1基因的全長(zhǎng)或部分DNA，所述PCR用聚合酶擴(kuò)增核苷酸序列。為此目的，首先制備與至少部分的GASC1基因具有相同序列的引物。然后，將引物作為篩選探針與生物樣品(核酸樣品)反應(yīng)，由此可檢查樣品中是否存在GASC1基因序列。核酸樣品的制備可采用有助于檢測(cè)靶序列的任何各種技術(shù)，如變性、限制消化、電泳或斑點(diǎn)印跡。
作為上述的篩選方法，從靈敏度的觀點(diǎn)出發(fā)尤其優(yōu)選PCR技術(shù)，并且該技術(shù)不受特別限制，這是因?yàn)镚ASC1基因的片段用作引物。因此，可采用任何迄今已知的技術(shù)(Science，2301350-1354(1985))和最近已經(jīng)開(kāi)發(fā)或以后將被開(kāi)發(fā)的PCR的修飾版本(Sakaki，Yoshiyuki等編，Jikken Igaku(Experimental Medicine)，Supplement8(9)(1990)，Yodosha；Protein，Nucleic Acid，EnzymeSpecialSupplement，Kyoritsu Shuppan，35(17)(1990))。
用作引物的DNA片段是化學(xué)合成的寡DNA，這種寡DNA的合成可利用全自動(dòng)DNA分析儀等，例如Pharmacia LKB Gene Assemblerplus(Pharmacia)。優(yōu)選的準(zhǔn)備合成的引物(有義引物或反義引物)長(zhǎng)度可以是例如約10-30個(gè)核苷酸。用于上述篩選的探針通常是標(biāo)記探針，但可以是未標(biāo)記探針，或者根據(jù)與直接或間接標(biāo)記的配體特異的結(jié)合可進(jìn)行檢測(cè)。合適的標(biāo)記和標(biāo)記探針或配體的方法是本發(fā)明所屬領(lǐng)域公知的。因此，現(xiàn)有技術(shù)標(biāo)記包括放射性同位素、生物素、熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、酶和抗體等，這些標(biāo)記可通過(guò)已知程序如缺口平移、隨機(jī)引發(fā)和激酶處理來(lái)進(jìn)行。
用于檢測(cè)的PCR技術(shù)可以是例如RT-PCR，但可采用本領(lǐng)域常用的該技術(shù)的各種修飾。
此外，利用試劑盒檢測(cè)樣品中的GASC1基因，本發(fā)明的測(cè)定方法可快速施行。
因此，本發(fā)明提供包括GASC1基因的DNA片段的GASC1基因檢測(cè)試劑盒。
該試劑盒至少包括作為必要組分的DNA片段，所述DNA片段雜交于部分或全部SEQ ID NO2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。其可任選地含有其他組分如標(biāo)記介質(zhì)和PCR試劑(例如，Taq DNA聚合酶、三磷酸脫氧核苷酸、引物等)。
標(biāo)記介質(zhì)可以是放射性同位素或化學(xué)修飾物如熒光物質(zhì)。在DNA片段與這種標(biāo)記介質(zhì)預(yù)先已經(jīng)結(jié)合的情況下，試劑盒不需單獨(dú)含有這種標(biāo)記介質(zhì)。
試劑盒可進(jìn)一步含有適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)稀釋劑、標(biāo)準(zhǔn)抗體、緩沖液、洗滌溶液、反應(yīng)終止溶液等，這些物質(zhì)使得測(cè)定更容易操作。
本發(fā)明還提供用于癌癥診斷的方法，其包括利用上述測(cè)定方法和診斷藥劑或診斷試劑盒用于操作所述方法。
利用本發(fā)明的測(cè)定方法，通過(guò)直接或間接對(duì)獲自測(cè)試樣品的GASC1基因測(cè)序，有可能發(fā)現(xiàn)新的GASC1基因相關(guān)的基因，這些相關(guān)的基因與野生型GASC1基因具有高度同源性。所以，本發(fā)明進(jìn)一步提供篩選測(cè)試樣品中人GASC1基因相關(guān)的基因的方法，其包括進(jìn)行測(cè)定并對(duì)測(cè)試樣品中所含的GASC1 DNA進(jìn)行測(cè)序。
利用具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，即由人GASC1基因所編碼的蛋白質(zhì)，具有從SEQ ID NO1所示序列中通過(guò)缺失、替換或添加一種至若干種或多種氨基酸而衍生的氨基酸序列的蛋白，它們每一種的片段，或抗任何這些蛋白的抗體，可確定野生型GASC1和/或突變的GASC1。因此，本發(fā)明提供抗體方法和抗原方法用于確定抗野生型GASC1和/或突變的GASC1。
通過(guò)這些方法，根據(jù)野生型GASC1多肽中的變化，可檢測(cè)贅生性態(tài)失調(diào)或惡性腫瘤的惡性的程度。這類(lèi)變化的檢測(cè)可由GASC1序列分析通過(guò)上文所述的明確的技術(shù)進(jìn)行，更優(yōu)選的是利用抗體(多克隆或單克隆抗體)。由此，可檢測(cè)GASC1蛋白中的差異或者是否存在GASC1蛋白。
更具體而言，在實(shí)施本發(fā)明的野生型GASC1和/或突變的GASC1測(cè)定方法時(shí)，利用抗GASC1抗體，將GASC1蛋白從含有生物樣品的溶液中免疫沉淀出來(lái)，所述生物樣品獲自人體，如血液或血清。然后，對(duì)與聚丙烯酰胺凝膠上的GASC1蛋白反應(yīng)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡或免疫印跡。當(dāng)利用抗GASC1抗體時(shí)，通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)可檢測(cè)在石蠟包埋或冷凍的組織切片中的GASC1蛋白。用于上述測(cè)定和檢測(cè)的技術(shù)可適當(dāng)?shù)剡x自本領(lǐng)域中眾所周知的抗體生產(chǎn)和純化技術(shù)。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，用于檢測(cè)野生型和/或突變的GASC1的方法利用單克隆抗體和/或多克隆抗體，包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、免疫放射分析(IRMA)、免疫酶分析(IEMA)，包括三明治技術(shù)。本發(fā)明的蛋白受體和藥物篩選本發(fā)明可進(jìn)一步提供存在于細(xì)胞膜部分或細(xì)胞表面上并具有與GASC1蛋白親和性結(jié)合的GASC1受體。
通過(guò)結(jié)合生物樣品中標(biāo)記的GASC1蛋白，所述生物樣品含有細(xì)胞膜部分，抽提和分離GASC1結(jié)合產(chǎn)物，并鑒定被分離產(chǎn)物的氨基酸序列，可得到GASC1受體。獲得和測(cè)序GASC1受體的程序可以本領(lǐng)域中常規(guī)的方式進(jìn)行。
GASC1受體或其片段優(yōu)選GASC1受體可用于對(duì)任何各種藥物進(jìn)行篩選的技術(shù)中。由此，有可能對(duì)化合物進(jìn)行篩選(與GASC1受體反應(yīng)的化合物，包括低分子的化合物、高分子的化合物、蛋白、部分蛋白質(zhì)片段、抗原、抗體等)。用于這些篩選測(cè)試中的GASC1受體(多肽或其片段；下文將同樣適用)可固定在固相基質(zhì)上。
上述藥物篩選的例子是一種篩選方法，其包括以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析將測(cè)試物質(zhì)和GASC1蛋白或其片段與GASC1受體部分地反應(yīng)，然后檢測(cè)在測(cè)試條件下該物質(zhì)對(duì)GASC1受體和GASC1蛋白或其片段之間形成復(fù)合體的抑制程度。因此，本發(fā)明提供藥物篩選方法，其包括將測(cè)試物質(zhì)與GASC1受體接觸以使它們之間形成復(fù)合體，然后測(cè)定由GASC1受體和GASC1蛋白或其片段之間復(fù)合體形成而產(chǎn)生的復(fù)合體所導(dǎo)致的抑制程度。如由該篩選方法所得到的具有抑制活性的物質(zhì)可通過(guò)抑制GASC1受體的活性來(lái)調(diào)節(jié)GASC1自身的活性。
通過(guò)標(biāo)記GASC1受體和測(cè)定在上述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析中游離(非復(fù)合體形成)GASC1受體上的標(biāo)記量，可將測(cè)定值作為測(cè)試物質(zhì)與GASC1受體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)，或者可作為GASC1受體和GASC1蛋白之間復(fù)合體形成的抑制的測(cè)定。
藥物篩選也可用于不僅對(duì)物質(zhì)而且對(duì)化合物(肽)的篩選，所述物質(zhì)能夠抑制GASC1受體活性，所述化合物(肽)對(duì)所述受體具有足夠水平的結(jié)合親和性。
該程序包括在固相支持物如塑料針狀物的表面上合成大量不同的測(cè)試化合物，然后將化合物與GASC1受體反應(yīng)，并且洗滌后通過(guò)已知方法[例如PCT專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朩O 84-03564]檢測(cè)結(jié)合的反應(yīng)產(chǎn)物。在該程序中，純化的GASC1受體可通過(guò)在適當(dāng)?shù)陌迳现苯影辉撐锒褂?，或者也可以被抗此多肽的非中和抗體捕獲的形式使用，并因此固定在固相上。
此外，上述篩選方法也可用于競(jìng)爭(zhēng)性藥物篩選分析中。在這種情況下，中和抗體能夠特異地結(jié)合到GASC1受體上，引起與測(cè)試化合物的競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)。這種競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)能檢測(cè)是否存在任何具有一個(gè)或多個(gè)GASC1受體的抗原決定簇的肽。
作為藥物篩選的進(jìn)一步方法，所述方法利用可提及的內(nèi)含非功能性GASC1基因的真核宿主細(xì)胞系。該方法包括在測(cè)試化合物存在下真核宿主細(xì)胞生長(zhǎng)一定的周期時(shí)間，然后測(cè)定宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，由此可能證實(shí)測(cè)試化合物能否與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的蛋白結(jié)合，從而控制例如血液和組織中結(jié)合蛋白的濃度及其遷移程度，或者控制這種蛋白自身的活性。測(cè)定宿主細(xì)胞生長(zhǎng)速率的一種方法是測(cè)定GASC1受體的生物活性。
根據(jù)本發(fā)明，也有可能設(shè)計(jì)和生產(chǎn)另一生物活性蛋白或結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，所述結(jié)構(gòu)類(lèi)似物與GASC1蛋白例如GASC1激動(dòng)劑、GASC1拮抗劑或GASC1抑制劑相互作用。這些物質(zhì)可用于開(kāi)發(fā)更具活性或更穩(wěn)定的GASC1蛋白的衍生物，或者例如能體內(nèi)增強(qiáng)或抑制GASC1蛋白的功能的藥物。
例如通過(guò)X射線晶體學(xué)、計(jì)算機(jī)模型方法或這些方法的組合來(lái)鑒定和分析GASC1蛋白和另一蛋白的復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)，可設(shè)計(jì)出這種結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的序列。有關(guān)結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)信息也可由蛋白模型根據(jù)同源蛋白的結(jié)構(gòu)而獲得。
至于更具活性或更穩(wěn)定的GASC1蛋白的衍生物，對(duì)GASC1蛋白的活性或穩(wěn)定性施加重要影響的區(qū)域例如可通過(guò)丙氨酸掃描(丙氨酸替換)組成GASC1蛋白的至少一種氨基酸殘基，并在丙氨酸替換后測(cè)定肽的GASC1活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，更具活性或更穩(wěn)定的GASC1蛋白的衍生物可通過(guò)用丙氨酸替換在那個(gè)區(qū)域中的至少一種氨基酸殘基來(lái)獲得。
為獲得能與GASC1蛋白相互作用并具有生物活性的其他蛋白或其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，通過(guò)功能性分析預(yù)先分離靶特異的抗體并分析其晶體結(jié)構(gòu)也是有用的。該方法使得獲得用作設(shè)計(jì)所需藥物的基礎(chǔ)的藥核(pharmacore)成為可能。通過(guò)利用針對(duì)藥物活性抗體的功能性抗獨(dú)特型的抗體，從由化學(xué)或生物合成并積累而構(gòu)建的肽庫(kù)中篩選所需的肽成為可能。以此方式篩選的肽也可期待用作藥核。
根據(jù)本發(fā)明，如果GASC1蛋白可大量獲得，這將使在分析研究如X射線晶體學(xué)中利用該蛋白成為可能。進(jìn)一步，由本發(fā)明提供的GASC1蛋白可用于計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)來(lái)代替X射線晶體學(xué)，或與X射線晶體學(xué)一起使用。
此外，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)構(gòu)建的攜帶GASC1基因的剔除小鼠(轉(zhuǎn)基因小鼠)，有可能查明GASC1基因序列的哪一個(gè)或哪些位點(diǎn)對(duì)體內(nèi)所述多種GASC1活性具有影響，也就是說(shuō)GASC1基因表達(dá)產(chǎn)物和修飾的GASC1基因產(chǎn)物在體內(nèi)具有什么樣的功用。
該方法是通過(guò)利用同源性重組基因而有意修飾生命體遺傳信息的技術(shù)，其包括使用小鼠胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)作為例子的方法[Capecchi，M.R.，Science，244，1288-1292(1989)]。
構(gòu)建這種突變小鼠的方法是迄今為止相關(guān)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)[例如Noda，Testuo(編)Jikken Igaku(Experimental Medicine)，Supplement，14(20)(1996)，Yodosha]。通過(guò)將該技術(shù)適用于野生型GASC1基因和突變的GASC1基因，可容易地生產(chǎn)突變小鼠。
在突變小鼠得到的突變基因序列和其功用之間關(guān)系的建立，為設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)如上所述的更具活性或更穩(wěn)定形式的GASC1蛋白衍生物，尤其是作為GASC1激動(dòng)劑、GASC1拮抗劑或GASC1抑制劑功能的藥物提供了有用的信息。本發(fā)明的效果本發(fā)明提供能夠調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)錄活化等的新基因。該基因用于例如闡明疾病的病理、診斷和/或治療疾病，其中都涉及這些活性，例如下述的惡性腫瘤。
如同已知的致癌基因，本發(fā)明基因編碼相關(guān)氨基酸序列C末端上的兩個(gè)PHD指狀結(jié)構(gòu)基元和一個(gè)PX結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步，本發(fā)明基因所在的染色體9p23-24區(qū)域的擴(kuò)增已在許多癌癥中被觀察到。分析本發(fā)明基因用于解釋該基因的功用和各種疾病之間的關(guān)系。所以，當(dāng)利用這種分析時(shí)，本發(fā)明基因通過(guò)檢查該基因在各種組織中的表達(dá)狀態(tài)或其體內(nèi)功能分析實(shí)現(xiàn)了各種疾病的基因診斷。
根據(jù)本發(fā)明，有可能以遺傳工程方式大量生產(chǎn)由本發(fā)明基因編碼的蛋白，也有可能生產(chǎn)針對(duì)該蛋白的抗體。該蛋白用于測(cè)定GASC1活性、與GASC1受體的結(jié)合活性以及其他功能。該蛋白及其抗體尤其用于疾病的病理說(shuō)明、診斷和治療，GASC1基因及其產(chǎn)物參與其中，例如癌癥。
此外，本發(fā)明提供本發(fā)明基因的反義鏈、用于基因治療含有相同反義鏈的基因轉(zhuǎn)移載體、內(nèi)含所述載體的細(xì)胞、包含所述載體或細(xì)胞作為活性成分的基因治療劑，以及利用相同物質(zhì)的基因治療方法。具體而言，通過(guò)抑制生長(zhǎng)活性抗各種癌細(xì)胞，上述基因療法可用于治療各種癌癥。
圖2表示如實(shí)施例1-1中所述對(duì)食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系KYSE150進(jìn)行FISH分析的典型結(jié)果。
圖3表示實(shí)施例1-2中所述的測(cè)試結(jié)果。在該圖中，A表示GASC1在各種食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中擴(kuò)增的程度，以及B表示利用來(lái)自各種食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的RNA進(jìn)行RNA印跡分析的結(jié)果，這表明GASC1的過(guò)量表達(dá)。
圖4表示實(shí)施例1-2中所述的測(cè)試結(jié)果，這顯示本發(fā)明基因在各種正常人組織中的表達(dá)模式的檢查結(jié)果。
2)采用YAC和PAC作為探針的FISH測(cè)試對(duì)指定區(qū)域中YAC的定位的信息收集來(lái)自Whitehead研究所/MIT基因組中心(MIT Genome Center)(http//www-genome.Wi.Mit.Edu/)以及人類(lèi)分子細(xì)胞遺傳學(xué)資源(Resources for Human MolecularCytogenetics)(http//bioserver.uniba.it/FISH/rocchi/welcom.html)。
覆蓋人9p23-24區(qū)域的多種YAC克隆分離自Center d′Etude duPolymorphisme Humain(CEPH)的YAC文庫(kù)，以及FISH探針的準(zhǔn)備根據(jù)上述Shinomiya等的方法通過(guò)PCR利用Alu序列進(jìn)行。
PCR按照下列方式進(jìn)行。將YAC DNA 1μg(1μl)、具有SEQ IDNO4所示核苷酸序列的引物2484(30μM)1μl、具有SEQ ID NO5所示核苷酸序列的引物PDJ34(10μM)1μl、10×PCR緩沖液(ExTaq緩沖液，Takara Shuzo)10μl、2.5mM dNTP(Takara Shuzo)5μl、ExTaq聚合酶0.5μl以及水81.5μl(總100μl)混合，然后在95℃處理4分鐘(首先一次變性處理)，反應(yīng)共進(jìn)行30次循環(huán)(各個(gè)循環(huán)包括95℃-4分鐘、55℃-1分鐘和72℃-4分鐘)，接著在72℃進(jìn)行終處理(一次)7分鐘。上述全部反應(yīng)都采用Perkin-Elmer GeneAmp PCR system9700進(jìn)行。
一種PAC克隆子(由Peter Marynen博士贈(zèng)送)用作探針，其含有janua激酶2(JAK2，GenBank保藏編號(hào)為NM-004972)，是9p24圖中的已知基因。
采用生物素16-dUTP或地高辛11-dUTP(Boehringr Mannheim)通過(guò)缺口平移標(biāo)記上述探針。根據(jù)上述Shinomiya等的方法進(jìn)行染色體雜交信號(hào)的熒光檢測(cè)。
沖洗后，將載玻片上染色的影象和熒光信號(hào)利用CCD(冷電荷偶聯(lián)裝置)照相機(jī)(KAF 1400，Photometrics產(chǎn)品)同時(shí)進(jìn)行成像分析。
利用IP實(shí)驗(yàn)室光譜軟件(Signal Analytics Corp.產(chǎn)品)對(duì)DNA序列拷貝數(shù)的相對(duì)變化進(jìn)行分析。根據(jù)染色體在分裂中期和休眠期所觀察到的雜交模式來(lái)評(píng)估必要區(qū)域的拷貝數(shù)。當(dāng)熒光強(qiáng)度比率超過(guò)1.5時(shí)，可判斷此染色體區(qū)域表現(xiàn)出高水平的擴(kuò)增。
結(jié)果，通過(guò)前述的CGH分析，在本發(fā)明人所研究的29種食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中檢測(cè)到5種有9p上拷貝數(shù)的增加(17.2％)。發(fā)現(xiàn)在它們中間有一個(gè)存在更高水平的擴(kuò)增。在此CGH結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用8種YAC和一種PAC作為探針在KYSE150中進(jìn)行FISH分析。
3)結(jié)果結(jié)果顯示在

圖1中(圖1A和圖1B)。
在圖1中，A是9p23-24區(qū)域包括本發(fā)明基因的基因圖，在該圖中，“STSs(基因/ESTs)”代表序列-標(biāo)記的位點(diǎn)(基因/表達(dá)序列標(biāo)記)，“Tel”代表端粒邊，“Cen”代表著絲粒邊，以及“YACs/PAC”代表在FISH中所用的各個(gè)探針。
在圖1A中，由括號(hào)中所示的各自表達(dá)序列標(biāo)記(EST)所鑒定的已知基因和轉(zhuǎn)錄物表示在代表染色體的線上。這些基因和轉(zhuǎn)錄物用作DNA印跡中的探針。
FISH中所用的多種YAC(953A7、807B4、799D2、871F1、853F4、933F6、830E1和845G2)和一種PAC(PJ2B)由分別在染色體-標(biāo)志線以下被一個(gè)或多個(gè)白色小圓中斷的水平黑線來(lái)表示。這些水平線中的小圓分別顯示在YAC或PAC上標(biāo)記的固定點(diǎn)。此圖是示意圖，因此，其不反映YAC和PAC的真正大小和實(shí)際的標(biāo)記-標(biāo)記距離。
圖1B是在5種各自食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(在圖中顯示為KYSE70、KYSE450、KYSE890、KYSE1170和KYSE150)中的9p23擴(kuò)增子的示意圖，所述這些細(xì)胞系經(jīng)DNA印跡分析后指定(大約對(duì)應(yīng)于圖1A中的染色體-標(biāo)志線所示)。在該圖中，最小的重疊區(qū)域(SRO)由FISH與DNA印跡分析的結(jié)果一起指定。
圖2表示在KYSE150中FISH分析的典型結(jié)果，所述KYSE150是一種上述的食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系。
在該圖中，采用PACPJ2B、YAC799D2和YAC830E1克隆子進(jìn)行FISH的結(jié)果分別被從上到下顯示。在各圖象中，熒光點(diǎn)的數(shù)目表示DNA拷貝數(shù)。在各圖象中，縮寫(xiě)PJ2B、799D2和830E1與圖1A中所示的相同。
如圖2所示，YAC799D2產(chǎn)生了強(qiáng)烈的信號(hào)，如同在兩個(gè)標(biāo)記染色體上的均勻染色區(qū)域(HSR)。這說(shuō)明高水平的擴(kuò)增出現(xiàn)在該區(qū)域，其中包括YAC799D2。在807B4的情況下，以同樣方式進(jìn)行的FISH給出了相同的結(jié)果(未顯示)。
出現(xiàn)在YAC799D2(參見(jiàn)圖1A)兩邊的YAC953A7、871F1、853F4和933F6中FISH信號(hào)的數(shù)目范圍從4到9。然而，這些信號(hào)數(shù)目與YAC799D2和807B4比較要少得多。而采用PACPJ2B和YAC830E1，拷貝數(shù)僅為2到3。
為了對(duì)在9p23-24區(qū)域內(nèi)顯示最低水平擴(kuò)增的公共區(qū)域進(jìn)行鑒定，其他4種細(xì)胞系(KYSE70、450、890和1170)在前述的CGH分析中顯示了9p上拷貝數(shù)的增加，對(duì)這些細(xì)胞系也進(jìn)行了FISH分析。
結(jié)果在KYSE890和1170中，YAC799D2和807B4的雜交信號(hào)被檢測(cè)為小HSR模式。另一方面，在KYSE70和450中信號(hào)數(shù)為約6到9。然而在這些細(xì)胞系中，比在KYSE150中所檢測(cè)的擴(kuò)增區(qū)域更大的區(qū)域得到擴(kuò)增，因此在KYSE150中所測(cè)定的擴(kuò)增子大小不可能狹小。
因此，預(yù)測(cè)在9p23-24區(qū)域擴(kuò)增子中的目的基因應(yīng)出現(xiàn)在被YAC799D2和807B4所覆蓋的相對(duì)狹小的區(qū)域中。
2.DNA印跡分析和RNA印跡分析如同選自Whitehead研究所的基因組研究數(shù)據(jù)庫(kù)，在9p23-24區(qū)域中的8種EST克隆子((1)GYG2、(2)GLDC、(3)IMAGE克隆子131865(GenBank保藏編號(hào)R24542)、(4)SLC1A1、(5)CSNK1G2、(6)JAK2、(7)IMAGE克隆子650495(GenBank保藏編號(hào)AA219360)和(8)IMAGE克隆子30354(GenBank保藏編號(hào)R18567)；上述克隆(1)、(2)和(4)-(6)各是已知基因的部分以及(3)、(7)和(8)各是轉(zhuǎn)錄物的部分)都購(gòu)自Research Genetics公司，并用作DNA印跡和RNA印跡分析的探針。
將腫瘤DNA從通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(參考Sambrook，J.等，MolucularCloning，A Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)培養(yǎng)的各個(gè)食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中抽提出來(lái)。
對(duì)于DNA印跡分析，10μg的DNA從各細(xì)胞系或正常淋巴細(xì)胞中抽提出來(lái)，并用EcoRI消化，然后在0.8％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，接著轉(zhuǎn)移到聚酰胺膜(BIODYNE B，Nihon Pall產(chǎn)品)上。對(duì)于RNA印跡分析，20μg的總RNA從各細(xì)胞系中抽提出來(lái)，在1.0％瓊脂糖/0.67M甲醛凝膠上進(jìn)行電泳，接著轉(zhuǎn)移到聚酰胺膜(Hybond-N+，Amersham Pharmacia Biotech產(chǎn)品)上。
轉(zhuǎn)移后，在適當(dāng)條件下各膜與標(biāo)記有[α32P]dCTP的各個(gè)EST探針雜交，洗滌后，根據(jù)上述Shinomiya的方法雜交膜用于科達(dá)X-OMAT膠片的曝光。
為了比較不同人正常組織中的表達(dá)模式，將通過(guò)使用從12種不同組織(MTN-human 12泳道，Clontech產(chǎn)品)中抽提的RNA而制備的RNA印跡與標(biāo)記有[α32P]dCTP的IMAGE克隆131865(GenBank保藏編號(hào)R24542)雜交。
按照下列條件進(jìn)行DNA印跡分析1)預(yù)雜交和雜交緩沖液含有變性鮭魚(yú)精子DNA(200mg/ml)和人胎盤(pán)DNA(200mg/ml)的PEG/SDS溶液(7％PEG8000，10％SDS)；2)預(yù)雜交條件在65℃下連續(xù)攪拌12-16小時(shí)；3)雜交條件在65℃下連續(xù)攪拌12-16小時(shí)；4)洗滌用洗滌溶液1(2×SSC，0.1％SDS)在55℃下連續(xù)攪拌15分鐘，然后用洗滌溶液2(0.1×SSC，0.1％SDS)在55℃下連續(xù)攪拌15分鐘，接著用2×SSC漂洗。
按照下列條件進(jìn)行RNA印跡分析1)預(yù)雜交和雜交緩沖液采用ExpressHyb(Clontech)；2)預(yù)雜交條件在68℃下連續(xù)攪拌30分鐘；3)雜交條件在68℃下連續(xù)攪拌1小時(shí)；4)洗滌用洗滌溶液1(2×SSC，0.1％SDS)在55℃下連續(xù)攪拌30分鐘，然后用洗滌溶液2(0.1×SSC，0.1％SDS)在55℃下連續(xù)攪拌15分鐘，接著用2×SSC漂洗。
結(jié)果，在CGH和FISH測(cè)試中，利用三種EST探針即糖原素2(glycogenin 2)(GYG2)和位于YAC799D2上的甘氨酸脫氫酶(GLDC)以及IMAGE克隆131865(GenBank保藏編號(hào)R24542)，對(duì)食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系進(jìn)行DNA印跡分析，在5種已顯示9p上拷貝數(shù)增加的細(xì)胞系中表現(xiàn)了擴(kuò)增模式。
與之相反的是，在KYSE150中用于區(qū)域外基因或未知轉(zhuǎn)錄物的探針即SLC1A1、一種溶質(zhì)載體家族、JAK2、酪蛋白激酶1γ2(CSNK1G2)、IMAGE克隆650495(GenBank保藏編號(hào)AA219360)和IMAGE克隆350354(GenBank保藏編號(hào)R18567)并未顯示擴(kuò)增(對(duì)于這些探針，參照?qǐng)D1B)。
根據(jù)食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系DNA和正常DNA之間的雜交信號(hào)的比較，在粗略估計(jì)擴(kuò)增的程度后表明，首先的三種探針(GYG2、GLDC和IMAGE克隆131865)在KYSE150中顯示了至少12倍的擴(kuò)增，以及在其他四種細(xì)胞系中3-6倍的擴(kuò)增得到證實(shí)(參見(jiàn)圖3A)。
圖3A表示GASC1在食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的擴(kuò)增。利用IMAGE克隆131865作為探針以上述方式通過(guò)DNA印跡獲得該圖。
從該圖可看出，在8種食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中，正常人外周血淋巴細(xì)胞-衍生的DNA(N)上的信號(hào)要比KYSE70、150、450、890和1170弱，但強(qiáng)于1250和1260，并與110相當(dāng)。這說(shuō)明IMAGE克隆131865在KYSE70、150、450、890和1170中得到擴(kuò)增。
圖3B顯示RNA印跡分析的結(jié)果，利用IMAGE克隆131865(GASC1)或?qū)φ?GAPDH)作為探針，將如圖3A中所用的同樣8種食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系各個(gè)的總RNA進(jìn)行雜交，以獲得圖3B中的結(jié)果。
從該圖中，顯然GASC1基因在5種食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中過(guò)量表達(dá)，所述5種細(xì)胞系在圖3A中表現(xiàn)擴(kuò)增(KYSE70、KYSE150、KYSE450、KYSE890和KYSE1170)。
進(jìn)一步，圖4顯示本發(fā)明基因在正常人組織中表達(dá)的檢查結(jié)果。
該圖顯示利用從12種不同的組織中抽提出來(lái)的RNA樣品與標(biāo)記有[α32P]dCTP的IMAGE克隆131865進(jìn)行RNA印跡雜交所產(chǎn)生的結(jié)果。所用的此雜交程序與圖3B中的情形相同。
依據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行如下討論。
對(duì)三種未知轉(zhuǎn)錄物(IMAGE克隆131865、650495和30354)的表達(dá)水平進(jìn)行分析的RNA印跡的結(jié)果揭示，僅IMAGE克隆131865在9p23-24上顯示擴(kuò)增的細(xì)胞系中顯示過(guò)量表達(dá)(參見(jiàn)圖3B)。
該結(jié)果說(shuō)明IMAGE克隆131865是出現(xiàn)在這種擴(kuò)增子內(nèi)的部分候選擴(kuò)增靶基因。所以，利用此克隆對(duì)全長(zhǎng)基因進(jìn)行克隆，并且對(duì)序列進(jìn)行了測(cè)定。
利用來(lái)自多種與IMAGE克隆131865雜交的人正常組織的RNA而產(chǎn)生的RNA印跡揭示出了在所有組織中的一種信號(hào)轉(zhuǎn)錄物4.5kb的表達(dá)(參見(jiàn)圖4)。
3.cDNA文庫(kù)篩選和DNA序列測(cè)定利用寡帽(oligo cap)方法(Maruyama，K.等，Gene，138，171-174(1994))和ZAP-cDNA GigaPACK III Gold克隆試劑盒(stratagene)從胃癌細(xì)胞系(HSC39)中構(gòu)建兩個(gè)cDNA文庫(kù)。
利用IMAGE克隆131865(其部分序列是已知的，該序列具有GenBank保藏編號(hào)R24542)作為探針對(duì)各個(gè)文庫(kù)進(jìn)行篩選。
作為篩選結(jié)果，分離到6個(gè)重疊的cDNA克隆，采用型號(hào)377 ABI的全自動(dòng)測(cè)序儀(PE Biosystems)測(cè)定它們的DNA序列。以這種方式，找到了由4235個(gè)核苷酸組成的轉(zhuǎn)錄物。
該轉(zhuǎn)錄物在大小上與通過(guò)RNA印跡分析所顯示的轉(zhuǎn)錄物符合一致，因此，該cDNA估計(jì)是全長(zhǎng)cDNA。
在核酸序列分析后發(fā)現(xiàn)，用于轉(zhuǎn)錄起始的共有序列(Kozak規(guī)則)是高度保守的，因此，推測(cè)轉(zhuǎn)錄應(yīng)在第147位核苷酸開(kāi)始。在由聚腺苷酸延伸而持續(xù)的3′端發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)AATAA聚腺苷酸化信號(hào)。因此，推導(dǎo)蛋白的氨基酸序列被鑒定為包含如SEQ ID NO1所示的1056個(gè)氨基酸殘基的序列。
來(lái)自GASC1的DNA序列(SEQ ID NO2所示)的第10到第3140位核苷酸的區(qū)域顯示顯著同源于KIAA0780的cDNA部分(GenBank保藏編號(hào)AB018323)。
此外，為了確認(rèn)分離的克隆的序列，利用來(lái)自已顯示過(guò)量表達(dá)的5種食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(KYSE-70、KYSE-150、KYSE-450、KYSE-890和KYSE-1170)每一種的RNA作為模板，與兩對(duì)引物一起，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，所述引物如下所示，根據(jù)從由篩選克隆131865而被分離的克隆中所測(cè)定的序列來(lái)制備。
用于這種RT-PCR中的引物的序列顯示在SEQ ID NO6-SEQ IDNO9中。
引物W1fSEQ ID NO6引物W1rSEQ ID NO7引物W2fSEQ ID NO8引物W2rSEQ ID NO9RT(反轉(zhuǎn)錄)反應(yīng)操作如下將1μg的RNA與0.5μg的寡脫氧胸苷酸引物混合(總量10μl)，在70℃變性處理10分鐘后，加入4μl的5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液(GIBCO)、1μl的核糖核酸酶抑制劑(TOYOBO)以及4μl的2.5mM dNTP(TAKARA)(總量為19μl)、再加入1μl的Superscript II(GIBCO)，并在42℃下溫育45分鐘。
利用GeneAmp PCR系統(tǒng)9700(Perkin-Elmer)進(jìn)行PCR。反應(yīng)操作如下將2μl的10×ExTaq緩沖液(TAKARA)、1.0μl的2.5mMdNTP(TAKARA)、0.5μl的10μM各個(gè)引物以及0.5單位的ExTaq(TAKARA)加入到1μl的RT產(chǎn)物中，并使總量達(dá)到20μl。至于反應(yīng)條件，起始在94℃下變性2分鐘，接著進(jìn)行25次循環(huán)，各循環(huán)包括94℃下30秒、58℃下30秒以及72℃下30秒，并進(jìn)一步在72℃延伸7分鐘。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)已產(chǎn)生單一條帶產(chǎn)物，其具有預(yù)測(cè)的大小，通過(guò)測(cè)定序列確認(rèn)是正確的。此外，包含DNA序列第238位到第638位的核苷酸的DNA片段利用W2f和W2r作為探針通過(guò)PCR生產(chǎn)，用[α32P]dCTP標(biāo)記，并與被含有IMAGE克隆(R24542)的YAC799D2點(diǎn)綴的聚酰胺膜(BIODYNE B，Nihon Pall產(chǎn)品)雜交，于是檢測(cè)信號(hào)，此外，擴(kuò)增信號(hào)顯示在5種腫瘤細(xì)胞系(KYSE70、KYSE150、KYSE450、KYSE890和KYSE1170)的所有DNA印跡上，所述5種細(xì)胞系在9p23-24區(qū)域中顯示擴(kuò)增。
對(duì)估計(jì)的氨基酸序列的分析暗示該基因產(chǎn)物含有兩個(gè)PHD指狀結(jié)構(gòu)和一個(gè)PX結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO1所示氨基酸序列中從第687位到第749位以及從第806位到第867位的序列是指狀結(jié)構(gòu)序列，而從第980位到第1047位的氨基酸序列是PX結(jié)構(gòu)域序列)。
利用PSORT II程序(參見(jiàn)http//psort.nibb.ac.jp/form2.html)，在對(duì)其胞內(nèi)定位進(jìn)行計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)中，一種典型的雙聯(lián)體核定位信號(hào)在GASC1蛋白第979位到第996位氨基酸上被檢測(cè)到，這暗示了胞核中的定位。
根據(jù)上述結(jié)果，含有PHD指狀結(jié)構(gòu)基元的GASC1基因，這些基元暗示其是候選的“致癌基因”，以及PX結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為在各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等中發(fā)揮重要作用，以及強(qiáng)烈暗示的是在染色體9p23-24區(qū)域中GASC1轉(zhuǎn)錄物的增加的表達(dá)后，所述基因應(yīng)是與各種類(lèi)型腫瘤的發(fā)生和/或發(fā)展相關(guān)的腫瘤伴隨基因(包括候選致癌基因)，也包括食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供新基因，即GASC1基因，其具有調(diào)節(jié)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)錄活化等的活性。利用該基因，闡明與所述活性相關(guān)的疾病例如惡性腫瘤的病理學(xué)和/或?qū)嵤┢湓\斷和治療等變?yōu)榭赡堋?br> 序列表<110>大塚制藥株式會(huì)社(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.)<120>GASC1基因(GASC1 gene)<130>SCT022782-09<150>JP 2000-174946<151>2000-6-12<160>9<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1056<212>PRT<213><400>1Met Glu Val Ala Glu Val Glu Ser Pro Leu Asn Pro Ser Cys Lys Ile1 5 10 15Met Thr Phe Arg Pro Ser Met Glu Glu Phe Arg Glu Phe Asn Lys Tyr20 25 30Leu Ala Tyr Met Glu Ser Lys Gly Ala His Arg Ala Gly Leu Ala Lys35 40 45Val Ile Pro Pro Lys Glu Trp Lys Pro Arg Gln Cys Tyr Asp Asp Ile50 55 60Asp Asn Leu Leu Ile Pro Ala Pro Ile Gln Gln Met Val Thr Gly Gln65 70 75 80Ser Gly Leu Phe Thr Gln Tyr Ash Ile Gln Lys Lys Ala Met Thr Val85 90 95Lys Glu Phe Arg Gln Leu Ala Asn Ser Gly Lys Tyr Cys Thr Pro Arg100 105 110Tyr Leu Asp Tyr Glu Asp Leu Glu Arg Lys Tyr Trp Lys Asn Leu Thr115 120 125Phe Val Ala Pro Ile Tyr Gly Ala Asp Ile Asn Gly Ser Ile Tyr Asp130 135 140Glu Gly Val Asp Glu Trp Asn Ile Ala Arg Ile Asn Thr Val Leu Asp145 150 155 160Val Val Glu Glu Glu Cys Gly Ile Ser Ile Glu Gly Val Asn Thr Pro165 170 175Tyr Leu Tyr Phe Gly Met Trp Lys Thr Thr Phe Ala Trp His Thr Glu180 185 190Asp Met Asp Leu Tyr Ser Ile Asn Tyr Leu His Phe Gly Glu Pro Lys195 200 205Ser Trp Tyr Ala Ile Pro Pro Glu His Gly Lys Arg Leu Glu Arg Leu210 215 220Ala Gln Gly Phe Phe Pro Ser Ser Ser Gln Gly Cys Asp Ala Phe Leu225 230 235 240Arg His Lys Met Thr Leu Ile Ser Pro Ser Val Leu Lys Lys Tyr Gly245 250 255Ile Pro Phe Asp Lys Ile Thr Gln Glu Ala Gly Glu Phe Met Ile Thr260 265 270Phe Pro Tyr Gly Tyr His Ala Gly Phe Asn His Gly Phe Asn Cys Ala275 280 285Glu Ser Thr Asn Phe Ala Thr Val Arg Trp Ile Asp Tyr Gly Lys Val290 295 300Ala Lys Leu Cys Thr Cys Arg Lys Asp Met Val Lys Ile Ser Met Asp305 310 315 320Ile Phe Val Arg Lys Phe Gln Pro Asp Arg Tyr Gln Leu Trp Lys Gln325 330 335Gly Lys Asp Ile Tyr Thr Ile Asp His Thr Lys Pro Thr Pro Ala Ser340 345 350Thr Pro Glu Val Lys Ala Trp Leu Gln Arg Arg Arg Lys Val Arg Lys355 360 365Ala Ser Arg Ser Phe Gln Cys Ala Arg Ser Thr Ser Lys Arg Pro Lys370 375 380Ala Asp Glu Glu Glu Glu Val Ser Asp Glu Val Asp Gly Ala Glu Val385 390 395 400Pro Asn Pro Asp Ser Val Thr Asp Asp Leu Lys Val Ser Glu Lys Ser405 410 415Glu Ala Ala Val Lys Leu Arg Asn Thr Glu Ala Ser Ser Glu Glu Glu420 425 430Ser Ser Ala Ser Arg Met Gln Val Glu Gln Asn Leu Ser Asp His Ile435 440 445Lys Leu Ser Gly Asn Ser Cys Leu Ser Thr Ser Val Thr Glu Asp Ile450 455 460Lys Thr Glu Asp Asp Lys Ala Tyr Ala Tyr Arg Ser Val Pro Ser Ile465 470 475 480Ser Ser Glu Ala Asp Asp Ser Ile Pro Leu Ser Thr Gly Tyr Glu Lys485 490 495Pro Glu Lys Ser Asp Pro Ser Glu Leu Ser Trp Pro Lys Ser Pro Glu500 505 510Ser Cys Ser Ser Val Ala Glu Ser Asn Gly Val Leu Thr Glu Gly Glu515 520 525Glu Ser Asp Val Glu Ser His Gly Asn Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ile530 535 540Pro Ala Val Pro Ser Gly Glu Arg Asn Ser Phe Lys Val Pro Ser Ile545 550 555 560Ala Glu Gly Glu Asn Lys Thr Ser Lys Ser Trp Arg His Pro Leu Ser565 570 575Arg Pro Pro Ala Arg Ser Pro Met Thr Leu Val Lys Gln Gln Ala Pro
580 585 590Ser Asp Glu Glu Leu Pro Glu Val Leu Ser Ile Glu Glu Glu Val Glu595 600 605Glu Thr Glu Ser Trp Ala Lys Pro Leu Ile His Leu Trp Gln Thr Lys610 615 620Ser Pro Asn Phe Ala Ala Glu Gln Glu Tyr Asn Ala Thr Val Ala Arg625 630 635 640Met Lys Pro His Cys Ala Ile Cys Thr Leu Leu Met Pro Tyr His Lys645 650 655Pro Asp Ser Ser Asn Glu Glu Asn Asp Ala Arg Trp Glu Thr Lys Leu660 665 670Asp Glu Val Val Thr Ser Glu Gly Lys Thr Lys Pro Leu Ile Pro Glu675 680 685Met Cys Phe Ile Tyr Ser Glu Glu Asn Ile Glu Tyr Ser Pro Pro Asn690 695 700Ala Phe Leu Glu Glu Asp Gly Thr Ser Leu Leu Ile Ser Cys Ala Lys705 710 715 720Cys Cys Val Arg Val His Ala Ser Cys Tyr Gly Ile Pro Ser His Glu725 730 735Ile Cys Asp Gly Trp Leu Cys Ala Arg Cys Lys Arg Asn Ala Trp Thr740 745 750Ala Glu Cys Cys Leu Cys Asn Leu Arg Gly Gly Ala Leu Lys Gln Thr755 760 765Lys Asn Asn Arg Trp Ala His Val Met Cys Ala Val Ala Val Pro Glu770 775 780Val Arg Phe Thr Asn Val Pro Glu Arg Thr Gln Ile Asp Val Gly Arg785 790 795 800Ile Pro Leu Gln Arg Leu Lys Leu Lys Cys Ile Phe Cys Arg His Arg805 810 815Val Lys Arg Val Ser Gly Ala Cys Ile Gln Cys Ser Tyr Gly Arg Cys820 825 830Pro Ala Ser Phe His Val Thr Cys Ala His Ala Ala Gly Val Leu Met835 840 845Glu Pro Asp Asp Trp Pro Tyr Val Val Asn Ile Thr Cys Phe Arg His850 855 860Lys Val Asn Pro Asn Val Lys Ser Lys Ala Cys Glu Lys Val Ile Ser865 870 875 880Val Gly Gln Thr Val Ile Thr Lys His Arg Asn Thr Arg Tyr Tyr Ser885 890 895Cys Arg Val Met Ala Val Thr Ser Gln Thr Phe Tyr Glu Val Met Phe900 905 910Asp Asp Gly Ser Phe Ser Arg Asp Thr Phe Pro Glu Asp Ile Val Ser915 920 925Arg Asp Cys Leu Lys Leu Gly Pro Pro Ala Glu Gly Glu Val Val Gln
930 935 940Val Lys Trp Pro Asp Gly Lys Leu Tyr Gly Ala Lys Tyr Phe Gly Ser945 950 955 960Asn Ile Ala His Met Tyr Gln Val Glu Phe Glu Asp Gly Ser Gln Ile965 970 975Ala Met Lys Arg Glu Asp Ile Tyr Thr Leu Asp Glu Glu Leu Pro Lys980 985 990Arg Val Lys Ala Arg Phe Ser Thr Ala Ser Asp Met Arg Phe Glu Asp99510001005Thr Phe Tyr Gly Ala Asp Ile Ile Gln Gly Glu Arg Lys Arg Gln Arg101010151020Val Leu Ser Ser Arg Phe Lys Asn Glu Tyr Val Ala Asp Pro Val Tyr1025 103010351040Arg Thr Phe Leu Lys Ser Ser Phe Gln Lys Lys Cys Gln Lys Arg Gln104510501055<210>2<211>3168<212>DNA<213>人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(KYSE)<400>2atggaggtgg ccgaggtgga aagtcctctg aaccccagct gtaagataat gaccttcaga 60ccctccatgg aggagttccg ggagttcaac aaataccttg catacatgga gtctaaagga 120gcccatcgtg cgggtcttgc aaaggtgatt cctcctaagg agtggaagcc aagacagtgc 180tatgatgaca ttgataattt gctcattcca gcaccaattc agcagatggt cacagggcag 240tcaggactgt tcactcagta caacatccag aaaaaagcga tgactgtgaa ggagttcagg 300cagctggcca acagtggcaa atattgtact ccaagatact tggattacga agatttggag 360cgcaagtact ggaagaactt aacttttgtg gcacctatct atggtgcaga tattaatggg 420agcatatatg atgagggtgt ggatgaatgg aacatagctc gcatcaatac agtcttggat 480gtggttgaag aagagtgtgg catttctatt gagggtgtaa ataccccata tctctatttt 540ggcatgtgga agaccacgtt tgcatggcac accgaagaca tggacctcta tagcattaat 600tatctccact ttggagagcc caagtcttgg tatgctatac ctccggagca tggaaaacga 660cttgaaagac tagctcaagg ttttttccca agcagctccc aagggtgtga tgcatttctt 720cgccacaaga tgacattgat ttctccatca gtattgaaga aatatggtat tccctttgac 780aagataaccc aggaggctgg agaattcatg atcactttcc catatggcta ccatgctggt 840tttaatcatg gtttcaactg tgcagaatct acaaattttg ctactgtcag atggattgac 900tatggaaaag ttgccaaatt gtgcacttgc aggaaagaca tggtgaagat ttcaatggat 960atctttgtga ggaaatttca gccagacaga tatcagcttt ggaaacaagg aaaggatata 1020tacaccattg atcacacgaa gcctactcca gcatccaccc ctgaagtaaa agcatggctg 1080cagaggagga ggaaagtaag aaaagcatcc cgaagcttcc agtgtgctag gtctacctct 1140aaaaggccta aggctgatga ggaagaggaa gtgtcagatg aagtcgatgg ggcagaggtc 1200cctaaccccg actcagtcac agatgacctc aaggtcagtg aaaagtcaga agcagcagtg 1260aagctgagga acacagaagc atcttcagaa gaagagtcat ctgctagcag gatgcaggtg 1320gagcagaatt tatcagatca tatcaaactc tcaggaaaca gctgcttaag tacatctgta 1380acagaagaca taaaaactga ggatgacaaa gcttatgcat atagaagtgt accttctata 1440tccagtgagg ctgatgattc cattccattg tctactggct atgagaagcc cgagaaatca 1500gacccatccg agctttcatg gccaaagtca cctgagtcat gctcatcagt ggcagagagt 1560aatggtgtgt taacagaggg agaagagagt gatgtggaga gccatgggaa tggccttgaa 1620cctggggaaa tcccagcggt ccccagtgga gagagaaata gcttcaaagt ccccagtata 1680gcagagggag agaacaaaac ctctaagagt tggcgccatc cacttagcag gcctccagca 1740agatctccga tgactcttgt gaagcagcag gcgccaagtg atgaagaatt gcctgaggtt 1800ctgtccattg aggaggaagt ggaagaaaca gagtcttggg cgaaacctct catccacctt 1860tggcagacga agtcccctaa cttcgcagct gagcaagagt ataatgcaac agtggccagg 1920atgaagccac actgtgccat ctgcactctg ctcatgccgt accacaagcc agatagcagc 1980aatgaagaaa atgatgctag atgggagaca aaattagatg aagtcgttac atcggaggga 2040aagactaagc ccctcatacc agagatgtgt tttatttata gtgaagaaaa tatagaatat 2100tctccaccca atgccttcct tgaagaggat ggaacaagtc tccttatttc ctgtgcaaag 2160tgctgcgtac gggttcatgc aagttgttat ggtattcctt ctcatgagat ctgtgatgga 2220tggctgtgtg cccggtgcaa aagaaatgcg tggacagcag aatgctgtct ctgcaatttg 2280agaggaggtg ctcttaagca aacgaagaac aataggtggg cccatgtcat gtgcgccgtt 2340gcggtcccag aagttcgatt cactaatgtc ccagaaagga cacaaataga tgtaggcaga 2400atacctttac agaggttaaa attgaaatgc atcttctgca gacaccgggt taagagggtc 2460tctggagcct gcatccagtg ttcctacggt cgctgcccgg cctccttcca tgtcacttgt 2520gcccatgctg ctggggtact gatggagcct gatgattggc cttatgtggt gaacattaca 2580tgctttcgac ataaggtcaa ccccaacgtg aagtccaagg cttgcgagaa ggtcatttcc 2640gtgggtcaaa cggtcatcac gaagcatcgg aacacccggt attacagttg cagagtgatg 2700gctgtgacat cgcagacctt ctatgaggtc atgtttgatg atggctcctt tagcagagac 2760acatttcctg aggatatcgt gagccgagac tgtctgaagc tgggcccacc tgctgaggga 2820gaagtcgtcc aagtcaagtg gcccgatggc aaactctatg gagcaaaata ttttggatca 2880aatattgccc acatgtacca ggttgagttt gaagatggat cccagatagc aatgaagaga 2940gaggacatct acactttaga tgaagagtta cccaagagag tgaaagctcg attttccaca 3000gcctctgaca tgcgatttga agacacgttt tatggagcag acattatcca aggggagaga 3060aagagacaaa gagtgctgag ctccaggttt aagaatgaat atgtggccga ccctgtatac 3120cgcacttttt tgaagagctc tttccagaag aagtgccaga agagacag 3168<210>3<211>4235<212>DNA<213>人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(KYSE)<220><221>CDS<222>(147)..(3314)<400>3cggcacgaga acagctgtca cctagtgcgg aacaagtctc ccaaatttcc caaatctccc 60tgggccggag gccactgtct tctcttcctc ctccaccgag tcgtgctctc gccccaaccc 120gcgcgccaga cactgcccta accatc atg gag gtg gcc gag gtg gaa agt cct 173Met Glu Val Ala Glu Val Glu Ser Pro1 5ctg aac ccc agc tgt aag ata atg acc ttc aga ccc tcc atg gag gag221Leu Asn Pro Ser Cys Lys Ile Met Thr Phe Arg Pro Ser Met Glu Glu10 15 20 25ttc cgg gag ttc aac aaa tac ctt gca tac atg gag tct aaa gga gcc269Phe Arg Glu Phe Asn Lys Tyr Leu Ala Tyr Met Glu Ser Lys Gly Ala30 35 40cat cgt gcg ggt ctt gca aag gtg att cct cct aag gag tgg aag cca317His Arg Ala Gly Leu Ala Lys Val Ile Pro Pro Lys Glu Trp Lys Pro45 50 55aga cag tgc tat gat gac att gat aat ttg ctc att cca gca cca att365Arg Gln Cys Tyr Asp Asp Ile Asp Asn Leu Leu Ile Pro Ala Pro Ile60 65 70cag cag atg gtc aca ggg cag tca gga ctg ttc act cag tac aac atc413Gln Gln Met Val Thr Gly Gln Ser Gly Leu Phe Thr Gln Tyr Asn Ile75 80 85cag aaa aaa gcg atg act gtg aag gag ttc agg cag ctg gcc aac agt461Gln Lys Lys Ala Met Thr Val Lys Glu Phe Arg Gln Leu Ala Asn Ser90 95 100 105ggc aaa tat tgt act cca aga tac ttg gat tac gaa gat ttg gag cgc509Gly Lys Tyr Cys Thr Pro Arg Tyr Leu Asp Tyr Glu Asp Leu Glu Arg110 115 120aag tac tgg aag aac tta act ttt gtg gca cct atc tat ggt gca gat557Lys Tyr Trp Lys Asn Leu Thr Phe Val Ala Pro Ile Tyr Gly Ala Asp125 130 135att aat ggg agc ata tat gat gag ggt gtg gat gaa tgg aac ata gct605Ile Asn Gly Ser Ile Tyr Asp Glu Gly Val Asp Glu Trp Asn Ile Ala140 145 150cgc atc aat aca gtc ttg gat gtg gtt gaa gaa gag tgt ggc att tct653Arg Ile Asn Thr Val Leu Asp Val Val Glu Glu Glu Cys Gly Ile Ser155 160 165att gag ggt gta aat acc cca tat ctc tat ttt ggc atg tgg aag acc701Ile Glu Gly Val Asn Thr Pro Tyr Leu Tyr Phe Gly Met Trp Lys Thr170 175 180 185acg ttt gca tgg cac acc gaa gac atg gac ctc tat agc att aat tat749Thr Phe Ala Trp His Thr Glu Asp Met Asp Leu Tyr Ser Ile Asn Tyr190 195 200ctc cac ttt gga gag ccc aag tct tgg tat gct ata cct ccg gag cat797Leu His Phe Gly Glu Pro Lys Ser Trp Tyr Ala Ile Pro Pro Glu His205 210 215gga aaa cga ctt gaa aga cta gct caa ggt ttt ttc cca agc agc tcc845Gly Lys Arg Leu Glu Arg Leu Ala Gln Gly Phe Phe Pro Ser Ser Ser220 225 230caa ggg tgt gat gca ttt ctt cgc cac aag atg aca ttg att tct cca893Gln Gly Cys Asp Ala Phe Leu Arg His Lys Met Thr Leu Ile Ser Pro
235 240 245tca gta ttg aag aaa tat ggt att ccc ttt gac aag ata acc cag gag941Ser Val Leu Lys Lys Tyr Gly Ile Pro Phe Asp Lys Ile Thr Gln Glu250 255 260 265gct gga gaa ttc atg atc act ttc cca tat ggc tac cat gct ggt ttt989Ala Gly Glu Phe Met Ile Thr Phe Pro Tyr Gly Tyr His Ala Gly Phe270 275 280aat cat ggt ttc aac tgt gca gaa tct aca aat ttt gct act gtc aga1037Asn His Gly Phe Asn Cys Ala Glu Ser Thr Asn Phe Ala Thr Val Arg285 290 295tgg att gac tat gga aaa gtt gcc aaa ttg tgc act tgc agg aaa gac1085Trp Ile Asp Tyr Gly Lys Val Ala Lys Leu Cys Thr Cys Arg Lys Asp300 305 310atg gtg aag att tca atg gat atc ttt gtg agg aaa ttt cag cca gac1133Met Val Lys Ile Ser Met Asp Ile Phe Val Arg Lys Phe Gln Pro Asp315 320 325aga tat cag ctt tgg aaa caa gga aag gat ata tac acc att gat cac1181Arg Tyr Gln Leu Trp Lys Gln Gly Lys Asp Ile Tyr Thr Ile Asp His330 335 340 345acg aag cct act cca gca tcc acc cct gaa gta aaa gca tgg ctg cag1229Thr Lys Pro Thr Pro Ala Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Trp Leu Gln350 355 360agg agg agg aaa gta aga aaa gca tcc cga agc ttc cag tgt gct agg1277Arg Arg Arg Lys Val Arg Lys Ala Ser Arg Ser Phe Gln Cys Ala Arg365 370 375tct acc tct aaa agg cct aag gct gat gag gaa gag gaa gtg tca gat1325Ser Thr Ser Lys Arg Pro Lys Ala Asp Glu Glu Glu Glu Val Ser Asp380 385 390gaa gtc gat ggg gca gag gtc cct aac ccc gac tca gtc aca gat gac1373Glu Val Asp Gly Ala Glu Val Pro Asn Pro Asp Ser Val Thr Asp Asp395 400 405ctc aag gtc agt gaa aag tca gaa gca gca gtg aag ctg agg aac aca1421Leu Lys Val Ser Glu Lys Ser Glu Ala Ala Val Lys Leu Arg Asn Thr410 415 420 425gaa gca tct tca gaa gaa gag tca tct gct agc agg atg cag gtg gag1469Glu Ala Ser Ser Glu Glu Glu Ser Ser Ala Ser Arg Met Gln Val Glu430 435 440cag aat tta tca gat cat atc aaa ctc tca gga aac agc tgc tta agt1517Gln Asn Leu Ser Asp His Ile Lys Leu Ser Gly Asn Ser Cys Leu Ser445 450 455aca tct gta aca gaa gac ata aaa act gag gat gac aaa gct tat gca1565Thr Ser Val Thr Glu Asp Ile Lys Thr Glu Asp Asp Lys Ala Tyr Ala460 465 470tat 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1.一種被分離的DNA分子，其包括下列多核苷酸(a)-(d)中的一種(a)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列組成；(b)與SEQ ID NO2所示核苷酸序列比較具有至少95％同源性的多核苷酸；(c)在嚴(yán)格條件下，能與SEQ ID NO2所示的核苷酸序列雜交的多核苷酸；(d)與上述多核苷酸(a)或(b)互補(bǔ)的多核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的被分離的DNA分子，其是編碼由SEQ IDNO1所示氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的被分離的DNA分子，其具有SEQ IDNO2所示的核苷酸序列。
4.一種表達(dá)產(chǎn)物，其包括SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
5.一種重組表達(dá)載體，其包括根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的被分離的DNA分子。
6.一種重組表達(dá)載體，其包括根據(jù)權(quán)利要求3所述的被分離的DNA分子。
7.一種宿主細(xì)胞，其內(nèi)含根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體。
8.一種宿主細(xì)胞，其內(nèi)含根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體。
9.一種GASC1檢測(cè)用探針，其具有包括SEQ ID NO2所示核苷酸序列中的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的GASC1檢測(cè)用探針，其具有包括SEQID NO2所示核苷酸序列中的至少30個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
11.一種癌癥診斷劑，其包括根據(jù)權(quán)利要求9所述的探針作為活性成分。
12.一種癌癥診斷劑，其包括根據(jù)權(quán)利要求10所述的探針作為活性成分。
13.一種癌癥診斷試劑盒，其包括根據(jù)權(quán)利要求9所述的探針作為活性成分。
14.一種癌癥診斷試劑盒，其包括根據(jù)權(quán)利要求10所述的探針作為活性成分。
15.一種抗體或抗體片段，其能夠與根據(jù)權(quán)利要求1所述的被分離的DNA分子的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合。
16.一種診斷癌癥的方法，其包括下列步驟制備生物樣品，制備根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體或抗體片段，以及將所述樣品與所述抗體或抗體片段免疫反應(yīng)并且檢測(cè)樣品中的免疫反應(yīng)產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明提供例如基因，其包括編碼具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸。該基因顯示在9p23－24區(qū)域中的擴(kuò)增，具有PX結(jié)構(gòu)域和PHD指狀結(jié)構(gòu)基元，在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化以及腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了重要作用，以及用于闡明各種由蛋白導(dǎo)致的疾病的病理學(xué)，所述蛋白參與惡性腫瘤等中的細(xì)胞分化，并用于這些疾病的診斷和治療。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1436236SQ01811036
公開(kāi)日2003年8月13日 申請(qǐng)日期2001年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月12日
發(fā)明者稻澤讓治, 井本逸勢(shì) 申請(qǐng)人:大塚制藥株式會(huì)社