檢測(cè)蘋(píng)果銹果類病毒的nasba引物、試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)蘋(píng)果銹果類病毒的NASBA引物、試劑盒和方法，上游引物、下游引物的序列分別為 SEQ ID NO:1～2；NASBA擴(kuò)增試劑盒，包括如下組分：（1）NASBA擴(kuò)增反應(yīng)液A；（2）NASBA擴(kuò)增反應(yīng)液B；檢測(cè)方法如下：1）樣品RNA的提?。?）進(jìn)行ASSVd的NASBA擴(kuò)增；3）電泳檢測(cè)。本發(fā)明適用于對(duì)蘋(píng)果銹果類病毒進(jìn)行快速檢測(cè)確證，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境中的疫情監(jiān)控及進(jìn)出口貿(mào)易中該類病毒的監(jiān)測(cè)及檢測(cè)，操作極為簡(jiǎn)便，所需樣品量小且對(duì)于模板RNA的質(zhì)量要求較低。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)蘋(píng)果銹果類病毒的NASBA引物、試劑盒和方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)蘋(píng)果銹果類病毒的NASBA引物、試劑盒和方法，屬于植物病原的檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]【背景技術(shù)】:
蘋(píng)果銹果類病毒{Apple scar skid viroid, ASSVd)歸于蘋(píng)果銹果類病毒屬(Apscaviroid)，粒體由330個(gè)核苷酸組成。蘋(píng)果銹果類病毒的侵染寄主是蘋(píng)果和梨。感病的蘋(píng)果因品種和環(huán)境條件的變化表現(xiàn)出5種顯性病癥:銹果型、花臉型、銹果-花臉型、環(huán)斑型和綠點(diǎn)型，感病的梨大多數(shù)表現(xiàn)為隱性，少數(shù)為畸形果。由于類病毒在寄主植物細(xì)胞核中復(fù)制和累積，在感病寄主的葉、莖、皮、砧木，以及果實(shí)的表皮、果肉和種子中均可檢測(cè)出類病毒。因此，感染類病毒的果樹(shù)終生帶毒，并通過(guò)嫁接和修剪工具傳染的途徑使類病毒病蔓延。許多國(guó)家的蘋(píng)果樹(shù)和梨樹(shù)中均發(fā)現(xiàn)ASSVd的危害，我國(guó)東北、西北、華北，以及江蘇、安徽、山西和山東等地亦有發(fā)生。目前尚未有蘋(píng)果銹果類病毒的恒溫?cái)U(kuò)增方面的檢測(cè)技術(shù)的發(fā)明報(bào)道。因此，建立簡(jiǎn)單實(shí)用的蘋(píng)果銹果類病毒新型檢測(cè)鑒定方法，對(duì)于提高蘋(píng)果銹果類病毒的檢疫檢驗(yàn)效率、防止蘋(píng)果銹果類病毒的傳入、傳出，保護(hù)我國(guó)農(nóng)業(yè)的安全生產(chǎn)，促進(jìn)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的順利出口，具有十分重要的意義。植物類病毒由于不顯性侵染比較普遍，癥狀表現(xiàn)受環(huán)境溫度的影響較大，而且?guī)追N鑒別植物對(duì)不同類病毒的反應(yīng)癥狀相似，故難于應(yīng)用生物測(cè)定的方法。由于類病毒不能產(chǎn)生任何蛋白質(zhì)，所以也不能使用檢測(cè)病毒的電鏡、血清學(xué)方法。因此，選用分子生物學(xué)方法對(duì)蘋(píng)果銹果類病毒進(jìn)行檢測(cè)。
[0003]NASBA (Nuleic and sequence based amplipicain, NASBA)即“核酸序列依賴性擴(kuò)增”檢測(cè)技術(shù)是一種經(jīng)典的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，適用于單鏈核糖核酸RNA —步擴(kuò)增及檢測(cè)，已廣泛應(yīng)用于人類及動(dòng)植物病原的檢測(cè)與診斷。NASBA是由一對(duì)引物引導(dǎo)的，在含有T7 RNA聚合酶、RNAseH、反轉(zhuǎn)錄酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各種反應(yīng)緩沖液所組成的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中，通過(guò)連續(xù)均一的體外特異性酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)核苷酸序列的等溫?cái)U(kuò)增。
[0004]由于細(xì)胞壁中富含大量的多糖、酚類物質(zhì)，植物病毒RNA的提取存在著穩(wěn)定性差、重復(fù)性低、效率低等問(wèn)題，加之在提取過(guò)程中RNA本身的自降解現(xiàn)象，病毒RNA的含量往往較低，對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度和穩(wěn)定性提出了較高要求。同時(shí)由于多糖等物質(zhì)對(duì)于Taq聚合酶的抑制作用，限制了 RT-PCR技術(shù)在葡萄、草莓、糧谷類等多酚含量較高的植物病毒RNA檢測(cè)中的應(yīng)用。由于NASBA技術(shù)的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程被直接合并到擴(kuò)增反應(yīng)中，因此NASBA具備了適合于病原RNA的擴(kuò)增、檢測(cè)的特點(diǎn)，最適合各種RNA樣品的分析，符合植物病毒檢疫的要求，鑒于蘋(píng)果銹果類病毒危害的嚴(yán)重性，加強(qiáng)環(huán)境中的的監(jiān)控，提高檢測(cè)效率，對(duì)于有效控制蘋(píng)果銹果類病毒的傳播在現(xiàn)階段具有重要的實(shí)際意義。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于檢測(cè)蘋(píng)果銹果類病毒的NASBA引物，試劑盒和方法。其主要原理是利用一對(duì)引物引導(dǎo)，在含有T7 RNA聚合酶、RNAseH、反轉(zhuǎn)錄酶AMV、NTP,dNTP及需要使用的各種反應(yīng)緩沖液所組成的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中，通過(guò)連續(xù)均一的體外特異性酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)核苷酸序列的等溫?cái)U(kuò)增NASBA。經(jīng)過(guò)循環(huán)反復(fù)，使RNA不斷擴(kuò)增，對(duì)樣品中的蘋(píng)果銹果類病毒進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)，首先依據(jù)蘋(píng)果銹果類病毒全基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物；再提取待測(cè)樣品的核糖核酸(RNA)，然后分別以特異性引物進(jìn)行NASBA擴(kuò)增；用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，最后根據(jù)NASBA擴(kuò)增結(jié)果來(lái)判定樣品中是否含有蘋(píng)果銹果類病毒。
[0007]本發(fā)明用于檢測(cè)蘋(píng)果銹果類病毒的NASBA引物，其引物序列分別為SEQ IDNO:1 ?2。
[0008]SEQ ID NO:1:
NA-P1:5， -aattctaatacgactcactatagggag TGGGTTCGCCTACAAGAACG-3’
SEQ ID NO:2:
NA_P2:5’ -aattctaatacgactcactatagggag ATTTACCCTGGGAACCCACC-3’
本發(fā)明提供的檢測(cè)蘋(píng)果銹果類病毒的NASBA擴(kuò)增試劑盒，包括如下組分:
(I) NASBA擴(kuò)增反應(yīng)液A:
每25 μ L包括 10XAMV buffer 2.5 μ 1,6.25mmol /L NTPs 3 μ L，10 mmol /L dNTPs
1.5 yL, 10 μπιο? /L 引物 NA-P1、NA-P2 各 0.5 μ L，.雙蒸水 9 yL。
[0009]其中緩沖液為含40mmol /L PH8.5 Tris_HCL，70 mmol /LKCL，12 mmol /L MgCL2，5 mmol /L DTT 緩沖液。
[0010](2) NASBA 擴(kuò)增反應(yīng)液 B:
0.5 U RNaseH, 32 U T7RNA 聚合酶，6.4 U AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，2 μ L DMS0，0.1 μ LI mo I/L 二硫蘇糖醇，0.25 μ L 10 mg /mL BSA，20 U RNA 酶抑制劑。
[0011](3) NASBA 擴(kuò)增程序:
將待檢樣品RNA 3 μ L加入14 μ L反應(yīng)液Α，在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65 °C溫浴5min，立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min，迅速加入4 μ L反應(yīng)液B，41°C溫育2 h，4 °C終止反應(yīng)；
(4)NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定
反應(yīng)產(chǎn)物用5%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果并進(jìn)行判定。
[0012]本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)蘋(píng)果銹果類病毒的NASBA的方法，按如下的步驟進(jìn)行: I)樣品RNA的提取
A、取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent，顛倒混勾，2°C ~8°C，12000 g，離心 lOmin。
[0013]B、取上清，15°C~30°C，放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約 15s。15°C ~3(TC，放置 2min~3min ；2°C ~8°C, 12000 g，離心 15min。
[0014]C、小心吸取約為600 μ?的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加500 μ L異丙醇混合上清液，15°C ~30°C，放置 lOmin。2°C ~8°C, 12000 g，離心 lOmin。
[0015]D、去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；2°C ~8°C，7500 g，離心5min。
[0016]E、去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無(wú)RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0017]2)進(jìn)行蘋(píng)果銹果類病毒的NASBA擴(kuò)增
Α、在裝有14 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B、在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min，；
C、在反應(yīng)管中迅速加入4μ L反應(yīng)液B; D.于41°C溫育2h ；
E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應(yīng)，3 min后取出；
3)電泳檢測(cè)
取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。如果擴(kuò)增片段為157 bp，說(shuō)明待檢病毒是蘋(píng)果銹果類病毒，如果沒(méi)有出現(xiàn)157 bp擴(kuò)增片段，則說(shuō)明待檢病毒不是蘋(píng)果銹果類病毒。
[0018]本發(fā)明根據(jù)蘋(píng)果銹果類病毒的序列高度保守區(qū)的設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性內(nèi)引物，該保守基因序列為具有蘋(píng)果銹果類病毒的不同株系所共有，以保證從株系的水平上檢測(cè)不同來(lái)源的蘋(píng)果銹果類病毒的可靠性。本發(fā)明適用于對(duì)蘋(píng)果銹果類病毒進(jìn)行快速檢測(cè)確證，可廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)和環(huán)境中的病害監(jiān)控、進(jìn)出口貿(mào)易中該病毒的確證。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果包括:
第一，便捷性。該發(fā)明在進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)，不需要昂貴的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置，整個(gè)過(guò)程始終在42 °C進(jìn)行，無(wú)需熱循環(huán)儀，僅I個(gè)普通的恒溫水浴鍋就可完成。
[0020]第二，精確度高。該發(fā)明酶循環(huán)反應(yīng)的循環(huán)數(shù)少，不需高溫變性步驟，相對(duì)于RT-PCR錯(cuò)配率較低，更適于檢測(cè)和定量特異RNA。
[0021]第三，靈敏度高。該發(fā)明比起PCR技術(shù)，能用較少的循環(huán)便擴(kuò)增出大量的目的基因，保證了檢測(cè)的高敏感性，是PCR技術(shù)靈敏度的10倍。
[0022]第四，縮短周期。由于反轉(zhuǎn)錄過(guò)程被直接合并到擴(kuò)增反應(yīng)中，PCR大約需要20輪循環(huán)才能擴(kuò)增16倍，而NASBA只需循環(huán)4~5輪即可達(dá)到10 6倍。
[0023]第五，降低了對(duì)植物RNA模板的質(zhì)量要求。由于細(xì)胞壁中富含大量的多糖、酚類物質(zhì)，植物病毒RNA的提取存在著穩(wěn)定性差、重復(fù)性低、效率低等問(wèn)題，加之在提取過(guò)程中RNA本身的自降解現(xiàn)象，病毒RNA的含量往往較低，對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度和穩(wěn)定性提出了較高要求。由于該發(fā)明針對(duì)的模板是RNA，反應(yīng)的產(chǎn)物也是RNA，反應(yīng)的結(jié)果不受環(huán)境中DNA的影響。即使存在外來(lái)的雙鏈DNA污染，但由于其不具備T7啟動(dòng)子序列，不可能被擴(kuò)增，其次，該反應(yīng)只在42 °C恒溫條件下進(jìn)行，不需高溫變性步驟，所以NASBA反應(yīng)流程不會(huì)受到外來(lái)雙鏈DNA的污染，因此對(duì)于模板純度和質(zhì)量要求較低。
[0024]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
圖1為本發(fā)明對(duì)病株樣品中NASBA擴(kuò)增圖譜。其中M:ssRNA Ladder marker ；1:健康葡萄；2:空白對(duì)照；3蘋(píng)果銹果類病毒感病材料。
[0025]圖2為本發(fā)明特異性結(jié)果圖。其中M:ssRNA Ladder marker ；1:蘋(píng)果銹果類病毒；2:啤酒花矮化類病毒；3:梨泡狀潰瘍類病毒；4:桃潛隱花葉病毒；5:蘋(píng)果莖痘病毒。
[0026]圖3為本發(fā)明敏感性結(jié)果圖。其中M: ssRNA Ladder marker ； 1-7: 1X10'I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X Kr6 ng/ μ L，蘋(píng)果銹果類病毒感病材料總RNA0
[0027]圖4為本發(fā)明實(shí)施例4的實(shí)際樣品檢測(cè)圖。其中M: ssRNA Ladder marker ；1~20:其中 1、4、6、8、9:豐水梨樣品 S1、S4、S6、S8、S9 ;2、3、5、7:庫(kù)爾勒香梨 S2、S3、S5、S7 ;11、12,13:南水梨 S11、S12、S13 ;10、14、16、19:雪花梨 S10、S14、S16、S19 ;15、17、18、20:黃金梨 S15、S17、S18、S20o

【具體實(shí)施方式】
[0028]為了更充分地解釋本發(fā)明的實(shí)施方法，提供了用于檢測(cè)蘋(píng)果銹果類病毒NASBA試劑盒的實(shí)施實(shí)例。這些實(shí)施實(shí)例僅僅是解釋，而不是限制本發(fā)明的范圍。其中反轉(zhuǎn)錄聚合酶 AMV、RNaseH、RNase inhibitor、T7 RNA 聚合酶、dNTP、ssRNA marker、rNTP 均購(gòu)于 NEWENGLAND B1LAB公司；PCR擴(kuò)增試劑、DNA marker及等均購(gòu)于北京天根公司；。
[0029]實(shí)施例1 I材料
1.1病毒
蘋(píng)果銹果類病毒為中國(guó)檢科院提供，啤酒花矮化類病毒(/?/? stunt vroid, HSVd)>梨泡狀潰瘍類病毒(Pear Blis ter Canker Viroid, PBCVd)、桃潛隱花葉類病毒{Peachlatent mosaic Firoit/，PLMVd)、蘋(píng)果莖痕病毒stem pitting Firw1S^ASPV)由本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0030]1.2 試劑
反轉(zhuǎn)錄聚合酶 AMV、RNaseH、RNase inhibitor、T7 RNA 聚合酶、dNTP、ssRNA marker、rNTP均購(gòu)于NEW ENGLAND B1LAB公司；PCR擴(kuò)增試劑、DNA marker及等均購(gòu)于北京天根公司；
1.3引物
根據(jù)NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中蘋(píng)果銹果類病毒的基因全長(zhǎng)序列(登錄號(hào)EU825613.1)，在保證擴(kuò)增的兼并性和通用性的前提下通過(guò)比較分析蘋(píng)果銹果類病毒高度保守區(qū)，設(shè)計(jì)5’端帶有T7啟動(dòng)子序列NASBA反應(yīng)引物(NA-P1、NA-P2)，設(shè)計(jì)完成后將引物在數(shù)據(jù)庫(kù)的Primer-Blast模塊下進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。
[0031]2 方法
2.1病毒RNA的提取
取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent，顛倒混勾，2 °C ~8°C，12000 g，離心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C，放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；2°C ~8°C，12000 g，離心15min。小心吸取約為600 μ?的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加 500 UL 異丙醇混合上清液，150C ~30°C，放置 lOmin。2°C ~8°C，12000 g，離心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；2°0~8°0，7500 g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無(wú)RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0032]2.2 NASBA 擴(kuò)增體系
Α、在裝有14 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min，；
C.在反應(yīng)管中迅速加入4μ L反應(yīng)液B;
D.于41°C溫育2h ；
E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應(yīng)，3 min后取出；
2.3電泳檢測(cè)
取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。預(yù)期產(chǎn)物大小為157 bp ο見(jiàn)圖1。
[0033]實(shí)施例2特異性實(shí)驗(yàn)
1、提取蘋(píng)果銹果類病毒、啤酒花矮化類病毒、梨泡狀潰瘍類病毒、桃潛隱花葉病毒、蘋(píng)果莖痘病毒的RNA，使用NASBA方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0034]2、病毒RNA的提取
取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent，顛倒混勾，2 °C ~8°C，12000 g，離心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C，放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；2°C ~8°C，12000 g，離心15min。小心吸取約為600 μ?的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加 500 UL 異丙醇混合上清液，150C ~30°C，放置 lOmin。2°C ~8°C，12000 g，離心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；2°0~8°0，7500 g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無(wú)RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0035]3、擴(kuò)增反應(yīng)
Α、在裝有14 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min，；
C.在反應(yīng)管中迅速加入4μ L反應(yīng)液B;
D.于41°C溫育2h ；
E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應(yīng)，3 min后取出；
4、NASBA產(chǎn)物電泳檢測(cè)
取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。電泳結(jié)果顯示，同時(shí)使用NASBA方法進(jìn)行檢測(cè)蘋(píng)果銹果類病毒、啤酒花矮化類病毒、梨泡狀潰瘍類病毒、桃潛隱花葉病毒、蘋(píng)果莖痘病毒的RNA，只有蘋(píng)果銹果類病毒得到預(yù)期157 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(見(jiàn)圖2)。
[0036]實(shí)施例3敏感性實(shí)驗(yàn)
1、用DEPC水將蘋(píng)果銹果類病毒RNA模板液向下做10倍梯度稀釋，依次為1X10'I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X I(T6 ng/ μ L，各取 2 μ L 為模板分別進(jìn)行 NASBA 擴(kuò)增反應(yīng)。O
[0037]2、病毒RNA的提取
取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent，顛倒混勾，2 °C ~8°C，12000 g，離心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C，放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；2°C ~8°C，12000 g，離心15min。小心吸取約為600 μ?的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加 500 UL 異丙醇混合上清液，150C ~30°C，放置 lOmin。2°C ~8°C，12000 g，離心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；2°0~8°0，7500 g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無(wú)RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0038]3、擴(kuò)增反應(yīng)
A.在裝有14μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min，；
C.在反應(yīng)管中迅速加入4μ L反應(yīng)液B;
D.于41°C溫育2h ；
E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應(yīng)，3 min后取出；
4、NASBA產(chǎn)物電泳檢測(cè)
取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。NASBA產(chǎn)物鑒定:電泳結(jié)果顯示，蘋(píng)果銹果類病毒使用NASBA方法能夠得到10_4稀釋倍數(shù)的模板(見(jiàn)圖3)。
[0039]實(shí)施例4實(shí)際樣品檢測(cè)及對(duì)比實(shí)驗(yàn)
將從新疆采集的具有典型蘋(píng)果銹果類病毒癥狀的病樣及實(shí)驗(yàn)室留樣(出口臺(tái)灣梨接穗)，豐水梨(S1、S4、S6、S8、S9)、庫(kù)爾勒香梨(S2、S3、S5、S7)南水梨(Sll、S12、S13)、雪花梨(S10、S14、S16、S19)、黃金梨(S15、S17、S18、S20)分別采用 NASBA, RT-PCR 進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的效果，以進(jìn)一步評(píng)估NASBA方法的可靠性。
[0040]1、實(shí)際樣品NASBA檢測(cè) I)病毒RNA的提取
取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent，顛倒混勾，2°C ~8°C，12000 g，離心 10 min。取上清，15°C ~30°C，放置 5min;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15sd5°C~30°C，放置2 min~3 min ；2°C ~8°C, 12000 g，離心15 min。小心吸取約為600 PL的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加500 “1^異丙醇混合上清液，15°0~30°0，放置10 min。2°C ~8°C，12000 g，離心10min。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；2°C ~8°C，7500 g，離心5 min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無(wú)RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0041]2)擴(kuò)增反應(yīng)
Α、在裝有14 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min，；
C.在反應(yīng)管中迅速加入4μ L反應(yīng)液B;
D.于41°C溫育2h ；
E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應(yīng)，3 min后取出；
3) NASBA產(chǎn)物鑒定
紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄，電泳結(jié)果顯示，在20份樣品中8份樣品為陽(yáng)性，其他樣品為陰性(見(jiàn)圖4)。
[0042]2、PCR 擴(kuò)增
I)方法:普通RT-PCR反應(yīng)條件為50 °C反轉(zhuǎn)錄30 min ；94 °C預(yù)變性2 min; 94 °C 30S，53 0C 30 S，72 °C 30 S，循環(huán)反應(yīng) 35 次；65 °C延伸 10 min。
[0043]2)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果:在20份樣品中，8份為陽(yáng)性，其余12份樣品為陰性。
[0044]結(jié)論:利用上述NASBA和PCR方法同時(shí)檢測(cè)實(shí)際樣品，兩種方法的符合率100%，但NASBA對(duì)設(shè)備要求更低，便捷性更高。
[0045]目前，蘋(píng)果銹果類病毒是我國(guó)較為普遍、危害最為嚴(yán)重的梨類病毒病，引起的病害往往與病毒病易混淆。本發(fā)明的應(yīng)用將有助于在諸多形態(tài)相近的病原癥狀中實(shí)現(xiàn)蘋(píng)果銹果類病毒的快速鑒別。本發(fā)明可應(yīng)用于蘋(píng)果、梨幼苗的培育過(guò)程中，通過(guò)對(duì)類病毒的快速高效檢測(cè)，可以確保脫毒梨的質(zhì)量和增產(chǎn)效果。本發(fā)明可對(duì)蘋(píng)果銹果類病毒進(jìn)行特異性鑒定，可應(yīng)用于蘋(píng)果、梨種苗的進(jìn)出口檢疫、國(guó)內(nèi)地區(qū)間調(diào)運(yùn)以及病害調(diào)查。
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)蘋(píng)果銹果類病毒的NASBA擴(kuò)增引物，其上游引物、下游引物的序列分別為SEQID NO:1 ?2。
2.一種檢測(cè)蘋(píng)果銹果類病毒的NASBA擴(kuò)增試劑盒，包括如下組分: (1)NASBA擴(kuò)增反應(yīng)液A:
每25 μ L包括 1XAMV buffer 2.5 μ 1,6.25mmol /L NTPs 3 μ L，10 mmol /L dNTPs1.5 yL, 10 μ mo I /L 引物 NA-Pl、NA-P2 各 0.5 yL，雙蒸水 9 Ml; 其中緩沖液為含 40 mmol /L PH8.5 Tris-HCL, 70 mmol /LKCL，12 mmol /L MgCL2，5mmol /L DTT 緩沖液； (2)NASBA擴(kuò)增反應(yīng)液B: 0.5 U RNaseH, 32 U T7RNA 聚合酶，6.4 U AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，2 μ L DMS0，0.1 μ LI mo I/L 二硫蘇糖醇，0.25 μ L 10 mg /mL BSA，20 U RNA 酶抑制劑。
3.檢測(cè)蘋(píng)果銹果類病毒的NASBA方法，包括下列步驟: 1)樣品RNA的提取 A、取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent，顛倒混勾，2°C ~8°C，12000 g，離心 1min ; B、取上清，15°C~30°C，放置5min;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，15s ；15°C ~30°C，放置 2min~3min ；2°C ~8°C, 12000 g，離心 15min ； C、吸取600PL的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相，加500 UL異丙醇混合上清液，15°C ~30°C，放置 10min，2°C ~8°C, 12000 g，離心 1min ； D、去除上清液，沉淀中加入ImL 75%乙醇，洗滌；2°C ~8°C，7500 g，離心5min; E、去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30UL -50 μ L無(wú)RNase的水中，即為待檢模板RNA ； 2)進(jìn)行ASSVd的NASBA擴(kuò)增 Α、在裝有14 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ L待檢模板RNA ； B.在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min，立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min ； C.在反應(yīng)管中迅速加入4μ L反應(yīng)液B; D.于41°C溫育2h ； E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應(yīng)，3 min后取出； 3)電泳檢測(cè) 取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104450972SQ201410832199
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月29日
【發(fā)明者】吳興海, 張成標(biāo), 魏曉棠, 宋濤, 姜英輝, 邵秀玲, 歷艷, 尼秀媚 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心