專利名稱：類病毒組合物顆粒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于組合物與使用方法，特別是關(guān)于類病毒組合物及其使用方法。
背景技術(shù)：
本申請(qǐng)主張以2008年11月沈日與2008年12月5日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案號(hào) 61/118，206與61/201，118作為優(yōu)先權(quán)案，并且上述兩案的全文內(nèi)容皆并入本案作為參考?；卓夏醽?chikimgimya)病毒(CHIKV)是披膜病毒科中由蚊子傳播的亞法病毒 (alphavirus)，最先是1952年在坦桑尼亞分離而得。此種病毒感染造成的人類疾病特征在于疹子、高燒以及明顯特征就是持續(xù)數(shù)年的關(guān)節(jié)炎。從2004年在肯尼亞再次出現(xiàn)起，在非洲、歐洲與亞州，基孔肯尼亞病毒(CHIKV)已經(jīng)感染數(shù)百萬人。在沒有疫苗或是抗病毒治療之下，病毒的演化與散布進(jìn)入新的地理區(qū)域，以及疾病嚴(yán)重性成為嚴(yán)重的公共務(wù)生問題。因此，CHIKV抗病毒的發(fā)展與疫苗發(fā)展成具有高優(yōu)先性。CHIKV的系統(tǒng)發(fā)生分析顯示有三種基因型(genotypes)亞洲、東/中/南非以及西非。亞洲與東/中/南非基因型最相似，然而西非品系較不同。急迫需要用于治療或預(yù)防基孔肯亞病毒疾病的治療與/或預(yù)防方法。

發(fā)明內(nèi)容
如下所述，本發(fā)明特征在用于預(yù)防或治療一或多種基孔肯尼亞病毒株與其它亞法病毒(alphavirus)媒介疾病的組合物與方法。在一方面，本發(fā)明提供類病毒顆粒(VLP)包含一或多(例如一、二、三、四、五)基孔肯尼亞病毒結(jié)構(gòu)多肽。在一實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)多肽是殼體與包膜蛋白E3、E2、6K與El其中任一個(gè)或多個(gè)。在另一方面，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，它是編碼前述或是本申請(qǐng)所述任何其它VLP的類病毒顆粒。在一實(shí)施例中，所述多核苷酸編碼包含C-E3-E2-6K-E1的基孔肯尼亞病毒多蛋白。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供包含多核苷酸的表現(xiàn)載體，所述多核苷酸編碼一或多個(gè)基孔肯尼亞病毒結(jié)構(gòu)多肽。在另一方面，本發(fā)明提供包含任何前述表現(xiàn)載體或是本申請(qǐng)中任何其它表現(xiàn)載體的原核或真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物、人類、昆蟲)。在另一方面，本發(fā)明提供免疫原組合物(immunogenic composition)，包含有效量的前述的類病毒顆?；虮旧暾?qǐng)中任何其它VLP0在相關(guān)方面，本發(fā)明提供免疫原組合物，包含有效量的VLP，含有具有 C-E3-E2-6K-E1的基孔肯尼亞結(jié)構(gòu)多蛋白，以及佐劑。在另一方面，本發(fā)明提供免疫原組合物，包含有效量的任何前述或本申請(qǐng)中其它的表現(xiàn)載體(例如DNA疫苗)。在另一方面，本發(fā)明提供疫苗，包含有效量的一或多個(gè)基孔肯尼亞病毒結(jié)構(gòu)多肽， 是殼體(C)與包膜蛋白E1、E2、E3與6K中的任一個(gè)或多個(gè)。
在另一方面，本發(fā)明提供疫苗，包含有效量的前述類病毒顆?；蚴前哂?C-E3-E2-6K-E1 的多蛋白。在另一方面，本發(fā)明提供疫苗，包含編碼基孔肯尼亞結(jié)構(gòu)多蛋白或其片段的多核苷酸。在一實(shí)施例中，由任何前述的表現(xiàn)載體編碼基孔肯尼亞結(jié)構(gòu)多蛋白。在一實(shí)施例中， 所述表現(xiàn)載體包刮CMV/R啟動(dòng)子。在另一實(shí)施例中，所述疫苗是DNA疫苗。在另一方面，本發(fā)明提供在個(gè)體(例如人類)中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)對(duì)抗基孔肯尼亞病毒的方法，所述方法涉及對(duì)所述個(gè)體給予有效量的前述免疫原組合物或是本申請(qǐng)中任何其它的免疫原組合物。在一實(shí)施例中，所述免疫原組合物包含一或多個(gè)基孔肯尼亞病毒結(jié)構(gòu)多肽，亦即殼體(C)與孢膜蛋白E1、E2、E3與6K中的一或多個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述免疫原組合物包括含有C-E3-E2-6K-E1的多蛋白。在另一實(shí)施例中，所述方法在個(gè)體中誘導(dǎo)中和抗體。在另一方面，本發(fā)明提供一種用于個(gè)體中治療或預(yù)防基孔肯尼亞感染的方法，所述方法涉及對(duì)所述個(gè)體給予有效量的前述疫苗或是任何前述的免疫原組合物。在一實(shí)施例中，其中給予所述疫苗或免疫原組合物一次或多次劑量。在另一方面，本發(fā)明提供一種用于產(chǎn)生類病毒顆粒的方法，所述方法是涉及在細(xì)胞中表現(xiàn)一或多種可自行組合(self-assembly)的基孔肯尼亞結(jié)構(gòu)蛋白，形成類病毒顆粒。在一實(shí)施例中，所述方法更包含分離所述類病毒顆粒。在另一方面，本發(fā)明提供包含一或多個(gè)亞法結(jié)構(gòu)多肽(例如殼體或是包膜多肽) 的類病毒顆粒(VLP)。在一實(shí)施例中，亞法病毒是基孔肯尼亞病毒、辛德畢病毒(Sindbis virus)、東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis (EEE) virus)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis (WEE) virus)以及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus)巾白勺ftfS]"一禾中$$禾中。在另一方面，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼前述或本申請(qǐng)所述的類病毒顆粒。在另一方面，本發(fā)明提供包含編碼一或多個(gè)亞法病毒結(jié)構(gòu)多肽的表現(xiàn)載體， 其中所述亞法病毒是選自于基孔肯尼亞病毒、辛德畢病毒(Sindbis virus)、東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis (EEE) virus)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis (WEE) virus)以及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus)所組成的群組。在另一方面，本發(fā)明提供免疫原組合物，包含有效量的前述或本申請(qǐng)所述的類病
毒顆粒。在另一方面，本發(fā)明提供疫苗，包含有效量的一種或多種亞法病毒結(jié)構(gòu)多肽或是編碼一或多種亞法病毒結(jié)構(gòu)蛋白的多核苷酸，其中所述亞法病毒是選自于基孔肯尼亞病毒、辛德畢病毒(Sindbis virus)、東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis (EEE) virus)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis (WEE) virus)以及委內(nèi)瑞拉馬腦
(Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus) MtIj^白勺 1￥砠。在另一方面，本發(fā)明提供一種在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)對(duì)放亞法病毒的方法，所述方法涉及對(duì)所述個(gè)體給予有效量的前述免疫原組合物。在一實(shí)施例中，所述免疫原組合物包含一或多種亞法病毒結(jié)構(gòu)多肽(例如包膜或是殼體)。
在另一方面，本發(fā)明提供一種用于個(gè)體中治療或預(yù)防亞法病毒感染的方法，所述方法涉及對(duì)所述個(gè)體給予有效量的前述任何疫苗或是免疫原組合物。在另一方面，本發(fā)明提供包含前述任何VLP以及使用說明的套組(kit)。在另一方面，本發(fā)明提供包含前述任何免疫原組合物以及在個(gè)體中使用說明的套組。在一實(shí)施例中，所述免疫原組合物是提供在第一容器中，以及第二免疫原組合物是提供在第二容器中，以及基礎(chǔ)加強(qiáng)免疫(prime boost immunization)的使用說明。在另一實(shí)施例中在第二容器中的所述免疫原組合物包含VLP、病毒的多肽或是病毒的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供一種用于辨識(shí)基孔肯尼亞病毒進(jìn)入真核細(xì)胞的抑制劑的方法，所述方法涉及使表現(xiàn)基孔肯尼亞病毒受體的細(xì)胞接觸選自于C、E3、E2、6K與El的基孔肯尼亞多肽以及候選化合物，以及分析病毒進(jìn)入，其中相較于控制細(xì)胞，減少病毒進(jìn)入系崩的候選化合物被辨識(shí)為基孔肯尼亞病毒進(jìn)入的抑制劑。在一實(shí)施例中，所述候選抑制劑是抗體或是其片段或是小分子。在另一方面，本發(fā)明提供一種用于辨識(shí)基孔肯尼亞病毒進(jìn)入的抑制劑的方法， 涉及將表現(xiàn)基孔肯尼亞病毒受體的細(xì)胞接觸候選抑制劑以及含有受體基因的假型病毒 (pseudotyped virus)；以及測(cè)量細(xì)胞中受體基因的表現(xiàn)，其中相較于控制細(xì)胞，減少受體基因表現(xiàn)的化合物被辨識(shí)為抑制病毒進(jìn)入。在一實(shí)施例中，所述假型病毒(例如慢病毒 (Ientivirus))包含一或多種基孔肯尼亞病毒包膜蛋白(例如E3、E2、6K與El)。在一實(shí)施例中，所述候選抑制物是抗體或是其片段，或是小分子。在另一方面，本發(fā)明提供類病毒顆粒(VLP)包含一或多種基孔肯尼亞病毒結(jié)構(gòu)多肽，用于治療或預(yù)防基孔肯尼亞感染。在另一方面，本發(fā)明提供一種用于治療或預(yù)防基孔肯尼亞感染的方法，所述方法涉及給予類病毒顆粒(VLP)，包含一或多個(gè)基孔肯尼亞病毒結(jié)構(gòu)多肽，并且是在給予一或多另一免疫原組合物、抗病毒或抗生素劑之前、之后、同時(shí)或是任何順序。在另一方面，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防基孔肯尼亞感染的方法，對(duì)個(gè)體(例如人類)給予對(duì)抗本發(fā)明VLP所產(chǎn)生的中和抗體(例如哺乳動(dòng)物、人類)。在上述各方面或是本發(fā)明任何其它方面的不同實(shí)施例中，所述VLP包含一或多種 (1、2、3、4)包膜蛋白E3、E2、6K與E1。在其它實(shí)施例中，所述VLP包含含有C-E3-E2-6K-E1 或其片段的多蛋白。在上述各方面或是本發(fā)明任何其它方面的其它實(shí)施例中，多核苷酸編碼一或多種結(jié)構(gòu)多肽，所述結(jié)構(gòu)多肽是亞法病毒或是基孔肯尼亞病毒殼體(C)與包膜蛋白 E3、E2、6K與El中的任何一種或多種。在其它實(shí)施例中，所述多核苷酸編碼包膜蛋白E3、 E2、6K與E1。在其它實(shí)施例中，所述多核苷酸編碼包含C-E3-E2-6K-E1的基孔肯尼亞病毒多蛋白。在其它實(shí)施例中，表現(xiàn)載體可在原核或真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物、人類)中表現(xiàn)。 在其它實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)多蛋白取得于基孔肯尼亞株37997或是LR2006。在其它實(shí)施例中，載體包括CMV/R啟動(dòng)子。在其它實(shí)施例中，表現(xiàn)載體是C-E37997或是C-E0PY-1。在其它實(shí)施例中，所述VLP在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)(例如保護(hù)性的免疫反應(yīng))。在其它實(shí)施例中，免疫反應(yīng)治療或是預(yù)防個(gè)體中基孔肯尼亞感染。在上述方面的其它實(shí)施例中，所述VLP誘導(dǎo)對(duì)抗基孔肯尼亞同源或異源品系的抗體。在上述方面的實(shí)施例中，所述佐劑是免疫刺激劑 (例如Ribi、鋁鹽、胞壁酰肽(muramyl peptides)、細(xì)菌細(xì)胞壁成分、皂素佐劑)。在上述方面的其它實(shí)施例中，所述疫苗或免疫原組合物的給予是一或多次基礎(chǔ)免疫以及一或多次加強(qiáng)免疫。在另一實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)免疫是在一、二、三、四、五、六、七或八周間隔給予。在另一實(shí)施例中，所述加強(qiáng)免疫是在基礎(chǔ)免疫之后兩周、一個(gè)月、兩個(gè)月或三個(gè)月給予。在上述方面或本申請(qǐng)任何其它方面的其它實(shí)施例中，所述免疫保護(hù)個(gè)體對(duì)抗感染的viremia或發(fā)炎結(jié)果。在其它實(shí)施例中，所述方法保護(hù)個(gè)體免于lethality。在其它實(shí)施例中，所述方法在個(gè)體中誘導(dǎo)中和抗體。本發(fā)明提供免疫原組合物特征在于類病毒顆粒，包括基孔肯尼亞多肽用于預(yù)防或治療基孔肯尼亞病毒疾病。以下所提供的范例，說明分離或制造本發(fā)明定義的組合物或物品。由詳細(xì)說明與權(quán)利要求書可知本發(fā)明的其它特征與優(yōu)點(diǎn)。定義“亞法病毒結(jié)構(gòu)蛋白”是指與自然存在的病毒殼體或包膜蛋白具有至少約40%胺基酸序列相似度的多肽或其片段，以及在哺乳動(dòng)物中具有免疫原活性。在一實(shí)施例中，所述亞法病毒結(jié)構(gòu)蛋白與基孔肯尼亞病毒結(jié)構(gòu)蛋白或其免疫原片段具有至少約85%、90%、 95%或更大的氨基酸序列相似度。在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)范例亞法病毒包含但不限于西方、東方與委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、阿尼昂尼昂病毒(ο’ nyong-nyong virus)、羅斯河病毒 (Ross River virus)與斤文德畢斯病毒(Sindbis virus)?！盎卓夏醽啿《窘Y(jié)構(gòu)蛋白”是指與自然存在的基孔肯尼亞病毒殼體或包膜蛋白具有至少約85%胺基酸序列鄉(xiāng)速度的多肽或其片段。在其它實(shí)施例中，所述胺基酸序列相似度至少約90%、95%或更高?！皠笔侵溉魏涡》肿踊瘜W(xué)化合物、抗體、核酸分子或是多肽，或其片段。如本申請(qǐng)中所使用，“佐劑”是指當(dāng)在配方中與特定免疫原結(jié)合使用時(shí)，會(huì)增強(qiáng)、改變或修飾造成的免疫反應(yīng)的化合物。在一些實(shí)施例中，所述佐劑與VLP結(jié)合使用。在其它實(shí)施例中，所述佐劑與DNA疫苗結(jié)合使用。免疫反應(yīng)的修飾包含強(qiáng)化或是擴(kuò)大抗體與細(xì)胞免疫反應(yīng)的專一性。免疫反應(yīng)的修飾也可指降低或抑制某些抗原專一性的免疫反應(yīng)。在一實(shí)施例中，所述佐劑是Ribi佐劑。本申請(qǐng)中的“亞法病毒”是指含有RNA的病毒，屬于第四類披膜病毒科(group IV Togaviridae family)。范例亞法病毒包含但不限于西方、東方與委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、 阿尼昂尼昂(O’ nyong-nyong virus)、羅斯河病毒(Ross River virus)與欣德畢斯病毒 (Sindbis virus)。本申請(qǐng)中“誘導(dǎo)免疫性”是指產(chǎn)生對(duì)抗抗原的任何免疫反應(yīng)。在一實(shí)施例中，免疫性是由抗體媒介，對(duì)抗感染劑，所述免疫性是由脊椎動(dòng)物(例如人類)所展示，防止或改善感染或是減少至少一癥狀。本發(fā)明的VLP或是DNA疫苗可刺激抗體的產(chǎn)生，例如中和感染劑、抑制感染劑進(jìn)入細(xì)胞、抑制感染劑的復(fù)制，以及/或保護(hù)宿主細(xì)胞不受感染與破壞。所述用詞也可指由T淋巴細(xì)胞與/或其它白血球細(xì)胞媒介的免疫反應(yīng)對(duì)抗感染劑，這是由脊椎動(dòng)物(例如人類)所展示，預(yù)防或是改善感染，例如基孔肯尼亞感染，或是減少至少一癥狀?！案纳啤笔侵笢p少、抑制、減弱、減小、暫?；蚴欠€(wěn)定疾病或其癥狀的發(fā)展或進(jìn)程?！案淖儭笔侵赣衫绫旧暾?qǐng)所述標(biāo)準(zhǔn)技藝已知的方法偵測(cè)到的表現(xiàn)量或是基因或多肽活性的變化(增加或減少)。如本申請(qǐng)所述，改變包含表現(xiàn)量10%變化，較佳為表現(xiàn)量 25%變化，更佳為40%變化，以及最佳為50%或更多的變化。
“類似物”是指不同的分子，但是具有類似功能或結(jié)構(gòu)特征。例如，多肽類似物保留對(duì)應(yīng)自然存在多肽的生物活性，然而具有某些生物化學(xué)修飾，相較于自然存在的多肽，更可促進(jìn)類似物的功能。所述生物化學(xué)修飾可增加類似物的蛋白酶抗性、膜穿透性或是半衰期， 而不改變例如與配體(Iigand)的結(jié)合。類似物可包含非自然的胺基酸。在本申請(qǐng)中，“包括”(comprises，comprising)、“含有”(containing)以及“具有” (having)可具有美國(guó)專利法中所描述的意義，以及可指“包含”(including)與類似詞；
(consisting essentically of)(consisting essentially)胃
有美國(guó)專利法所描述的意義且此用詞是開放式，允許除了所主張內(nèi)容之外的存在，只要它的基本或是主張的新特征不改變，但排除習(xí)知技藝的實(shí)施例。“偵測(cè)”是指辨識(shí)所偵測(cè)分析物的存在、不存在或是含量?！凹膊　笔侵溉魏螤顟B(tài)或不適破壞或干擾細(xì)胞、組織或器官的正常功能。疾病的例子包含病毒感染，包含但不限于西方、東方與委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、阿尼昂尼昂 (ο，nyong-nyong virus)、羅其jf河病毒(Ross River virus)與斤文德畢其jf 病毒(Sindbis virus)ο“有效量”是指相較于為治療的病患，減緩疾病癥狀所需要的劑量。實(shí)施本發(fā)明用于預(yù)防或治療疾病的活性化合物有效量視投藥方式、個(gè)體的年齡、體重與通常健康狀況而改變。最后，參加的醫(yī)師與獸醫(yī)會(huì)決定適當(dāng)劑量與劑量配方。所述劑量是指“有效”量。本發(fā)明提供許多目標(biāo)用于高專一藥物的發(fā)展，治療或預(yù)防本申請(qǐng)所述的疾病。除此之外，本發(fā)明的方法提供簡(jiǎn)易的方法辨識(shí)安全使用于個(gè)體中的治療。此外，本發(fā)明的方法提供高效能、高敏感性與低復(fù)雜性，實(shí)際分析任何數(shù)目的化合物對(duì)于本申請(qǐng)所述疾病的效果，“片段”是指多肽或核苷酸分子的一部分。此部分包含較佳為參考核苷酸分子或多肽全長(zhǎng)的至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或 90%。。片段可含有 10、20、 30、40、50、60、70、80、90 或 100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 個(gè)核苷或是胺基酸?！半s交”是指互補(bǔ)核苷堿基之間的氫鍵，可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反 Hogsteen氫鍵。例如，腺嘌呤與胸腺嘧啶是互補(bǔ)的核苷堿基，它們是經(jīng)由形成氫鍵而配對(duì)?！胺蛛x的多核苷酸”是指核苷酸分子(例如DNA)，它是沒有自然存在生物體基因組所得的基因兩側(cè)的基因。因此，所述分離的多核苷酸包含例如并入載體中、自動(dòng)復(fù)制質(zhì)體或病毒中或是原核或真核的基因組DNA中重組的DNA ；或是存在成為個(gè)別分子(例如cDNA或是基因組或是PCR或限制酶作用產(chǎn)生的cDNA片段)與其它序列無關(guān)。此外，所述分離的多核苷酸包含由DNA轉(zhuǎn)錄的RNA分子，以及重組的DNA，它是編碼其它多核苷酸序列的融合基因的一部分?！胺蛛x的多肽”是指本發(fā)明的多肽是從自然伴隨的成分中分離的。典型地，當(dāng)免除至少60%重量與其自然結(jié)合的蛋白質(zhì)與自然存在的有機(jī)分子時(shí)，所分離而得的所述多肽。 較佳地，所述制備是本發(fā)明多肽的重量至少75%，更佳為致使90%，以及更佳為至少99%。 例如，通過從自然來源萃取、通過表現(xiàn)編碼所述多肽的重組核酸；或是通過化學(xué)合成所述蛋白質(zhì)，可得到本發(fā)明分離的多肽?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)姆椒?，例如管柱層析、聚丙烯酰胺膠體電泳或是HPLC分析，測(cè)量純度。
“標(biāo)志”(marker)是指與疾病或不適相關(guān)且表現(xiàn)量或活性改變的任何蛋白質(zhì)或多核苷酸。如本申請(qǐng)所述，“得到一劑”中的“得到”包含合成、購(gòu)買或是取得所述劑?！皽p少”是指負(fù)向改變至少10%、25%、50%、75%或是100%?！皡⒖肌笔侵笜?biāo)準(zhǔn)或是控制條件?！皡⒖夹蛄小笔潜欢x的序列，作為序列比較的基礎(chǔ)。參考序列可以是特定序列全長(zhǎng)的一部分，例如，全長(zhǎng)cDNA或基因序列的片段，或全部cDNA或基因序列。關(guān)于多肽，參考多肽序列的長(zhǎng)度通常至少約16個(gè)胺基酸，較佳為至少約20個(gè)胺基酸，更佳為至少約25個(gè)胺基酸，甚至更佳為約35個(gè)胺基酸、約50個(gè)胺基酸或約100個(gè)胺基酸。關(guān)于核苷酸，參考核苷酸序列的長(zhǎng)度通常至少約50個(gè)核苷酸，較佳為至少約60個(gè)核苷酸，更佳為至少約75 個(gè)核苷酸，甚至更佳為至少約100個(gè)核苷酸，或約300個(gè)核苷酸，或任何以上或之間的整數(shù)?！皩Ｒ绘I結(jié)”是指化合物或抗體，辨識(shí)與結(jié)合本發(fā)明的多肽，但不會(huì)實(shí)質(zhì)辨識(shí)與結(jié)合樣品中的其它分子，例如生物樣品，自然包含本發(fā)明的多肽。用于本發(fā)明方法中的核苷酸分子包含編碼本發(fā)明多肽或其片段的任何核苷酸分子。此核苷酸分子不需要與內(nèi)生(endogenous)核苷酸序列100%相同，但典型具有實(shí)質(zhì)相同性。與內(nèi)生序列具有“實(shí)質(zhì)相同性”的多核苷酸典型可與雙股核苷酸分子的至少一股雜交。用于本發(fā)明方法中的核苷酸分子可包含編碼本發(fā)明多肽或其片段的任何核苷酸分子。此核苷酸分子不需要與內(nèi)生(endogenous)核苷酸序列100%相同，但典型具有實(shí)質(zhì)相同性。與內(nèi)生序列具有“實(shí)質(zhì)相同性”的多核苷酸典型可與雙股核苷酸分子的至少一股雜交?！半s交”是指在不同嚴(yán)厲條件下，互補(bǔ)多核苷酸序列(例如本申請(qǐng)所述的基因)或是其部分之間配對(duì)形成雙股分子(參閱Wahl，G.M.與S. L. Berger (1987)發(fā)表在Methods Enzymo 1. 152 :399 ；Kimmel，A. R. (1987)發(fā)表在 Methods Enzymo 1. 152 :507)。例如，嚴(yán)厲(stringent)鹽濃度常低于約750mM NaCl與75mM檸檬酸鈉，較佳為低于約500mM NaCl與50mM檸檬酸鈉，以及更佳為低于約250mM NaCl與25mM檸檬酸鈉?？稍跊]有有機(jī)溶劑例如甲醛存在下，得到低嚴(yán)厲雜交，而可在至少約35 %甲醛或更佳至少約 50%甲醛存在下得到高嚴(yán)厲雜交。嚴(yán)厲的溫度條件通常包含至少約30°C，較佳為至少約 37°C，以及更佳為約42°C。熟知此技藝的人士可知變化其它參數(shù)，例如雜交時(shí)間、清潔劑， 例如十二烷基硫酸鈉(SDS)，的濃度，以及包含或排除載體DNA。不同程度的嚴(yán)厲是結(jié)合需要的不同條件而完成。在較佳實(shí)施例中，雜交發(fā)生在30°C，750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉、 SDS、35%甲醛以及1001^/111變質(zhì)的鮭魚精子0嫩(％0嫩)。在最佳實(shí)施例中，雜交發(fā)生在 42°C,250mM NaCl、25mM檸檬酸鈉、1 % SDS、50%甲醛以及200 μ g/m ssDNA。這些條件的有用變化對(duì)熟知此技藝的人士是明顯的。對(duì)于大部分的應(yīng)用，雜交后的清洗步驟也會(huì)改變?？捎甥}濃度與溫度定義清洗嚴(yán)厲條件(wash stringent conditions)。如上所述，減少鹽濃度或增加溫度可增加清洗嚴(yán)厲。例如，清洗步驟的嚴(yán)厲鹽濃度較佳是低于約30mM NaCl與3mM檸檬酸鈉，以及最佳為低于約15mM NaCl與1. 5mM檸檬酸鈉。清洗步驟的嚴(yán)厲溫度條件通常包含溫度至少約25°C， 更佳為至少約42°C以及甚至更佳為至少約68°C。在一較佳實(shí)施例中，清洗步驟發(fā)生在 25°C、30mM NaC、3mM檸檬酸鈉以及0. 1 % SDS。在一更佳實(shí)施例中，清洗步驟發(fā)生在42°C、 15mM NaC、l. 5mM檸檬酸鈉以及0. 1% SDS0在一更佳實(shí)施例中，清洗步驟發(fā)生在68°C、15mMNaC、1.5mM檸檬酸鈉以及0. SDS。熟知此技藝的人士會(huì)明白這些條件的其它變化。雜交技術(shù)為熟知此技藝的人士已知的，并且描述在例如Benton與DavisGcience 196 :180， 1977) ；Grunstein 與 Hogness(Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72 :3961,1975) ；Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York,2001)； Berger 與 Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)；以及 Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York?！皩?shí)質(zhì)相同”是指與參考胺基酸序列(例如本申請(qǐng)所描述的任一胺基酸序列)或是核苷酸序列(例如本申請(qǐng)所述的任一核苷酸序列)具有至少約50%相似性的多肽或是核苷酸分子。較佳地，此序列是與用于比較序列的氨基酸程度或核苷酸有至少60%、更佳為 80%或85%，以及更佳為90%、95%或甚至99%相似性。使用序列分析軟件(例如 Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison的遺傳計(jì)算器組的序列分析軟件封裝、Wis. 53705、BLAST、BESTFIT、GAP或 PILEUP/PRETITB0X程序)測(cè)量序列相似性。分配同構(gòu)型程度制不同取代、刪除與/或其它修飾，所述軟件符合相同或類似序列。保留取代典型包含以下群組的取代物甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬酰胺、麩酰胺、絲胺酸、羥丁胺酸、離胺酸、精胺酸、苯丙胺酸以及酪胺酸。在決定相似程度的舉例方式中，可使用BLAST程序，可能性分?jǐn)?shù)介在e_3與之間，指示接近相關(guān)序列?！敖Y(jié)構(gòu)多蛋白”是指組合胺基酸分子，包括至少兩個(gè)不同多肽，貢獻(xiàn)于病毒殼體或包膜。在一實(shí)施例中，所述多肽可切除病毒酵素(例如自動(dòng)蛋白酶與信息酶)。例如結(jié)構(gòu)多蛋白序列在Genbank存取編號(hào)ABX40006. 1，如下所示。MEFIPTQTFYNRRYQPRPWTPRPTIQVIRPRPRPQRQAGQLAQLISAVNKLTMRAVPQQKPRRNRKNKKQKQKQQAPQNNTNQKKQPPKKKPAQKKKKPGRR ERMCMKIEND CIFEVKHEGKVTGYACLVGDKVMKPAHVKGTIDNADLAKLAFKRSSKYDLECAQIPVHMKSDASKFTHEKPEGYYNWHHGAVQYSGGRFTIPTGAGKP⑶SGRPIFDNKGRWAIVLGGANEGARTALSWTWNKDIVTKITPEGAEEffSLAIPVMCLLANTTFPCSQPPCTPCCYE KEPEETLRMLEDNVMRPGYYQLLQASLTCSPHRQRRSTKDNFNVYKATRPYLAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEA TDGTLKIQVSLQIGIKTDDSHDWTKLRYMDNHMPADAERAGLFVRTSAPCTITGTMGHFILARCPKGETLTVGFTDS RKISHSCTHPFHHDPPVIGREKFHSRPQHGKELPCSTYVQSTAATTEEIEVHMPPDTPDRTLMSQQSGNVKITVNGQ TVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKVDQCHAAVTNHKKWQYNSPLVPRNAEL⑶RKGKIHIPFPLANVTCRVPKAR NPTVTYGKNQVIMLLYPDHPTLLSYRNMGEEPNYQEEWVMHKKEWLTVPTEGLEVTffGNNEPYKYffPQLSTNGTAHG HPHEIILYYYELYPTMTWWSVATFILLSMVGMAAGMCMCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLICCIRTAKAATYQEAAIYLWNEQQPLFWLQALIPLAALIVLCNCLRLLPCCCKTLAFLA VMSVGAHTVS AYEHVTVIPNTVGVPYKTLVNRPGYSPMVLEMELLSVTLEPTLSLDYITCEYKTVIPSPYVKCCGTAECKDKNLPDY SCKVFTGVYPFMWGGAYCFCDAENTQLSEAHVEKSESCKTEFASAYRAHTASASAKLRVLYQGNNITVTAYANGDHA VTVKDAKFIVGPMSSAWTPFDNKIVWK⑶VY匪DYPPFGAGRPGQFGDIQSRTPESKDVYANTQLVLQRPAVGTVHV PYSQAPSGFKYWLKERGASLQHTAPFGCQIATNPVRAVNCAVGNMPISIDIPEAAFTRWDAPSLTDMSCEVPACTHS SDFGGVAIIKYAASKKGKCAVHSMTNAV TIREAEIEVEGNSQLQISFSTALASAEFRVQVCSTQVHCAAECHPPKD HIVNYPASHT
TLGVQDI SATAMSffVQK I TGGVGLVVAVAALILIVVLCVSFSRH例如編碼上述結(jié)構(gòu)多蛋白的表現(xiàn)載體在Genbank存取編號(hào)為EU224268 (圖24)。第二例子，結(jié)構(gòu)蛋白序列在Genbank存取編號(hào)為ABX40011. 1”，如下所示。MEFIPTQTFYNRRYQPRPWAPRPTIQVIRPRPRPQRQAGQLAQLISAVNKLTMRAVPQQKPRRNRKNKKQRQKKQAPQNDPKQKKQPPQKKPAQKKKKPGRR ERMCMKIEND CIFEVKHEGKVMGYACLVGDKVMKPAHVKGTIDNADLAKLAFKRSSKYDLECAQIPVHMKSDASKFTHEKPEGYYNW HHGAVQYSGGRFTIPTGAGKP⑶SGRPIFDNKGRWAIVLGGANEGARTALSWTWNKDIVTKITPEGAEEWSLALPVL CLLANTTFPCSQPPCTPCCYEKEPESTLRMLEDNVMRPGYYQLLKASLTCSPHRQRRSTKDNFNVYKATRPYLAHCP DCGEGHSCHSPIALERIRNEATDGTLKIQVSLQIGIKTDDSHDWTKLRYMDSHTPADAERAGLLVRTSAPCTITGTM GHFILARCPKGETLTVGFTDSRKISHTCTHPFHHEPPVIGRERFHSRPQHGKELPCSTYVQSTAATAEEIEVHMPPD TPDRTLMTQQSGNVKITVNGQTVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKIDQCHAAVTNHKNWQYNSPLVPRNAEL⑶RKGKIHIPFPLAIWTCRVPKARNPTVTYGKNQVTMLLYPDHPTLLSYRN MGQEPNYHEE WVTHKKEVTLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYffPQMSTNGTAHGHPHEIILYYYELYPTMTfflVSVASFVLLSMVGTAVG MCVCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLLCCVRTTKAATYYEAAAYLWNEQQPLFWLQALIPLAALIVLCNCLKLLPC CCKTLAFLAVMSIGAHTVSAYEHVTVIPNTVGVPYKTLVNRPGYSPMVLEMELQSVTLEPTLSLDYITCEYKTVIPS PYVKCCGTAECKDKSLPDYSCKVFTGVYPFMWGGAYCFCDAENTQLSEAHVEKSESCKTEFASAYRAHTASASAKLR VLYQGNNITVAAYAN⑶HAVTVKDAKFWGPMSSAWTPFDNKIWYK⑶VYNMDYPPFGAGRPGQFGDIQSRTPESKDV YANTQLVLQRPAAGTVHVPYSQAPSGFKYWLKERGASLQHTAPFGCQIATNPVRAVNCAVGNIPISIDIPDAAFTRW DAPSVTDMSCEVPACTHSSDFG6VAIIKYTASKKGKCAVHSMTNAVTIREADVEVEGNSQLQISFSTALASAEFRVQ VCSTQVHCAAACHPPKDHIVNYPASHTTLGVQDISTTAMSWVQKITGGVGLIVAVAALILIVVLCVSFSRH“個(gè)體”是指哺乳動(dòng)物，包含但不限于人類或非人類哺乳動(dòng)物，例如牛、馬、犬或貓。本申請(qǐng)所提供的范圍是范圍內(nèi)所有值的速記。例如1至50的范圍是包含1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 組成群處中的任何數(shù)目、數(shù)目的組合或是次范圍。如本申請(qǐng)所述，“治療”是指減少或減緩不適與/或相關(guān)癥狀。應(yīng)理解雖然不排除， 但治療不適或狀況并不需要所述不適、狀態(tài)或相關(guān)癥狀完全消除。“疫苗”是指包含本發(fā)明VLP或DNA或其它基因?yàn)榛A(chǔ)的疫苗載體，它的形式是可被給予至脊椎動(dòng)物，以及誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)，足以誘導(dǎo)免疫性預(yù)防與/或減緩感染與/或減少感染的至少一癥狀，以及/或促進(jìn)VLP或DNA疫苗其它劑量的有效性。典型地，所述疫苗包括習(xí)知的鹽類或緩沖液容易培養(yǎng)液，本發(fā)明的組合物懸浮或溶解于其中。在此形式中，本發(fā)明的組合物可方便使用于預(yù)防、簡(jiǎn)煥或治療感染。在導(dǎo)入宿主之后，所述疫苗可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，包含但不限于產(chǎn)生抗體與/或細(xì)胞激素與/或活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞、抗原表現(xiàn)細(xì)胞、助手T細(xì)胞、星狀細(xì)胞以及/或其它細(xì)胞反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，疫苗也可以是蛋白質(zhì)。例如，由遺傳工程細(xì)胞產(chǎn)生一或多個(gè)外來基因所產(chǎn)生的重組蛋白，而后產(chǎn)生作為免疫原的蛋白質(zhì)。如本申請(qǐng)所述，“類病毒顆?！?VLP)是指結(jié)構(gòu)至少貢獻(xiàn)組成病毒但已知不具有感染性。根據(jù)本發(fā)明，類病毒顆粒不帶有類病毒顆粒不帶有編碼類病毒顆粒的蛋白質(zhì)的遺傳信息。通常，類病毒顆粒缺少病毒基因組，因此不具感染性。此外，通常可通過異質(zhì)表現(xiàn)而大量產(chǎn)生且容易純化類病毒顆粒。除非特別聲明或是由內(nèi)容明顯可知，如本申請(qǐng)所述，“或”是包含在其中的意思。除非特別聲明或是由內(nèi)容明顯可知，如本申請(qǐng)所述，“一”與“所述”是單一或復(fù)數(shù)的意思。除非特別聲明或是由內(nèi)容明顯可知，如本申請(qǐng)所述，“約”是技藝中正常容忍范圍內(nèi)的意思，例如平均值的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)。約可理解為所述值的lO^j^^S^j^j^、 5%,4%,3%,2%U%>0. 5%,0. 1%、0. 05%或0. 01%之內(nèi)。除非申請(qǐng)內(nèi)容中清楚表明，否則所有數(shù)值皆由約這個(gè)字修飾。本申請(qǐng)任何定義中的化學(xué)官能基列示主張包含任何單一官能基或所列官能基組合的變化定義。本申請(qǐng)變化的實(shí)施例包含任何單一實(shí)施例或是任何其它實(shí)施例或其部分的組合。本申請(qǐng)的任何組合物或方法可與本申請(qǐng)的一或多個(gè)任何其它組合物與方法結(jié)合。


圖IA至ID說明CHIKV E假型慢病毒在體的特征。圖1概示說明CHIKV基因組， 以及CHIKV E表現(xiàn)載體用于將37997與LR2006 OPY-I株CHIKV E并入假型慢病毒載體。 CHIKV基因組包含非結(jié)構(gòu)多蛋白NS1、NS2、NS3與NS4以及結(jié)構(gòu)多蛋白殼體(C)與包膜(E E3、E2、6K與El)(頂部)。來自37997與LR20060PY-1株的多肽E基因被插入表現(xiàn)載體(底部)。圖IB包含兩圖。左圖說明所指假型慢病毒載體在幾個(gè)CHIKV允許的細(xì)胞株中的感染性，所述細(xì)胞株包含人類腎表皮細(xì)胞、HeLa子宮頸表皮細(xì)胞、Vero腎表皮細(xì)胞、A549 鱗狀表皮細(xì)胞以及嬰兒倉鼠腎(BHK)細(xì)胞。假型載體由HIV-IGag p24(左)或是pM所指濃度標(biāo)準(zhǔn)化，以及用于感染細(xì)胞(右)。在與假型載體培養(yǎng)M小時(shí)之后，溶解細(xì)胞并且測(cè)量熒光酵素(Iuciferase)活性。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三重復(fù)。圖IC包含兩圖，說明CHIKV假型慢病毒載體PH依附性的進(jìn)入。在所指示的氯化銨(左)與氯喹(chloroquine)(右)濃度存在中培養(yǎng)假型慢病毒載體。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三重復(fù)。數(shù)據(jù)的呈現(xiàn)是相較于沒有處理的活性，在所指劑量的活性百分比。圖ID說明以注射CHIKV(S-27株)老鼠血清中的假型慢病毒載體測(cè)量的中和作用。以所指稀釋倍數(shù)將血清與VSV-G、CHIKV 37997或R2003 0PY-1E假型慢病毒載體及感染四3々細(xì)胞的混合物培養(yǎng)。感染M小時(shí)之后，分析熒光酵素活性。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三重復(fù)。觀察得知控制組無免疫抗血清沒有抑制作用。圖2A制圖2C說明質(zhì)體表現(xiàn)載體與CHIKV VLP的特征。圖2A提供說明用于DNA疫苗與VLP生產(chǎn)的CHIKV C-E或E表現(xiàn)載體。來自37997與LR2006 0PY-1株的CHIKV結(jié)構(gòu)多蛋白殼體加包膜(C-E)或是單獨(dú)E被插入表現(xiàn)載體。將所指的各個(gè)質(zhì)體轉(zhuǎn)染四31~細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染M小時(shí)之后，用西方轉(zhuǎn)印以先前描述的09)用與CHIKV的抗血清反應(yīng)測(cè)量表現(xiàn)。圖 2B包含圖標(biāo)、西方轉(zhuǎn)印與電子顯微圖。從轉(zhuǎn)軟C-E表現(xiàn)載體(^37997)(左)細(xì)胞的上清液純化VLP。在轉(zhuǎn)染72小時(shí)之后，收取上清液，而后Optift^p密度梯度離心。依浮力密度(左上)劃分每一部分，以及藉由用CHIKV的抗血清西方轉(zhuǎn)印分析定性每一部分的蛋白量(左下)。通過穿透式電子顯微鏡20，OOOx (左，IOOnm)(右)倍率觀察每一部分的VLP。 圖2C提供比較CHIKV VLP的cryo-EM重組與辛德畢病毒(Sindbis virus)，說明CHIKV VLP 結(jié)構(gòu)類似亞法病毒。CHIKV VLP (左上部)與辛德畢病毒(右上部)的3D密度圖沿著二十面體的二重對(duì)稱軸的陰影表面呈現(xiàn)。白色三角形標(biāo)示二十面體不對(duì)稱單元的邊界。數(shù)字表示二十面體二重、三重與五重軸限制不對(duì)稱單元的位置。中心橫切面通過CHIKV VLP (左下部)與辛德畢病毒(右下部)的cryo-EM圖。二十面體(二重、三重與五重)軸與類三重 (q3)軸的位向以白線顯示。圖計(jì)算為1.8A分辨率。圖3A-3D說明在老鼠與猴子中DNA或VPL疫苗作用之后CHIKV 37997與LR2006 0PY-1細(xì)胞株的中和作用。以最終免疫作用后10天的免疫老鼠的血清測(cè)試CHIKV細(xì)胞株 37997 (圖3A)或是LR2006 OPY-1 (圖E假型慢病毒載體。用所指的DNA或VLP37997免疫老鼠。在0、3與6周注射每一個(gè)C-E或是E(細(xì)胞株37997與LR2006 OPY-1)質(zhì)體。在第2與6周注射含與不含Ribi佐劑的VLP37997。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三重復(fù)。符號(hào)顯示五只老鼠的平均，橫杠顯示平均的標(biāo)準(zhǔn)偏差。用Prism軟件計(jì)算曲線符合。圖3C說明在第0、4與對(duì)周VLP37997或PBS (控制組)免疫猴子的結(jié)果。在免疫之后10天，在收集免疫猴子的血清中進(jìn)行中和作用分析CHIKV細(xì)胞株37997 (左)或LR2006 0PY-1 (右)E假型慢病毒載體。 符號(hào)顯示六只猴子的平均，橫杠顯示平均的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖3D說明標(biāo)準(zhǔn)蝕斑減數(shù)中和試驗(yàn) (PRNT)確認(rèn)第二次與第三次免疫作用之后，在免疫的猴子血清中對(duì)CHIKV LR2006 0PY-1的中和活性。符號(hào)顯示六只猴子的平均，橫杠顯示平均的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖4A至圖4D說明在被動(dòng)轉(zhuǎn)換純化的IgG之后，在VLP免疫的猴子與CHIKV老鼠模式中，保護(hù)對(duì)抗CHIKV LR2006 0PY-1挑戰(zhàn)。圖4A定量猴子注射PBS(控制組)或用 VLP37997免疫得到的結(jié)果。在最終刺激后15周，用IOiqPFU的CHIKV細(xì)胞株LR2006 0PY-1 挑戰(zhàn)猴子。在挑戰(zhàn)后M小時(shí)，用蝕斑分析測(cè)量頂峰病毒血癥(peak viremia)。血清稀釋從 1 200(偵測(cè)限制=1000PFU/ml)開始。誤差橫杠代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖4B說明猴子白血球中的單核細(xì)胞比例。在用CHIKV挑戰(zhàn)之前與7天之后，使用血液分析器測(cè)量單核細(xì)胞比例。使用非參數(shù)兩t-測(cè)試進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(在第7天，控制組vs. VLP, ρ = 0. 0036 ；第 0天控制組vs.第7天控制組，p = 0. 0015 ；第0天VLP vs.第7天VLP，P > 0. 5)。圖4C 說明在被動(dòng)轉(zhuǎn)換從VLP免疫猴子(免疫)或是控制組猴子(控制組IgG)的純化IgG至老鼠(每只老鼠2!^的總186，每組11 = 5)之后，存在的病毒RNA復(fù)制數(shù)。在IgG轉(zhuǎn)換之后M 小時(shí)，受體老鼠皮下注射致命的LR2006 0PY-1挑戰(zhàn)(30PFU)。在挑戰(zhàn)之后，用定性RT-PCR 測(cè)量老鼠的病毒血癥(偵測(cè)限制=40RNA復(fù)制數(shù)/ml)。誤差橫杠代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。 圖4D說明用控制組IgG或是CHIKV免疫的IgG被動(dòng)轉(zhuǎn)換的老鼠對(duì)抗致命LR2006 0PY-1挑戰(zhàn)的存活曲線。圖5說明浮力密度沉降與西方轉(zhuǎn)印分析的CHIKV E假型慢病毒在體的特性。編碼所指CHIKV Env細(xì)胞株的植體與慢病毒表現(xiàn)載體共同轉(zhuǎn)染制四31~細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后， 收取上清液進(jìn)行上述的沉降梯度。以所指的細(xì)胞株顯示梯度部分的定量，顯示Env與慢病毒顆粒(1.08-1. lg/ml)預(yù)期的浮力密度有共同落點(diǎn)(上部)。顯示CHIKV E1/E2與Gag梯度部分的西方轉(zhuǎn)印分析(下部)。圖 6 說明 CMV/R-CHIKV C-E3-E2-6K-E1 質(zhì)體(細(xì)胞株 37997)。圖7A說明插入的序列(SEQ ID NO :1)。圖7B說明整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 2)。圖8A顯示CMV/R-CHIKV C-E3-E2-6K-E1質(zhì)體(細(xì)胞株0PY1)。圖8B顯示插入序列(SEQ ID NO 3)。圖8C顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 4)。圖9A顯示CMV/R-Middleburg病毒VLP質(zhì)體。圖9B顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 5)。
圖IOA顯示CMV/R-睡眠癥病毒VLP質(zhì)體。圖IOB顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 6)。圖11 (A與B) A顯示CMV/R-Getah病毒VLP質(zhì)體，B顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 7)。圖12A顯示CMV/R-委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒VLP質(zhì)體。圖12B顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 8)。圖13A顯示CMV/R-西方馬腦炎病毒VLP質(zhì)體。圖1 顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 9)。圖14A顯示CMV/R-東方馬腦炎病毒VLP質(zhì)體。圖14B顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 10)。圖15A顯示CMV/R-辛德畢病毒VLP質(zhì)體。圖15B顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 11)。圖16A顯示CMV/R-西門利克森林病毒VLP質(zhì)體。圖16B顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 12)。圖17A顯示CMV/R-鮭魚胰臟病病毒VLP質(zhì)體。圖17B顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 13)。圖18A顯示CMV/R-羅斯河病毒VLP質(zhì)體。圖18B顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 14)。圖19A顯示CMV/R-阿尼昂尼昂病毒VLP質(zhì)體。圖19B顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 15)。圖20A顯示CMV/R-馬亞羅病毒VLP質(zhì)體。圖20B顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 16)。圖21A顯示CMV/R-巴馬森林病毒VLP質(zhì)體。圖21B顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 17)。圖22A顯示CMV/R-奧拉病毒VLP質(zhì)體。圖22B顯示整個(gè)質(zhì)體序列(SEQ ID NO 18)。圖23A顯示CMV/R-CHIKV E3-E2-6K-E1質(zhì)體(細(xì)胞株37997)以及沒有殼體(C) 的插入序列(SEQ ID NO: 19)。圖 23B 顯示 CMV/R-CHIKV E3-E2-6K-E1 質(zhì)體(細(xì)胞株 0PY1) 以及沒有殼體(C)的插入序列(SEQ ID NO 20)。圖M顯示Genbank存取編號(hào)EU224268序列，它是轉(zhuǎn)殖載體pCHIKV-LR ic完整序列。參閱 Tsetsarkin, K. , Higgs, S. , McGee, C. Ε. , De Lamballerie, X. , Charrel, R. N 與 Vanlandingham, D. L.載體補(bǔ)償研究基孔肯尼亞病毒的感染轉(zhuǎn)殖，Vector Borne Zoonotic Dis. 6(4) ,325-337(2006)。圖M顯示Genbank存取編號(hào)EU224270序列，它是轉(zhuǎn)殖載體pCHIKV-37997ic完整序列。
具體實(shí)施例方式從2004年在肯尼亞再次出現(xiàn)起，在非洲、歐洲與亞州，基孔肯尼亞病毒(CHIKV) 已經(jīng)感染數(shù)百萬人。在沒有疫苗或是抗病毒治療之下，病毒的演化與散布進(jìn)入新的地理區(qū)域，以及疾病嚴(yán)重性成為嚴(yán)重的公共務(wù)生問題。本發(fā)明提供組合物與方法用于誘導(dǎo)保護(hù)免疫性。本發(fā)明至少部分基于發(fā)現(xiàn)在非人類靈長(zhǎng)類中重組類病毒顆粒(VLP)疫苗保護(hù)對(duì)抗CHIKV感染。通過表現(xiàn)病毒結(jié)構(gòu)蛋白來產(chǎn)生VLP。這些與復(fù)制補(bǔ)償病毒 (replication-competent virus)具有類似的浮力密度與外型。以VLP免疫作用引起中和抗體對(duì)抗同質(zhì)與異質(zhì)外膜。用VLP免疫的猴子產(chǎn)生高量的交叉反應(yīng)中和抗體，保護(hù)對(duì)抗高劑量表皮CHIKV挑戰(zhàn)。再者，從免疫猴子被動(dòng)轉(zhuǎn)換這些抗體產(chǎn)生對(duì)抗免疫缺陷老鼠中致命的CHIKV挑戰(zhàn)，說明保護(hù)是由體液免疫反應(yīng)媒介。以VLP疫苗免疫作用是策略，防止對(duì)人類感染與傳播CHIKV以及相關(guān)的致病病毒。因此，本發(fā)明提供免疫原組合物包含一或多亞法病毒(例如基孔肯尼亞病毒)結(jié)構(gòu)多肽。特別地，所述免疫原組合物(例如疫苗)包含包膜或殼體多肽，足以形成類病毒顆粒。本發(fā)明更提供編碼亞法病毒(基孔肯尼亞)結(jié)構(gòu)多肽的核苷酸分子、包括這些編碼序列的表現(xiàn)載體以及使用這些核苷酸分子用于制備類病毒顆粒的方法。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供DNA疫苗，用于在個(gè)體的細(xì)胞中表現(xiàn)一或多個(gè)病毒多肽。免疫原組合物本發(fā)明提供用于在個(gè)體中，特別是在人類，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組合物與方法，涉及所述個(gè)體預(yù)防接種包括一或多病毒或CHIKV多肽的VLP或其片段，是在合適載體中用于誘導(dǎo)或增進(jìn)免疫反應(yīng)。在一實(shí)施例中，免疫反應(yīng)保護(hù)個(gè)體免于CHIKV感染或是其發(fā)炎結(jié)果(例如關(guān)節(jié)炎)。給予此免疫原組合物可治療已受CHIVK感染的個(gè)體或是用于預(yù)防CHIKV感染。 在一些實(shí)施例中，比較西非的37997與東/中/南非的最新0PY-1兩種不同細(xì)胞株基因產(chǎn)物的免疫原性，用來發(fā)展CHIKV候選疫苗。這些細(xì)胞株分享95%胺基酸序列相似性，但具有不同的生物差異性，特別是關(guān)于它們的宿主范圍。本發(fā)明的VLP可用于制備疫苗與免疫原組合物。VLP的一重要特征是比現(xiàn)表面蛋白的能力，因而脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)包含對(duì)抗所述蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)。然而，并不是所有蛋白質(zhì)都可以表現(xiàn)在VLP的表面。某些蛋白質(zhì)不表現(xiàn)或在VLP表面上表現(xiàn)差有許多原因。一個(gè)原因是所述蛋白質(zhì)未到達(dá)宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜或是所述蛋白質(zhì)沒有穿膜區(qū)域。對(duì)熟知此技藝的人士而言，免疫原組合物與疫苗的制備是已知的。所述疫苗包含 VLP,所述VLP包括一或多CHIKV多肽或其片段。本發(fā)明亦提供編碼一或多CHIKV多肽或其片段或其變異的表現(xiàn)載體。所述免疫原組合物在細(xì)胞內(nèi)傳送，用以誘導(dǎo)或促進(jìn)個(gè)體中的免疫反應(yīng)，例如體液反應(yīng)。例如，在體內(nèi)傳送包括一或多CHIKV多肽或其片段的VLP，用來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。疫苗典型制備為可注射型式，液體溶液或是懸浮液。也可制備適合注射的固體型式，例如乳狀液或是脂肪體包覆的多肽。疫苗抗原通常結(jié)合醫(yī)藥可接受的載體，可以是任何載體只要不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體傷害接收所述載體的個(gè)體。適合的載體典型包括代謝緩慢的巨分子，例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚甘醇酸、聚胺基酸、胺基酸共聚物、脂肪凝聚物以及非活性病毒顆粒。所述載體是熟知此技藝的人士已知的。所述載體也可作為佐劑。包括一或多CHIKV多肽或其片段或變異的VLP可與佐劑(例如Ribi) —起被給予。 佐劑是促進(jìn)疫苗效果的免疫刺激劑。視需要，包括一或多CHIKV多肽或其片段或變異的VLP 可與佐劑一起被給予，所述佐劑促進(jìn)免疫反應(yīng)對(duì)抗目標(biāo)抗原。有效的佐劑包含但不限于鋁鹽，例如氫氧化鋁與磷酸鋁、胞壁酰肽(muramyl peptides)、細(xì)菌細(xì)胞壁成分、皂素佐劑，以及其它做為免疫刺激劑促進(jìn)組合物有效性的物質(zhì)。免疫原組合物，亦即包括一或多CHIKV多肽的VLP，醫(yī)藥可接受的載體與佐劑典型也包含稀釋劑，例如水、鹽水、甘油、乙醇。也可以有輔助物質(zhì)，例如濕潤(rùn)或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。蛋白質(zhì)可配方在疫苗中成為中性或鹽形式。免疫原組合物典型為腹腔注射給予， 例如皮下注射或肌肉注射。其它配方適合用于其它形式的給予，例如栓劑或口服。口服組合物可投予成為溶液、懸浮液、錠劑、藥丸、膠囊或是緩釋劑型。免疫原組合物給予方式與劑量劑型兼容。免疫原組合物包括免疫有效量的VLP以及其它上述成分。免疫有效量是指單一劑量，或是多劑量排程給予的組合物，有效治療或預(yù)防感染。投藥劑量隨治療個(gè)體、個(gè)體健康與生理狀況、個(gè)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的能力、所要的保護(hù)程度以及相關(guān)參數(shù)而改變。需要的活性成分精確量取決于從業(yè)人員的判斷，但每一劑量通常是在5微克至250微克之間的抗原。本發(fā)明提供VLP，用于治療或預(yù)防亞法病毒感染(例如基孔肯尼亞感染)。多肽表現(xiàn)通常，用合適表現(xiàn)在體中全部或部分編碼多派的核苷酸分子或其片段，轉(zhuǎn)型宿主細(xì)胞，產(chǎn)生包括一或多本發(fā)明CHIKV多肽的VLP。熟知分子生物領(lǐng)域的人士會(huì)了解用于提供重組蛋白質(zhì)的任一個(gè)表現(xiàn)系統(tǒng)。所使用的確切宿主細(xì)胞并不是本發(fā)明的關(guān)鍵?？稍谠怂拗鱃f^BE. coli)或真核宿主(例如釀酒酵母、昆蟲細(xì)胞，例如Sf21細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如NIH 3T3、HeLa, COS細(xì)胞)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。這些細(xì)胞可取自許多來源范圍(例如美國(guó)形式培養(yǎng)收集，Rockland，Md.參閱例如Ausubel et al.，supra)。昆蟲細(xì)胞不限為秋年蟲(Sf)細(xì)胞，例如Sf9、Sf21、粉斑夜蛾，例如高五細(xì)胞與果蠅S2細(xì)胞。真菌(包含酵母菌)宿主細(xì)胞例如釀酒酵母、乳酸克魯維酵母(K lactis)、念珠菌物種包含白色念珠菌與光滑假絲酵母、小巢狀曲菌、粟酒裂殖酵母(S. pombe)、畢赤酵母以及耶羅威亞酵母。哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如COS細(xì)胞、嬰兒倉鼠腎細(xì)胞、 老鼠L細(xì)胞、LNCaP細(xì)胞、中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人類胚胎腎(HEK)細(xì)胞、非洲綠猴細(xì)胞、 CVl細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、Vero與Hep_2細(xì)胞。也可使用非洲爪蟾卵母細(xì)胞或是兩棲動(dòng)物的其它細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞包含細(xì)菌細(xì)胞，例如E. coli, B. subtilis與分枝桿菌。轉(zhuǎn)殖(cloning)所述蛋白質(zhì)的方法是此技藝已知的。例如，從已被所述病毒感染的細(xì)胞萃取的多腺嘌呤(polyadenylayted)mRNA，用RT-PCR分離編碼特定CHIKV或任何亞法病毒蛋白的基因。所得的產(chǎn)物基因可被轉(zhuǎn)殖成為DNA插入載體。“載體”是指可以在生物體、細(xì)胞或細(xì)胞成分之間增殖與/或轉(zhuǎn)換的核苷酸。載體包含質(zhì)體、病毒、噬菌體、前病毒、噬菌質(zhì)體、轉(zhuǎn)位子(transposon)、人工染色體等，可自行復(fù)制或是可以并入宿主細(xì)胞的染色體。載體也可以是不會(huì)自行復(fù)制的裸露的RNA多核苷酸、裸露的DNA多核苷酸、在同一股中由DNA與RNA組成的多核苷酸、多離胺酸結(jié)合的DNA或RNA、多肽結(jié)合的DNA或RNA、 脂肪體結(jié)合的DNA等。通常但并非全部的實(shí)施例中，本發(fā)明的載體是質(zhì)體或桿狀病毒質(zhì)粒 (bacmid) 0本發(fā)明更提供核苷酸，所述核苷酸是編碼包含嵌合分子的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)殖至表現(xiàn)載體中，在細(xì)胞中表現(xiàn)用于形成VLP?！氨憩F(xiàn)載體”是一載體，例如質(zhì)體，可促進(jìn)比現(xiàn)與合并在內(nèi)的核苷酸的復(fù)制。典型地，要表現(xiàn)的所述核苷酸分子是“操作連結(jié)”至與啟動(dòng)子/或促進(jìn)子，由所述啟動(dòng)子與/促進(jìn)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制。在一實(shí)施例中，所述VLP包括一或多亞法病毒包膜蛋白，特別是CHIKV病毒包膜蛋白。在另一實(shí)施例中，所述一或多包膜蛋白是E3、 E2、6K與El中任一個(gè)或多個(gè)。在另一實(shí)施例中，所述VLP更包括CHIKV病毒殼體蛋白。在相關(guān)實(shí)施例中，使用所述基孔肯尼亞病毒殼體蛋白。在另一實(shí)施例，所述VLP包括殼體、E3、 E2、6K與E1。在另一實(shí)施例，所述表現(xiàn)載體是哺乳動(dòng)物表現(xiàn)載體或是桿狀病毒載體。轉(zhuǎn)型或轉(zhuǎn)染的方法以及表現(xiàn)載體的選擇取決于所選的宿主系統(tǒng)。轉(zhuǎn)型與轉(zhuǎn)染方法描述在例如Ausubel等人(supra)；表現(xiàn)載體可從中選擇，例如轉(zhuǎn)殖載體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè) (P. H. Pouwels et al.，1985 supp. 1987)。許多表現(xiàn)系統(tǒng)用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。可用于產(chǎn)生所述多肽的表現(xiàn)載體包含但不限于染色體、游離基因(episome)與得自病毒的載體，例如得自于細(xì)菌質(zhì)體、噬菌體、轉(zhuǎn)位子、酵母菌游離基因、插入元素、酵母菌染色體元素、例如桿狀病毒、乳突多瘤病毒(papova virus)例如SV40、痘苗病毒、腺病毒、雞痘病毒、偽狂犬病毒與反轉(zhuǎn)錄病毒的載體以及來自其組合的載體。本申請(qǐng)所提供的建構(gòu)與/或載體包括CHIKV多核苷酸，編碼結(jié)構(gòu)多肽，包含包膜蛋白或是殼體蛋白或是其部分。所述載體可以是例如噬菌體、質(zhì)體、病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。包括多核苷酸的所述建構(gòu)與/或載體應(yīng)運(yùn)作連結(jié)至適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，例如但不限于CMV啟動(dòng)子、噬菌體浪達(dá)(Iambda)PL啟動(dòng)子、E. coli lac、phoA與tac啟動(dòng)子、SV40早與晚啟動(dòng)子以及反轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動(dòng)子。熟知此技藝的人士知道其它合適的啟動(dòng)子取決于所要的宿主細(xì)胞與 /或表現(xiàn)速度。表現(xiàn)建構(gòu)更包含轉(zhuǎn)錄區(qū)域中的轉(zhuǎn)錄起始、終止位置以及轉(zhuǎn)譯的核醣體結(jié)合位置。建構(gòu)所表現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄編碼部分較佳包含所要轉(zhuǎn)譯的多肽的開始處的起始編碼子以及結(jié)束處的終止編碼子。表現(xiàn)載體較佳包含至少一可選擇的標(biāo)示(marker)。所述標(biāo)示包含用于真核細(xì)胞的二氫葉酸還原酶抑制劑、G418或新霉素抗性以及用于培養(yǎng)E. coli與其它細(xì)菌的四環(huán)霉素、卡那霉素或青霉素抗性基因。這些載體中較佳為病毒在體，例如桿狀病毒、痘病毒(例如痘苗病毒、雞痘病毒、金絲雀痘病毒、雞痘病毒、浣熊痘病毒、豬痘病毒等)、腺病毒(例如犬腺病毒)、泡疹病毒以及反轉(zhuǎn)錄病毒?？捎糜诒景l(fā)明的其它載體包括用于細(xì)菌的載體，包括 pQE70、pQE60 以及 pQE_9、pBluescript 載體、Phagescript 載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、 pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。真核載體較佳為 pFastBacl、pWINEO、 pSV2CAT、p0G44、pXTl以及pSG、pSVK3、pBPV、pMSG與pSVL。熟知此技藝的人士會(huì)明白其它適合的載體。重組架構(gòu)可被制備并且用于在真核細(xì)胞與/或原核細(xì)胞，轉(zhuǎn)染、感染或是轉(zhuǎn)型，以及可以表現(xiàn)病毒蛋白，包含本申請(qǐng)所述的病毒蛋白。因此，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞，包括載體， 含有編碼CHIKV結(jié)構(gòu)基因的核苷酸，包含殼體、E3、E2、6K與El或其部分，以及/或上述任何嵌合分子，并且允許CHIKV結(jié)構(gòu)基因的表現(xiàn)，包含殼體、E3、E2、6K與El或其部分，以及/ 或上述任何嵌合分子在所述宿主細(xì)胞中與可形成VLP的條件。在一實(shí)施例中，所述載體是重組的桿狀病毒。在另一實(shí)施例中，所述重組的桿狀病毒轉(zhuǎn)染至昆蟲細(xì)胞中。在較佳實(shí)施例中，所述細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，所述昆蟲細(xì)胞是Sf9細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，所述載體與/或宿主細(xì)胞包括核苷酸，編碼CHIKV基因，包含殼體、E3、E2、6K與El或是上述其部分。在另一實(shí)施例中，所述載體與/或宿主細(xì)胞主要包含CHIKV殼體、E3、E2、6K與El或上述其部分。在另一實(shí)施例中，所述載體與/或宿主細(xì)胞包含CHIKV蛋白質(zhì)，包括殼體、E3、E2、6K與El或上述其部分。如本申請(qǐng)所述，這些載體與/ 或宿主細(xì)胞包含CHIKV核心E3、E2、6K與El或其部分，以及可包含其它細(xì)胞組成，例如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、醣類等。用于多肽產(chǎn)生的一特定細(xì)菌表現(xiàn)系統(tǒng)是E. Coli pET表現(xiàn)系統(tǒng)(Novagen，Inc.， Madison, Wis) 0根據(jù)此表現(xiàn)系統(tǒng)，編碼多肽的DNA以一能表現(xiàn)的位向插入pET載體中。由于編碼所述多肽的基因是在T7調(diào)節(jié)信號(hào)控制下，所以通過誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中T7RNA聚合酶的表現(xiàn)來達(dá)到多肽的表現(xiàn)。典型是使用響應(yīng)IPTG誘導(dǎo)表現(xiàn)T7RNA聚合酶的宿主細(xì)胞株來達(dá)到。一旦產(chǎn)生之后，根據(jù)此記憶中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如本申請(qǐng)所述的方法，分離重組多肽。用于多肽產(chǎn)生的另一細(xì)菌表現(xiàn)系統(tǒng)是pGEX表現(xiàn)系統(tǒng)(Pharmacia)。此系統(tǒng)使用 GST基因融合系統(tǒng)，用于高量表現(xiàn)基因或基因片段成為融合蛋白，可快速純化與回收功能性的基因產(chǎn)物。目標(biāo)蛋白質(zhì)融合至日本血吸蟲(Schistosoma japonic·)的麩胺基硫轉(zhuǎn)移酵素的羥基端，以及可使用麩胺基瓊脂糖凝膠4B的親和性層析，從細(xì)菌溶融液中純化?？稍跍睾蜅l件以麩胺基沖提來回收融和蛋白質(zhì)。在麩胺基硫轉(zhuǎn)移酵素區(qū)域上游位置專一性的蛋白酶辨認(rèn)位置存在，促使從融合蛋白質(zhì)切除麩胺基硫轉(zhuǎn)移酵素區(qū)域。例如，在PGEX-2T中表現(xiàn)的蛋白質(zhì)可用凝血酶(thrombin)切除；在pGEX_3X中表現(xiàn)的蛋白質(zhì)可用因子fe切除。一旦表現(xiàn)本發(fā)明的重組多肽，分離所述重組多肽，例如使用親和性層析。在一范例中，對(duì)抗本發(fā)明多肽的抗體(如本申請(qǐng)所描述產(chǎn)生的)可接合在管柱，用以分離重組多肽。 在親和性層析之前，可用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如Ausubel等人，supra)進(jìn)行具有多肽細(xì)胞的溶融與劃分。分離之后，如有需要，可進(jìn)一步分離所述重組蛋白質(zhì)，例如用高效能脂質(zhì)層析(參閱例如Fisher，生化與分子生物中的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，Work與Burdon，Elservier，1980)。也可用化學(xué)合成產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，特別是短多肽片段(例如用固相勝肽合成，第二版，1984， The Pierce Chemical Co.，Rockford，III)。這些一般的多肽表現(xiàn)技術(shù)與純化也可用于產(chǎn)生以及分離有用的勝肽片段或類似物(如本申請(qǐng)所述)。CHIKV多肽與類似物本發(fā)明提供包括一或多CHIKV多肽的VLP。本發(fā)明也包含包括一或多CHIKV多肽或其片段的的VLP，由許多方式修飾或是不抑制調(diào)整免疫反應(yīng)的功能。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供通過產(chǎn)生改變來優(yōu)化CHIKV胺基酸序列或核苷酸序列的方法。所述改變可包含一些突變、刪除、插入或是轉(zhuǎn)譯后修飾。本發(fā)明更包含任何本發(fā)明自然存在多肽的類似物。類似物可與本發(fā)明自然存在的多肽胺基酸序列不同、轉(zhuǎn)譯后修飾不同或是二者皆不同。本發(fā)明的類似物與本發(fā)明自然存在的胺基酸序列通常具有至少85%、較佳為90%以及更佳為 95%或甚至99%相似性。序列比較的長(zhǎng)度至少10、13、15個(gè)胺基酸，較佳為至少25個(gè)胺基酸，及更佳為超過35個(gè)胺基酸。亞法病毒或CHIKV多肽的改變包含但不限于位置直接或隨機(jī)突變、同質(zhì)重組(DNA 改組)、使用含有模板尿嘧啶的突變、寡核苷酸突變、硫代寡核苷酸修飾的DNA突變、使用間隔的雙DNA的突變等。其它適合的方法包含點(diǎn)錯(cuò)配修補(bǔ)、使用修復(fù)缺陷宿主細(xì)胞株的突變、 限制-選擇與限制-純化、刪除突變、總基因合成突變、雙股鍛煉修補(bǔ)等。本發(fā)明中，突變也包含例如涉及嵌合架構(gòu)。在一實(shí)施例中，自然存在的、改變的分子信息，或是突變的自然存在分子的信息，例如序列、序列比較、生理性質(zhì)、結(jié)晶結(jié)構(gòu)等可領(lǐng)導(dǎo)突變，。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供多肽變異，它不同于參考多肽。相較于參考序列，“變異”是指胺基酸序列改變一或多個(gè)胺基酸。所述變異可具有“保留的”(conservative)改變，其中取代的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)化或化學(xué)性質(zhì)，例如用異白胺酸取代白胺酸。或者， 變異可具有“非保留的”(nonconservative)改變，例如用色胺酸取代甘胺酸。類似的較小變異也可包含胺基酸刪除或插入，或二者都有。使用此技藝已知的計(jì)算器程序，可發(fā)現(xiàn)決定那些胺基酸可被取代、插入或刪除而不會(huì)破壞生物或免疫活性的指南，例如DNASTAR軟件。 較佳為變異顯示實(shí)質(zhì)的生物活性。在一實(shí)施例中，蛋白質(zhì)變異形成VLP以及給予至個(gè)體時(shí)， 具有抗體反應(yīng)。蛋白質(zhì)中的突變可發(fā)生自然變異。在感染劑的個(gè)別群組內(nèi)，例如CHIKV，這些突變可造成抗原變異性。因此，感染特定菌株的人發(fā)展抗體對(duì)抗病毒，當(dāng)較新的病毒株出現(xiàn)，對(duì)抗較老菌株的的抗體不再辨識(shí)較新的病毒，以及可發(fā)生再次感染。本發(fā)明包括來自感染劑的蛋白質(zhì)的所有的抗原性與遺傳變異，用于制造VLP。再次，在決定相似性程度的示范方法中，可使用BLAST軟件，或然率在e_3與e—· 之間指示接近相關(guān)的序列。修飾包含體內(nèi)與體外多肽的化學(xué)衍生作用，例如乙酰化、羥基化、磷酸化或醣基化；所述修飾可發(fā)生在多肽合成過程或是處理過程或是在以分離的修飾酵素處理之后。類似物也可以通過在初級(jí)序列改變而不同于本發(fā)明自然存在的多肽。這些包含遺傳變異，自然的與誘導(dǎo)的(例如得自于輻射或暴露在硫酸乙基甲基酯隨機(jī)突變或是位置專一性突變，如SambrooKFritsh與Maniatis，分子轉(zhuǎn)殖實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版)，CSH ft~ess，1989，或Ausubel等人，supra)。也包含環(huán)化的勝肽、分子與類似物，包含除了 L-胺基酸之外的基，例如D-胺基酸或非自然存在或合成的胺基酸，例如貝塔或加碼胺基酸。除了全長(zhǎng)多肽之外，本發(fā)明也包含本發(fā)明任一多肽的的片段。如本申請(qǐng)所述，“片段”是指至少5、10、13或15。在其它實(shí)施例中，片段是至少20個(gè)連續(xù)的胺基酸、至少30個(gè)連續(xù)的胺基酸或至少50個(gè)連續(xù)的胺基酸，以及在其它實(shí)施例中，至少60至80個(gè)或更多個(gè)連續(xù)胺基酸。本發(fā)明的片段可由熟知此技藝的人士已知的方法產(chǎn)生，或是來自于正常的蛋白質(zhì)程序(例如從初期不需要生物活性的多肽移除胺基酸或是改變mRNA切除來改變胺基酸或是其它的蛋白質(zhì)處理作用)。根據(jù)本發(fā)明的方法，可給予具有化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)仿真CHIKV VLP或一或多個(gè)CHIKV 多肽功能活性的非蛋白質(zhì)類似物。CHIKV類似物可超過自然CHIKV的生理活性。類似物設(shè)計(jì)的方法是此技藝已知的，以及可根據(jù)所述方法，通過修飾化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行類似物的合成，因而所得的類似物具有自然CHIKV多肽的免疫調(diào)節(jié)活性。這些化學(xué)修飾包含但不限于在自然的CHIKV分子的特定碳原子處取代其它R基，以及變化飽和程度。較佳地，所述類似物對(duì)于體內(nèi)降解較有抗性，造成給予后較長(zhǎng)的治療效果。量測(cè)功能活性的分析包含但不限于以下范例所描述的內(nèi)容。CHIKV 多月太通常，本發(fā)明包含任何核苷酸序列，編碼包括一或多個(gè)CHIKV多肽或其片段的 VLP，其中所述片段誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。可通過此技藝已知的重組DNA技術(shù)，操作分離的核苷酸分子。因此，載體中的核苷酸序列被認(rèn)為是分離的，其中5’與3’限制處為已知，或是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引子序列已被揭露，但是以自然狀態(tài)存在的核苷酸序列則認(rèn)為不是分離的。在一些范例中，所述載體包括基孔肯尼亞37997或基孔肯尼亞0PY-1核苷酸段，或其片段。 所述載體更包括CMV/R啟動(dòng)子。所述載體也包括殼體蛋白或其片段。在其它實(shí)施例中，所述載體包括包膜蛋白，選自于E3、E2、6K與El組成的群組。在一些范例中，疫苗可包括殼體、E3、E2、6K與E1。在其它范例中，疫苗可包括E3、E2、6K與El。根據(jù)本發(fā)明的一些較佳實(shí)施例，C-Env37997是 SEQ ID NO 1 ；Env37997 是 SEQ ID NO: 19 ；C-Env0PH 是 SEQID NO 3 ；Envop^1 是 SEQ ID NO :20。以下所示是對(duì)應(yīng)于所述CMV/R-CHIKV C-E3-E2-6K-E1質(zhì)體(37997)的殼體(SEQ ID NO 21)以及E3、E2、6K與E1(SEQ ID NO 19)的核苷酸序列。例如，所述CMV/R表現(xiàn)載體描述在美國(guó)專利號(hào)7，094，598中，所述專利全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)中。E3-E2-6K-E1SEQ ID NO 19Atgagcctcgccctcccggtcttgtgcctgttggcaaacactacattcccctgctctcagccgccttgc acaccctgctgctacgaaaaggaaccggaaagcaccttgcgcatgcttgaggacaacgtgatgagacccggatactaccagctactaaaagcatcgc tgacttgctctccccaccgccaaagacgcagtactaaggacaattttaatgtctataaagccacaagaccatatctagctcattgtcctgactgcg gagaagggcattcgtgccacagccctatcgcattggagcgcatcagaaatgaagcaacggacggaacgctgaaaatccaggtctctttgcagatcggg ataaagacagatgacagccacgattggaccaagctgcgctatatggatagccatacgccagcggacgcggagcgagccggattgcttgtaaggac ttcagcaccgtgcacgatcaccgggaccatgggacactttattctcgcccgatgcccgaaaggagagacgctgacagtgggatttacggacagc agaaagatcagccacacatgcacacacccgttccatcatgaaccacctgtgataggtagggagaggttccactctcgaccacaacatggtaaaga gttaccttgcagcacgtacgtgcagagcaccgctgccactgctgaggagatagaggtgcatatgcccccagatactcctgaccgcacgctgatgac gcagcagtctggcaacgtgaagatcacagttaatgggcagacggtgcggtacaagtgcaactgcggtggctcaaacgagggactgacaaccacag acaaagtgatcaataactgcaaaattgatcagtgccatgctgcagtcactaatcacaagaattggcaatacaactcccctttagtcccgcgcaac gctgaactcggggaccgtaaaggaaagatccacatcccattcccattggcaaacgtgacttgcagagtgccaaaagcaagaaaccctacagtaact tacggaaaaaaccaagtcaccatgctgctgtatcctgaccatccgacactcttgtcttaccgtaacatgggacaggaaccaaattaccacgaggag tgggtgacacacaagaaggaggttaccttgaccgtgcctactgagggtctggaggtcacttggggcaacaacgaaccatacaagtactggccgcaga tgtctacgaacggtactgctcatggtcacccacatgagataatcttgtactattatgagctgtaccccactatgactgtagtcattgtgtcggtgg cctcgttcgtgcttctgtcgatggtgggcaca
gcagtgggaatgtgtgtgtgcgcacggcgcagatgcattacaccatatgaattaacaccaggagccact gttcccttcctgctcagcctgctatgctgcgtcagaacgaccaaggcggccacatattacgaggctgcggcatatctatggaacgaacagcagcccct gttctggttgcaggctcttatcccgctggccgccttgatcgtcctgtgcaactgtctgaaactcttgccatgctgctgtaagaccctggctttttt agccgtaatgagcatcggtgcccacactgtgagcgcgtacgaacacgtaacagtgatcccgaacacggtgggagtaccgtataagactcttgtcaacaga ccgggttacagccccatggtgttggagatggagctacaatcagtcaccttggaaccaacactgtcacttgactacatcacgtgcgagtacaaaac tgtcatcccctccccgtacgtgaagtgetgtggtacagcagagtgcaaggacaagagcctaccagactacagctgcaaggtctttactggagtctacc catttatgtggggcggcgcctactgcttttgcgacgccgaaaatacgcaattgagcgaggcacatgtagagaaatctgaatcttgcaaaacagagtt tgcatcggcctacagagcccacaccgcatcggcgtcggcgaagctccgcgtcctttaccaaggaaacaacattaccgtagetgcctacgctaacg gtgaccatgccgtcacagtaaaggacgccaagtttgtcgtgggcccaatgtcctccgcctggacaccttttgacaacaaaatcgtggtgtacaaa ggcgacgtctacaacatggactacccaccttttggcgcaggaagaccaggacaatttggtgacattcaaagtcgtacaccggaaagtaaagacgttt atgccaacactcagttggtactacagaggccagcagcaggcacggtacatgtaccatactctcaggcaccatctggcttcaagtattggctgaagga acgaggagcatcgctacagcacacggcaccgttcggttgccagattgcgacaaacccggtaagagctgtaaattgcgctgtggggaacataccaa tttccatcgacataccggatgcggcctttactagggttgtcgatgcaccctctgtaacggacatgtcatgcgaagtaccagcctgcactcactcctc cgactttgggggcgtcgccatcatcaaatacacagctagcaagaaaggtaaatgtgcagtacattcgatgaccaacgccgttaccattcgagaagccg acgtagaagtagaggggaactcccagctgcaaatatccttctcaacagccctggcaagcgccgagtttcgcgtgcaagtgtgctccacacaagt acactgcgcagccgcatgccaccctccaaaggaccacatagtcaattacccagcatcacacaccacccttggggtccaggatatatccacaacggc aatgtcttgggtgcagaagattacgggaggagtaggattaattgttgctgttgctgccttaattttaattgtggtgctatgcgtgtcgtttagcag gcac核心SEQ ID NO :21Atggagttcatcccgacgcaaactttctataacagaaggtaccaaccccgaccctgggccccacgccct acaattcaagtaattagacctagaccacgtccacagaggcaggctgggcaactcgcccagctgatctccgcagtcaacaaattgaccatgcgcgcggtacctcaacagaagcctcgcagaaatcggaaaaacaagaagcaaaggcagaagaagcaggcgccgcaaaacgacccaaagcaaaagaagcaac caccacaaaagaagccggctcaaaagaagaagaaaccaggccgtagggagagaatgtgcatgaaaattgaaaatgattgcatcttcgaag tcaagcatgaaggcaaagtgatgggctacgcatgcctggtgggggataaagtaatgaaaccagcacatgtgaagggaactatcgacaatgccga tctggctaaactggcctttaagcggtcgtctaaatacgatcttgaatgtgcacagataccggtgcacatgaagtctgatgcctcgaagtttaccca cgagaaacccgaggggtactataactggcatcacggagcagtgcagtattcaggaggccggttcactatcccgacgggtgcaggcaagccgggagac agcggcagaccgatcttcgacaacaaaggacgggtggtggccatcgtcctaggaggggccaacgaaggtgcccgcacggccctctccgtggtg acgtggaacaaagacatcgtcacaaaaattacccctgagggagccgaagagtgg以下所示是對(duì)應(yīng)于 CMV/R-CHIKV ΟΕ3-Ε2_6Κ_Ε1 質(zhì)體(0ΡΥ-1)的殼體(SEQ ID NO 22)以及E3、E2、6K與E1(SEQ ID NO 20)的核苷酸序列。Ε3-Ε2-6Κ-Ε1SEQ ID NO 20Atgagtcttgccatcccagttatgtgcctgttggcaaacaccacgttcccctgctcccagcccccttgc acgccctgctgctacgaaaaggaaccggaggaaaccctacgcatgcttgaggacaacgtcatgagacctgggtactatcagctgctacaagcatcct taacatgttctccccaccgccagcgacgcagcaccaaggacaacttcaatgtctataaagccacaagaccatacttagctcactgtcccgactgtg gagaagggcactcgtgccatagtcccgtagcactagaacgcatcagaaatgaagcgacagacgggacgctgaaaatccaggtctccttgcaaatcg gaataaagacggatgacagccacgattggaccaagctgcgttatatggacaaccacatgccagcagacgcagagagggcggggctatttgtaag aacatcagcaccgtgtacgattactggaacaatgggacacttcatcctggcccgatgtccaaaaggggaaactctgacggtgggattcactgacag taggaagattagtcactcatgtacgcacccatttcaccacgaccctcctgtgataggtcgggaaaaattccattcccgaccgcagcacggtaaaga gctaccttgcagcacgtacgtgcagagcaccgccgcaactaccgaggagatagaggtacacatgcccccagacacccctgatcgcacattaatgtc acaacagtccggcaacgtaaagatcacagtcaatggccagacggtgcggtacaagtgtaattgcggtggctcaaatgaaggactaacaactaca gacaaagtgattaataactgcaaggttgatcaatgtcatgccgcggtcaccaatcacaaaaagtggcagtataactcccctctggtcccgcgtaat gctgaacttggggaccgaaaaggaaaaattcacatcccgtttccgctggcaaatgtaacatgcagggtgcctaaagcaaggaaccccaccgtgacgtacgggaaaaaccaagtcatcatgctactgtatcctgaccacccaacactcctgtcctaccggaatatgggagaagaaccaaactatcaagaagag tgggtgatgcataagaaggaagtcgtgctaaccgtgccgactgaagggctcgaggtcacgtggggcaacaacgagccgtataagtattggccgcag ttatctacaaacggtacagcccatggccacccgcatgagataattctgtattattatgagctgtaccccactatgactgtagtagttgtgtcagt ggccacgttcatactcctgtcgatggtgggtatggcagcggggatgtgcatgtgtgcacgacgcagatgcatcacaccgtatgaactgacaccaggagcta ccgtccctttcctgcttagcctaatatgctgcatcagaacagctaaagcggccacataccaagaggctgcgatatacctgtggaacgagcagcaacc tttgttttggctacaagcccttattccgctggcagccctgattgttctatgcaactgtctgagactcttaccatgctgctgtaaaacgttggctttt ttagccgtaatgagcgtcggtgcccacactgtgagcgcgtacgaacacgtaacagtgatcccgaacacggtgggagtaccgtataagactctagtcaatag acctggctacagccccatggtattggagatggaactactgtcagtcactttggagccaacactatcgcttgattacatcacgtgcgagtacaaaa ccgtcatcccgtctccgtacgtgaagtgetgcggtacagcagagtgcaaggacaaaaacctacctgactacagctgtaaggtcttcaccggcgtctacc catttatgtggggcggcgcctactgcttctgcgacgctgaaaacacgcagttgagcgaagcacacgtggagaagtccgaatcatgcaaaacagaatt tgcatcagcatacagggctcataccgcatctgcatcagctaagctccgcgtcctttaccaaggaaataacatcactgtaactgcctatgcaaacg gcgaccatgccgtcacagttaaggacgccaaattcattgtggggccaatgtcttcagcctggacacctttcgacaacaaaattgtggtgtacaaagg tgacgtctataacatggactacccgccctttggcgcaggaagaccaggacaatttggcgatatccaaagtcgcacacctgagagtaaagacgtctatgc taatacacaactggtactgcagagaccggctgtgggtacggtacacgtgccatactctcaggcaccatctggctttaagtattggctaaaagaac gcggggcgtcgctgcagcacacagcaccatttggctgccaaatagcaacaaacccggtaagagcggtgaactgcgccgtagggaacatgcccatct ccatcgacataccggaagcggccttcactagggtcgtcgacgcgccctctttaacggacatgtcgtgcgaggtaccagcctgcacccattcctca gactttgggggcgtcgccattattaaatatgcagccagcaagaaaggcaagtgtgcggtgcattcgatgactaacgccgtcactattcgggaagctga gatagaagttgaagggaattctcagctgcaaatctctttctcgacggccttagccagcgccgaattccgcgtacaagtctgttctacacaagtaca ctgtgcagccgagtgccaccccccgaaggaccacatagtcaactacccggcgtcacataccaccctcggggtccaggacatctccgctacggcgatg tcatgggtgcagaagatcacgggag
gtgtgggactggttgttgctgttgccgcactgattctaatcgtggtgctatgcgtgtcgttcagcaggc ac核心SEQ ID NO 22Atggagttcatcccaacccaaactttttacaataggaggtaccagcctcgaccctggactccgcgccct actatccaagtcatcaggcccagaccgcgccctcagaggcaagctgggcaacttgcccagctgatctcagcagttaataaactgacaat gcgcgcggtaccacaacagaagccacgcaggaatcggaagaataagaagcaaaagcaaaaacaacaggcgccacaaaacaacacaa atcaaaagaagcagccacctaaaaagaaaccggctcaaaagaaaaagaagccgggccgcagagagaggatgtgcatgaaaatc gaaaatgattgtattttcgaagtcaagcacgaaggtaaggtaacaggttacgcgtgcctggtgggggacaaagtaatgaaaccagca cacgtaaaggggaccatcgataacgcggacctggccaaactggcctttaagcggtcatctaagtatgaccttgaatgcgcgcaga tacccgtgcacatgaagtccgacgcttcgaagttcacccatgagaaaccggaggggtactacaactggcaccacggagcagtacagtac tcaggaggccggttcaccatccctacaggtgctggcaaaccaggggacagcggcagaccgatcttcgacaacaagggacgcgtggt ggccatagtcttaggaggagctaatgaaggagcccgtacagccctctcggtggtgacctggaataaagacattgtcactaaaatca cccccgagggggccgaa gagtgg在一特定實(shí)施例中，核苷酸分子SEQ ID NO :1、19、3或20包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽與編碼選自殼體、E3、E2、6K與El或E3、E2、6K與El的包膜蛋白的多肽具有至少約 50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或更高的相似性(例如當(dāng)和胺基酸序列全長(zhǎng)比較時(shí))。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)可包括含有改變的突變，產(chǎn)生無聲取代(silent substitutions)、加成或刪除，但不改變編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)或活性，或是蛋白質(zhì)如何制造。 可由許多理由制造核苷酸變異，例如優(yōu)化在特定宿主的密碼子表現(xiàn)。參閱美國(guó)專利公開案號(hào)2005/0118191，所述公開案的全文并入本申請(qǐng)作為參考。除此之外，可定序核苷酸，確認(rèn)轉(zhuǎn)殖正確的編碼區(qū)域并且不包含任何不想要的突變。核苷酸可次轉(zhuǎn)殖至表現(xiàn)載體(例如桿狀病毒)中，用于任何細(xì)胞中的表現(xiàn)。熟知此技藝的人士理解不同的次轉(zhuǎn)殖方法是可獲得且可能的?？蓪?shí)質(zhì)純化但不需要純化分離的核苷酸。例如，在轉(zhuǎn)殖或表現(xiàn)在體內(nèi)分離的核苷酸并不純，可包括所在細(xì)胞內(nèi)的一點(diǎn)物質(zhì)。所述核苷酸被分離，如本申請(qǐng)所用的詞，是用熟知此技藝的人士已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來進(jìn)行操作。CHIKV VLP 產(chǎn)生本發(fā)明也提供建構(gòu)與方法，用于產(chǎn)生包括CHIKV多肽或其片段的VLP，以及增加VLP產(chǎn)生效率的組合物與方法。例如，增加領(lǐng)導(dǎo)序列至CHIKV殼體、E3、E2、6K與El或其部分，可改善在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)效率。在另一范例中，異質(zhì)信號(hào)序列可融合至CHIKV殼體、E3、E2、6K與El或其部分。在一實(shí)施例中，所述信號(hào)序列可得自于昆蟲細(xì)胞的基因。對(duì)于特定的細(xì)胞型式，增加VLP產(chǎn)生效率的其它方法是優(yōu)化核苷酸的密碼子，編碼CHIKV殼體、E3、E2、6K與El或其部分。選殖所述蛋白質(zhì)的方法是此技藝中已知的。例如，編碼特定CHIKV或任何亞法蛋白的基因可用RT-PCR從細(xì)胞萃取的多腺嘌呤化的mRNA中分離，所述細(xì)胞已經(jīng)被所述病毒感染。所得的基因可被轉(zhuǎn)殖成為DNA插入載體中?！拜d體”是指核苷酸可在生物體、細(xì)胞或細(xì)胞成分間增殖與/或轉(zhuǎn)換。載體包含質(zhì)體、病毒、噬菌體、前病毒、噬菌質(zhì)體、轉(zhuǎn)位子、人工染色體等，自動(dòng)復(fù)制或是可整合至宿主細(xì)胞的染色體。載體也可以是裸露的RNA多核苷酸、 裸露的DNA多核苷酸、在同一股中由DNA與RNA組成的多核苷酸、多離胺酸結(jié)合的DNA或 RNA、勝肽結(jié)合的DNA或RNA、脂肪體結(jié)合的DNA等，不自動(dòng)復(fù)制。在許多并非全部的實(shí)施例中，本發(fā)明的載體是質(zhì)體或桿狀病毒質(zhì)粒。因此，本發(fā)明包括編碼蛋白質(zhì)的核苷酸，包含嵌合分子，轉(zhuǎn)殖在可表現(xiàn)載細(xì)胞中的表現(xiàn)載體中，誘導(dǎo)形成本發(fā)明的VLP?！氨憩F(xiàn)載體”是載體，例如質(zhì)體，可促進(jìn)表現(xiàn)以及并入其中的核苷酸復(fù)制。典型地，要表現(xiàn)的核苷酸是“操作連結(jié)”至啟動(dòng)子與/或促進(jìn)子，以及用于由所述啟動(dòng)子與/或促進(jìn)子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制。在一實(shí)施例中，VP包括一或多個(gè)亞法病毒包膜蛋白，特別是CHIKV病毒包膜蛋白。在另一實(shí)施例中，所述一或多個(gè)包膜蛋白是選自E3、 E2、6K與El組成的群組中。在另一實(shí)施例中，VLP包括CHIKV病毒殼體蛋白。在相關(guān)的實(shí)施例中，使用基孔肯尼亞病毒殼體蛋白。在另一實(shí)施例中，所述VLP是由E3、E2、6K與El組成。在另一實(shí)施例中，VLP是由殼體、E3、E2、6K與El組成。在另一實(shí)施例中，表現(xiàn)載體是桿狀病毒載體。本發(fā)明也提供產(chǎn)生包括CHIKV多肽或其片段的VLP。在一范例中，所述方法涉及在細(xì)胞中表現(xiàn)編碼CHIKV多肽的多核苷酸，以及培養(yǎng)所述細(xì)胞，因而產(chǎn)生VLP。在一實(shí)施例中， 用DNA疫苗感染細(xì)胞(例如人類細(xì)胞)，其中所述DNA疫苗是DNA載體，包括編碼亞法病毒殼體蛋白或一或多亞法病毒包膜蛋白或其片段的核苷酸片段，產(chǎn)生亞法病毒VLP。特別地， 所述亞法病毒是CHIKV。取決于選擇的表現(xiàn)系統(tǒng)與宿主細(xì)胞，在條件下成長(zhǎng)表現(xiàn)載體轉(zhuǎn)型的宿主細(xì)胞，因而表現(xiàn)重組蛋白以及形成VLP。在一實(shí)施例中，本發(fā)明包括產(chǎn)生VLP的方法，涉及轉(zhuǎn)染編碼至少一亞法病毒蛋白的載體至合適的宿主細(xì)胞中，以及在條件下表現(xiàn)所述亞法病毒蛋白， 產(chǎn)生VLP。在另一實(shí)施例中，所述真核細(xì)胞是選自于酵母菌、昆蟲、兩棲類、鳥類或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。合適成長(zhǎng)條件的選擇是熟知此技藝的人士已知的。成長(zhǎng)產(chǎn)生本發(fā)明VLP的細(xì)胞的方法包含但不限于批次、批次-喂養(yǎng)、連續(xù)與灌注細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。在一實(shí)施例中，包括CHIKV或亞法病毒多肽的細(xì)胞生長(zhǎng)在生物反應(yīng)器或發(fā)酵槽中，細(xì)胞增生與表現(xiàn)蛋白質(zhì)(例如重組蛋白)用于純化與分離。典型地，在無菌、控制溫度與氣壓條件下，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。生物反應(yīng)器是用于培養(yǎng)細(xì)胞的腔室，其中可監(jiān)視例如溫度、氣壓、攪動(dòng)與/或PH環(huán)境條件。在一實(shí)施例中，生物反應(yīng)器是不銹鋼腔室。在另一實(shí)施例中，所述生物反應(yīng)器是預(yù)先消毒的塑料袋(例如Celling. RTM.，Wave Biotech, Bridge, N. J.)。在其它實(shí)施例中，所述預(yù)先消毒的塑料袋是約50公升至1000公升的袋子。
VLP的分離方法保留其完整性，例如梯度離新，例如氯化銫、蔗糖與碘克沙醇，以及標(biāo)準(zhǔn)的純化技術(shù)，包含例如離子交換與膠體過濾層析。以下是如何制造、分離與純化本發(fā)明VLP的范例。熟知此技藝的人士理解可使用其他方法制造與純化VLP。因此，本發(fā)明不限于本申請(qǐng)所述的方法。通常，本發(fā)明產(chǎn)生VLP是通過培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如人類胚胎腎Q93T)細(xì)胞) 或Sf9細(xì)胞(未感染)至搖蕩錐形瓶中，細(xì)胞增生放大(例如從125毫升錐形瓶至50公升Wave袋)。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液是調(diào)配用于合適的細(xì)胞株(較佳為無血清培養(yǎng)液，例如昆蟲培養(yǎng)液ExCell-420，JRH)。接著，用合適的載體(例如哺乳動(dòng)物表現(xiàn)載體)或?qū)τ?SF (在最有效復(fù)制感染(例如每個(gè)細(xì)胞從約1至約3的蝕斑形成單元)的細(xì)胞重組桿狀病毒)轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞。在細(xì)胞中表現(xiàn)多核苷酸或其部分，它們自身組合成VLP，并且在感染后M至72小時(shí)，從細(xì)胞分泌出來。通常，當(dāng)細(xì)胞在生長(zhǎng)的mid-log相G-SxlO6細(xì)胞/毫升)且至少約90%存活時(shí)，轉(zhuǎn)染或感染最有效率。感染后約48至120小時(shí)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中VLP的量接近最大值但在大量細(xì)胞溶融之前，收取本發(fā)明的VLP。由染色排除分析顯示，收取時(shí)的細(xì)胞密度與存活率可約為0. 5X106 細(xì)胞/毫升至約1.5X106細(xì)胞/毫升，至少20%存活率。接著，移除并凈化培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中可加入NaCl至濃度約0. 4至約1. 0M，較佳為約0. 5M，避免VLP集結(jié)。通過切向流過濾 (Tangential Flow Filtration, TFF)，用單次使用、預(yù)先消毒的中空纖維0. 5或1. 00微米過濾匣或類似裝置，從含有本發(fā)明VLP的細(xì)胞培養(yǎng)液中移除細(xì)胞與細(xì)胞殘骸。接著，通過超過濾，使用可拋式、預(yù)先消毒的500，000分子量切斷中空纖維匣，濃縮凈化的培養(yǎng)液中的VLP?？捎?0倍體積pH7. 0至8. 0含有0. 5M NaCl的磷酸緩沖鹽(PBS) 透析濃縮的VLP，移除殘留的培養(yǎng)液成分?？捎胮H7. 2PBS緩沖液與0. 5M NaCl中20%至60%不連續(xù)蔗糖梯度，進(jìn)一步純化濃縮、透析的VLP，在約4°C至約10°C，6，500x g離心18小時(shí)。通常在約30%至約40%蔗糖之間或接口處(在20%與60%階梯梯度)，VLP會(huì)形成明顯可見帶，可從梯度收集并且儲(chǔ)存。所述產(chǎn)物可被稀釋至包括200mM的NaCl，用于純化程序的下個(gè)步驟。所述產(chǎn)物包含 VLP,并且可包含完整的桿狀病毒顆粒?？赏ㄟ^離子交換層析或44%等密度蔗糖緩沖離心，達(dá)到進(jìn)一步純化VLP。在離子交換層析中，來自蔗糖梯度(參閱如上)的樣品置入含有具陰離子的培養(yǎng)液(例如Matrix Fractogel EMD TMAE)以及通過鹽梯度(從約0. 2M至約1. OM NaCl)沖提，可分離VLP與其它污染物(例如桿狀病毒與DNA/RNA)。在所述蔗糖緩沖方法中，包括VLP的樣品加入44% 蔗糖緩沖，并且在30，OOOg離心約18小時(shí)。在44%蔗糖的頂部形成VLP，而桿狀病毒沉淀在底部，以及其它污染物停留在頂部的0%蔗糖層。收集VLP峰或帶。視需要可去活化完整的桿狀病毒?？赏ㄟ^化學(xué)方法完成去活化作用，例如福爾馬林或是貝塔丙內(nèi)酯(BPL)。如上所述，使用此技藝中已知的選擇性沉淀與色層方法，也可大量完成完整桿狀病毒的移除與/或去活化。去活化的方法包括在約25°C至約27°C，將含有 0. 2% BPL的VLP的樣品培養(yǎng)3小時(shí)。也可通過在4°C將含有在0. 05% BLP的VLP樣品培養(yǎng)3天，而后在37°C培養(yǎng)1小時(shí)，將桿狀病毒去活化。在所述去活化/移除步驟之后，包括VLP的產(chǎn)物可進(jìn)入另一透析過濾步驟，移除來自去活化步驟與/或任何殘留蔗糖的任何試劑，以及放置VLP在所要的緩沖液(例如PBS)中?？捎么思妓囍幸阎姆椒?例如消毒過濾)，消毒所述包括VLP的溶液，并且儲(chǔ)存在冰箱或冷凍器中?？赏ㄟ^許多級(jí)別(scales)實(shí)施上述技術(shù)。例如，T-燒瓶、搖蕩-燒瓶、旋轉(zhuǎn)瓶、上至工業(yè)尺寸的生物反應(yīng)器。所述生物反應(yīng)器可包括不銹鋼槽或是預(yù)先消毒的塑料袋(例如 Wave Biotech, Bridgewater, NJ.賣的系統(tǒng))。熟知此技藝的人士知道最適合他們目的要用的。在一些實(shí)施例中，DNA疫苗或是VLP包括試劑，例如核苷酸分子、siRNA、微RNA、化學(xué)治療劑、顯影劑與/或其它需要傳送至病人的試劑。因此，本發(fā)明提供治療病毒疾病與/或不適或其癥狀的方法，所述方法包括對(duì)個(gè)體(例如哺乳動(dòng)物，例如人類)給予有治療效果劑量的醫(yī)藥組合物，所述組合物包括本申請(qǐng)的VLP或DNA。因此，一實(shí)施例是治療受到或是疑似受到病毒感染、病毒疾病、不是或其癥狀的個(gè)體的方法。所述方法包含對(duì)所述哺乳動(dòng)物給予治療或預(yù)防量的化合物，在條件下足以治療疾病、不適或其癥狀，因而預(yù)防或治療所述疾病或不適。本申請(qǐng)的方法包含對(duì)所述個(gè)體(包含辨識(shí)需要此治療的個(gè)體)給予有效量的本申請(qǐng)化合物或本申請(qǐng)組合物，產(chǎn)生所述效應(yīng)。辨識(shí)需要此治療的個(gè)體可以是評(píng)估個(gè)體或是健康照顧專業(yè)，并且可以是主觀(例如意見)或是客觀(例如測(cè)試或是診斷方法)。如本申請(qǐng)所使用，“治療”是指減少或減緩不適與/或相關(guān)癥狀。應(yīng)理解雖然不排除，但治療疾病或狀況不需要所述不適、狀況或相關(guān)癥狀完全消除。如本申請(qǐng)所使用，“預(yù)防”、“預(yù)防治療”是指在個(gè)體中減少發(fā)展不適或狀況的可能性，所述個(gè)體不具有但有風(fēng)險(xiǎn)或疑似發(fā)展不適或狀況。本發(fā)明的治療方法通包括對(duì)有需要的個(gè)體(例如動(dòng)物、人類)給予治療有效量的試劑，例如VLP或本申請(qǐng)DNA，所述個(gè)體包含哺乳動(dòng)物，特別是人類。此治療適合給予個(gè)體， 特別是受到、具有、疑似或是有風(fēng)險(xiǎn)疾病、不適或其癥狀。通過診斷測(cè)試或主觀意見或健康照顧提供者(例如遺傳測(cè)試、酵素或是蛋白質(zhì)標(biāo)示，標(biāo)示(本申請(qǐng)定義的)、家庭歷史等)， 可用任何客觀或主觀決定方式?jīng)Q定這些個(gè)體“有風(fēng)險(xiǎn)”。本申請(qǐng)的試劑也可用于治療受到亞法病毒感染的任何其它不適。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供監(jiān)視治療過程的方法。所述方法包含對(duì)遭受或疑似有亞法病毒感染不適或其相關(guān)癥狀的個(gè)體，給予一程度的診斷標(biāo)示(Marker)(例如本申請(qǐng)所述由本申請(qǐng)化合物、蛋白質(zhì)或其指示物調(diào)節(jié)的任何目標(biāo))，或診斷測(cè)量(例如篩選、分析)， 其中所述個(gè)體已經(jīng)被給予治療量的本申請(qǐng)化合物，足以治療所述疾病或其癥狀。方法中決定的標(biāo)示程度可與已知的標(biāo)示程度比較，作為健康正?？刂苹蚴窃谄渌』忌辖€(gè)體疾病狀態(tài)。在較佳實(shí)施例中，第一程度決定之后，在較晚的時(shí)間點(diǎn)，決定個(gè)體中第二程度的標(biāo)示，以及比較兩程度，監(jiān)視疾病進(jìn)程或是治療效果。在一些較佳實(shí)施例中，在開始治療之前， 決定個(gè)體中預(yù)先治療程度的標(biāo)示；此預(yù)先治療程度的標(biāo)示可與治療后個(gè)體中的標(biāo)示程度比較，決定治療的有效性。醫(yī)藥組合物與給予本發(fā)明特征在醫(yī)藥組合物，包括本申請(qǐng)所述亞法病毒的VLP。本申請(qǐng)有用的醫(yī)藥組合物包含醫(yī)藥可接受的載體，包含任何適合的稀釋劑或賦形劑，包含任何醫(yī)藥試劑，自身不包含產(chǎn)生免疫反應(yīng)危害接受所述組合物的脊椎動(dòng)物，并且可給予無過度毒性以及本發(fā)明的VLP。如本申請(qǐng)所述，“醫(yī)藥可接受的”是指聯(lián)邦或州政府管理局所通過或美國(guó)藥典、歐洲藥典或用于哺乳動(dòng)物，特別是用于人類的其它一般公認(rèn)藥典所通過的。這些組合物可用于疫苗與/或抗原性組合物，用于在脊椎動(dòng)物中，誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明包括抗原性配方，包括VLP，包括至少一病毒蛋白質(zhì)，例如一亞法病毒蛋白。所述亞法病毒可選自但不限于基孔肯尼亞病毒、辛德畢病毒(Sindbis virus)、東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis (EEE) virus)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis (WEE) virus)以及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus)。在一些較佳實(shí)施例中，醫(yī)藥組合物包括基孔肯尼亞病毒的VLP，以及醫(yī)藥可接受的載體。在其它的一些較佳實(shí)施例中，醫(yī)藥組合物包括基孔肯尼亞病毒的VLP、佐劑以及醫(yī)藥可接受的載體。在一實(shí)施例中，所述VLP包括基孔肯尼亞病毒包膜蛋白，例如所述包膜蛋白可選自娛E3、E2、6K與E1。在另一實(shí)施例中，所述醫(yī)藥組合物更包括基孔肯尼亞病毒殼體蛋白。 在一些范例中，基孔肯尼亞病毒殼體蛋白是殼體蛋白。在一些范例中，所述VLP包括E3、E2、 6K與E1。在其它范例中，所述VLP包括殼體、E3、E2、6K與El。本發(fā)明也包括疫苗配方，包括VLP，所述VLP包括至少一病毒蛋白，例如一亞法病毒蛋白。所述亞法病毒可選自但不限于基孔肯尼亞病毒、辛德畢病毒(Sindbis virus), 東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis (EEE) virus)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis (WEE) virus)以及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus)。在一些較佳實(shí)施例中，疫苗組合物包括基孔肯尼亞病毒的VLP，以及醫(yī)藥可接受的載體。在其它的一些較佳實(shí)施例中，疫苗組合物包括基孔肯尼亞病毒的VLP、佐劑以及醫(yī)藥可接受的載體。在一實(shí)施例中，所述疫苗組合物包括基孔肯尼亞病毒包膜蛋白的VLP，例如所述包膜病毒可選自于E3、E2、6K與E1。在另一實(shí)施例中，所述疫苗組合物更包括基孔肯尼亞病毒殼體蛋白以及醫(yī)藥可接受的載體或賦形劑。在一些范例中，基孔肯尼亞病毒殼體蛋白是殼體蛋白。在一些范例中，所述VLP包括E3、E2、6K與E1。在其它范例中，VLP包括殼體、E3、E2、6K 與 E1。醫(yī)藥可接受的載體包含但不系于鹽、緩沖鹽、葡萄糖、水、甘油、無菌等滲透壓液體緩沖以及其組合。醫(yī)藥可接受的載體、稀釋劑與其它賦形劑請(qǐng)參閱Remington’ s Pharmaceutically Sciences (Mack Pub. Co. N. J.目前版本)。所述配方應(yīng)適合給予模式。 在一較佳實(shí)施例中，所述配方適合給予至人類，較佳是無菌、非微粒與/或非高熱生成的。視需要，所述組合物也可包含較少量的濕潤(rùn)或乳化劑或pH緩沖劑。所述組合物可以是固體形式，例如適合重組的冷凍干燥粉末、液體溶液、懸浮液、乳狀物、錠劑、粒狀、膠囊、持續(xù)釋放配方或粉末。口服配方可包含標(biāo)準(zhǔn)載體，例如醫(yī)藥等級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、 知脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。在一些實(shí)施例中，所述VLP組合物供應(yīng)微液體形式，例如在密封容器中，指示所述 VLP組合物的量與濃度。較佳地，所述VLP組合物的液體形式供應(yīng)在密封容器中，至少約50 微克/毫升，更佳為至少約100微克/毫升，至少約200微克/毫升，至少500微克/毫升， 或至少1毫克/毫升。
通常，給予有效量(如本申請(qǐng)所述)的本發(fā)明VLP或DNA疫苗，足以刺激免疫反應(yīng)對(duì)抗一或多病毒株，例如亞法病毒，例如CHIKV。較佳地，給予本發(fā)明的VLP誘導(dǎo)免疫對(duì)抗病毒，例如亞法病毒，特別是例如CHIKV。典型地，可在此范圍內(nèi)調(diào)整劑量，例如基于生理狀況、體重、性別、飲食、給予時(shí)間以及其它臨床因子。預(yù)防疫苗配方是系統(tǒng)給予，例如使用針與針筒或是無針注射裝置，通過皮下或是肌肉注射?；蛘?，疫苗配方是鼻內(nèi)給予或滴劑、大顆粒氣霧劑(大于約10微米)或是噴入上呼吸道或是小顆粒氣霧劑(小于10微米)，或是噴入下呼吸道。當(dāng)上述任何傳遞路徑造成免疫反應(yīng)，在病毒進(jìn)入處，鼻內(nèi)給予增加誘導(dǎo)黏膜免疫的效果，所述病毒包含亞法病毒，例如CHIKV。因此，本發(fā)明也包括調(diào)配疫苗或抗原性組合物的方法，對(duì)哺乳動(dòng)物誘導(dǎo)免疫對(duì)抗感染或是至少一癥狀，所述方法包括增加所述配方有效劑量的VLP，例如CHIKV VLP。在一實(shí)施例中，所述感染是亞法病毒感染，例如但不限于基孔肯尼亞病毒、辛德畢病毒(Sindbis virus)、東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis (EEE) virus)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis (WEE) virus)以及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus)。在一些范例中，較佳為單一劑量的免疫刺激，然而也可給予額外的劑量，通過相同或不同路徑，達(dá)到所要的效果。例如，在嬰兒與新生兒中，可能需要多次給予，刺激足夠量的免疫性?？稍谡麄€(gè)幼兒期持續(xù)給予，視需要維持足夠量的保護(hù)對(duì)抗感染。同樣地，特別受到重復(fù)或嚴(yán)重感染的成人，例如健康照顧工作者、日間照顧工作者、小孩、老人的家人，心肺功能或免疫系統(tǒng)需要多次免疫作用建立與/或維持保護(hù)性免疫反應(yīng)的個(gè)體。例如，通過量測(cè)中和分泌與血清抗體量可監(jiān)視誘導(dǎo)免疫性的程度，以及調(diào)整的劑量或視需要重復(fù)的疫苗作用，刺激與保持所要的保護(hù)程度。初始刺激(Prime Boost)本發(fā)明方法也包含不同的初次刺激方式。在這些方法中，一或多次免疫作用之后， 接著一或多刺激免疫作用。實(shí)際免疫原組合物的每一次免疫作用可以相同或不同，以及免疫原組合物的形式(例如包含蛋白質(zhì)或表現(xiàn)載體)、路徑與免疫原的配方也可變化。例如，在一實(shí)施例中，最初包括給予如本申請(qǐng)所述的DNA或基因?yàn)榛A(chǔ)的疫苗，以及刺激包括給予本申請(qǐng)所述的VLP。在另一實(shí)施例中，最初包括給予本申請(qǐng)所述的VLP，以及刺激包括給予本申請(qǐng)所述的DNA或其它基因?yàn)榛A(chǔ)的疫苗。一有效的初次刺激方式提供兩次初始免疫作用，間隔四周，接著是在最后的初始免疫作用后，在第四周與第八周進(jìn)行兩次刺激免疫作用。熟知此技藝的人士應(yīng)理解有幾種變更與組合，包括使用本發(fā)明的DNA、細(xì)菌與病毒表現(xiàn)載體，提供初始與刺激方式。給予包括VLP與/或DNA疫苗(疫苗與/或抗原配方)組合物的方法包含但不限于腹腔給予(例如皮膚內(nèi)、肌肉、血管與皮下)、硬腦膜上以及黏膜(例如鼻內(nèi)與口服或肺部路徑或栓劑)。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物給予方式是肌肉內(nèi)、血管內(nèi)、皮下、穿皮或皮膚內(nèi)。所述組合物的給予可以是任何方便的路徑，例如注入或大丸藥注射，通過表皮或黏膜層吸收(例如口腔黏膜、直腸、結(jié)膜、鼻咽、口咽、陰道、尿道、膀胱與腸道黏膜等)，以及可與其它生物活性劑一起給予。在一些實(shí)施例中，鼻內(nèi)或其它粘膜路徑給予包括本發(fā)明VLP 的組合物可誘導(dǎo)高于其它給予路徑的抗體或其它免疫反應(yīng)。在另一實(shí)施例中，鼻內(nèi)或其它粘膜路徑給予包括本發(fā)明VLP的組合物可誘導(dǎo)抗體或其它免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)交叉保護(hù)對(duì)抗其它病毒株。給予可以是肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)。在一較佳實(shí)施例中，所述給予是肌肉內(nèi)。在另一實(shí)施例中，針對(duì)黏膜組織，給予所述疫苗與/或抗原性配方，在免疫作用位置誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。例如，可針對(duì)黏膜組織例如膽相連的淋巴組織(GALT)，使用口服包含佐劑與特定黏膜目標(biāo)性質(zhì)的組合物，進(jìn)行免疫作用。也可針對(duì)其它的粘膜組織，例如鼻咽淋巴組織(NALT)以及支氣管相連的淋巴組織(BALT)。本發(fā)明的疫苗與/或抗原性配方也可依照劑量排程給予，例如所述疫苗組合物的初始給予以及后續(xù)的刺激給予。在特定的實(shí)施例中，在初始給予之后，第二劑量的組合物給予在任何處，從兩周至一年，較佳從約一、約二、約三、約四、約五至約六個(gè)月。除此之外， 在第二季量之后，從初始給予后約三個(gè)月至約兩年或甚至更久，較佳約四、約五或約六個(gè)月或約七個(gè)月至約一年可給予第三劑量。在第二劑量之后，當(dāng)在個(gè)體的血清與/或尿液或粘膜分泌中偵測(cè)不到特定免疫球蛋白時(shí)，可以是需要給予所述第三劑量。在一較佳實(shí)施例中， 在所述第一給予之后約一個(gè)月，給予第二劑量，以及在第一給予之后約六個(gè)月，給予第三劑量。在另一實(shí)施例中，在第一投之后約六個(gè)月，給予所述第二劑量。在另一實(shí)施例中，所述本發(fā)明的VLP可給予成為組合治療的一部分。例如，本發(fā)明的VLP可與其它免疫原性組合物、抗病毒與/或抗生素調(diào)配?？膳c預(yù)防或治療亞法病毒(例如基孔肯尼亞病毒感染)的另一免疫原組合物、抗病毒、抗生素或任何其它試劑同時(shí)、后續(xù)或連續(xù)給予VLP。熟知此技藝的人士可決定醫(yī)藥配方的劑量，例如第一辨識(shí)劑量有效誘導(dǎo)預(yù)防或治療的免疫反應(yīng)，例如量測(cè)病毒特異性的免疫球蛋白的血清量或是量測(cè)血清樣品或尿液樣品或黏膜分泌中的抗體抑制率?？蓮膭?dòng)物研究中決定所述劑量。用于研究疫苗有效性的動(dòng)物可包含豚鼠、倉鼠、貂鼠、金吉拉(chinchilla)、老鼠與棉鼠(cotton rat)，以及非人類的靈長(zhǎng)類。大部分動(dòng)物并不是感染試劑的自然宿主，但仍可以作為不同疾病的研究。例如，上述任何動(dòng)物可給予疫苗候選者，例如本發(fā)明的VLP，部分定性所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，以及/或決定是否已經(jīng)產(chǎn)生任何中和抗體。例如，已經(jīng)進(jìn)行許多老鼠模式的研究，因?yàn)槔鲜篌w積小且成本低，因此研究人員用以進(jìn)行大量研究。除此之外，熟知此技藝的人士可進(jìn)行人類臨床研究，決定對(duì)于人類較佳的有效劑量。在此技藝中，此臨床研究常規(guī)且已知的。精確的劑量也取決于給予路徑?？蓮捏w外或動(dòng)物測(cè)試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線，外插得到有效劑量。同樣是此技藝中已知的，可使用免疫反應(yīng)的非專一性刺激物，促進(jìn)特定組合物的免疫原性。已經(jīng)實(shí)驗(yàn)使用佐劑促進(jìn)增加免疫性對(duì)抗未知的抗原(例如美國(guó)專利號(hào) 4，877，611)。在免疫作用中已經(jīng)使用佐劑刺激反應(yīng)長(zhǎng)達(dá)多年，因此對(duì)于熟知此技藝的人士而言，佐劑是已知的。一些佐劑影響抗原呈現(xiàn)的方式。例如，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)抗原是由明礬沉淀時(shí)， 免疫反應(yīng)會(huì)增加?？乖娜榛饔靡矔?huì)延長(zhǎng)抗原呈現(xiàn)的時(shí)間。Vogel等人發(fā)表的“疫苗佐劑與賦形劑概略(第二版)”描述的任何佐劑全文并入本申請(qǐng)作為參考，且包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。范例佐劑包含完整的Freimd佐劑(包含已死的結(jié)核桿菌的非專一性免疫反應(yīng)的刺激物)，不完整的Freund佐劑與氫氧化鋁佐劑。其它佐劑包括GMCSP、BCG、氫氧化鋁、MDP 化合物，例如thur-MDP與nor-MDP、CGP (MTP-PE)、脂肪A以及單磷酸脂肪A (MPL)。也可考慮 RIBI，它包含在2%角鯊烯(Squalene)/TWeen-80乳液物中有萃取自細(xì)菌的三種成分，MLP、 海藻糖二分枝酸酯(TDM)以及細(xì)胞壁骨架(CWS)。也可使用MF-59、Novasmes. RTM.、MHC抗原。本發(fā)明的VLP也可調(diào)配“免疫刺激物”。這些是身體自身的化學(xué)傳訊者(細(xì)胞激素)，增加免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。免疫刺激物包含但不限于具免疫刺激作用的各種細(xì)胞激素， 淋巴激素以及化學(xué)激素，以及前發(fā)炎活性，例如細(xì)胞白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-12、IL-13)；生長(zhǎng)因子(例如顆粒球細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM)群落刺激因子(CSF)；以及其它免疫刺激分子，例如巨噬細(xì)胞發(fā)炎因子、Flt3配體、B7. 1 ；B7. 2等?？稍谙嗤浞街薪o予免疫刺激分子作為VLP或是可分別給予。可給予蛋白質(zhì)或是編碼所述蛋白質(zhì)的載體，產(chǎn)生免疫刺激效應(yīng)。因而，在一實(shí)施例中，本發(fā)明包括抗原性與疫苗配方，包括佐劑與/或免疫刺激物。傳遞方式本發(fā)明的VLP可用于制備組合物，刺激免疫反應(yīng)。所述組合物可用于治療或預(yù)防病毒感染(例如CHIKV或是其它亞法病毒感染)。黏膜與細(xì)胞免疫皆可對(duì)于感染劑與疾病， 貢獻(xiàn)免疫性。在一實(shí)施例中，本發(fā)明包括誘導(dǎo)對(duì)抗病毒感染的方法，例如個(gè)體中基孔肯尼亞病毒感染，對(duì)所述個(gè)體給予基孔肯尼亞病毒VLP或DNA疫苗。本發(fā)蒙也提供在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫對(duì)抗病毒感染或至少其一癥狀的方法，包括給予至少一有效劑量本申請(qǐng)所述的VLP或DNA疫苗，例如包括一或多病毒蛋白的VLP，例如一或多CHIKV病毒包膜蛋白，或包括編碼亞法病毒殼體蛋白或一或多亞法病毒包膜蛋白或其片段的DNA疫苗。在一些范例中，所述VLP更包括病毒殼體蛋白。在另一實(shí)施例中，所述方法包括誘導(dǎo)免疫對(duì)抗病毒感染，例如CHIKV感染或是至少一其癥狀，以多次劑量給予所述配方。當(dāng)給予至脊椎動(dòng)物時(shí)，本發(fā)明的VLP可在所述脊椎動(dòng)物(例如人類)中誘導(dǎo)實(shí)質(zhì)免疫。免疫反應(yīng)造成的實(shí)質(zhì)免疫對(duì)抗本發(fā)明的VLP，在所述脊椎動(dòng)物中，保護(hù)或減緩感染或至少減少感染的癥狀。在一些例子中，如果所述脊椎動(dòng)物被感染，所述感染是無癥狀的。反應(yīng)可能不是完全保護(hù)反應(yīng)。在此例子中，如果所述脊椎動(dòng)物被感染劑感染，則相較于未被免疫的脊椎動(dòng)物，所述脊椎動(dòng)物會(huì)經(jīng)歷較輕的癥狀或是較短的癥狀期間。在一實(shí)施例中，本發(fā)明包括在個(gè)體中，誘導(dǎo)實(shí)質(zhì)免疫對(duì)抗亞法病毒感染或至少其一癥狀的方法，包括給予至少一有效劑量的VLP與/或DNA疫苗，所述DNA疫苗包括編碼亞法病毒殼體蛋白或一或多亞法病毒包膜蛋白或其片段的核苷酸片段。在特定實(shí)施例中，所述感染是CHIKV以及所述VLP包括本申請(qǐng)所述的一或多CHIKV包膜蛋白。在另一實(shí)施例中， 本發(fā)明包括對(duì)哺乳動(dòng)物接種疫苗對(duì)抗亞法病毒的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物給予保護(hù)誘導(dǎo)量的VLP或DNA疫苗，所述DNA疫苗包括殼體、E3、E2、6K與El。在另一實(shí)施例中，所述方法包括給予包括E3、E2、6K與El的DNA疫苗。在另一實(shí)施例中，所述方法包括給予DNA疫苗， 所述DNA疫苗包括C-Env37997如SEQ ID NO 1。在另一實(shí)施例中，所述方法包括給予DNA疫苗，所述DNA疫苗包括Env37997如SEQ ID NO 19。在另一實(shí)施例中，所述方法包括給予DNA 疫苗，所述DNA疫苗包括^!^。!^如SEQ ID NO :3。在另一實(shí)施例中，所述方法包括給予 DNA疫苗，所述DNA疫苗包括Envra^1如SEQ ID NO :20。在一實(shí)施例中，所述方法包括給予 VLP，所述VLP包括殼體、E3、E2、6K與El。在另一實(shí)施例中，所述方法包括給予VLP，所述 VLP包括E3、E2、6K與El。在一實(shí)施例中，所述方法包括給予VLP，所述VLP包括基孔肯尼亞病毒包膜蛋白。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明包括在個(gè)體中，誘導(dǎo)保護(hù)性細(xì)胞反應(yīng)對(duì)抗病毒感染或至少一其癥狀的方法，包括給予至少一有效劑量的DNA疫苗或VLP。如上所述，本發(fā)明的VLP在個(gè)體中預(yù)防或減少感染的至少一癥狀。可主觀或客觀決定癥狀減少，例如個(gè)體的自身評(píng)估、臨床師的評(píng)估或是進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆治龌驕y(cè)量(例如體溫)，包含例如生命評(píng)估的質(zhì)量、減緩的病毒感染進(jìn)程或是其它癥狀、病毒癥狀嚴(yán)重性降低或是合適的分析(例如抗體量與/或T細(xì)胞活化分析)。客觀評(píng)估包括動(dòng)物與人類評(píng)估。本發(fā)明也提供辨識(shí)病毒進(jìn)入抑制劑的分析，包括在至少一實(shí)施例中，遺傳修飾的目標(biāo)細(xì)胞表現(xiàn)至少一基孔肯尼亞病毒受體與任何共同受體可能是感染或進(jìn)入需要的。這些細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾，因而表現(xiàn)報(bào)導(dǎo)基因，例如親和性標(biāo)示、熒光蛋白或是可將基質(zhì)轉(zhuǎn)換成熒光、化學(xué)或冷光產(chǎn)物的酵素。在用目標(biāo)病毒感染之后，將報(bào)導(dǎo)基因的表現(xiàn)配置明顯減少(向下調(diào)節(jié))，則是完成將此型式的報(bào)導(dǎo)信號(hào)耦合至病毒感染的抑制。原則上，可由任何合適的裝置確認(rèn)，但主要較佳為報(bào)導(dǎo)基因產(chǎn)物本身融合至細(xì)胞蛋白，在用目標(biāo)病毒感染之后，本身被向下調(diào)節(jié)。例如，報(bào)導(dǎo)基因產(chǎn)物可被融合至對(duì)應(yīng)的病毒受體，在許多范例中，感染后是被向下調(diào)節(jié)。因此，可對(duì)化合物庫篩選具有抑制細(xì)胞受到基孔肯尼亞病毒(CHIKV)感染能力。 能穩(wěn)定產(chǎn)生報(bào)導(dǎo)基因則為適當(dāng)?shù)闹甘炯?xì)胞株。在一范例中，這些細(xì)胞培養(yǎng)在微升盤中，在每一槽中，在不同化合物，例如抗生素，存在下和CHIKV顆粒一起培養(yǎng)。在感染后，由于病毒基因的表現(xiàn)，融合蛋白被向下調(diào)節(jié)。因此，只有不被CHIKV感染的細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)報(bào)導(dǎo)基因。因此， 具有正報(bào)導(dǎo)信號(hào)的槽則含有抑制感染的化合物。這些分析的變化與修飾從描述說明的相關(guān)部分看來是明顯的，在分析的個(gè)別部分中有詳細(xì)說明。特別地，在一實(shí)施例中，當(dāng)發(fā)生感染時(shí)，可表現(xiàn)報(bào)導(dǎo)基因，而非感染后的報(bào)導(dǎo)基因被向下調(diào)節(jié)。在另一實(shí)施例中，病毒顆粒是假型病毒顆粒，包括一或多個(gè)包膜蛋白，以及視需要有來自CHIKV的殼體蛋白。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供辨識(shí)病毒進(jìn)入的方法，使用報(bào)導(dǎo)基因系統(tǒng)作為范例。 簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明提供重組的慢病毒載體，表現(xiàn)報(bào)導(dǎo)基因。培養(yǎng)細(xì)胞，以及使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，共同轉(zhuǎn)染表現(xiàn)載體，例如Env37997、Envop^1以及報(bào)導(dǎo)質(zhì)體。在感染前一天，放置細(xì)胞。通過序列稀釋，先滴定編碼報(bào)導(dǎo)基因的CHIKV Env-假型慢病毒載體。而后在加入病毒之前，相同量的假型載體與候選抑制劑培養(yǎng)。而后使用細(xì)胞溶融緩沖液融融細(xì)胞，以及測(cè)量報(bào)導(dǎo)基因活性。基于報(bào)導(dǎo)基因的表現(xiàn)，辨識(shí)病毒進(jìn)入的抑制劑。套組(KITS)本發(fā)明也提供醫(yī)藥包裝或套組，包括填充本發(fā)明配方的一或多成分的一或多容器。在一較佳實(shí)施例中，所述套組包括兩個(gè)容器，一個(gè)包含VLP，另一個(gè)包含佐劑。與此容器相關(guān)的可以是政府機(jī)構(gòu)規(guī)范制造、使用或醫(yī)藥或生物產(chǎn)品銷售的說明，所述說明反應(yīng)出制造商、使用或銷售給予人類的核準(zhǔn)。本發(fā)明也提供VLP配方密封在在密封容器中的，例如安瓶或是sachette指示組合物的量。在一實(shí)施例中，所述VLP組合物供應(yīng)為溶液，在另一實(shí)施例中，作為密封容器中干燥無菌的冷凍粉末或是無水濃縮物，以即可被重組，例如具有水或鹽類至給予個(gè)體的適當(dāng)濃度。本發(fā)明的特征也是包括本申請(qǐng)所述VLP的套組。本發(fā)明的特征也是包括本申請(qǐng)所述DNA疫苗的套組供于使用。本發(fā)明的特征也是一套組，包括第一容器中的VLP以及第二容器中的DNA疫苗，以及用于初始刺激免疫作用的說明。以下范例是說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明。雖然提供特定范例，但以上描述僅作為說明而非具有限制性。前述實(shí)施例的任何一或多個(gè)特征可用任何方式結(jié)合本發(fā)明任何其它實(shí)施例的一或多個(gè)特征。再者，在看過本申請(qǐng)說明書之后，本發(fā)明的許多變化對(duì)熟知此技藝的人士而言是明顯的。因此，本發(fā)明的范圍決定并非參考上述說明，而是參考附隨的權(quán)利要求書以及均等物的全部范圍。除非特別說明，實(shí)施本發(fā)明使用習(xí)知的分子生物(包含重組技術(shù))，微生物、細(xì)胞生物、化學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)，這些是熟知此技藝的人士已知的。所述技術(shù)在文獻(xiàn)中有完全的解釋與說明，例如“分子選殖實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”第二版(Sambrook，1989)；“寡核苷酸合成” (Gait, 1984)；“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)” (Freshney, 1987)；“酵素學(xué)中的方法” “實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)” (Weir, 1996)；“用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)換載體” (Miller與Calos，1987)；“分子生物的現(xiàn)今流程”(Ausubel，1987) ；“PCR 聚合酶鏈反應(yīng)”(Mullis，1994)；“免疫學(xué)的現(xiàn)今流程”(Coligan，1991)。這些技術(shù)可用于產(chǎn)生本發(fā)明的多核苷酸與多肽，以及可考慮用于制造與實(shí)施本發(fā)明。特定實(shí)施例使用的特別技術(shù)會(huì)在后續(xù)部分討論。以下范例是提供熟知此技藝的人士完整的揭露內(nèi)容與描述如何制造與使用本發(fā)明的分析、篩選以及治療方法，而不是用于限制本發(fā)明的范圍。范例范例1 慢病毒載體假型與CHIKV包膜媒介進(jìn)入通過與野生型病毒相同機(jī)制為了檢驗(yàn)CHIKV細(xì)胞進(jìn)入的機(jī)制與專一性，慢病毒載體報(bào)導(dǎo)者用來自不同CHIKV 株的醣蛋白假型(pseudotyped)，媒介進(jìn)入可穿透的細(xì)胞。在病毒顆粒表面刺穿的CHIKV 是由三個(gè)E1-E2異源二聚體形成，其中El醣蛋白媒介融合，以及E2醣蛋白與宿主受體交互作用。CHIKV基因表現(xiàn)自然多太，E3-E2-6K-E1多蛋白，使37997與LR20060PY-1株插入表現(xiàn)載體(E37997與E0PY-1)(圖1A、圖6、7A、7B與8A-8C)。通過病毒的浮力密度梯度沉降， 確認(rèn)兩個(gè)CHIKV E進(jìn)入假型慢病毒在體。CHIKV E與HIV-IGag具有相同的浮力密度作為慢病毒顆粒(圖幻。37997與LR20060PY-1CHIKV假型慢病毒載體感染幾個(gè)許可的細(xì)胞株 (Sourisseau et al.，PLoS. Pathog. 3，e89 Q007))，由熒光酵素報(bào)導(dǎo)活性，而控制組 CHIKV 包膜蛋白不感染這些細(xì)胞株(圖1B，左)，以及感染系有劑量相關(guān)性(圖1B，右)。為了決定進(jìn)入是否透過與自然病毒相同的機(jī)制，如上所述，分析進(jìn)入的PH與核內(nèi)體(endosome)相關(guān)性(Yang et al.，J. Virol. 78, 5642 (2004)) CHIKV 通過 pH 相關(guān)性的細(xì)胞融合過程感染細(xì)胞。因此，加入氯化銨或氯喹(chloroquine)，防止核內(nèi)體的酸化作用， 造成CHIKV假型載體進(jìn)入的劑量相關(guān)性減少(圖1C)。觀察到VSV-G也有類似的進(jìn)入抑制作用，已知VSV-G以此方式進(jìn)入，但沒有雙嗜性(amphotropic)鼠科白血病病毒(MuLV)醣蛋白70，它是以pH依存方式進(jìn)入。這些發(fā)現(xiàn)說明慢病毒載體假型CHIKV包膜媒介通過與野生型病毒相同的機(jī)制進(jìn)入。接著測(cè)試注射CHIKV株的老鼠血清。將免疫血清與所述CHIKV 假型慢病毒載體培養(yǎng)，但沒有VSV-G假型載體抑制進(jìn)入(圖1D)。因此，可定量中和抗體的專一性與潛力而不暴露至感染病毒。范例2 =VLP具有野生型病毒的外型
CHIKV編碼四個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，賂1、賂2、賂3與賂4，涉及病毒復(fù)制，以及5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，是由殼體(C)與包膜蛋白(E;E1、E2、E3與6K)組成，它們被合成為多蛋白并且被殼體自動(dòng)蛋白酶與信號(hào)酶切除(Strauss, Microbiol, Res. 58，491 (1994))。分析真核表現(xiàn)載體編碼來自 37997 與 LR2006 0PY-1 株的 C-E3-E2-6K-E1 (C-E37997 與 C-E0PY-1)產(chǎn)生 VLP的能力。質(zhì)體C-E37997或C-E0PY-1或上述的表現(xiàn)載體E37997或是C0PY-1 (圖2，上半部)轉(zhuǎn)染至人類胚胎腎093T)細(xì)胞，以及用西方轉(zhuǎn)印(圖2A，下半部)確認(rèn)表現(xiàn)。在轉(zhuǎn)染 C-E37997或C-E0PY-1載體之后，在上清液中偵測(cè)到C與E/E2蛋白質(zhì)，表示已經(jīng)產(chǎn)生CHIKV VLP。使用浮力密度梯度沉降純化VLP。來自37997株的VLP產(chǎn)量是10-20毫克/升，高于來自LR20060PY-1約100倍；因而選擇37997做進(jìn)一步VLP特性化與發(fā)展。相較于野生型 CHIKV的密度，凈化的上清液的劃分顯示在密度1. 2克/毫升處E1/E2的高峰合并(圖2B， 左)。電子顯微鏡檢視37997的純化部分顯示VLP與野生型病毒具有相同的外型(圖2B， 右)。冷凍電子顯微鏡與三維影重組假設(shè)二十面體對(duì)稱，顯示VLP具有外部直徑65納米，以及核心直徑40納米(圖2C，左)。蛋白質(zhì)免疫原性E1/E2醣蛋白組織成為240異源二聚體，組合成為80醣蛋白尖狀物在VLP表面上配置T = 4類對(duì)稱(圖2C，左)接近類似辛德畢病毒(Sindbis virus)的結(jié)構(gòu)。除此之外，核殼體核心的組織也類似于其它的亞法病毒。范例3 卩向應(yīng)CHIKV，VLP比DNA疫苗誘導(dǎo)更有效力的中和抗體在Ribi佐劑存在或不存在下，用編碼C-E或E(37997與LR20060PY-l)的DNA疫苗或來自37997的VLP(VLP37997)免疫的老鼠中，決定DNA與VLP疫苗的免疫原性。用VLP與佐劑注射老鼠產(chǎn)生最高量的中和反應(yīng)對(duì)抗同源株37997(圖3A，右半部；IC50，1 10, 703) 以及異源株LR20060PY-1 (圖B，右半部；IC50，1 54, 600) 0當(dāng)用編碼來自兩株C-E與E 的質(zhì)體免疫作用誘導(dǎo)中和反應(yīng)，這些反應(yīng)比VLP免疫的老鼠低100倍(圖3A、B ；左半部)。 這些結(jié)果指示VLP比DNA疫苗誘導(dǎo)更有效的中和抗體反應(yīng)。為了在對(duì)人類具有強(qiáng)預(yù)測(cè)值的模式中定性VLP誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，用VLP免疫恒河猴。用VLP37997或PBS單獨(dú)注射猴子做為控制組。測(cè)試免疫與控制組猴子的血清對(duì)抗 CHIKV 37997與LR2006 0PY-1假型慢病毒載體。在初始免疫作用之后，用VLP免疫的所有非人類靈長(zhǎng)類(NHP)針對(duì)同源與異源株發(fā)展許多中和抗體，在刺激之后更為增加(圖3C ； 左半部37997，右半部LR2006 0PY-1)。為了確認(rèn)這些抗體中和感染的病毒，進(jìn)行蝕斑減少中和作用測(cè)試(PRNT)對(duì)抗CHIKV LR2006 0ΡΥ-1。來自免疫猴子的抗血清誘導(dǎo)中和抗體反應(yīng)對(duì)抗LR2006 0ΡΥ-1滴定量(titer)超過1 40，000 (圖3D)。這些數(shù)據(jù)說明使用假型慢病毒載體的中和抗體與PRNT分析相關(guān)聯(lián)，以及所有的免疫猴子產(chǎn)生有效的中和抗體反應(yīng)對(duì)抗CHIKV。范例4 初始VLP免疫作用保護(hù)對(duì)抗CHIKV感染的病毒血癥與發(fā)炎結(jié)果在最終免疫作用后15周，通過靜脈內(nèi)挑戰(zhàn)(intravenous challenge) VLP免疫的猴子或使用高量LR2006 0PY-1病毒，決定VLP疫苗保護(hù)對(duì)抗感染的能力。如同人類，單核球細(xì)胞數(shù)量增加測(cè)量NHP感染造成非致命的病毒血癥與前發(fā)炎反應(yīng)?？刂平M猴子在6小時(shí)開始有病毒血癥，并且持續(xù)直到挑戰(zhàn)后72小時(shí)，然而所有的免疫猴子完全控制挑戰(zhàn)病毒(圖 4A)。同樣地，挑戰(zhàn)后4天，相較于接種疫苗的猴子，控制組猴子的單核球數(shù)量明顯增加(圖4B，控制組vs. VLP ；ρ = 0. 0036)。這些數(shù)據(jù)顯示免疫作用保護(hù)對(duì)抗感染的病毒血癥與發(fā)炎結(jié)果。為了定義這些動(dòng)物中的保護(hù)機(jī)制，使用采用轉(zhuǎn)換模式(adoptive transper model), 檢測(cè)免疫IgG是否可保護(hù)對(duì)抗致命挑戰(zhàn)的問題。范例5 =CHIKV VLP誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)提供保護(hù)對(duì)抗CHIKV感染先前的研究已經(jīng)顯示免疫缺陷老鼠具有缺陷型式I IFN傳信發(fā)展的嚴(yán)重感染，顯示癥狀以及組織向性類似人類，以及提供模式評(píng)估保護(hù)的免疫機(jī)制。從免疫或控制組猴子純化的總IgG被動(dòng)轉(zhuǎn)換至這些老鼠中。在IgG轉(zhuǎn)換后M小時(shí)，用致命劑量的LR2006 0PY-1 皮膚內(nèi)挑戰(zhàn)接收者老鼠。純化的CHIKV免疫IgG的接收者在感染后沒有可偵測(cè)的病毒血癥， 并且完全受到保護(hù)不受致命危害(圖4C、D)。相對(duì)地，接收來自控制組猴子純化IgG的所有老鼠顯示嚴(yán)重的感染與病毒血癥，并且全部死亡。這些結(jié)果顯示CHIKV VLP誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)提供保護(hù)對(duì)抗CHIKV感染。如本申請(qǐng)所述，評(píng)估對(duì)抗CHIKV的VLP與質(zhì)體DNA疫苗誘導(dǎo)交叉株系中和抗體的能力。用VLP的免疫作用顯示交叉株系反應(yīng)，并且比DNA疫苗高100倍，以及猴子顯示保護(hù)對(duì)抗CHIKV感染的劑量高于所述領(lǐng)域可能遭遇的。再者，在相關(guān)的老鼠模式中，來自VLP免疫的猴子的抗體被動(dòng)轉(zhuǎn)換會(huì)保護(hù)對(duì)抗致命挑戰(zhàn)，這說明體液反應(yīng)對(duì)于保護(hù)對(duì)抗CHIKV是重要的。目前爆發(fā)的CHIKV熱大部分發(fā)生在南亞，以及強(qiáng)調(diào)人類疫苗的需求。這些感染表示在 2005-2006年散播至印度洋幾個(gè)島之前，2004年首先在肯尼亞辨識(shí)的病毒已經(jīng)散播。聯(lián)合島(Reunion Island)單獨(dú)爆發(fā)感染M4，000人，整個(gè)血清陽性率35%。而后病毒散播至其它陸地，2008 年已知發(fā)生在 37 個(gè)國(guó)家(http://www. cdc. gov/ncidod/dvbid/chikungunya/ CH_GloblaMaphtml)，估計(jì)在印度、非洲、歐洲與南亞有1. 4-6. 5百萬病例。在2009年，病例數(shù)持續(xù)增加，部分是因?yàn)槟壳癈HIKV傳染株已經(jīng)適應(yīng)新的載體，亞洲虎蚊、白紋伊蚊(Ae. Albopictus)，可存活在更溫和的氣候，包含歐洲與美國(guó)。CHIKV持續(xù)造成嚴(yán)重的發(fā)病率，以及造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雖然沒有報(bào)導(dǎo)先前基孔肯尼亞傳染病的發(fā)病率，但是在最新的爆發(fā)中超過260人的死亡直接與病毒有關(guān)。現(xiàn)今，發(fā)展安全與有效的 CHIKV疫苗的成功有限。活的CHIKV疫苗候選物造成志愿者的短暫關(guān)節(jié)痛。其它努力包含活的減毒疫苗，福爾馬林處理過的疫苗、委內(nèi)瑞拉馬腦炎/CHIKV嵌合的活減毒疫苗以及一致性(consensus)為基礎(chǔ)的 DNA 疫苗(Muthumani et al.，Vaccine 26,5128(2008))尚未被證明安全與有效。雖然CHIKV變化很廣，個(gè)別株系之間有抗原性相關(guān)，因此可達(dá)到能對(duì)抗異源株系的疫苗(Harrison et al. ,Am. J. Trop. Med. Hyg. 16,786(1967))。VLP 疫苗的安全性與有效性通常使它們?cè)诤罄m(xù)研究中成為更有希望的候選物。已知相較于基于個(gè)別蛋白質(zhì)的次單元疫苗，VLP是高免疫原性且誘導(dǎo)高量的中和抗體反應(yīng)。所述VLP確實(shí)呈現(xiàn)病毒外貌以及在重復(fù)數(shù)組中的其它表面成分，有效誘導(dǎo)B細(xì)胞的辨識(shí)，刺激抗體分泌。此辨識(shí)造成B細(xì)胞信號(hào)與MHC第II類上升調(diào)節(jié)，促使產(chǎn)生高量專一性的抗體。來自其它病毒的VLP，包含B型肝炎病毒(HBV)以及人類乳突瘤病毒(HPV)， 誘導(dǎo)高量中和抗體反應(yīng)，貢獻(xiàn)至對(duì)人類的保護(hù)性免疫。本申請(qǐng)所述的疫苗代表第一次使用重組的VLP，預(yù)防亞法病毒感染。貿(mào)易、旅游或全球氣候幫助全球蚊子物種的散播，并且可能潛在造成其它的亞法病毒爆發(fā)。這個(gè)疫苗發(fā)展的方法可證明對(duì)于其它增加的亞法病毒有用，包含西方、東方與委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、阿尼昂尼昂病毒(ο，nyong-nyong virus)與羅其jf河病毒(Ross River virus)。
本申請(qǐng)是使用以下方法與材料而得到結(jié)果。載體建構(gòu)(vector construction)如前所述，合成編碼結(jié)構(gòu)多蛋白C、El、E2、E3與6K(37997與LR2006 0ΡΥ-1, Genbank EU22470)(圖 25)以及 EU224268 (圖 24)) (Yang et al. ,Science 317,825(2007)) (GeneArt, Regensburg，德國(guó))。用PCR放大編碼多蛋白E3、E2、6K與El的質(zhì)體，使用義股引子(sense primer) 5' GCTCTAGACACCATGAGCCTCGCCCTCCCGGTCTTG 3’ 以及反義股引子 5， TGGATCCTCATTAGTGCCTGCTAAACGACA 3，(37997)以及義股 5，GCTCTAGACACCATGAGTCTTGCCA TCCCAGTTATG 3，以及反義股 5，TGGATCCTCATTAGTGCCTGCTGAACGACA 3，(LR2006 0ΡΥ-Ι)。 插入^CbaI與BamHI位置用于選殖。每一個(gè)片段用^(bal/BamHI切過并且插入真核表現(xiàn)載體，受控于巨細(xì)胞病毒促進(jìn)子/啟動(dòng)子，CMV/R(Yang et al.，Science 317,825(2007)) (C-E37997> C-Eqpy^ E37997 以及 Ε0Ρη)。為了確認(rèn)表現(xiàn) CHIKV C 與 E 蛋白質(zhì)，使用 FuGENETM 6 Transfection Reagent Kit (Roche Diagnostics GmbH，德國(guó))，用 3 微克的質(zhì)體 DNA，依照制造商的建議使用。細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%熱去活化的胎牛血清(FBS) (GIBC0 BRL)的Dulbecco修飾Eagle培養(yǎng)液(DMEM ；GIBCO BRL)中，培養(yǎng)293T與293A (人類胚胎腎細(xì)胞)、Vero (非洲綠猴腎表皮細(xì)胞)、HeLa (人類子宮頸腺癌)、A549 (人類肺癌)以及BHK (嬰兒倉鼠腎細(xì)胞)。產(chǎn)生假型慢病毒載體產(chǎn)生來自不同CHIKV株的醣蛋白的慢病毒載體。表現(xiàn)熒光酵素報(bào)告基因的重組慢病毒載體的產(chǎn)生如前所述(Naldini et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,11382(1996), Yang et al.，Science 317,825 (2007)) 簡(jiǎn)單地說，293T細(xì)胞共同轉(zhuǎn)染500納米克來自 E37997或E0PY-1的CHIKV E質(zhì)體、7微克的轉(zhuǎn)導(dǎo)(transfucing)載體編碼熒光酵素報(bào)導(dǎo)基因(pHR’ MV-熒光酵素質(zhì)體)，以及7微克的封裝載體，表現(xiàn)人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-I) 結(jié)構(gòu)蛋白(pCMVaR8. 2)。2微克的囊泡口腔炎病毒醣蛋白(VSV-G)、2微克的pNGVL_4070A 雙嗜性MuLV gp70表現(xiàn)載體或500納米克的空載體分別作為這些假型報(bào)導(dǎo)的正與負(fù)控制。 在磷酸鈣轉(zhuǎn)染anvitroger^CarlskicbVA)隔夜之后，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液。48小時(shí)之后，收取上清液，用0.45微米針筒過濾膜過濾、儲(chǔ)存分裝，冰凍在-80°C。用HIV-I Gag pM的量將這些病毒標(biāo)準(zhǔn)化。如前述的方法，在感染前根據(jù)HIV Gag pM輛，將轉(zhuǎn)染72小時(shí)候收取的 CHIKV 假型慢病毒載體長(zhǎng)規(guī)化(normalized) (Yang et al.，Science 317,825 (2007)) 用老鼠與猴子抗血清中和CHIKV E假型慢病毒載體中和作用分析如前述方式進(jìn)行(Yang et al. ,Science 317,825 (2007)) 在感染前一天，在96槽盤中的每一槽中，放置IO4 細(xì)胞。編碼熒光酵素的CHIKV E-假型病毒在體先用序列稀釋滴定。在加入病毒血清溶液至細(xì)胞(96槽盤，每槽IO4細(xì)胞，50微克/槽，三重復(fù))之前，在室溫下，同樣量的假型慢病毒載體(pM量約50ng/ml)與所指示的老鼠抗血清培養(yǎng)60分鐘。來自非免疫老鼠或猴子的血清是作為負(fù)控制。培養(yǎng)M小時(shí)之后，使用細(xì)胞溶溶緩沖液(Cell Signal)溶融細(xì)胞，以及根據(jù)制造商的流程，在用“熒光酵素分析試劑”(Promega，Madison, WI)培養(yǎng)之后，使用 Microbeta. JET(PerkinElmer，Turku,
Finland)測(cè)量熒光酵素活性。抑制質(zhì)計(jì)算如下抑制(％ ) = [1_ (假型慢病毒載體中熒光酵素活性(cps)用所指示稀釋倍數(shù)的老鼠抗血清培養(yǎng)感染細(xì)胞)/(假型慢病毒載體中熒光酵素活性(cps)用相同稀釋倍數(shù)的非免疫老鼠抗血清培養(yǎng)感染細(xì)胞)]xl00。用軟件 (第5版)計(jì)算IC50。電子顯微鏡在國(guó)家癌正研究所的影像分析實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)VLP的型態(tài)。用Optipr印密度離心分離VLP，所述VLP而后在PBS中與4%甲醛混合。負(fù)染色電子顯微鏡用于病毒診斷如前所述 (CRC Press,Boca Raton，F(xiàn)L，1988)。簡(jiǎn)而言之，在碳覆蓋的R)rmvar-filmed銅柵(Tousimis Research Corp.，Rockville, MD)上，放置1. O微升的樣品，使得附接VLP。加入2微升的 1 % PTA 溶液(磷鎢酸，ρΗ7· 0) (Fisher Scientific Co.，F(xiàn)airlawn, NJ)，負(fù)染色所述 VLP。 而后用電子顯微鏡(Hitachi H7000,日本東京)，在75kV操作檢視所述柵。使用CXD相機(jī) (AMT, Danvers, MA)拍攝數(shù)字影像。冷凍電子顯微鏡與影像分析基孔肯尼亞VLP在液體乙烷中的孔柵上被快速冷凍。用CM300 FEG顯微鏡以電子劑量程度約20e/A2，在47K放大倍數(shù)下記錄影像。使用Nikon掃描儀，以6. 35微米像素?cái)?shù)字化所有的顯微照片。使用EMAN2包裝中的程序e2boXer，把個(gè)別顆粒影像框起來(Tang et al.，J Struct. Biol. 157, 38 (2007)) 決定 CTF 參數(shù)，以及從 EMAN 包裝(Ludtke et al.， J Struct. Biol. 128,82(1999))使用CTFIT程序翻轉(zhuǎn)相。使用分配的2_、3_與5-倍圖，在 EMAN中建構(gòu)初始模式，以及假設(shè)二十面體對(duì)稱性，在EMAN中精煉初始模式。并入最終重組的顆粒數(shù)是1489，基于0.5 Fourier shell關(guān)聯(lián)門坎，最終分辨率是18A。浮力密度梯度沉降分析與VLP的純化如前述方法，進(jìn)行浮力密度梯度分析與VLP的純化(Akahata et al.，J. Virol. 9， 626(2005))。簡(jiǎn)單地說，得自293的懸浮細(xì)胞株O. 5xl08細(xì)胞)(Invitrogen)依照制造商的建議流程，轉(zhuǎn)染^3feCtin轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)以及125微克的C-E37997 質(zhì)體。在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)收取上清液，通過0. 45微米孔徑的過濾膜過濾，而后在60 % Optiprep (Iodixanol)培養(yǎng)液(Invitrogen)分層，在 50, OOOx g 用 Surespin 630 轉(zhuǎn)子(Sorvall)離心1. 5小時(shí)。移除上清液，留下病毒戴上方4毫升，以及混合至最終濃度20%的OptiPr印。用NVTlOO轉(zhuǎn)子(Beckman)在360，OOOx g離心3.5小時(shí)，形成密度梯度。每一部分收集500微升、秤重，以及制作所述部分的密度圖。每部分取20微升， 用 4% -15% SDS-PAGE 膠體分離，轉(zhuǎn)印至 Lnmobilon-P 膜，以及用 CHIKV S-27 株(ATCC， VR-1241AF)注射的老鼠血清以及山羊抗老鼠免疫球蛋白連結(jié)至辣根過氧化酶(Santa Cruz Biotechnology)進(jìn)行點(diǎn)印。老鼠與猴子的免疫作用與挑戰(zhàn)依照制造商的流程建議，每只老鼠使用60微升正常鹽水中19微克的VLP (相當(dāng)于約 10 微克的 E1/E2)與 60 微升的 Ribi 溶液(Sigma Adjuvant system, Sigma-Aldrich)。 用正常鹽水中的VLP或是Ribi，總體積120微升，注射雌性6至8周大BALB/c老鼠的右與左四頭肌，在第2周與第6周注射兩次。對(duì)于DNA疫苗組，老鼠右與左四頭肌注射100微升正常鹽水中總量15微克純化的質(zhì)體C-E37997、E37997、C-E0PY-1或是E0PY-1，在第0、3與 6周共三次。每組有5只老鼠皆被注射。在最后注射后10天，收集血清與脾臟。在猴子實(shí)驗(yàn)中，在第0、4與M周，重量3-4公斤的恒河猴(Macaca mulatta)的前四頭肌肌肉注射1毫升PBS中20微克的VLP (VLP組)或是1毫升PBS (控制組)。每組有六只猴子皆被注射。在第_14、0、10、觀、8、56、70、161與178天，收集血液，測(cè)量抗體量。 通過靜脈注射，用1010PFU的CHIKV (LR2006 0PY-1)挑戰(zhàn)猴子(每組η = 3，從各組隨機(jī)選擇)。在0、6、24、48、72、96、120與168小時(shí)，收集血液測(cè)量病毒血癥。挑戰(zhàn)之后168小時(shí)， 犧牲猴子。使用血液分析器(IDEXX Laboratories Inc. ,ffestbrook,Maine)測(cè)量全部的血液細(xì)胞。血液是EDTA抗凝結(jié)，使用20-22 口徑(gauge)針以及針筒或是真空管。每個(gè)月移除的最大血液量不超過20% (iaiil/kg)，任何單一次移除量不超過15% (9ml/kg)。由動(dòng)物照顧與使用委員會(huì)、疫苗研究中心(VRC)、過敏與感染疾病的國(guó)家研究中心 (http://www. niaid. nih. gov/vrc)，檢視與核準(zhǔn)所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以及根據(jù)所有相關(guān)的聯(lián)邦與國(guó)家衛(wèi)生研究院的規(guī)則進(jìn)行。病毒制備如前所述，制備CHIKV(LR2006 0PY-1)，以及決定病毒量(Tsetsarkin et al.， PLoS. Pathog. 3，e20K2007)與 Pastorino et al. ,J Virol. Methods 124，65 Q005))。簡(jiǎn)而言之，從質(zhì)體CHIK-LR ic轉(zhuǎn)錄病毒RNA，用電穿孔轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞。分裝來自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液，以及滴定儲(chǔ)存病毒，以及使用Vero細(xì)胞決定組織培養(yǎng)感染劑量50% (TCID50)終點(diǎn)滴定量。為了產(chǎn)生用于脊椎動(dòng)物挑戰(zhàn)的病毒，生長(zhǎng)在T150的C6/36(AedeS albopictus) 細(xì)胞被儲(chǔ)存病毒感染，感染重復(fù)數(shù)為0. 03。感染后48小時(shí)，收取上清液，分裝以及滴定，決定Vero細(xì)胞的TCID5tl終端量。蝕斑分析用標(biāo)準(zhǔn)蝕斑減少中和測(cè)試(PRNT)測(cè)試血清樣品的CHIKV中和抗體。簡(jiǎn)而言之，猴子血清在56°C加熱去活化30分鐘，以及在病毒稀釋液((PBS/5% BSA)中稀釋。稀釋的血清樣品與等體積的40PFUCHIKV(LR2006 0PY-1)混合，并且在37°C培養(yǎng)1小時(shí)。六槽盤中長(zhǎng)滿Vero細(xì)胞，用200微升的血清-病毒混合物預(yù)防接種，進(jìn)行三重復(fù)，并且在37°C培養(yǎng)1 小時(shí)。培養(yǎng)盤用3毫升含有0.9%洋菜膠(Lonza Rockland,Rockland,ME)的培養(yǎng)液覆蓋， 并且在37°C含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。而后加入第二層含有中和紅與洋菜膠的培養(yǎng)液，并且在可見且能計(jì)算蝕斑之前將培養(yǎng)盤培養(yǎng)過夜。挑戰(zhàn)后，用蝕斑分析測(cè)量猴子的病毒血癥。六槽盤中長(zhǎng)滿Vero細(xì)胞，用200微升的血清-病毒混合物預(yù)防接種，進(jìn)行二重復(fù)。在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)較低的血清稀釋毒性(偵測(cè)限制稀釋倍數(shù)是1 200 = 1000PFU/ml)， 所以血清稀釋倍數(shù)為 1 200、1 400,1 800,1 1000,1 10，000 以及 1 100,000被動(dòng)轉(zhuǎn)換(passive transfer)免疫球蛋白以及挑戰(zhàn)IFN α / β R+老鼠IFNa/β Κ+老鼠是由 Robert kder 與 Daniel D. Pinschewer 提供。從 CHIKV VLP免疫的猴子或是注射PBS (控制組)的猴子血清純化IgG，使用HiTrapTM Protein G HP 管柱(GE Healthcare)，依照制造商的建議流程進(jìn)行。進(jìn)一步使用Melon Gel IgG純化套組純化IgG，依照制造商的建議流程進(jìn)行。純化的IgG對(duì)PBS透析三次。在挑戰(zhàn)的M小時(shí)之前，在每一只接收者IFNa / β R+老鼠尾巴靜脈注射2毫克純化的IgG(大約是來自200微克的血清)。用皮膚內(nèi)注射方式，以30PFU的CHIKV (LR2006 OPY-1)挑戰(zhàn)老鼠。用定量的RT-PCR 偵測(cè) CHIKV RNA為了 RNA分離，血清樣品在10，000旋轉(zhuǎn)1小時(shí)，倒掉液體，加入1毫升的RNA-STAT 60 (Isotex Diagnostics, Friendswood, TX)。而后在室溫培養(yǎng)樣品5分鐘，以及重新懸浮在 250微升的三氯甲烷震蕩混合。樣品在10，000旋轉(zhuǎn)1小時(shí)，移除上層溶液，加入0. 5毫升異丙醇與10微升tRNA (10微克/毫升)，在_20°C沉淀過夜。樣品旋轉(zhuǎn)1小時(shí)，用冷的75%乙醇清洗，以及再旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。RNA重新懸浮在30微升無RNAse水中。為了進(jìn)行RT-PCR，10% RNA加入TaqMan試劑(Applied Biosyste m, Foster City, CA)以及引子與探針(如下所列示)，在7700序列偵測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystem)中放大。簡(jiǎn)而言之，在48°C反轉(zhuǎn)錄樣品 30分鐘，在95°C放置10分鐘，而后進(jìn)行40個(gè)周期的95°C反應(yīng)30秒以及60°C反應(yīng)1分鐘。 信號(hào)與已知濃度的含有LR2006 0PY-1序列的質(zhì)體標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，開始在IO7下至Icoly/mL 以及乘以10，得到偵測(cè)范圍從40-108COpieS/mL。所有樣品進(jìn)行三重復(fù)。引子與探針是設(shè)計(jì)結(jié)合在El結(jié)構(gòu)蛋白基因的高保留區(qū)域。引子序列CHIK-F 5' AAGCTCCGCGTCCTTTACCAAG 3，以及 CHIK-R 5，CCAAATTGTCCTGGTCTTCCT 3，。探針序列=CHICK-P FAM-CCAATGTCTTCAGC CTGGACACCTTT-TAMRA，如前所述(Huang et al.，J. Virol. 78,12557(2004) ；Pastorino et al.，J Virol. Methods 124,65 (2005)) 其它實(shí)施例從上述描述說明，可知本發(fā)明可具有變化與修飾，用來符合不同的使用與條件。這些變化的實(shí)施例也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本申請(qǐng)變量的任何定義中組件表列包含定義變量為任何單一組件或所列組件的組合(或次組合)。本申請(qǐng)的實(shí)施例包含任何單一實(shí)施例或是任何其它實(shí)施例或其部分的組合。本申請(qǐng)說明書中提到的所有專利與公開案內(nèi)容并入本申請(qǐng)作為參考，猶如特定且個(gè)別所指的每一獨(dú)立的專利與公開案并入本申請(qǐng)作為參考。
權(quán)利要求
1.一種類病毒顆粒(VLP)，包括一或多基孔肯尼亞病毒結(jié)構(gòu)多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述結(jié)構(gòu)多肽是選自于殼體與包膜蛋白E3、E2、6K與 El組成的群體。
3.如權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述VLP包括包膜蛋白E3、E2、6K與El。
4.如權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述VLP包括多蛋白，所述多蛋白包括 C-E3-E2-6K-E1。
5.一種分離的多核苷酸，編碼權(quán)利要求1-5中任一類病毒顆粒。
6.如權(quán)利要求5所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包括C-E3-E2-6K-E1 的基孔肯尼亞病毒多蛋白。
7
8.一種表現(xiàn)載體，包括編碼一或多基孔肯尼亞病毒結(jié)構(gòu)多肽的多核苷酸。
9.如權(quán)利要求8所述的表現(xiàn)載體，其中所述多核苷酸編碼一或多結(jié)構(gòu)多肽，所述結(jié)構(gòu)多肽是選自殼體(C)與包膜蛋白E3、E2、6K與El組成的群組。
10.如權(quán)利要求8所述的表現(xiàn)載體，其中所述多核苷酸編碼包膜蛋白E3、E2、6K與E1。
11.如權(quán)利要求8所述的表現(xiàn)載體，其中所述多核苷酸編碼包括C-E3-E2-6K-E1的基孔肯尼亞病毒多蛋白。
12.如權(quán)利要求8所述的表現(xiàn)載體，其中所述表現(xiàn)載體可在原核或真核細(xì)胞中表現(xiàn)。
13.如權(quán)利要求8所述的表現(xiàn)載體，其中所述結(jié)構(gòu)多蛋白是得自基孔肯尼亞37997或 LR2006 株系。
14.如權(quán)利要求8所述的表現(xiàn)載體，其中所述載體包括CMV/R啟動(dòng)子。
15.如權(quán)利要求8所述的表現(xiàn)載體，其中所述表現(xiàn)載體是C-E37997或C-E0PY-1。
16.一種原核或真核細(xì)胞，包括權(quán)利要求8-15中任一項(xiàng)的所述表現(xiàn)載體。
17.一種免疫原組合物，包括有效量的權(quán)利要求1-5的類病毒顆粒。
18.一種免疫原組合物，包括有效量的VLP，所述VLP包括基孔肯尼亞結(jié)構(gòu)多蛋白，所述基孔肯尼亞結(jié)構(gòu)多蛋白包括C-E3-E2-6K-E1與佐劑。
19.一種免疫原組合物，包括有效量的權(quán)利要求8-15任一項(xiàng)的表現(xiàn)載體。
20.如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的免疫原組合物，其中所述VLP在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
21.如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的免疫原組合物，其中所述免疫反應(yīng)在個(gè)體中治療或預(yù)防基孔肯尼亞感染。
22.如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的免疫原組合物，其中所述VLP誘導(dǎo)抗體對(duì)抗同源或異源株系的基孔肯尼亞。
23.如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的免疫原組合物，其中所述佐劑是免疫刺激劑。
24.如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的免疫原組合物，其中所述佐劑是選自Ribi、鋁鹽、胞壁酰肽、細(xì)菌細(xì)胞壁成分、皂素佐劑組成的群組。
25.一種疫苗，包括有效量的一或多基孔肯尼亞病毒結(jié)構(gòu)多肽，選自殼體(C)與包膜蛋白E3、E2、6K與El所組成的群組。
26.一種疫苗，包括有效量的權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的類病毒顆?；虬ǘ嗟鞍祝龆嗟鞍装?C-E3-E2-6K-E1。
27.一種疫苗，包括編碼基孔肯尼亞結(jié)構(gòu)多肽或其片段的多核苷酸。
28.如權(quán)利要求27的疫苗，其中所述基孔肯尼亞結(jié)構(gòu)多蛋白是由權(quán)利要求8-15任一項(xiàng)的表現(xiàn)載體編碼。
29.如權(quán)利要求27的疫苗，其中所述表現(xiàn)載體包括CMV/R啟動(dòng)子。
30.如權(quán)利要求M的疫苗，其中所述疫苗是DNA疫苗。
31.一種在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)對(duì)抗基孔肯尼亞的方法，所述方法包括對(duì)所述個(gè)體給予有效量的權(quán)利要求14-24中任一項(xiàng)的免疫原組合物。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述免疫原組合物包括一或多基孔肯尼亞病毒結(jié)構(gòu)多肽，選自殼體(C)與包膜蛋白E3、E2、6K與El組成的群組。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述免疫原組合物包括多蛋白，所述多蛋白包括 C-E3-E2-6K-E1。
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述方法在個(gè)體中誘導(dǎo)中和抗體。
35.一種用于個(gè)體中治療或預(yù)防基孔肯尼亞感染的方法，所述方法包括對(duì)所述個(gè)體給予有效量的權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的疫苗或權(quán)利要求14-24中任一項(xiàng)的免疫原組合物。
36.如權(quán)利要求31或35所述的方法，其中一或多次劑量給予所述疫苗或免疫原組合物。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中給予所述疫苗或免疫原組合物一或多次初始免疫作用以及一或多次刺激免疫作用。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中在一、二、三、四、五、六、七或八周間隔，給予所述初始免疫作用。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中在所述初始免疫作用之后，兩周、一個(gè)月、兩個(gè)月或三個(gè)月給與所述刺激免疫作用。
40.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述免疫作用保護(hù)所述個(gè)體對(duì)抗病毒血癥或感染的發(fā)炎結(jié)果。
41.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述方法保護(hù)免于致命。
42.一種用于產(chǎn)生類病毒顆粒的方法，所述方法包括在細(xì)胞中表現(xiàn)一或多基孔肯尼亞結(jié)構(gòu)蛋白，可自身組合形成類病毒顆粒。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述方法更包括分離所述類病毒顆粒。
44.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述基孔肯尼亞結(jié)構(gòu)蛋白是選自殼體(C)與包膜蛋白E3、E2、6K與El組成的群組。
45.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述基孔肯尼亞結(jié)構(gòu)蛋白是存在基孔肯尼亞結(jié)構(gòu)多蛋白中。
46.一種類病毒顆粒(VLP)，包括一或多亞法病毒結(jié)構(gòu)多肽。
47.如權(quán)利要求42所述的VLP，其中所述結(jié)構(gòu)多肽是殼體或是包膜多肽。
48.如權(quán)利要求43所述的VLP，其中所述亞法病毒是選自基孔肯尼亞病毒、辛德畢病毒、東方馬腦炎病毒(EEE)、西方馬腦炎病毒(WEE)以及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)組成的群組。
49.一種分離的多核苷酸，編碼權(quán)利要求44-46中任一項(xiàng)的類病毒顆粒。
50.一種表現(xiàn)載體，包括編碼一或多亞法病毒結(jié)構(gòu)多肽的多核苷酸，其中所述亞法病毒是選自基孔肯尼亞病毒、辛德畢病毒、東方馬腦炎病毒(EEE)、西方馬腦炎病毒(WEE)以及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)組成的群組。
51.一種免疫原組合物，包括有效量的權(quán)利要求44-46中任一項(xiàng)的類病毒顆粒。
52.一種疫苗，包括有效量的一或多亞法病毒結(jié)構(gòu)多肽或編碼一或多亞法病毒結(jié)構(gòu)蛋白的多核苷酸，其中所述亞法病毒是選自基孔肯尼亞病毒、辛德畢病毒、東方馬腦炎病毒 (EEE)、西方馬腦炎病毒(WEE)以及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)組成的群組。
53.一種在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)對(duì)抗亞法病毒的方法，所述方法包括對(duì)所述個(gè)體給予有效量的權(quán)利要求51的免疫原組合物。
54.如權(quán)利要求53的方法，其中所述免疫原組合物包括一或多亞法病毒結(jié)構(gòu)多肽。
55.如權(quán)利要求53的方法，其中所述方法在所述個(gè)體中誘導(dǎo)中和抗體。
56.一種用于在個(gè)體中治療或預(yù)防亞法病毒感染的方法，所述方法包括對(duì)所述個(gè)體給予有效量的權(quán)利要求44的疫苗或權(quán)利要求47的免疫原組合物。
57.一種套組，包括權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的VLP，以及使用說明。
58.一種套組，包括權(quán)利要求13-19或41-43中任一項(xiàng)的免疫原組合物，以及在個(gè)體中的使用說明。
59.如權(quán)利要求58的套組，其中所述免疫原組合物提供在第一容器中，以及第二免疫原組合物提供在第二容器中，以及初始刺激免疫作用的使用說明。
60.如權(quán)利要求58的套組，其中在所述第二容器中的所述免疫原組合物包括VLP、病毒多肽或病毒多核苷酸。
61.一種用于辨識(shí)基孔肯尼亞病毒進(jìn)入真核細(xì)胞的方法，所述方法包括表現(xiàn)基孔肯尼亞病毒報(bào)導(dǎo)物以及選自C、E3、E2、6K與El的基孔肯尼亞多肽的細(xì)胞接觸候選化合物，以及分析病毒進(jìn)入，其中相較于控制細(xì)胞，減少病毒進(jìn)入所述細(xì)胞的候選化合物被辨識(shí)為基孔肯尼亞病毒進(jìn)入的抑制劑。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述候選抑制劑是抗體或其片段或小分子。
63.一種用于辨識(shí)基孔肯尼亞病毒進(jìn)入的抑制劑的方法，包括表現(xiàn)基孔肯尼亞病毒報(bào)導(dǎo)物的細(xì)胞接觸候選抑制劑以及包括報(bào)導(dǎo)基因的假型病毒；以及測(cè)量所述細(xì)胞中所述報(bào)導(dǎo)基因的表現(xiàn)，其中相較于控制細(xì)胞，減少所述報(bào)導(dǎo)基因表現(xiàn)的化合物被辨識(shí)為抑制病毒進(jìn)入。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述假型病毒包括一或多基孔肯尼亞病毒包膜蛋白。
65.如權(quán)利要求63所述的方法，其中一或多包膜蛋白選自E3、E2、6K與El組成的群組。
66.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述假型病毒是慢病毒。
67.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述候選抑制劑是抗體或其片段，或小分子。
68.一種類病毒顆粒(VLP)，包括一或多基孔肯尼亞病毒結(jié)構(gòu)多肽，用于治療或預(yù)防基孔肯尼亞感染。
69.一種用于治療或預(yù)防基孔肯尼亞感染的方法，所述方法包括給予類病毒顆粒 (VLP)，所述類病毒顆粒包括一或多基孔肯尼亞病毒結(jié)構(gòu)多肽，以及所述給予類病毒顆粒是在給予一或多另一免疫原組合物、抗病毒或抗生素劑之前、之后或同時(shí)或任何其它順序。
全文摘要
本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療一或多基孔肯尼亞病毒株系與其它亞法病毒媒介疾病的組合物與方法。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102317308SQ200980155476
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2009年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月26日
發(fā)明者G·J·納貝爾, S·S·拉奧, 赤旗航 申請(qǐng)人:美國(guó)國(guó)有健康與人類服務(wù)部