一種多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法
【專利摘要】一種多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法，通過將鮑內(nèi)臟濕物料絞碎后與水混合蒸煮，用堿性蛋白酶進(jìn)行第一次酶解，所得酶解液進(jìn)行膜分離，得到的截留液用風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行第二次酶解就，再進(jìn)行膜分離，所得截留液通過冷凍干燥、噴霧干燥或醇沉、真空干燥處理得到鮑內(nèi)臟多糖，截留液與第一次酶解所得透過液合并，通過反滲透或真空濃縮處理后，冷凍干燥或噴霧干燥得鮑內(nèi)臟蛋白肽。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單、實(shí)用，可以同時(shí)制備多糖和蛋白肽，生產(chǎn)效率高。
【專利說明】一種多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于多糖、蛋白的分離提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]福建是鮑養(yǎng)殖大省，鮑年產(chǎn)量近10萬噸，占國(guó)內(nèi)總產(chǎn)量80%以上，隨著市場(chǎng)需求的快速增長(zhǎng)，干鮑、凍鮑加工發(fā)展迅速，但在加工過程中會(huì)產(chǎn)生約占鮑重1/4的內(nèi)臟等副產(chǎn)物，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)這些加工副產(chǎn)物的處理主要用來生產(chǎn)飼料等低附加值產(chǎn)品，大部分鮑魚內(nèi)臟沒有得到充分的利用，不僅浪費(fèi)資源，也會(huì)給環(huán)境造成污染。鮑內(nèi)臟中多糖、蛋白質(zhì)分別占其干物質(zhì)約20%、50%，是極好的加工生物多糖和小分子蛋白活性肽的資源。鮑內(nèi)臟多糖、蛋白肽與人體細(xì)胞有良好的生物兼容性，無細(xì)胞毒性且可被生物體分解，具有增強(qiáng)免疫、抗疲勞、抗氧化及抗腫瘤等生物學(xué)活性，在保健食品、護(hù)膚日用品、生物制藥等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003]目前，利用鮑內(nèi)臟制備多糖、蛋白肽的工藝主要是針對(duì)多糖或蛋白肽進(jìn)行單獨(dú)提取、制備，缺乏聯(lián)合制備工藝，原料利用率低。同時(shí)，由于鮑內(nèi)臟中多糖與蛋白質(zhì)主要以糖蛋白的結(jié)合形式存在，無論是采用熱水/堿浸提、單一的酶解或膜分離技術(shù)制備獲得的鮑多糖，均含有較多的蛋白質(zhì)成分，導(dǎo)致鮑多糖純度低，而后期無論采用Sevag法或三氯乙酸法脫蛋白，還是采用過氧化氫或活性炭脫色，都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的得率明顯降低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，使用分步酶解和膜分離技術(shù)組合工藝，旨在提供一種鮑內(nèi)臟多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法。
[0005]本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0006]一種多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法，包括以下步驟:
[0007]I)原料預(yù)處理:將鮑內(nèi)臟濕物料絞碎，加水混合在100?105°C條件下蒸煮10?20min，降溫至 50 0C ；
[0008]2)第一次酶解:添加堿性蛋白酶，酶解完成后，料液煮沸10?15min，冷卻至40°C以下，離心分離得沉淀和酶解液；
[0009]3)第一次膜分離:將酶解液進(jìn)行膜分離，得到透過液和截留液；
[0010]4)第二次酶解:截留液加水稀釋，加入步驟⑵中沉淀物，添加風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行二次酶解，酶解完成后加入料液重量I?2%的活性炭粉末，煮沸10?15min，冷卻至40°C以下，離心去除沉淀，得酶解液；
[0011]5)第二次膜分離:所得酶解液除去懸浮微粒及雜質(zhì)，濾液進(jìn)行膜分離，得到透過液和截留液；
[0012]6)干燥制備:步驟(5)所得截留液通過冷凍干燥、噴霧干燥或醇沉、真空干燥處理得到鮑內(nèi)臟多糖；步驟(3)和(5)所得透過液合并，通過反滲透或真空濃縮處理后，冷凍干燥或噴霧干燥得鮑內(nèi)臟蛋白肽。
[0013]進(jìn)一步，
[0014]步驟(I)中所述的加水量為鮑內(nèi)臟濕物料重量的5?8倍。
[0015]步驟⑵中酶的添加量為200?600U/g鮑內(nèi)臟原料，酶解反應(yīng)時(shí)間為8?16h。
[0016]步驟(3)中酶解液用截留分子量5000?1000Da的膜進(jìn)行膜分離，所述的截留液的體積為酶解液的1/6?1/4。
[0017]步驟(4)中截留液加I?2倍體積的水稀釋，所述的風(fēng)味蛋白酶的添加量為50?200U/g鮑內(nèi)臟原料，酶解時(shí)間為6?10h。
[0018]步驟(5)中酶解液用過濾精度為1.0?5.0微米的微孔過濾機(jī)過濾除去懸浮微粒及雜質(zhì)，濾液用截留分子量5000?1000Da的膜進(jìn)行膜分離，得到截留液的體積為酶解液的 1/6 ?1/4。
[0019]本發(fā)明的有益效果為:
[0020]I)采用不同的蛋白酶對(duì)鮑內(nèi)臟進(jìn)行分步酶解，達(dá)到了充分分解的目的；
[0021]2)采用多次酶解和膜分離聯(lián)合制備工藝有利于獲得低蛋白含量的高純度鮑內(nèi)臟多糖；
[0022]3)選用堿性蛋白酶為第一次酶解用酶，酶解的堿性pH環(huán)境可以促進(jìn)多糖類物質(zhì)從原料中釋放、溶出；選用同時(shí)含有端肽酶和內(nèi)切酶活性的風(fēng)味蛋白酶為第二次酶解用酶，有利于將第一次酶解獲得的粗多糖中的蛋白質(zhì)進(jìn)一步水解；
[0023]4)鮑內(nèi)臟含有大量的色素類物質(zhì)，鮑內(nèi)臟多糖、蛋白肽的制備過程中要進(jìn)行脫色處理。本發(fā)明第一次膜分離時(shí)，色素隨多糖類物質(zhì)被截留，蛋白肽透過液無需進(jìn)行脫色處理，截留物進(jìn)行二次酶解后，滅酶前加入活性碳，同時(shí)完成滅酶和脫色處理，活性碳還能吸附物料中的懸浮顆粒，有利于后續(xù)的膜分離操作。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是鮑內(nèi)臟多糖GlOO凝膠柱色譜圖；
[0025]圖2是多肽分子量測(cè)定標(biāo)樣凝膠色譜HPLC圖；
[0026]圖3是鮑內(nèi)臟蛋白肽分子量分布凝膠色譜HPLC圖。

【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以下實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0028]實(shí)施例1
[0029]一種多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法，包括以下步驟:
[0030](I)原料預(yù)處理:取凍藏鮑內(nèi)臟1.5kg，經(jīng)Imm孔徑絞肉機(jī)絞碎后作為原料送入酶解罐，加7.5kg水充分混合制成料液，料液升溫至105°C加熱15min，降溫至50°C。
[0031](2)第一次酶解:調(diào)整料液ρΗΙΟ.Ο、溫度52°C，添加600U/g原料的中性蛋白酶，恒溫酶解8hr，煮沸15min，冷卻至30°C，酶解液在5000rpm轉(zhuǎn)速條件下離心，得沉淀和酶解液；
[0032](3)第一次膜分離:酶解液用截留分子量1000Da的超濾膜進(jìn)行膜分離，截留液體積約2000ml時(shí)停止超濾。
[0033](4)第二次酶解:將第一次酶解所得沉淀物和第一次膜分離所得截留液加入酶解罐，加入4000ml的水混勻，調(diào)整料液pH7.0、溫度50°C，添加200U/g原料的風(fēng)味蛋白酶，恒溫酶解1hr，加入60g活性碳粉末，煮沸15min，冷卻至30°C，酶解液在4500rpm轉(zhuǎn)速條件下離心脫除沉淀，酶解液用過濾精度為5.0微米的微孔過濾機(jī)過濾除去懸浮微粒及雜質(zhì)。
[0034](5)第二次膜分離:第二次酶解的酶解液用截留分子量5000Da的超濾膜進(jìn)行膜分離，截留液體積約1500ml時(shí)停止超濾。
[0035](6)干燥制備:第二次膜分離的截留液經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥后得鮑內(nèi)臟多糖76g，兩次膜分離所得透過液合并經(jīng)反滲透濃縮、冷凍干燥后得鮑內(nèi)臟蛋白肽145g。
[0036]實(shí)施例2
[0037]一種多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法，包括以下步驟:
[0038](I)原料預(yù)處理:取新鮮鮑內(nèi)臟1kg，經(jīng)2mm孔徑絞肉機(jī)絞碎后作為原料送入酶解罐，加8kg水充分混合制成料液，料液升溫至100°C加熱lOmin，降溫至50°C。
[0039](2)第一次酶解:調(diào)整料液ρΗΙΟ.0、溫度52°C，添加200U/g原料的中性蛋白酶，恒溫酶解16hr，煮沸l(wèi)Omin，冷卻至30°C，酶解液在5000rpm轉(zhuǎn)速條件下離心，得沉淀和酶解液；
[0040](3)第一次膜分離:酶解液用截留分子量5000Da的超濾膜進(jìn)行膜分離，截留液體積約1500ml時(shí)停止超濾。
[0041](4)第二次酶解:將第一次酶解所得沉淀物和第一次膜分離所得截留液加入酶解罐，加入1500ml的水混勻，調(diào)整料液pH7.0、溫度50°C，添加50U/g原料的風(fēng)味蛋白酶，恒溫酶解6hr，加入60g活性碳粉末，煮沸l(wèi)Omin，冷卻至30°C，酶解液在4500rpm轉(zhuǎn)速條件下離心脫除沉淀，酶解液用過濾精度為1.0微米的微孔過濾機(jī)過濾除去懸浮微粒及雜質(zhì)。
[0042](5)第二次膜分離:第二次酶解的酶解液用截留分子量1000Da的超濾膜進(jìn)行膜分離，截留液體積約500ml時(shí)停止超濾。
[0043](6)干燥制備:第二次膜分離的截留液經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥后得鮑內(nèi)臟多糖46g，兩次膜分離所得透過液合并經(jīng)反滲透濃縮、冷凍干燥后得鮑內(nèi)臟蛋白肽85g ;鮑內(nèi)臟多糖含糖量63%，蛋白含量20%，鮑內(nèi)臟多糖樣品上葡聚糖凝膠GlOO柱層析分離得兩個(gè)多糖組分，凝膠色譜圖見圖1 ;鮑內(nèi)臟蛋白肽總氮含量為13.8%，如圖2所示，圖中從左至右波峰依次為細(xì)胞色素C(12384 Da)、抑肽酶(6512Da)、生長(zhǎng)激素抑制素(1636.7 Da)、氧化性谷胱甘肽(613 Da)、谷胱甘肽(307 Da)，結(jié)合圖3可知，鮑內(nèi)臟蛋白肽中小分子肽的分子量主要分布在300?700Da，相對(duì)分子量小于100Da的小分子肽占蛋白水解物的比例大于90%。
[0044]后經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明也可用于以海參、蠶蛹等富含多糖、蛋白質(zhì)的其它生物材料為原料制備多糖和蛋白肽，故不能以此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明專利涵蓋的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)原料預(yù)處理:將鮑內(nèi)臟濕物料絞碎，加水混合在100?105°C條件下蒸煮10?20min，降溫至 50 0C ； 2)第一次酶解:添加堿性蛋白酶，酶解完成后，料液煮沸10?15min，冷卻至40°C以下，離心分離得沉淀和酶解液； 3)第一次膜分離:將酶解液進(jìn)行膜分離，得到透過液和截留液； 4)第二次酶解:截留液加水稀釋，加入步驟(2)中沉淀物，添加風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行二次酶解，酶解完成后加入料液重量I?2 %的活性炭粉末，煮沸10?15min，冷卻至40°C以下，離心去除沉淀，得酶解液； 5)第二次膜分離:所得酶解液除去懸浮微粒及雜質(zhì)，濾液進(jìn)行膜分離，得到透過液和截留液； 6)干燥制備:步驟(5)所得截留液通過冷凍干燥、噴霧干燥或醇沉、真空干燥處理得到鮑內(nèi)臟多糖；步驟(3)和(5)所得透過液合并，通過反滲透或真空濃縮處理后，冷凍干燥或噴霧干燥得鮑內(nèi)臟蛋白肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的加水量為鮑內(nèi)臟濕物料重量的5?8倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法，其特征在于:步驟(2)中酶的添加量為200?600U/g鮑內(nèi)臟原料，酶解反應(yīng)時(shí)間為8?16h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法，其特征在于:步驟(3)中酶解液用截留分子量5000?1000Da的膜進(jìn)行膜分離，所述的截留液的體積為酶解液的1/6 ?1/4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法，其特征在于:步驟(4)中截留液加I?2倍體積的水稀釋，所述的風(fēng)味蛋白酶的添加量為50?200U/g鮑內(nèi)臟原料，酶解時(shí)間為6?10h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多糖和蛋白肽的聯(lián)合制備方法，其特征在于:步驟(5)中酶解液用過濾精度為1.0?5.0微米的微孔過濾機(jī)過濾除去懸浮微粒及雜質(zhì)，濾液用截留分子量5000?1000Da的膜進(jìn)行膜分離，得到截留液的體積為酶解液的1/6?1/4。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK104513843SQ201410837532
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月30日
【發(fā)明者】熊何健, 馬英, 劉智禹, 何傳波, 魏好程, 吳國(guó)宏, 王嬌 申請(qǐng)人:集美大學(xué)