一種表達抗氧化多肽的畢赤酵母工程菌及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達抗氧化多肽的畢赤酵母工程菌及應用，本發(fā)明利用基因工程技術，構建獲得了一株表達抗氧化多肽的畢赤酵母工程菌 Pichia pastoris KM71H FZM2014 AOP，CCTCC NO: M 2014552，該菌株通過發(fā)酵可高表達抗氧化多肽VECYGPNRPQF。制備的抗氧化多肽能高效清除自由基，在斷奶仔豬為模型的動物試驗中表現(xiàn)出強效的生物活性。本發(fā)明提供的抗氧化肽具有制備方法易行、操作簡便、表達量高、成本低廉、生物學活性強的特點，可廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)、食品、保健品、水產、幼稚、化妝品等行業(yè)。
CCTCC NO:M2014552
20141106
【專利說明】一種表達抗氧化多肽的畢赤酵母工程菌及應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】，更具體涉及一種表達抗氧化多肽的畢赤酵母工程菌及 應用，該基因工程菌可表達抗氧化多肽VECYGPNRPQF，該多肽進一步純化后是一種新型抗氧 化產品，應用于醫(yī)藥、保健品、化妝品等行業(yè)。

【背景技術】
[0002] 地球上多數(shù)生物，包括人自身和常見的家養(yǎng)動物，是利用氧氣產生能量的。氧氣對 于這些生物的生存是必須的，但是在利用氧氣通過氧化磷酸化產生大量能量供應機體使用 的同時，機體也付出了很大代價。氧化磷酸化會引起不利于機體健康的副產物活性氧（ROS) 的蓄積，可誘發(fā)氧化應激給人體健康，給社會生產帶來不良影響。嚴重的氧化應激危害人類 健康，可造成細胞內關鍵分子（如DNA、RNA、蛋白、脂質）的損害，誘發(fā)動脈粥樣硬化、關節(jié) 炎、糖尿病、癌癥、胃潰瘍以及神經性疾病；氧化應激可導致飼養(yǎng)動物采食量降低、腸粘膜破 壞、消化率下降、致病率增加、出欄期延遲、肉品質下降等，影響畜產品生產，重者可引起動 物疾病甚至死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的損失。另外在畜禽飼料中經常需要添加脂肪和一些 脂肪含量較高的原料。在加工，貯存過程中，這些油脂類原料極易發(fā)生氧化和水解反應，導 致飼料尤其是高銅乳豬料的酸敗，產生醛、酮、酸、醇等有害產物，降低飼料品質和效價，并 可能對人體健康造成危害。這種現(xiàn)象在全國各地都非常普遍，迫切需要采取措施及早抑制 氧化酸敗的發(fā)生。
[0003] 目前，油脂、飼料、食品以及化妝品行業(yè)主要使用合成抗抗氧化劑。然而，合成抗氧 化劑主要有乙氧基喹（EMQ)、叔丁基羥基茴香醚（BHA)、二丁基羥基甲苯（BHT)、丙基沒食子 酸（PG)以及叔丁基氫醌（TBHQ)等。這些化學抗氧化劑使用需要嚴格控制，因為它們的蓄 積具有致癌性和基因毒性。天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑是今后飼料和食品工業(yè)的發(fā)展 趨勢，開發(fā)實用，安全，健康，高效，成本低廉的天然抗氧化劑是研宄的重點。食用級抗氧化 肽的安全性要求更高，抗氧化性較其他體內抗氧化生物分子更為顯著，可以穩(wěn)定脂質或含 脂質產品。天然的抗氧化多肽因分子量小、易吸收、活性強等特點。
[0004] 目前國外的研宄主要集中在對氧化肽的結構與功能的關系方面。研宄發(fā)現(xiàn)抗氧化 肽的抗氧化活性與多肽的相對分子質量大小、氨基酸序列、氨基酸側鏈基團、金屬鹽絡合有 關?？寡趸牡碾逆滈L短對活性影響較大，一般認為應在20個氨基酸殘基以內?？寡趸?多肽發(fā)揮其能清除ROS的功能，主要是由肽鏈中的特定氨基酸起作用，包括酪氨酸、甲硫氨 酸、組氨酸、賴氨酸和色氨酸等。如Cys殘基可直接清除R0S，肝細胞表達的脂肪酸結合蛋白 L-FABP通過使其內部的甲硫氨酸和半胱氨酸殘基失活而發(fā)揮其抗氧化作用。
[0005] 抗氧化多肽還有一個重要的發(fā)展優(yōu)勢，那就是其具有很強的分子可操作性。我們 可以改變抗氧化肽的氨基酸組成，引進對抗氧化活性有更大貢獻值的特定氨基酸，提高其 抗氧化性、結構穩(wěn)定性和靶向作用。有人研宄了模擬載脂蛋白Ap 0A-I的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn) 在N端的2或3位引入組氨酸后能顯著增加該肽段螯合Cu2+的能力，從而增強低密度脂蛋 白對Cu 2+的抗氧化性；用半胱氨酸替代12位的丙氨酸后，也有同樣的效果。而當同時引入 組氨酸和半胱氨酸，在對Cu2+的抗氧化性增加的同時，減了輕次氯酸和過氧化氫對低密度 脂蛋白的氧化，而所有這些改變并不影響其促進脂質的增溶能力。
[0006] 相比之下，國內的研宄比較薄弱，主要集中在對已發(fā)現(xiàn)抗氧化肽的功能驗證研宄 上。在生產方面主要通過酶解天然蛋白獲得，規(guī)?；没蚬こ毯桶l(fā)酵工程進行生產的 很少。在國內，對抗氧化肽的發(fā)現(xiàn)，結構分析，功能研宄以及生產應用方面還有很大的發(fā)展 空間。
[0007] 目前抗氧化肽主要是通過酶解大豆蛋白、奶酪、乳清蛋白、動物膠、面筋等各種食 物蛋白獲得。最近幾年發(fā)展到海洋產品如海藻、蝦皮、兩棲動物裸露皮膚分泌物、真菌等。利 用現(xiàn)有技術分離純化抗氧化肽，得到的多是混合多肽，并且純化工藝繁瑣，成本高昂，不能 規(guī)?；a，難以在需求量大的飼料行業(yè)推廣。由于受分離純化技術限制，分離的抗氧化肽 分子量都較大，未能獲得更短更有效的小分子量抗氧化肽。氨基酸序列間幾乎無同源性，進 一步加大了分離發(fā)現(xiàn)新抗氧化肽的難度?？寡趸嚯牡囊?guī)?；罅可a，可以促進食品，飼 料行業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。另外在全球的大背景下，表達生產抗氧化肽替代合成抗氧化劑 也順應越來越多的國家開始限制或禁止使用某些合成抗氧化劑的大趨勢，發(fā)展安全、環(huán)保、 健康、天然的抗氧多肽的推廣和使用。利用現(xiàn)代生物技術手段構建工程菌進行生物發(fā)酵，是 解決上述難題的有效方法。
[0008] 目前，有關應用微生物基因工程技術生產生物活性肽的主要方法有：在大腸桿菌 中或發(fā)光桿菌中誘導表達，在釀酒酵母中融合表達，在畢赤酵母中組成型或誘導表達等。其 中畢赤酵母被公認為安全的菌種，而且作為真核生物，畢赤酵母具有高等真核表達系統(tǒng)的 許多優(yōu)勢，能使外源真核基因正確翻譯和翻譯后加工。酵母pichia pasteris早已收入中 國藥典，是國內外公認的可供藥用，食用的酵母菌種。同為酵母，畢赤酵母具有與釀酒酵母 相似的分子及遺傳背景和分子操作簡單等優(yōu)點，但外源蛋白表達能力是后者的十倍以至百 倍，其外源蛋白可在畢赤酵母胞內表達或分泌至胞外。畢赤酵母的AOX強啟動子是目前最 強，調控機理最嚴格的啟動子之一，外源基因可以以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合入菌 體基因組特定位點，不易發(fā)生遺傳丟失。畢赤酵母作為培養(yǎng)菌可以連續(xù)高密度發(fā)酵培養(yǎng)，所 用發(fā)酵培養(yǎng)基廉價，培養(yǎng)條件容易控制。由于畢赤酵母自身外分泌蛋白很少，目的蛋白可占 分泌蛋白總量的80-90%，外分泌設計更大程度的減化了純化步驟，有利于工業(yè)生產。總體 說采用畢赤酵母表達生產生物活性多肽具有廉價、操作簡單、可高密度持續(xù)發(fā)酵、制備量大 等優(yōu)點。眾多研宄表明該系統(tǒng)為高效、實用、簡便，以提高表達量并保持產物生物學活性為 突出特征的外源基因表達系統(tǒng)，而且非常適合于工業(yè)化生產。
[0009] 微藻類是廣受歡迎的食物，2009年Sheih等用胃蛋白酶酶解微藻（Chlorella vulgaris)提取精華物質產生的蛋白廢棄物時，得到一種強效抗氧化肽VECYGPNRPQF。該多 肽能有效烊滅氫氧基、超氧負離子、過氧化氫、DPPH、ABTH在內的多種自由基。效果比丁基 羥基甲苯，生育酚好得多，并能顯著降低自由基對DNA的損害。對于抗氧化肽VECYGPNRPQF 的研宄還在起步階段，只是確定了其強效的清除自由基以及抗癌癥的生物學效能，還沒有 相應的應用研宄公布。
[0010] 鑒于抗氧化肽的優(yōu)良品質和社會需求，本發(fā)明構建高效表達抗氧化肽 VECYGPNRPQF表達畢赤酵母菌，優(yōu)化確定了抗氧化多肽VECYGPNRPQF的制備方法，并進行 了大鼠、斷奶仔豬以及產后母豬為動物模型的應用評價。通過本發(fā)明制備的抗氧化多肽 VECYGPNRPQF的方法可以解決抗氧化肽來源廣泛，有食用植物、藥材、香辛料等，使得較難有 統(tǒng)一的檢驗標準的難題；替代純化工藝繁瑣，成本高，產量低的酶解天然蛋白獲得抗氧化肽 制備工藝；走出抗氧化的制備和食品、藥品等行業(yè)競爭原材料困境。通過本發(fā)明獲得的抗氧 化多肽VECYGPNRPQF可廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)、食品、保健品、水產、油脂、化妝品等行業(yè)。


【發(fā)明內容】

[0011] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種表達抗氧化多肽VECYGPNRPQF的畢赤酵母工程 菌 Pichia pastoris KM71H FZM2tll4 AQP，CCTCC NO:M 2014552。該工程菌容易高密度發(fā)酵，生 產的抗氧化多肽VECYGPNRPQF不僅表達量高，而且易于純化，具有強效的自由基清除功能。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種抗氧化多肽VECYGPNRPQF的制備方法，該 方法操作簡便、成本低廉。
[0013] 本發(fā)明的最后一個目的是在于提供了一種畢赤酵母Pichia pastoris KM71H FZM2tll4 ωρ或抗氧化多肽VECYGPNRPQF的應用，包括制備成動物飼料添加劑或用于食物防腐 劑?？梢灾苯右援叧嘟湍窹ichia pastoris KM71H FZM2tll4 _培養(yǎng)物的形式直接添加，也可 以離心得到培養(yǎng)物上清，直接飼喂，或者冷凍干燥或者其他工藝處理（糖包被等）后添加到 飼料，以期得到較長保質期。
[0014] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術措施：
[0015] 一種表達抗氧化多肽VECYGPNRPQF的畢赤酵母工程菌Pichia pastoris KM71H fzM2ci14mp,通過以下步驟制備得到：
[0016] A、依據(jù)抗氧化多肽VECYGPNRPQF (本發(fā)明或稱A0P)的氨基酸序列，參考畢赤酵母 密碼子偏好性，設計抗氧化多肽VECYGPNRPQF對應的核苷酸序列，其編碼為SEQ ID NO. 1所 示的核苷酸序列?？紤]到下面同源重組的需要，需要在抗氧化多肽VECYGPNRPQF的兩端添 加同源臂。同源臂的設計依據(jù)質粒PPICZAa多克隆位點兩端的序列。添加同源臂后的抗 氧化多肽VECYGPNRPQF的核苷酸序列，其編碼為SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。相應的 帶有同源臂的抗氧化多肽VECYGPNRPQF的核苷酸序列由長沙中津生物科技有限公司合成。
[0017] B、表達盒PAQX1-a Factor-VECYGPNRPQF-Zeocin1的獲得：把上一步驟由公司合成 的帶同源臂的抗氧化多肽VECYGPNRPQF的核苷酸序列和畢赤酵母外分泌pPICZ Aa (購 自invitrogen公司）質粒一起電轉入大腸桿菌YZ2005中，經抗生素 Zeocin和PCR擴 增條帶大小篩選初步同源重組的正確性，并進行PCR產物序列測序最終確定，獲得質粒 pPICZA a -VECYGPNRPQF-Zeocin"，最后應用 Sac I 酶切后得到表達盒 Paqxi- a Factor-VECYG PNRPQF-Zeocinr。
[0018] C、工程菌Pichia pastoris KM71H FZM2tll4 AQP的構建：采用電穿孔法（1500V/cm)將 線性化的含有表達盒 Paqxi- a Factor-VECYGPNRPQF-Zeocin"的 pPICZ A α 質粒導入 Pichia pastoris ΚΜ71Η中。經抗生素 Zeocin和PCR擴增條帶大小篩選初步鑒定基因組上整合有 表達盒S'PAOXl-VECYGPNRPQF-Zeocin"的Pichia pastoris KM71H工程菌，并進行PCR產物 序列測序最終確定。至此，獲得了一種畢赤酵母基因工程菌Pichia pastoris KM71H FZM2tll4 AQP，該菌已于2014年11月6日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進行保藏，分類命名：Pichia pastoris KM71H FZM2ci14aqp，保藏編號為：CCTCC N0:M2014552,地址：中國武漢武漢大學。
[0019] Pichia pastoris KM71H FZM2tll4 AQP菌落大而厚，濕潤，表面光滑，不透明，乳白色， 邊緣十分圓整，容易挑起，菌落質地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一。可在固 態(tài)和液態(tài)Yro培養(yǎng)基良好生長，在液態(tài)Yro中培養(yǎng)時，若接種量大或者培養(yǎng)時間長時可以形 成明顯菌球。Pichia pastoris KM71H FZM2ci14aqp是甲醇營養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇 作為唯一碳源和能源的酵母菌，具有AOX強啟動子，基因組整合有抗氧化多肽VECYGPNRPQF 編碼基因的核苷酸序列，在甲醇誘導下可以高量分泌表達抗氧化多肽VECYGPNRPQF。P i ch i a pastoris KM71H FZM2tll4 AQP可連續(xù)高密度培養(yǎng)，用來生產抗氧化多肽VECYGPNRPQF，可廣泛 應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)、食品、保健品、水產、油脂、化妝品等行業(yè)。
[0020] 一種抗氧化多肽VECYGPNRPQF的制備方法，包括以下步驟：
[0021] A、材料與溶液配制：
[0022] 發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成成分為葡萄糖4% (m/v)、氨水150 μ UKH2PO4O. 7 % (m/v)， MgSO4. 7H20 0· 03 % (m/v)，F(xiàn)eSO4. 7H20 0· 05 % (m/v)，MnSO4. H2O 0· 05 % (m/v)，蛋白胨 0. I % (m/v), pH5. 5 ；
[0023] PTMl配方為：硫酸銅6g/L，碘化鉀0. 08g/L，一水硫酸錳3g/L，二水鉬酸鈉0. 2g/ L，硼酸0. 02g/L，氯化鋅20g/L，氯化鈷0. 5g/L，七水硫酸亞鐵65g/L，生物素0. 2g/L，硫酸 5ml/L〇
[0024] B、抗氧化多肽VECYGPNRPQF的制備：
[0025] 1)在含有 100 μ g/ml zeocin 的 YPD 平板上復蘇 Pichia pastoris KM71H FZM2014 AOP ;
[0026] 2)從復蘇平板上挑單克隆于含有Yro培養(yǎng)基中，30°C振搖培養(yǎng)17h ;
[0027] 3)將一體積培養(yǎng)17h的Pichia pastoris KM71H FZM2tll4 AQP，接種于十體積發(fā)酵培 養(yǎng)基中，30°C，260rpm，振搖培養(yǎng)4d ;期間每8h補加一次0· 15%氨水，24h補加一次0· 1 %甲 醇，0. 4%微量元素 PTMl (v/v)，培養(yǎng)四天即得。
[0028] 本發(fā)明構建高效表達抗氧化多肽VECYGPNRPQF工程菌Pichia pastoris KM71H FZM2ci14mp，分離、鑒定、制備抗氧化多肽VECYGPNRPQF的總體流程可總結為圖1。
[0029] 畢赤酵母 Pichia pastoris KM71H FZM2tll4 AQP或抗氧化多肽 VECYGPNRPQF 在作為 飼料添加劑中的應用，包括：
[0030] A、直接以培養(yǎng)物的形式直接添加，進行豬料、反芻料以及魚蝦蟹等水產養(yǎng)殖飼料 中的應用，應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)以及水產等行業(yè)。因為酵母pichia pasteris早已收入中國 藥典，是國內外公認的可供藥用，食用的酵母菌種；
[0031] B、通過離心得到培養(yǎng)物上清，直接飼喂，或者冷凍干燥或者其他工藝處理（糖包 被等）后添加到飼料，以期得到較長保質期；
[0032] C、利用生產級液相或者其他的分離方法，分離純化出抗氧化多肽VECYGPNRPQF，應 用于食品、保健品、化妝品等行業(yè)。
[0033] 本發(fā)明提供的高效表達抗氧化肽VECYGPNRPQF工程菌Pichia pastoris KM71H FZM2tll4 ωρ及表達抗氧化多肽VECYGPNRPQF的制備方法，可在經濟，溫和的條件下，大量制備 抗氧化多肽VECYGPNRPQF。該抗氧化多肽能有效清除各種自由基，緩解氧化應激，并且無藥 物殘留，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)有很大的應用潛力，也可推廣應用于食品、保健品、水產、油脂、化妝 品等彳丁業(yè)。
[0034] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果：
[0035] 本基因工程技術生產抗氧化多肽VECYGPNRPQF，所生產的抗氧化多肽 VECYGPNRPQF不僅表達量高，還具有高效清除自由基的生物學活性，而且同現(xiàn)有其它基因工 程技術生產抗氧化多肽VECYGPNRPQF相比具備以下特點：
[0036] 1、本發(fā)明生產的抗氧化多肽VECYGPNRPQF屬于天然多肽，不會同常規(guī)抗氧化劑一 樣具有潛在的毒性。
[0037] 2、采用安全、高效、無殘留的食品級真核表達系統(tǒng)畢赤酵母表達系統(tǒng)，可高效表達 安全、環(huán)保、高效表達來自于安全的被長期食用的天然藻類的抗氧化肽VECYGPNRPQF，該抗 氧化多肽具有很強的抗氧化功能，可有效清除自由基。
[0038] 3、將質粒整合入工程菌基因組，遺傳更穩(wěn)定，并且使得構建過程更快速、準確和簡 便。
[0039] 4、在分子水平操作過程中沒有多余的分子修飾和標簽添加，表達的產品抗氧化肽 和天然抗氧化肽VECYGPNRPQF結構、大小完全相同，不存在基因安全性問題。
[0040] 5、表達量比較高，并且容易純化。
[0041] 6、發(fā)酵使用的培養(yǎng)基比較廉價，純化也相對簡單，使得蛋白的生產成本大幅度降 低。
[0042] 7、表達抗氧化多肽VECYGPNRPQF用到的材料，裝置易得，產量大，生產成本比較 低，能有效清除動物體內自由基，緩解氧化應激，并且無藥物殘留，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)有很大的 應用潛力，也可推廣應用于食品、保健品、水產、油脂、化妝品等行業(yè)。另外因為表達的多肽 可經由攝食攝入，所以本發(fā)明生產方法獲得的抗氧化多肽VECYGPNRPQF在畜禽飼料中的應 用操作步驟簡單。既可以直接以培養(yǎng)物的形式直接添加，因為酵母Pichia pasteris早已 收入中國藥典，是國內外公認的可供藥用，食用的酵母菌種；也可以離心得到培養(yǎng)物上清， 直接飼喂，或者冷凍干燥或者其他工藝處理（糖包被等）后添加到飼料，以期得到較長保質 期。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043] 圖1為一種高效表達抗氧化多肽VECYGPNRPQF畢赤酵母工程菌構建全過程示意 圖。
[0044] 圖2本發(fā)明產生的抗氧化多肽VECYGPNRPQF和其他抗氧化劑對兩種自由基的清除 效果對比示意圖。
[0045] 其中圖 2 中 A: ABTS, B: DPPH。
[0046] 圖3為日糧添加0. 03%含量的三種抗氧化劑對斷奶仔豬血漿中丙二醛和活性氧 濃度的影響示意圖。
[0047] 圖4為30°C下本發(fā)明產生的抗氧化多肽VECYGPNRPQF和其他抗氧化劑對核桃油抗 氧化作用的影響示意圖。

【具體實施方式】
[0048] 實施例1 :
[0049] 一種表達抗氧化多肽VECYGPNRPQF的畢赤酵母工程菌Pichia pastoris KM71H FZM2tll4 ωρ的構建，包括以下步驟：
[0050] 1 材料：
[0051] I. 1菌種和載體
[0052] 菌種及載體基因型和來源見表1。
[0053] 表1菌種及載體基因型和來源
[0054]

【權利要求】
1. 一種畢赤酵母工程菌，其特征在于：pastoris KM71H FZM2(I14 AQP，CCTCC NO: M 2014552。
2. 權利要求1所述的工程菌在制備抗氧化多肽VECYGPNRPQF中的應用。
3. 權利要求1所述的工程菌在制備動物飼料添加劑中的應用。
4. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的動物為仔豬。
5. 權利要求1所述的工程菌在制備食品防腐劑中的應用。
【文檔編號】C12R1/84GK104498377SQ201510015888
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月13日 優(yōu)先權日:2015年1月13日
【發(fā)明者】馮澤猛, 李鐵軍, 印遇龍 申請人:中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所