專(zhuān)利名稱(chēng)：用畢赤酵母pGAP調(diào)控表達(dá)漆酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種應(yīng)用畢赤酵母的PGAP啟動(dòng)子調(diào)控生產(chǎn)生物蛋白的方法，具體是一種應(yīng)用畢赤酵母的PGAP調(diào)控表達(dá)漆酶的方法。
背景技術(shù)：
漆酶(laccase，EC 1. 10. 3. 2)廣泛地存在于自然界中，因最初發(fā)現(xiàn)于漆樹(shù)的樹(shù)脂而得名。從植物和一些微生物中能分離到漆酶。漆酶有多種工業(yè)用途。漆酶能除去酚類(lèi)物質(zhì)而應(yīng)用于污水處理和作為食品添加劑等；漆酶具有分解木質(zhì)素的作用而應(yīng)于紙漿、造紙工業(yè)和纖維素乙醇工業(yè)。雖然從植物中能分離到漆酶，但是工藝煩瑣，成本高；多種微生物具有產(chǎn)生漆酶的功能，但是，由于或是天然的產(chǎn)漆酶菌株的生長(zhǎng)緩慢，營(yíng)養(yǎng)要求較高，或是產(chǎn)物在胞內(nèi)形成包涵體(細(xì)菌菌株)不利于目標(biāo)蛋白的純化，生產(chǎn)成本較高。畢赤酵母 (Pichiapastoris)是最近迅速發(fā)展的一種真核表達(dá)宿主，營(yíng)養(yǎng)要求不高，適合于高密度發(fā)酵的大規(guī)模生產(chǎn)方式，由于Pichia pastoris分泌自身的蛋白很少，有利于表達(dá)產(chǎn)物的純化。pGAP (三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子)是Pichia pastoris的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，與Pichia pastoris的pAOXl (醇氧化酶1啟動(dòng)子)相比其優(yōu)越性主要是不需要有毒性的甲醇作為碳源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決應(yīng)用天然植物或天然的產(chǎn)漆酶的菌株生產(chǎn)漆酶的成本較高、產(chǎn)物難于純化的問(wèn)題，而提供一種應(yīng)用畢赤酵母的PGAP (三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子) 調(diào)控表漆酶的方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種用畢赤酵母pGAP調(diào)控表達(dá)漆酶的方法，其步驟是1、首先從畢赤酵母中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；2、在漆酶基因序列的3’末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控漆酶基因的由G418 抗性基因作為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體，將這一載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母基因組，并將轉(zhuǎn)化物涂布于含G418彡300 μ g/mL的G418-YPD平板上；即涂布于含G418為彡300 μ g/mL的 YPD (2%蛋白胨，yeast extract，2%葡萄糖)平板上；3、從步驟2的G418-YPD平板上再挑選畢赤酵母重組子作為工程菌株(畢赤酵母的基因組中沒(méi)有G418抗性基因，在含G418抗性的平板上不能生長(zhǎng)；由于重組子含有G418 抗性基因，所以在含G418抗性的平板上能生長(zhǎng)。也就是說(shuō)在G418抗性平板上能生長(zhǎng)的就是重組子)；4、將步驟3獲得的工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中，于觀 30°C在生物反應(yīng)器中發(fā)酵工程菌1 2d分泌表達(dá)漆酶。所述液體培養(yǎng)基是由以下組分組成85%磷酸 25 28ml/L、CaSO4 · 2Η200· 8 1. 2g/L、K2SO4 17 19g/L、MgSO4 · 7H20 13 16g/ L、K0H3. 5 4. 5g/L、碳源 15 45g/L、蛋白胨 18 22g/L、Yeast extract 8 12g/L、PTM43 5ml/L ；所述 PTM4 是由以下組分組成CuS04 · 5H20 2. Og/L、NaI · 2H20 0. lg/L、 MnSO4 · H2O 3. Og/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 2g/L、H3BO3 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 1. 05g/L、ZnCl2 7. Og/L, Fe2 (SO4) 3 · 7H20 22g/L、生物素 0. 2g/L、硫酸 lml/L。所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。本發(fā)明采用了畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達(dá)的漆酶，具有下列優(yōu)點(diǎn)1、生產(chǎn)成本低，只需使用普通的無(wú)機(jī)鹽、碳源和氮源作為發(fā)酵培養(yǎng)基。2、可在生物反應(yīng)器中發(fā)酵畢赤酵母，其細(xì)胞能生長(zhǎng)至細(xì)胞密度達(dá)200A以上，能以足夠多的細(xì)胞數(shù)量表達(dá)漆酶，有利于漆酶的大規(guī)模生產(chǎn)。3、發(fā)酵周期短，整個(gè)發(fā)酵周期只需1 2d。4、使用無(wú)毒性的碳源，不需要使用有毒性的甲醇作為碳源。5、由于pGAP是畢赤酵母的強(qiáng)啟動(dòng)子，由pGAP調(diào)控表達(dá)的L漆酶約占總分泌蛋白的比例較高，并且由于在漆酶的C端融合了 His6標(biāo)簽，有利于產(chǎn)物的純化。
具體實(shí)施例方式下面才用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例一1、首先從Pichia pastoris中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；2、在漆酶基因序列的3’末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控漆酶基因的由G418 抗性基因作為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體，將這一載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母基因組，并將轉(zhuǎn)化物涂布于含G418彡300 μ g/mL的G418-YPD平板上。3、從步驟2的G418-YPD平板上再挑選畢赤酵母重組子作為工程菌株；
4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，甘油 40g，蛋白胨 20g, Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml] (PTM4 配方(每升)=CuSO4 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)漆酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度^ 30°C，pH5.0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900r/min。發(fā)酵1 2d后離心收獲上清，用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化漆酶，通過(guò)蛋白電泳(在 SDS-PAGE上呈現(xiàn)純化的目標(biāo)蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(純化的目標(biāo)蛋白能夠催化愈創(chuàng)木酚生成醌類(lèi)物質(zhì))對(duì)表達(dá)的漆酶進(jìn)行鑒定。分泌于發(fā)酵液中的漆酶占 Pichia pastoris總的分泌蛋白的7%以上。實(shí)施例二步驟1、2、3同實(shí)施例一。4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升):85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，油酸 20g，蛋白胨 20g, Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml] (PTM4 配方(每升)=CuSO4 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)漆酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度^ 30°C，pH5.0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900r/min。發(fā)酵1 2d后
4離心收獲上清用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化漆酶，通過(guò)蛋白電泳(在 SDS-PAGE上呈現(xiàn)純化的目標(biāo)蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(純化的目標(biāo)蛋白能夠催化愈創(chuàng)木酚生成醌類(lèi)物質(zhì))對(duì)表達(dá)的漆酶進(jìn)行鑒定。分泌于發(fā)酵液中的漆酶占 Pichia pastoris總的分泌蛋白的8%以上。實(shí)施例三步驟1、2、3同實(shí)施例一。4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升):85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g,山梨醇 35g，蛋白胨 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)漆酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度^ 30°C，pH5.0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900r/min。發(fā)酵1 2d后離心收獲上清用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化漆酶，通過(guò)蛋白電泳(在 SDS-PAGE上呈現(xiàn)純化的目標(biāo)蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(純化的目標(biāo)蛋白能夠催化愈創(chuàng)木酚生成醌類(lèi)物質(zhì))對(duì)表達(dá)的漆酶進(jìn)行鑒定。分泌于發(fā)酵液中的漆酶占 Pichia pastoris總的分泌蛋白的5%以上。實(shí)施例四步驟1、2、3同實(shí)施例一。4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml，CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g,葡萄糖 40g,蛋白胨 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, C0Cl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)漆酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度^ 30°C，pH5.0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900r/min。發(fā)酵1 2d后離心收獲上清用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化漆酶，通過(guò)蛋白電泳(在 SDS-PAGE上呈現(xiàn)純化的目標(biāo)蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(純化的目標(biāo)蛋白能夠催化愈創(chuàng)木酚生成醌類(lèi)物質(zhì))對(duì)表達(dá)的漆酶進(jìn)行鑒定。分泌于發(fā)酵液中的漆酶占 Pichia pastoris總的分泌蛋白的6%以上。實(shí)施例五步驟1、2、3同實(shí)施例一。4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升):85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，乳酸 30g，蛋白胨 20g, Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml] (PTM4 配方(每升)=CuSO4 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)漆酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度^ 30°C，pH5.0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900r/min。發(fā)酵1 2d后離心收獲上清用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化漆酶，通過(guò)蛋白電泳(在 SDS-PAGE上呈現(xiàn)純化的目標(biāo)蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(純化的目標(biāo)蛋白能夠催化愈創(chuàng)木酚生成醌類(lèi)物質(zhì))對(duì)表達(dá)的漆酶進(jìn)行鑒定。分泌于發(fā)酵液中的漆酶占Pichia pastoris總的分泌蛋白的5%以上。
權(quán)利要求
1.一種用畢赤酵母PGAP調(diào)控表達(dá)漆酶的方法，其特征在于，其步驟是1)、首先從畢赤酵母中擴(kuò)增PGAP啟動(dòng)子；2)、在漆酶基因序列的3’末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控漆酶基因的由G418抗性基因作為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體，將這一載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母基因組，并將轉(zhuǎn)化物涂布于含G418彡300 μ g/mL的G418-YPD平板上；3)從步驟幻的G418-YPD平板上再挑選畢赤酵母重組子作為工程菌株；4)、將步驟幻獲得的工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中，于觀 301在生物反應(yīng)器中發(fā)酵工程菌1 2d分泌表達(dá)漆酶；所述液體培養(yǎng)基是由以下組分組成85%磷酸25 28ml/L、CaSO4 · 2Η200· 8 1. 2g/L、K2SO4 17 19g/L、MgSO4 · 7H20 13 16g/L、K0H3. 5 4. 5g/L、碳源 15 45g/L、蛋白胨 18 22g/L、Yeast extract 8 12g/L、PTM4 3 5ml/ L ；所述 PTM4 是由以下組分組成=CuSO4 ‘ 5H20 2. 0g/L、NaI · 2H20 0. 1 g/L,MnSO4 · H2O 3. Og/ L^Na2MoO4 ·2Η20 0. 2g/L、H3BO3O. 02g/L、CoCl2 · 6H20 1. 05g/L、ZnCl27. Og/L, Fe2 (SO4) 3 · 7H20 22g/L、生物素 0. 2g/L、硫酸 lml/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用畢赤酵母pGAP調(diào)控表達(dá)漆酶的方法，其特征在于所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用畢赤酵母pGAP調(diào)控表達(dá)漆酶的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域，首先從畢赤酵母中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；構(gòu)建由pGAP調(diào)控漆酶基因的畢赤酵母表達(dá)載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母基因組；根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株；將工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵工程菌分泌表達(dá)漆酶。本發(fā)明生產(chǎn)成本低，發(fā)酵周期短，利用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達(dá)的漆酶有利于產(chǎn)物的純化，解決應(yīng)用天然植物或天然的產(chǎn)漆酶的菌株生產(chǎn)漆酶的成本較高、產(chǎn)物難于純化的問(wèn)題，有利于漆酶的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102242084SQ20101018487
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者張?zhí)碓? 張愛(ài)聯(lián), 楊穗珊, 羅進(jìn)賢 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所