本
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
屬于生化物品的制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種納豆發(fā)酵花粉的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
花粉是植物的雄性繁殖細(xì)胞，類似于動(dòng)物的精子?；ǚ垭m小，但由它可以繁殖成新的植物體，所以稱花粉是植物的“生命之源”，它集中了整個(gè)植物體的精華，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和藥用成分，國(guó)際上譽(yù)之為完全細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)素。它不僅攜帶著生命的遺傳信息，而且包含著孕育新生命所必需的全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是植物傳宗接代的根本，含有豐富的細(xì)胞學(xué)水平的營(yíng)養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、微量元素、活性酶、黃酮類化合物、脂類、核酸、蕓苔素、植酸等，其中氨基酸含量及比例是最接近聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)推薦的氨基酸模式，這在天然食品中極其少見(jiàn)?；ǚ塾擅鄯洳杉姆Q為蜂花粉，因?yàn)樗粌H僅是花粉，還包含蜜蜂在采集過(guò)程中加入的特殊的腺體分泌物，因而具有獨(dú)特的天然保健作用與醫(yī)療及美容價(jià)值。
花粉是蜜蜂營(yíng)養(yǎng)來(lái)源的保證，蜂王漿是花粉經(jīng)蜜蜂體內(nèi)轉(zhuǎn)化后得到的“營(yíng)養(yǎng)精華的結(jié)晶”。然而，蜂王漿的產(chǎn)量是有限的，所以如何人為的將花粉轉(zhuǎn)化，使其營(yíng)養(yǎng)更加豐富并產(chǎn)生類似蜂王漿的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，長(zhǎng)期以來(lái)也一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員致力解決的問(wèn)題。微生物發(fā)酵就是利用微生物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的大量酶類(酵素)，將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的技術(shù),微生物發(fā)酵可以化腐朽為神奇,將平淡無(wú)奇的米、面、大豆轉(zhuǎn)化為酒、醋、醬等美味和營(yíng)養(yǎng)易于吸收的新物質(zhì)。人們平日生活中常見(jiàn)的酒、醋、醬、腐乳等等均是發(fā)酵產(chǎn)品?；ǚ墼诿鄯潴w內(nèi)酶類的作用下轉(zhuǎn)化為蜂王漿，以往人們就是利用不同微生物組合，產(chǎn)生所需酶類，將花粉轉(zhuǎn)化為類似蜂王漿作用的“類皇漿”。其特點(diǎn)是，1、維生素含量增加，特別是人體不能自己合成的維生素K2可以將血鈣轉(zhuǎn)化為骨鈣，預(yù)防和治療老年骨質(zhì)疏松；2、大分子蛋白降解形成大量的活性多肽，對(duì)降壓、降血糖、降血脂有幫助；3、黃酮類含量增加，降血壓、血脂、抗病毒能力增強(qiáng)；4、形成一些特有多糖，刺激免疫功能增強(qiáng)；另外它們還會(huì)產(chǎn)生一些特殊酶類，如納豆激酶，可以預(yù)防心梗，疏通和軟化血管，預(yù)防心血管疾病。因此，發(fā)酵花粉所形成的“類皇漿”不失為強(qiáng)生健體的保健圣品。
可用于發(fā)酵的菌株眾多，其中納豆芽孢桿菌是目前研究熱點(diǎn)之一。納豆在日本已經(jīng)有1000多年的歷史，其最初是利用廚房稻草上的枯草芽孢桿菌發(fā)酵黃豆制成，是素食僧侶們的重要食物營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，而后在皇室也逐漸流行起來(lái)。1996年日本掀起了全民食納豆的熱潮。日本政府在其開(kāi)展的“食育計(jì)劃”中專門將納豆作為專項(xiàng)進(jìn)行部署，即從小培養(yǎng)兒童青少年食用納豆。日本全民食用納豆不到10年，就成為了世界上公認(rèn)的第一長(zhǎng)壽大國(guó)。黃豆在納豆芽孢桿菌發(fā)酵作用下，100g的納豆中就包括不同的氨基酸(16g)，維他命B1(0.07mg)，維他命B2(0.56mg)，維他命B6(0.24mg)，纖維(6.7g)等，特別是發(fā)酵產(chǎn)生的納豆激酶具有溶栓功能，可以口服吸收清楚血栓，用于冠心病，腦血栓和動(dòng)脈硬化的治療。
目前，國(guó)家藥監(jiān)局已經(jīng)批準(zhǔn)的國(guó)產(chǎn)納豆保健食品共有14種，其功能為增強(qiáng)免疫力和輔助降血脂。日本，韓國(guó)等國(guó)家近年來(lái)也研制出了多種以納豆激酶為主要功效的產(chǎn)品，僅美國(guó)和歐洲的營(yíng)養(yǎng)品及功能性食品每年的營(yíng)銷額就達(dá)5000億美元，納豆激酶作為功能性食品和保健品的發(fā)展迅速，擁有廣闊的前景。
花粉本身雖然營(yíng)養(yǎng)豐富，但往往帶有少量異味(如腥味)，部分人群不易接受，而且花粉經(jīng)蜜蜂轉(zhuǎn)化成蜂王漿后，營(yíng)養(yǎng)更加全面和易于吸收，我們是否可以人為模擬蜜蜂，將花粉經(jīng)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化成為“類蜂皇漿”哪？本發(fā)明的目的就是消除花粉的異味，同時(shí)將花粉中營(yíng)養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化成對(duì)人體更有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和更易被人體吸收的成分。人類利用微生物發(fā)酵雖然已有上千年的歷史，但由于花粉來(lái)源有限，屬于珍惜物品，過(guò)去從未有人曾奢侈地利用花粉為原料進(jìn)行發(fā)酵。只有當(dāng)今養(yǎng)蜂規(guī)?；浠ǚ蹃?lái)源廣泛，數(shù)量有了保證，人們才陸續(xù)開(kāi)始了這方面的研究。而納豆雖是風(fēng)靡日本的食品，但只是近兩年才開(kāi)始引進(jìn)我國(guó)，在國(guó)內(nèi)納豆尚未被多數(shù)人群接受，所以迄今尚未有人考慮將花粉和納豆兩者進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合，故市場(chǎng)上目前也尚沒(méi)有這類產(chǎn)品。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題加以解決，提供一種以黃豆和花粉為原料制作納豆發(fā)酵花粉的生產(chǎn)方法，在發(fā)揮花粉原有營(yíng)養(yǎng)素的基礎(chǔ)上，結(jié)合納豆菌發(fā)酵產(chǎn)生的溶血栓的納豆激酶和促進(jìn)骨鈣吸收的維生素K2，由此賦予花粉新的功能和魅力。
為實(shí)現(xiàn)以上目的的技術(shù)解決方案如下所述。
一種納豆發(fā)酵花粉的生產(chǎn)方法，其特征在于以黃豆為營(yíng)養(yǎng)原料對(duì)納豆芽孢桿菌進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并以此培養(yǎng)物為基礎(chǔ)加入花粉進(jìn)行花粉發(fā)酵，具體包括固體發(fā)酵法和液體發(fā)酵法兩種：
1)固體發(fā)酵法，包括下述步驟：
1a、納豆芽孢桿菌培養(yǎng)液(納豆菌液)的制備——分別選取多個(gè)品牌的納豆原料，對(duì)各品牌納豆原料分別用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板分離純化得到相應(yīng)的多種納豆菌株，用纖維蛋白平板法分別測(cè)定各納豆菌株產(chǎn)生納豆激酶的能力，選出產(chǎn)納豆激酶能力最強(qiáng)的個(gè)體，-70℃冰箱保存菌種，作為生產(chǎn)菌種；將生產(chǎn)菌種接種于LB液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，35℃～40℃，每分鐘150～200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)16～24小時(shí)過(guò)夜，獲得納豆芽孢桿菌種培養(yǎng)液；
1b、將黃豆用水浸泡12～24小時(shí)過(guò)夜，115℃～130℃高壓滅菌20～30分鐘，以高壓后黃豆軟糯為準(zhǔn)，冷卻至40℃；
1c、在高壓后軟糯黃豆上按2％～10％的質(zhì)量比例接入液體培養(yǎng)過(guò)夜的納豆芽孢桿菌，攪拌均勻后，培養(yǎng)8～24小時(shí)，培養(yǎng)溫度為20℃～40℃，至黃豆表面生長(zhǎng)有灰白色菌膜；
1d、將花粉隔水蒸30分鐘，冷卻至室溫，然后將冷卻后的花粉與表面生長(zhǎng)有灰白色菌膜的黃豆按1:1～10的質(zhì)量比例拌和，繼續(xù)發(fā)酵24～48小時(shí)；
1e、收集發(fā)酵的黃豆和花粉的混合物，真空冰凍干燥36～48小時(shí)，真空要求≤10Pa，真空冰凍干燥起始溫度為-30～-50℃，真空冰凍干燥12小時(shí)后，每小時(shí)升溫5℃，溫度升至25℃后維持至完全干透為止，獲得干燥菌體；
1f、用冷循環(huán)粉碎機(jī)將干燥菌體粉碎成50～100目的細(xì)粉，包裝，制得產(chǎn)品；
2)液體發(fā)酵法，包括下述步驟：
2a、納豆芽孢桿菌培養(yǎng)液(納豆菌液)的制備——分別選取多個(gè)品牌的納豆原料，對(duì)各品牌納豆原料分別用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板分離純化得到相應(yīng)的多種納豆菌株，用纖維蛋白平板法分別測(cè)定各納豆菌株產(chǎn)生納豆激酶的能力，選出產(chǎn)納豆激酶能力最強(qiáng)的個(gè)體，-70℃冰箱保存菌種，作為生產(chǎn)菌種；將生產(chǎn)菌種接種于LB液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，35℃～40℃，每分鐘150～200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)16～24小時(shí)過(guò)夜，獲得納豆芽孢桿菌種培養(yǎng)液；
2b、將黃豆與水按1:2～5的質(zhì)量比例浸泡16～24小時(shí)，浸泡液勻漿或磨漿，以總質(zhì)量的1％～5％添加甘油或葡萄糖或麥麩，115℃～130℃高壓滅菌20～30分鐘，冷卻至40℃；
2c、在高壓后黃豆?jié){液中按2％～5％的質(zhì)量比例接入液體培養(yǎng)過(guò)夜的納豆芽孢桿菌，通入無(wú)菌空氣，溶氧量大于10％，以100～200轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枰后w至均勻后，培養(yǎng)6～12小時(shí)，培養(yǎng)溫度為30℃～42℃；
2d、將花粉置于水中以100℃煮沸15～25分鐘，將花粉煮液加到上述已培養(yǎng)6～12小時(shí)的黃豆?jié){液中，至花粉煮液占總液體量的10％～60％，繼續(xù)發(fā)酵24小時(shí)；
2e、收集發(fā)酵液，真空冰凍干燥36～48小時(shí)，真空要求≤10Pa，真空冰凍干燥起始溫度為-30～-50℃，真空冰凍干燥12小時(shí)后，每小時(shí)升溫5℃，溫度升至25℃后維持至完全干透為止，獲得干燥菌體；
2f、用冷循環(huán)粉碎機(jī)將干燥菌體粉碎成50～100目的細(xì)粉，包裝，制得產(chǎn)品。
上述納豆發(fā)酵花粉的生產(chǎn)方法中，步驟1a和步驟2a中所選取的納豆原料為日本產(chǎn)的“納豆生活”牌納豆、“山大美味”牌的納豆和極小粒納豆、中國(guó)北京產(chǎn)的“日本風(fēng)味燕京”牌納豆。
上述納豆發(fā)酵花粉的生產(chǎn)方法中，所述的花粉為油菜花粉、松花粉、茶花粉、棗花粉、蕎麥花粉、玉米花粉、荷花花粉、黨參花粉、益母草花粉、虞美人花粉、芝麻花粉、蒲公英花粉、菊花花粉、板栗花粉、五味子花粉、葵花蜂花粉、桃花花粉、哈密瓜花粉、洋槐花粉、山楂花花粉、野玫瑰花粉中的一種或多種組合。
上述納豆發(fā)酵花粉的生產(chǎn)方法中，發(fā)酵產(chǎn)物的真空冰凍干燥采用真空冰凍干燥機(jī)進(jìn)行，真空冰凍干燥的起始溫度為-50℃，抽真空達(dá)到真空度后，逐漸升溫至20℃～35℃后維持至干透為止。
上述納豆發(fā)酵花粉的生產(chǎn)方法中，步驟1b和步驟2b中所用的最佳高壓滅菌溫度為121℃。
上述納豆發(fā)酵花粉的生產(chǎn)方法中，納豆芽孢桿菌是指生產(chǎn)納豆所用菌種，在微生物學(xué)細(xì)菌學(xué)分類中屬于的枯草芽孢桿菌種中的納豆芽孢桿菌亞種，簡(jiǎn)稱納豆芽孢桿菌。
上述納豆發(fā)酵花粉的生產(chǎn)方法中，所稱的發(fā)酵指使用傳統(tǒng)的固體發(fā)酵或發(fā)酵罐液體發(fā)酵，具體包括純花粉發(fā)酵或添加利于納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)的添加物的發(fā)酵，其中所述的添加物包括黃豆、葡萄糖、甘油、麥粉、麩皮中一種或數(shù)種配合使用。
本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中，激酶活性能力的測(cè)定方法比較多，如纖維蛋白平板法、四肽底物法、血清板法等，本發(fā)明步驟1a和步驟2a中采用纖維蛋白平板法，即配制人工血栓平板，把納豆激酶的樣品點(diǎn)樣于平板上，其出現(xiàn)的溶解圈的面積與納豆激酶的溶纖維活性成正比。具體測(cè)定方法包括以下步驟：
A)配制纖維蛋白平板---先將0.20g牛纖維蛋白原與20ml的Tris-HlC緩沖液混合，50℃水浴20min，制成纖維蛋白原溶液備用；然后將0.3g的1.5％的瓊脂與20ml的Tris-HlC緩沖液混合，沸騰后冷卻至快要凝固，制成凝血酶(20U/ml)；把已準(zhǔn)備好的纖維蛋白原溶液與凝血酶混合；每個(gè)平板倒20ml的混合溶液，待冷卻后，分布均勻打6個(gè)孔(可分別用于四個(gè)納豆品牌、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的納豆激酶測(cè)定；或不同條件發(fā)酵花粉的納豆激酶測(cè)定)，備用；
B)待檢測(cè)樣品懸液配制---分別稱取不同品牌的納豆、發(fā)酵花粉各1克，分別用0.05mol/l的10ml Tris-HlC緩沖液配成樣品懸液，備用；
C)活性測(cè)定和結(jié)果觀察---纖維蛋白平板上不同孔分別加入不同品牌的納豆或發(fā)酵花粉樣品懸液，用納豆激酶純品做陽(yáng)性對(duì)照，0.05mol/l的10ml Tris-HlC緩沖液作為陰性對(duì)照。37℃培養(yǎng)箱靜置過(guò)夜，觀察結(jié)果；出現(xiàn)透明圈為陽(yáng)性結(jié)果，測(cè)量透明圈直徑，透明圈直徑越大，納豆激酶活性越高；
D)納豆激酶的定量計(jì)算---用不同酶活單位的標(biāo)準(zhǔn)納豆激酶按上述方法實(shí)驗(yàn)，測(cè)定不同酶活單位所形成的透明圈的直徑。以透明圈直徑為縱坐標(biāo)，以酶活單位為橫坐標(biāo)作圖，得到納豆激酶活性定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；依據(jù)試驗(yàn)中，不同品牌的納豆激酶、不同發(fā)酵花粉的透明圈直徑，在納豆激酶活性定量標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定相對(duì)應(yīng)的酶活性單位；
E)依據(jù)上法的檢測(cè)結(jié)果，在分離的不同納豆菌株中，選取產(chǎn)納豆激酶活性高的菌株為生產(chǎn)菌株；在不同花粉發(fā)酵條件中，同樣選取產(chǎn)生納豆激酶活性高的方法。本發(fā)明生產(chǎn)方法中，步驟1a和步驟2a中選出產(chǎn)納豆激酶能力最強(qiáng)納豆芽孢桿菌個(gè)體在發(fā)酵花粉中的活菌數(shù)不少于106CFU/克，納豆激酶活性大于800U/克。
本發(fā)明采用傳統(tǒng)的固態(tài)微生物發(fā)酵和現(xiàn)代的液體微生物發(fā)酵，以花粉和黃豆為原料，用納豆芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，將花粉大蛋白水解成利于人體吸收的小分子多肽(水解蛋白多肽)，同時(shí)產(chǎn)生納豆激酶、維生素K2、大量的維生素B類、可溶性膳食纖維和益生菌納豆芽孢桿菌活菌等。其技術(shù)含量高，改善和增強(qiáng)了黃豆及花粉的營(yíng)養(yǎng)成分，賦予黃豆及花粉新的功能和療效。經(jīng)該生產(chǎn)方法制得的納豆發(fā)酵花粉保留了花粉和黃豆中的黃酮類化合物、蕓苔素、植酸、微量元素如油菜花粉中的“硒”等，同時(shí)經(jīng)過(guò)發(fā)酵，產(chǎn)生溶解血栓的納豆激酶、治療骨質(zhì)疏松的維生素K2、大量B族維生素、膳食纖維以及大量對(duì)人體有益的益生菌，使納豆發(fā)酵花粉除了原有的保健作用外，又融入了納豆的溶栓和促進(jìn)骨鈣吸收作用，集花粉和納豆的營(yíng)養(yǎng)優(yōu)勢(shì)有機(jī)結(jié)合，將花粉轉(zhuǎn)化為“類蜂王漿”。本發(fā)明擴(kuò)展了花粉的保健范圍，除花粉原有保健作用外，對(duì)冠心病和骨質(zhì)疏松患者亦有良好的藥理作用或營(yíng)養(yǎng)功能。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種納豆發(fā)酵花粉的生產(chǎn)方法，采用固體發(fā)酵法，其生產(chǎn)步驟是：
1、、納豆芽孢桿菌培養(yǎng)液(納豆菌液)的制備——分別選取如下品牌納豆(日本進(jìn)口的“納豆生活”、日本北海道小樽市生產(chǎn)的“山大美味納豆”、“極小粒納豆”和北京生產(chǎn)的“日本風(fēng)味燕京納豆”)，用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板分離純化得到4種納豆菌株，用纖維蛋白平板法測(cè)定這四種納豆菌株產(chǎn)生納豆激酶的能力，選出產(chǎn)納豆激酶能力最強(qiáng)的個(gè)體，-70℃冰箱保存菌種，作為生產(chǎn)菌種；生產(chǎn)菌種接種于商品化的LB液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，35℃～40℃，每分鐘150～200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)16～24小時(shí)過(guò)夜，獲得納豆芽孢桿菌種培養(yǎng)液；
2、黃豆用水浸泡過(guò)夜(根據(jù)黃豆品質(zhì)不同浸泡24小時(shí)，黃豆吸水后的重量是其自身重量的2.3～2.7倍)，121℃高壓滅菌20～30分鐘(小粒黃豆可高壓20分鐘，大粒黃豆需要30分鐘，以高壓后黃豆軟糯為準(zhǔn))，冷卻至40℃；
3、在高壓后軟糯黃豆上按5％的質(zhì)量比例接入液體培養(yǎng)過(guò)夜的納豆芽孢桿菌，攪拌均勻后，培養(yǎng)24小時(shí)(黃豆表面生長(zhǎng)有灰白色菌膜)，培養(yǎng)溫度為37℃；
4、將油菜花粉隔水蒸30分鐘，冷卻至室溫，然后將冷卻后的油菜花粉與表面生長(zhǎng)有灰白色菌膜的黃豆按1:5的質(zhì)量比例拌和，繼續(xù)發(fā)酵36小時(shí)；
5、收集發(fā)酵的黃豆和油菜花粉的混合物，真空冰凍干燥48小時(shí)，真空要求≤10Pa，真空冰凍干燥起始溫度為-50℃，真空冰凍干燥12小時(shí)后，每小時(shí)升溫5℃，溫度升至25℃后維持至完全干透為止，獲得干燥菌體；
6、用冷循環(huán)粉碎機(jī)將干燥菌體粉碎成100目的細(xì)粉，包裝，制得產(chǎn)品。
表1.黃豆與油菜花粉按不同比例混合培養(yǎng)，不同溫度培養(yǎng)，完成發(fā)酵所需時(shí)間(以產(chǎn)生納豆菌特有的黏絲為標(biāo)準(zhǔn)，表中第2排數(shù)字為溫度，第3至6排數(shù)字為產(chǎn)生黏絲的時(shí)間，單位為小時(shí))
表2.真空冰凍干燥從-50℃起，逐漸升至不同平衡溫度下，干燥所需時(shí)間(小時(shí))
從表1可以看出，不同比例黃豆和油菜花粉混合，在20～45℃均可以很好生長(zhǎng)，其中37～45℃時(shí)，生長(zhǎng)速度更快。從表2可看出，真空冰凍干燥的平衡溫度越高，干燥時(shí)間越短，但考慮保留納豆激酶活性的需求，平衡溫度控制在30℃以內(nèi)為佳。
實(shí)施例2
一種納豆發(fā)酵花粉的生產(chǎn)方法，采用固體發(fā)酵法，其生產(chǎn)步驟是：
1、納豆芽孢桿菌培養(yǎng)液(納豆菌液)的制備——分別選不同品牌的日本納豆，用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板分離純化得到不同納豆菌株，用纖維蛋白平板法測(cè)定不同納豆桿菌株產(chǎn)生納豆激酶的能力，選出產(chǎn)納豆激酶能力最強(qiáng)的個(gè)體，-70℃冰箱保存菌種，作為生產(chǎn)菌種。生產(chǎn)菌種接種液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，35℃，每分鐘150轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)16小時(shí)，獲得納豆芽孢桿菌種培養(yǎng)液；
2、黃豆用水浸泡過(guò)夜(根據(jù)黃豆品質(zhì)不同浸泡12～24小時(shí)，黃豆吸水后的重量是其自身重量的2.3～2.7倍)，121℃高壓滅菌20～30分鐘(小粒黃豆可高壓20分鐘，大粒黃豆需要30分鐘，以高壓后黃豆軟糯為準(zhǔn))，冷卻至40℃；
3、在高壓后軟糯黃豆上按8％的質(zhì)量比例接入液體培養(yǎng)過(guò)夜的納豆芽孢桿菌，攪拌均勻后，培養(yǎng)16小時(shí)(黃豆表面生長(zhǎng)有灰白色菌膜)，培養(yǎng)溫度為37℃；
4、將松花粉隔水蒸30分鐘，冷卻至室溫，然后將冷卻后的松花粉與表面生長(zhǎng)有灰白色菌膜的黃豆按1:5的質(zhì)量比例拌和，繼續(xù)發(fā)酵36小時(shí)；
5、收集發(fā)酵的黃豆和油菜花粉的混合物，真空冰凍干燥48小時(shí)，真空要求≤10Pa，真空冰凍干燥起始溫度為-50℃，真空冰凍干燥12小時(shí)后，每小時(shí)升溫5℃，溫度升至25℃后維持至完全干透為止，獲得干燥菌體；
6、用冷循環(huán)粉碎機(jī)將干燥菌體粉碎成50目的細(xì)粉，包裝，制得產(chǎn)品。
表3.黃豆與松花粉按不同比例混合培養(yǎng)，不同溫度培養(yǎng)，完成發(fā)酵所需時(shí)間(以產(chǎn)生納豆菌特有的黏絲為標(biāo)準(zhǔn)，表中第2排數(shù)字為溫度，第3至6排數(shù)字為產(chǎn)生黏絲的時(shí)間，單位為小時(shí))
表4.真空冰凍干燥從-50℃起，逐漸升至不同平衡溫度下，干燥所需時(shí)間(小時(shí))
從表3可以看出，不同比例黃豆和松花粉混合，在20～45℃均可以很好生長(zhǎng)，其中37～45℃時(shí)，生長(zhǎng)速度更快。從表4可看出，真空冰凍干燥的平衡溫度越高，干燥時(shí)間越短，但考慮保留納豆激酶活性的需求，平衡溫度控制在30℃以內(nèi)為佳。
實(shí)施例3
一種納豆發(fā)酵花粉的生產(chǎn)方法，采用液體發(fā)酵法，其生產(chǎn)步驟是：
1、納豆芽孢桿菌培養(yǎng)液(納豆菌液)的制備——分別選不同品牌的日本納豆，用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板分離純化得到不同納豆菌株，用纖維蛋白平板法測(cè)定不同納豆桿菌株產(chǎn)生納豆激酶的能力，選出產(chǎn)納豆激酶能力最強(qiáng)的個(gè)體，-70℃冰箱保存菌種，作為生產(chǎn)菌種。生產(chǎn)菌種接種液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，40℃，每分鐘200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)24小時(shí)，獲得納豆芽孢桿菌種培養(yǎng)液；
2、將黃豆與水按1:3的質(zhì)量比例浸泡24小時(shí)，浸泡液勻漿或磨漿,以總質(zhì)量的3％添加甘油,121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻至40℃；
3、在高壓后黃豆?jié){液中按5％的質(zhì)量比例接入液體培養(yǎng)過(guò)夜的納豆芽孢桿菌，通入無(wú)菌空氣，溶氧值大于10％，以150轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枰后w，培養(yǎng)10小時(shí)，培養(yǎng)溫度為37℃；
4、將油菜花粉置于水中以100℃燒煮20分鐘，將油菜花粉煮液加到上述已培養(yǎng)10小時(shí)的黃豆?jié){液中，至油菜花粉煮液占總液體量的20％～60％，繼續(xù)發(fā)酵24小時(shí)；
5、收集發(fā)酵液，真空冰凍干燥48小時(shí)，真空要求≤10Pa，真空冰凍干燥起始溫度為-30℃，真空冰凍干燥12小時(shí)后，每小時(shí)升溫5℃，溫度升至25℃后維持至完全干透為止，獲得干燥菌體；
6、用冷循環(huán)粉碎機(jī)將干燥菌體粉碎成50-100目的細(xì)粉，包裝，制得產(chǎn)品。
表5.黃豆與油菜花粉按不同比例混合培養(yǎng)，不同溫度培養(yǎng)，完成發(fā)酵所需時(shí)間(以產(chǎn)生納豆菌特有的黏絲為標(biāo)準(zhǔn)，表中第2排數(shù)字為溫度，第3至6排數(shù)字為產(chǎn)生黏絲的時(shí)間，單位為小時(shí))
液體培養(yǎng)結(jié)果與固體法類似，但更容易批量化和自動(dòng)化，但含水量大，冰凍干燥的壓力也大。