本發(fā)明涉及高等真菌的生物發(fā)酵和保健食品加工，主要涉及黑脈羊肚菌菌絲體多糖和尖頂羊肚菌多糖復(fù)方顆粒劑，屬于食品與保健食品領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

動(dòng)物、植物和真菌中的多糖往往具有某些特殊功能，是現(xiàn)代功能食品研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。其中，真菌多糖的功效尤其顯著，例如眾所周知的香菇多糖。真菌多糖的來源一個(gè)是有子實(shí)體提取，這會(huì)消耗大量的食用菌，另一個(gè)較好的方法是由菌絲體提取，這樣較為經(jīng)濟(jì)高效，但不是每一種食用菌都能夠培養(yǎng)其菌絲體。

羊肚菌是一種野生名貴食藥用真菌，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、多糖、維生素、氨基酸和多種礦物質(zhì)以及豐富的脂肪酸，風(fēng)味鮮美，深受人們的喜愛。有研究報(bào)道，羊肚菌有降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞、抗輻射、抗腫瘤等作用。由于受羊肚菌栽培技術(shù)的限制，羊肚菌野生資源有限，使得羊肚菌價(jià)格居高不下。有研究表明，液體發(fā)酵培養(yǎng)的羊肚菌菌絲體營(yíng)養(yǎng)成分與子實(shí)體相似，于是，可以通過液體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)菌絲體做成不同羊肚菌產(chǎn)品來滿足人們對(duì)羊肚菌保健功效的渴求。

羊肚菌多糖具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、增強(qiáng)機(jī)體功能等生物活性，因此，從羊肚菌中提取多糖受到學(xué)者們關(guān)注。常規(guī)方法是以溶劑提取多糖居多，該法提取的多糖會(huì)有溶劑殘留現(xiàn)象，從而影響多糖質(zhì)量與食用安全。

顆粒劑是一種產(chǎn)品的物理形態(tài)，一些食品、保健食品和藥品的生產(chǎn)常常采用顆粒劑的表現(xiàn)形式。在生產(chǎn)技術(shù)上，通常將各種物料混合，拌合成半干物料，加入到搖擺式擠壓造粒機(jī)中擠壓造粒，再將濕顆粒干燥而成。該方法所得產(chǎn)品顆粒緊密，加水溶解時(shí)較為難溶，原料中含有多糖或蛋白質(zhì)等大分子膠體物質(zhì)時(shí)更難溶解。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)缺陷而提供一種能夠大規(guī)模地進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，并且能夠以較低成本生產(chǎn)出效用較高的羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑；本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)利用液體發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)的黑肚羊肚菌和尖頂羊肚菌菌絲體均生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)量高，若將兩種羊肚菌多糖進(jìn)行組合配比可以更好地發(fā)揮兩者菌多糖的生理活性。用膠體磨勻漿方法來提高菌絲體多糖的溶出率，解決了溶劑提取多糖溶劑殘留問題，同時(shí)，充分利用菌絲體中其他的營(yíng)養(yǎng)成分，生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)豐富的顆粒劑；在生產(chǎn)技術(shù)上，利用真空對(duì)漿料實(shí)現(xiàn)拉比容操作，所得顆粒內(nèi)部產(chǎn)生許多孔隙，比容減小，溶解時(shí)有利于水分快速滲透以促進(jìn)溶解，方便食用。

本發(fā)明復(fù)方羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑由以下重量份的組成物制得：黑脈羊肚菌多糖液2-5份、尖頂羊肚菌多糖液3-6份、糊精3-5份、低聚果糖2-4份；在生產(chǎn)技術(shù)上，利用真空對(duì)漿料進(jìn)行拉比容操作干燥，所得顆粒內(nèi)部產(chǎn)生許多孔隙，比容減小，溶解時(shí)有利于水分快速滲透以促進(jìn)溶解，方便食用。

其中黑脈羊肚菌多糖液和尖頂羊肚菌多糖液通過將黑脈羊肚菌菌種和尖頂羊肚菌菌種分別活化，經(jīng)液體深層發(fā)酵得菌絲體；菌絲體經(jīng)洗滌、膠體磨勻漿而制得。

本發(fā)明是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的：

（1）配制液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基：麥麩30g/l-50g/l、可溶性淀粉15g/l-25g/l、黃豆粉8g/l-12g/l、蔗糖8g/l-12g/l，其中麥麩用一定量的蒸餾水熬煮，過濾得麥麩汁，在麥麩汁中加入可溶性淀粉、黃豆粉、蔗糖，混合，補(bǔ)足水量，攪拌均勻，分裝，250ml錐形瓶裝液量160ml，121℃滅菌30min；

（2）菌種活化：將保藏的黑脈羊肚菌菌種和尖頂羊肚菌菌種分別接種于pda培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5d，備用；

（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將活化后的菌種接種于液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵溫度21℃-29℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速150r/min-180r/min下培養(yǎng)4d-12d；

（4）發(fā)酵液處理：取步驟（3）得到的發(fā)酵液，用兩層紗布過濾，菌絲體用蒸餾水反復(fù)洗滌3-5次，菌絲體用膠體磨勻漿，得菌絲體漿，即為黑脈羊肚菌多糖液和尖頂羊肚菌多糖液；

（5）羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑的制備：按重量份計(jì)，取黑脈羊肚菌多糖液2-5份、尖頂羊肚菌多糖液3-6份、糊精3-5份、低聚果糖2-4份，混合得漿料，將漿料混勻并加熱至80-90℃保持3-5分鐘殺菌，冷卻至常溫，充分?jǐn)嚢杌烊肟諝?，裝盤，放入真空干燥箱中于55-65℃抽真空4-6分鐘，使其產(chǎn)生氣泡并蒸發(fā)部分水分，提高漿料粘度，解除真空，再次對(duì)漿料進(jìn)行攪拌混入空氣，然后放入干燥箱中于55-65℃進(jìn)行真空干燥，漿料再次膨脹形成內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)并完成干燥，干燥后粉碎、包裝，即得復(fù)方羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑產(chǎn)品。

本發(fā)明中黑脈羊肚菌菌種和尖頂羊肚菌菌種為常規(guī)市售菌種。

本發(fā)明的有益效果是：

（1）采用本發(fā)明方法，使羊肚菌菌絲體多糖產(chǎn)品可以工業(yè)化生產(chǎn)，開發(fā)和提升了羊肚菌菌絲體的利用價(jià)值；

（2）采用膠體磨勻漿，菌絲體細(xì)胞內(nèi)多糖充分釋放出來，生物學(xué)功效更顯著；

（3）本發(fā)明的研究表明，尖頂羊肚菌和黑脈羊肚菌的菌絲體人工培養(yǎng)生物量（產(chǎn)量）高于其他種的羊肚菌，因此具有工業(yè)化開發(fā)價(jià)值；

（4）將兩種羊肚菌組合，使得多糖產(chǎn)品中多糖成分更多，含量更高，功效更好；本發(fā)明的研究證明：尖頂羊肚菌菌絲體中含有不同分子量的多糖，采用凝膠過濾法測(cè)定其中含量較高的兩種純多糖pa-1和pa-2的分子量，pa-1分子量為24.38kd、pa-2分子量為87.03kd；黑麥羊肚菌菌絲體中分離出含量較高的兩種多糖pb-1和pb-2，采用凝膠過濾法測(cè)定pb-1分子量為13.00kd、pb-2分子量為39.54kd；同時(shí)進(jìn)一步測(cè)定了pa-1和pa-2、pb-1和pb-2四種純多糖的單糖組成；測(cè)定結(jié)果表明：pa-1中含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木聚糖、阿拉伯糖、巖藻糖等6種單糖，pa-2含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖等7種單糖，pb-1和pb-2都含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖這五種單糖；

（5）多糖產(chǎn)品中，不但含有多種成分的羊肚菌多糖，還含有蛋白質(zhì)和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分，是一種具有保健功能的營(yíng)養(yǎng)食品；

（6）利用真空對(duì)漿料進(jìn)行拉比容操作，所得顆粒內(nèi)部產(chǎn)生許多孔隙，比容減小，溶解時(shí)有利于水分快速滲透以促進(jìn)溶解，方便食用；

本發(fā)明復(fù)方羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑產(chǎn)品，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞等生物活性；因含有蛋白質(zhì)、氨基酸等其他物質(zhì)，豐富了顆粒劑的營(yíng)養(yǎng)，是一種營(yíng)養(yǎng)保健食品。

附圖說明

圖1是尖頂羊肚菌中多糖pa-1的hplc測(cè)定圖譜；

圖2是尖頂羊肚菌中多糖pa-2的hplc測(cè)定圖譜；

圖3是黑脈羊肚菌中多糖pb-1的hplc測(cè)定圖譜；

圖4是黑脈羊肚菌中多糖pb-2的hplc測(cè)定圖譜。

具體實(shí)施方式

下面給出本發(fā)明具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于所述內(nèi)容。

實(shí)施例1：本復(fù)方羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑由以下組成物制得：黑脈羊肚菌多糖液2g、尖頂羊肚菌多糖液3g、糊精3g、低聚果糖2g。

（1）配制液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基：麥麩30g、可溶性淀粉15g，黃豆粉8g、蔗糖8g；其中30g麥麩用500ml的蒸餾水熬煮，過濾得麥麩汁，在麥麩汁中加入可溶性淀粉、黃豆粉、蔗糖，混合，補(bǔ)足水量至1000ml，攪拌均勻，分裝，250ml錐形瓶裝液量160ml，121℃滅菌30min；

（2）菌種活化：將保藏的黑脈羊肚菌菌種和尖頂羊肚菌菌種分別接種于pda培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，備用；

（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將活化后的兩個(gè)菌種分別接種于液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中黑脈羊肚菌的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度23℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)8d，ph7；尖頂羊肚菌的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度23℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)12d，ph9；

（4）發(fā)酵液處理：取步驟(3)得到的發(fā)酵液，用兩層紗布過濾，菌絲體用蒸餾水反復(fù)洗滌3次，菌絲體用膠體磨勻漿，得菌絲體多糖液；

（5）復(fù)方羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑的制備：取黑脈羊肚菌多糖液2g、尖頂羊肚菌多糖液3g、糊精3g、低聚果糖2g，混合均勻并加熱至80℃保持3分鐘殺菌，冷卻至常溫，充分?jǐn)嚢杌烊肟諝?，裝盤，放入真空干燥箱中于60℃抽真空5分鐘，使其產(chǎn)生氣泡并蒸發(fā)部分水分，提高料漿粘度，解除真空，再次對(duì)漿料進(jìn)行攪拌混入空氣，然后放入干燥箱中于60℃進(jìn)行真空干燥，料漿再次膨脹形成內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)并完成干燥，干燥后粉碎、包裝即得復(fù)方羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑產(chǎn)品。經(jīng)測(cè)定，每100g該產(chǎn)品含有的多糖量為227mg。

實(shí)施例2：本復(fù)方羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑由以下組成物制得：黑脈羊肚菌多糖液5g、尖頂羊肚菌多糖液4g、糊精5g、低聚果糖3g。

（1）配制液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基：麥麩40g，可溶性淀粉20g，黃豆粉10g，蔗糖10g；其中稱量后的40g麥麩用500ml蒸餾水熬煮，過濾得麥麩汁，在麥麩汁中加入可溶性淀粉、黃豆粉、蔗糖，混合，補(bǔ)足水量至1000ml，攪拌均勻，分裝，250ml錐形瓶裝液量160ml，121℃滅菌30min；

（2）菌種活化：將保藏的黑脈羊肚菌菌種和尖頂羊肚菌菌種分別接種于pda培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，備用；

（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將活化后的菌種接種于液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中黑脈羊肚菌的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度27℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)8d，ph9；尖頂羊肚菌的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度23℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)10d，ph8；

（4）發(fā)酵液處理：取步驟(3)得到的發(fā)酵液，用兩層紗布過濾，菌絲體用蒸餾水反復(fù)洗滌4次，菌絲體用膠體磨勻漿，得菌絲體多糖液；

（5）復(fù)方羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑的制備：按重量計(jì)，取黑脈羊肚菌多糖液4g、尖頂羊肚菌多糖液4g、糊精5g、低聚果糖3g，混合均勻并加熱至85℃保持4分鐘殺菌，冷卻至常溫，充分?jǐn)嚢杌烊肟諝猓b盤，放入真空干燥箱中于55℃抽真空4分鐘，使其產(chǎn)生氣泡并蒸發(fā)部分水分，提高料漿粘度，解除真空，再次對(duì)漿料進(jìn)行攪拌混入空氣，然后放入干燥箱中于55℃進(jìn)行真空干燥，料漿再次膨脹形成內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)并完成干燥，干燥后粉碎、包裝即得復(fù)方羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑產(chǎn)品。經(jīng)測(cè)定，每100g該產(chǎn)品含有的多糖量為192mg。

實(shí)施例3：本復(fù)方羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑由以下組成物制得：黑脈羊肚菌多糖液3g、尖頂羊肚菌多糖液6g、糊精4g、低聚果糖4g。

（1）配制液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基：麥麩50g、可溶性淀粉25g、黃豆粉12g、蔗糖12g；稱量后的麥麩用500ml的蒸餾水熬煮，過濾得麥麩汁，在麥麩汁中加入可溶性淀粉、黃豆粉、蔗糖，混合，補(bǔ)足水量至1000ml，攪拌均勻，分裝，250ml錐形瓶裝液量160ml，121℃滅菌30min；

（2）菌種活化：將保藏的黑脈羊肚菌菌種和尖頂羊肚菌菌種分別接種于pda培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，備用；

（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將活化后的菌種接種于液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中黑脈羊肚菌的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度23℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)10d，ph8；尖頂羊肚菌的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度25℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)8d，ph8；

（4）發(fā)酵液處理：取步驟(3)得到的發(fā)酵液，用兩層紗布過濾，菌絲體用蒸餾水反復(fù)洗滌5次，菌絲體用膠體磨勻漿，得菌絲體多糖液；

（5）復(fù)方羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑的制備：按重量計(jì)，取黑脈羊肚菌多糖液3g、尖頂羊肚菌多糖液6g、糊精4g、低聚果糖4g，混合均勻并加熱至90℃保持5分鐘殺菌，冷卻至常溫，充分?jǐn)嚢杌烊肟諝?，裝盤，放入真空干燥箱中于65℃抽真空6分鐘，使其產(chǎn)生氣泡并蒸發(fā)部分水分，提高料漿粘度，解除真空，再次對(duì)漿料進(jìn)行攪拌混入空氣，然后放入干燥箱中于65℃進(jìn)行真空干燥，料漿再次膨脹形成內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)并完成干燥，干燥后粉碎、包裝即得復(fù)方羊肚菌菌絲體多糖顆粒劑產(chǎn)品。經(jīng)測(cè)定，每100g該產(chǎn)品含有的多糖量為208mg。

上述實(shí)施例中羊肚菌多糖的單糖組成測(cè)定方法及結(jié)果：

1、測(cè)定方法

單糖標(biāo)品的衍生（pmp衍生法）：分別稱取10mg單糖標(biāo)品，溶于5ml純凈水中，分別稀釋10倍，向其中加入1ml0.5mol/lpmp劑（1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮）、1ml0.3mol/lnaoh溶液，于70℃烘箱中衍生30min，冷卻至室溫，加入1ml0.3mol/lhcl溶液中和。然后，分別加入3ml三氯甲烷振搖，靜置，棄去氯仿相，再加入同體積的三氯甲烷反復(fù)萃取三次至上層水相無色，將水相用0.45μm有機(jī)濾膜過濾后，供hplc進(jìn)樣分析。

樣品的衍生（pmp衍生法）：分別精確稱取純化后的多糖10mg于安培瓶中，加入2mol/l的三氟乙酸2ml，混勻后用酒精噴燈封管，在110℃烘箱中水解4h，取出后冷卻，用0.3mol/lnaoh溶液調(diào)ph至中性，定容至10ml，在5000r/min離心10min，分別取1ml上清液加入0.5mol/lpmp劑（1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮）和0.3mol/lhcl各1ml中和。然后，分別加入3ml三氯甲烷振搖，靜置，棄去氯仿相，再加入同體積的三氯甲烷反復(fù)萃取三次至上層水相無色，將水相用0.45μm有機(jī)濾膜過濾后，供hplc進(jìn)樣分析。

色譜條件：流動(dòng)相，溶劑a（15%乙腈+85%磷酸緩沖液（0.05mol/l的kh2po4-naoh，ph6.9）），溶劑b（40%乙腈+60%磷酸緩沖液（0.05mol/l的kh2po4-naoh，ph6.9））；色譜柱，sephaxc18-h；梯度模式，0→35min，相應(yīng)濃度梯度為0%→40%的溶劑b；流速，1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)，250nm；進(jìn)樣量，20μl；柱溫，25℃。

檢測(cè)結(jié)果見圖1、2、3、4；圖1中表明pa-1的單糖組成為甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木聚糖、阿拉伯糖、巖藻糖，其組成比例為12.59:103.69:13.58:12.41:10:137.76；圖2中pa-2的單糖組成為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖，其組成比例為55:10:19.6:44.7:18.2:34.2:25.3；圖3中pb-1含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖這五種單糖，其摩爾比為0.80:0.20:1.36:0.21:1.00；圖4中pb-2含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖這五種單糖，其摩爾比為1.61:0.45:1.00:0.43:1.16。