技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以花生粕為原料生產(chǎn)低聚肽、多糖和膳食纖維的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
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中國(guó)是世界最大的花生產(chǎn)地，產(chǎn)量占全球的40%以上，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年我國(guó)花生的年產(chǎn)量為1611萬(wàn)噸，占油料作物的50%左右，而其中50%-60%用于榨油，90%榨油企業(yè)采用熱榨工藝，因此每年產(chǎn)生大約500萬(wàn)噸花生粕（馬浩良等，2014）花生粕中含有豐富的活性成分，如蛋白質(zhì)含量高達(dá)48%以上，糖類含量高達(dá)30%左右，還有黃酮類、鞣質(zhì)、三萜或甾體類化合物；mg、k、ca、fe、na和zn含量也較高，是很好的礦物營(yíng)養(yǎng)源（謝秋濤等，2102）
劉大川等（2009）研究將花餅粕粉碎，過(guò)20目篩，在50℃下，用60%乙醇溶液浸取，固液比1:8的條件下，對(duì)低溫花生粕浸取5次（30min/次）。然后將浸提物分離，固相干燥即得花生濃縮蛋白，其粗蛋白含量為68.15%。
劉玉蘭等（2009）研究采用混合溶劑浸洗工藝提取花生濃縮蛋白，溶劑比（正己烷：75%乙醇）3.5:6.5，時(shí)間60min，溫度50℃，料液比1:11，萃取4次，在此條件下所得的產(chǎn)品粗蛋白含量70.50%。
王存章等（2009）研究以低溫頂榨花生餅粕為原料，經(jīng)viscozyme酶解處理后再用堿溶酸沉法提取蛋白。底物濃度為15%，溫度為45℃，酶用量1.26%，ph4.3，反應(yīng)時(shí)間134min，蛋白提取率為79.38%。
熊振海等（2009）研究采用堿提取法在溫度60℃，ph9.0，料液比1:8,浸提時(shí)間為60min條件下，提取產(chǎn)物中花生蛋白含量為89.94%。
yujiam-mei等（2007）研究通過(guò)等電沉淀法制備了花生濃縮蛋白，蛋白含量達(dá)85%。
張偉等（2006）研究對(duì)花生餅粕中蛋白質(zhì)的提取進(jìn)行了優(yōu)化，并在相同提取條件下進(jìn)行二次浸提，得花生蛋白含量達(dá)90.43%的產(chǎn)品。
李明姝等（2004）研究采用堿提酸沉法，料液比1:8，ph8.2,浸提溫度60℃，重復(fù)提取2次，每次2h，酸沉ph4.5的條件下制得的花生蛋白純度達(dá)90.21%。
楊偉強(qiáng)等（2009）研究采用堿提酸沉法從脫脂花生蛋白粉中提取花生分離蛋白，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝條件，得到了蛋白含量達(dá)95.65%的分離蛋白。
高云中等（2009）研究對(duì)花生餅進(jìn)行超微粉碎，通過(guò)鹽溶堿提酸沉工藝，花生分離蛋白的純度最高達(dá)91.63%。
劉大川等（1998）研究采用超濾膜法制備花生分離蛋白，產(chǎn)品蛋白得率高達(dá)95.8%。
馬濤等(2011)研究通過(guò)對(duì)堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶水解花生餅粕中的蛋白質(zhì)，確定了堿性蛋白酶來(lái)制備花生抗氧化肽，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化，最終得到了羥自由基清除率為62.15%的花生肽。
王英瑤等（2005）研究采用水酶法，利用alcacase蛋白酶制得花生肽，其相對(duì)分子量189-2000da范圍內(nèi)，具有抑制血管ace（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶）活性。
陳貴堂等（2008）研究用alcacase蛋白酶水解花生分離蛋白的條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到的花生肽分子量主要集中在5000以下，對(duì)亞油酸的氧化具有很好的抑制。
李瑞等（2010）研究采用復(fù)合蛋白酶對(duì)花生餅粕中的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，得到的花生肽的分子量集中在800-1200u之間。
柳杰等（2011）研究以枯草芽孢桿菌20029作為花生餅粕的發(fā)酵菌種，在發(fā)酵溫度30℃，ph8.0，發(fā)酵時(shí)間49.5h的條件下，得到對(duì)dpph。清除率達(dá)63.28%花生抗氧肽。
hwangjean-yu等（2001）研究采用esperase蛋白酶水解花生蛋白，得到抗氧化活性為27.5的活性多肽（相當(dāng)于vc9.5的抗氧化活性）
馬治良等（2016）研究通過(guò)排雜法將花生粕中的淀粉酶解水溶，建立了熱榨花生粕蛋白生物酶法的制備工藝，最佳條件為：料液比1:8，淀粉酶加量0.55%，ph6.0，溫度60℃，酶解時(shí)間1h，制備的花生蛋白純度為81.38%。
王瑩等（2014）研究以低溫花生粕為原料利用堿溶酸沉法提取花生分離蛋白，最佳條件為：ph9.5，堿提溫度55℃，料液比1:11，提取時(shí)間2.5h，此條件下，花生分離蛋白的得率可達(dá)90.25%。
劉紅梅等（2014）研究復(fù)合酶法水解花生粕制備抗氧化肽的工藝優(yōu)化：堿性蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)花生粕具有較強(qiáng)的水解能力，二者以2:1比例對(duì)花生粕水解時(shí)，較優(yōu)的條件為溫度50℃，ph8.54，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.34%，在此條件下，酶解16h，花生肽的收率為65.80%，濃度0.55mg/ml時(shí)對(duì)dpph自由基的清除率為25.77%。
梁蓉等（2008）研究以高溫花生粕為原料，研究?jī)?nèi)肽酶和端解酶復(fù)合處理制備低苦味花生混合肽的工藝，最佳條件為：ph7.0，溫度50℃，料液比1:25，as1398加量為4500u/g、flavourzyme500mg酶加入量為3%，反應(yīng)時(shí)間1.5h，在此條件下回收率為82.33%，水解肽液苦味值為2，干燥所得的花生肽nsi高。
劉大川等（2010）研究以脫脂花生粕為原料，采用alcalase堿性蛋白酶水解制備花生蛋白水解產(chǎn)品，最佳條件為：底物濃度30g/l，ph9.5，溫度60℃，酶加量7%，時(shí)間4h,脫色活性炭用量3%，溫度60℃，時(shí)間40min，在此條件下水解度達(dá)27.81%，氮回收率70.01%。
沈瑞敏等（2011）研究利用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解花生粕提取花生蛋白。確定最佳工藝條件為：料液比1:25，加酶量為3%，水解時(shí)間為2h,在此條件下蛋白轉(zhuǎn)化率為80%。
寧慶鵬等（2016）研究酶解制備花生粕醒酒肽，最佳工藝條件為料液比1:30，alcalaseaf2.4l加量5000u/g，ph9.5，溫度35℃，酶解3h，該條件花生肽分子量在1000u-3000u，體外動(dòng)物乙醇脫氫酶（alcoholdehydrogenase,adh）激活率為30.47%，對(duì)小鼠有顯著防醉醒酒作用。
劉英麗等（2014）研究采用堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解花生粕制備抗氧化肽，經(jīng)篩選確定最佳為堿性蛋白酶，最佳工藝參數(shù)為：底物濃度7%，酶添加量為2%，ph8.0，溫度為65℃，酶解時(shí)間為4h,在此條件下得到的多肽水解度為14.86%，dpph清除率為55.31%。
白水連等（2009）研究，用木瓜蛋白酶水解花生粕蛋白得到多肽的最佳工藝條件為：底物濃度10%，溫度45℃，ph7.5，加酶量6300u/g，酶解時(shí)間5h。
閻欲曉等(2013)研究超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取花生粕多糖的最佳工藝為：中性蛋白酶1.5%、纖維素酶1.5%、果膠酶1.5%，ph6.0.料液比1:25，時(shí)間2h后進(jìn)行超聲處理，功率104w，時(shí)間20min，在此條件下多糖提取率為9.59%。
高思思等（2015）研究比較了熱水提取法和微波提取法從花生粕中提取多糖，結(jié)果表明：熱水浸提法的提取條件料液比1:40，提取溫度100℃，提取時(shí)間120min，提取率為10.35%；微波提取的適宜條件為料液比1:25，微波功率300w。提取時(shí)間2min，提取率為9.93%。
任初杰等（2008）研究堿提花生粕中水溶性多糖的工藝，最佳工藝條件為：料液比1:34，堿濃度0.68mol/l，提取溫度88℃，提取時(shí)間2.4h，對(duì)應(yīng)預(yù)測(cè)得率為9.78%，實(shí)際得率為9.79%。
任初杰等（2007）研究酸提花生多糖的工藝，最佳工藝條件為：酸濃度0.17mol/l，提取溫度87℃，提取時(shí)間74min，料液比1:25，對(duì)應(yīng)預(yù)測(cè)得率為9.41%，實(shí)際得率9.39%。
劉潔等（2011）研究纖維素酶法提取花生粕多糖的工藝，結(jié)果表明：提取時(shí)間253min，提取溫度43℃，ph5.9，酶添加量0.3%，花生多糖的提取率達(dá)6.77%。
苗敬芝（2012）研究用超聲結(jié)合酶法提取花生粕中總膳食纖維的研究。結(jié)果：超聲水提法最佳工藝條件為：料液比1:15，功率150w，時(shí)間15min，提取率為80.51；超聲結(jié)合酶法提取的最佳工藝條件為加酶量4%，料液比1:15，超聲波150w，時(shí)間15min，提取率為83.83%。
陳輝等（2011）研究酶法提取花生粕中不溶性膳食纖維的工藝，結(jié)果表明：α-淀粉酶加量2%，ph4.0，溫度60℃，時(shí)間30min；調(diào)ph7.0，溫度80℃，加木瓜蛋白酶11%，時(shí)間2h，花生粕不溶性膳食纖維提取率達(dá)37.72%。
秦潔等（2011）研究雙酶法提取花生粕中總膳食纖維的工藝。結(jié)果表明：木瓜蛋白酶最佳提取工藝：加酶量8%，時(shí)間4h，溫度50℃；糖化酶的最佳提取工藝條件為：加酶量1.2%，時(shí)間1h，溫度60℃，在此條件下花生粕中總膳食纖維提取率為40.45%。
薛芳等（2008）研究用超聲波輔助減法提取花生粕中多糖，最佳工藝條件為：超聲功率70w，溫度73℃，堿濃度2.12mol/l，超聲處理時(shí)間18.65min，固液比1:20，多糖提取率13.78%。
韓冰等（2010）研究用響應(yīng)面法優(yōu)化水提花生餅粕中多糖，最佳參數(shù)：料液比1:41，溫度96℃，時(shí)間1.93h，在此條件下多糖得率為10.24%。
劉潔（2012）研究通過(guò)響應(yīng)面分析從花生粕中用纖維素酶法提取花生多糖的研究。結(jié)果表明：在提取時(shí)間253min，提取溫度43℃，ph5.9,纖維素酶濃度0.3%條件下，花生多糖提取得率達(dá)到6.77%。
通過(guò)對(duì)不同提取方式得到的花生多糖理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)組成的比較可以看出，酶提花生多糖中糖醛酸含量和硫酸根含量是四種提取方法中最高的。酶提花生多糖由葡萄糖和半乳糖構(gòu)成，酸提花生多糖由鼠李糖、木糖、葡萄糖和半乳糖構(gòu)成；堿提及水提花生多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖構(gòu)成。從分子量上看，酶提多糖分子量分布從1.08*103到2.39*103da，酸提多糖從3.39*103da到1.07*105da，堿提多糖從2.82*103da到1.32*105da，水提多糖從2.29*103da到1.32*105da.
從上述研究資料中仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn)如下不足：
1.所有研究只是從花生粕中提取1種活性成分，其余活性成分沒(méi)有被提取，既造成花生粕資源的浪費(fèi)，又增加了提取活性成分的原料成本。
2.采用堿提酸沉法提取花生分離蛋白的工藝中未見(jiàn)對(duì)提取花生分離后的乳清水進(jìn)行利用。發(fā)明者對(duì)乳清水（料液比1:5提取分離蛋白）中的主要成分進(jìn)行了測(cè)定。含蛋白0.3%-0.4%，多糖含量0.6%-0.7%。按日處理20噸花生企業(yè)，每天從乳清水中排掉蛋白質(zhì)600kg，多糖1400kg。不僅浪費(fèi)了寶貴的資源，而且污染了環(huán)境。
3.沒(méi)有對(duì)花生蛋白酶解用酶進(jìn)行系統(tǒng)篩選，也沒(méi)有對(duì)產(chǎn)品口感進(jìn)行了評(píng)價(jià)，更沒(méi)有對(duì)產(chǎn)品分子量進(jìn)行測(cè)試。
4.發(fā)明者對(duì)上述文獻(xiàn)提到的常用蛋白酶包括2709堿性蛋白酶。as1.398中性蛋白酶，胰酶，木瓜蛋白酶等酶解花生粕后的酶解液用常規(guī)方法處理如過(guò)濾、離心、加助濾劑等均得不到澄清液體。因此也無(wú)法得到復(fù)溶后澄清溶液的花生肽產(chǎn)品。
5.文獻(xiàn)中有錯(cuò)誤，可能是印刷錯(cuò)誤或校對(duì)疏漏，也可能沒(méi)有認(rèn)真做實(shí)驗(yàn)。誤報(bào)相關(guān)數(shù)據(jù)。如陳輝等研究酶法提取花生粕中不溶性膳食纖維，木瓜蛋白酶的用量11%，酶解溫度80℃不符合常理：一是木瓜蛋白酶常用量1%-3%；二是酶解溫度55℃左右。加熱至80℃時(shí)，酶全部失活。苗敬芝研究用超聲結(jié)合酶法提取花生粕中總膳食纖維，提取率高達(dá)83.83%。花生粕中蛋白質(zhì)50%左右，含多糖30%左右，不可能會(huì)提取83.83%總膳食纖維。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種以花生粕為原料生產(chǎn)低聚肽、多糖和膳食纖維的方法。
本發(fā)明的以花生粕為原料生產(chǎn)低聚肽、多糖和膳食纖維的方法：步驟一、取花生粕，粉碎過(guò)20目-80目篩，得花生粕粉，按料液比1：5-1：20加純凈水，調(diào)配成混懸液，混懸液用10%-30%的naoh液調(diào)ph8.5-11.0，將料液加熱至50℃-90℃，攪拌提取1h-4h，用臥螺分離機(jī)進(jìn)行固液分離，得到液相i和固相i，所述的液相i中含蛋白液，所述的固相i中包含濾渣，主要含纖維，濾渣用適量純水?dāng)嚢柘礈?，采用臥螺分離機(jī)進(jìn)行第二次固液分離，得到液相ii和固相ii；
步驟二、液相ii和液i合并，在攪拌下加入1.1-1:4鹽酸液至料液ph4.0-5,0，攪拌均勻后靜置5min-20min得凝乳,用臥螺分離機(jī)將凝乳分離得乳清液和分離蛋白；乳清液通過(guò)截留分子量2萬(wàn)da-10萬(wàn)da的有機(jī)膜分離，得到截留液i和透過(guò)液i，所述的截留液i中含蛋白質(zhì)，所述的透過(guò)液i中含多糖，將截留液i和步驟一中的固相i合并，攪拌分散，加純水調(diào)整底物濃度為5%-15%為料液；
步驟三、將料液加入naoh液調(diào)ph為9.0，加熱至70℃-90℃熱處理10min-60min，料液降溫至40℃-60℃，ph7.5-9.0，加復(fù)合蛋白酶，其中蛋白酶中蛋白總量為1%-5%，攪拌酶解3.5h-7.0h酶解液調(diào)ph至5.0-7.0，升溫至70℃-90℃在10min-25min滅酶，為滅酶液；
步驟四、將步驟三制備的滅酶液在攪拌下加濃度1-5%hacc，加量為2-10%，加濃度為1%-5%cts1-10%，充分?jǐn)噭蚝箪o置5min-10min由臥螺離心機(jī)或板框壓濾機(jī)分離，得到液相iii（含肽澄清液）和固相iii（含絮凝物，棄）；
步驟五、將液相iii過(guò)顆?；钚蕴贾M(jìn)行脫色精制，得過(guò)柱液，過(guò)柱液用孔徑50nm-100nm陶瓷膜進(jìn)行脫炭粒精濾，得澄清透明精濾液；精濾液用孔徑50da-200da有機(jī)膜進(jìn)行一級(jí)濃縮，得一級(jí)濃縮液至固含量為15%-25%；
步驟六、將步驟五中的一級(jí)濃縮液經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮機(jī)進(jìn)行再濃縮，得到固含量35%-55%的濃縮液，濃縮液經(jīng)壓力式噴霧干燥塔噴干，即花生蛋白低聚肽；
步驟七、將步驟二制備的透過(guò)液i用截留分子量500da-1000da的有機(jī)膜進(jìn)行濃縮至固含量25%-50%的濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得花生多糖，或加3倍95%乙醇攪拌沉淀，靜置，分離沉淀，分別用95%乙醇、無(wú)水乙醇洗滌，干燥，得花生多糖；將步驟一制備的固相ii用純水洗滌1次，采用臥螺離心機(jī)分離，固相用管束干燥機(jī)干燥，粉碎過(guò)100-200目即得膳食纖維。
作為優(yōu)選，所述的步驟三中的復(fù)合蛋白酶包含as1.398中性蛋白酶10萬(wàn)/g50%-70%，木瓜蛋白酶60萬(wàn)/g20%-50%和風(fēng)味蛋白酶5%-25%。
本發(fā)明的有益效果：1.以花生粕為原料同時(shí)提取花生低聚肽、花生多糖和膳食纖維，使花生粕資源得到綜合利用，降低了產(chǎn)品的原料成本，大大提高了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，又避免了大量乳清水的排放給環(huán)境造成的污染。
2.對(duì)酶解花生蛋白的蛋白酶進(jìn)行了系統(tǒng)篩選，在單酶篩選的基礎(chǔ)上，組成了對(duì)花生蛋白酶解率最高、產(chǎn)物分子量最小，口感最好的復(fù)合蛋白酶，使花生蛋白的酶解收率高達(dá)90%左右，花生低聚肽的分子量<1000da達(dá)95%左右，產(chǎn)品口感好，無(wú)苦味。
3.篩選了食品級(jí)絮凝劑hacc和cts作為花生蛋白酶解液絮凝澄清，并對(duì)使用濃度和絮凝工藝進(jìn)行了系統(tǒng)研究，使絮凝吸附花生低聚肽的量降到最低，保證了較高的花生低聚肽收率。
4.使用了膜分離和膜濃縮新設(shè)備。新工藝，使乳清水中未被等電點(diǎn)沉淀下的可溶性蛋白和多糖進(jìn)行有效分離，使低濃度的低聚肽溶液和多糖溶液得到濃縮。節(jié)省了能源，又提高了產(chǎn)品質(zhì)量。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明的制備結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式：
本具體實(shí)施方式采用以下實(shí)施例對(duì)發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例：步驟一、取花生粕，粉碎，過(guò)60目得花生粕粉；稱取花生粕粉100kg，在攪拌下加入600l純水中，料液比1:6，充分?jǐn)噭虺驶鞈乙海挥?0%naoh液調(diào)液ph9.0；加熱升溫至料液溫度60℃；攪拌提取2h；用臥螺分離機(jī)分離得液相i（蛋白液）和固相i；固相i入反應(yīng)釜，按料（花生粕粉）：液=1:4加純水第二次提取，條件同上臥螺分離機(jī)離心分離，得液ii和固相ii（為膳食纖維）；
步驟二、液相ii和液i合并；得合并料液用1:3稀釋的鹽酸液調(diào)合并料液ph4.5-4.6，充分?jǐn)噭?，靜置5min-10min得凝乳；用臥螺分離機(jī)將凝乳分離得乳清液和分離蛋白；乳清液通過(guò)截留分子量2萬(wàn)da-10萬(wàn)da的有機(jī)膜分離，透過(guò)液為花生多糖，截留液為蛋白，截留液多次用純水稀釋，將其中多糖洗出，洗液合并入透過(guò)液中；將透過(guò)液濃縮至固含量30%左右，用冷凍干燥或加3倍酒精攪拌沉淀，分別用95%乙醇、無(wú)水乙醇洗滌，干燥得花生多糖；截留液合并入分離蛋白中；分離蛋白中加純水，攪拌均勻，得蛋白乳液，用純水調(diào)整底物濃度（蛋白含量）7.5%左右；
步驟三、用濃度20%naoh液調(diào)料液ph9.0，在攪拌下夾層加熱，將料液升溫至70℃，熱處理20min；將料液降溫至46℃±1℃；調(diào)整料液ph8.3±0.1；加復(fù)合蛋白酶3.5%（蛋白總量），攪拌酶解5h；調(diào)整料液ph6.0；料液升溫至75℃10min滅酶；
步驟四、攪拌下在滅酶料液中加濃度1%hacc，加量5%（v/v）；濃度為2%cts，加量為1%（v/v）,充分?jǐn)嚢杈鶆?，靜置5min，進(jìn)行絮凝；絮凝液通過(guò)臥螺分離機(jī)分離得清液（含花生低聚肽）和固相（雜質(zhì)，棄）；
步驟五、將清液通過(guò)顆?；钚蕴恐M(jìn)行脫色脫味精制；過(guò)柱液通過(guò)100mm孔徑的陶瓷膜進(jìn)行精濾，得精濾液；精濾液通過(guò)截留分子量50da的有機(jī)膜濃縮，得一級(jí)濃縮液，固含量16%左右；
步驟六、將一級(jí)濃縮液經(jīng)機(jī)械減壓濃縮裝置濃縮得濃縮液，固含量45%左右；濃縮液經(jīng)噴霧干燥塔噴干，得花生低聚肽。
步驟七、將步驟一中固相ii按料液比1:3加純水?dāng)嚢柘礈?0min左右；臥螺分離機(jī)分離得固相iii；將固相iii通過(guò)管束干燥機(jī)但干燥至含水量12%以下，得干固形物；將干固形物超微粉碎通過(guò)200目，即膳食纖維成品
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。