專利名稱：識別α2→3鍵的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種新的雜交細胞瘤，制造它的方法，以及通過該雜交細胞瘤制備抗含唾液酸糖脂的單克隆抗體。
迄今為止，都是用各種抗原免疫動物，收集其血來制備抗血清。然而，抗血清含有大量來源于不同B淋巴細胞的抗體分子(多克隆抗體)，并經(jīng)常與其他抗體交叉反應。因此，很難得到專一性很強的抗血清。
在此背景下，Koehlo于1975年制備出能產(chǎn)生抗羊紅血細胞抗體的雜交細胞瘤，它是將免疫動物的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合得到的。由于雜交瘤高增殖率，可從這樣的雜交瘤細胞分離出來自單個細胞的一個雜交細胞瘤的克隆(所謂“克隆化”)。所有由這個克隆的雜交細胞瘤產(chǎn)生的抗體都是一致的，具有對某一抗原的專一性，能識別某特異抗原的同一部位。此外，雜交細胞瘤可以冷凍態(tài)保存，如在液氮中。因此，可以保證穩(wěn)定地供應每種抗體。根據(jù)細胞融合技術(shù)，有可能獲得對某一特異抗原高度特異性的單克隆抗體。
抗體是能夠識別被稱為“抗原”的一種分子或物質(zhì)，并與其結(jié)合的蛋白質(zhì)。單克隆抗體的意思是具有識別一種特異抗原的一個部位的抗體，換言之，它僅識別一個抗原決定簇。當今各種生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)及制備能生產(chǎn)單克隆抗體的雜交細胞瘤技術(shù)均是先有技術(shù)。這方面可參考最近出版的“單克隆雜交細胞瘤抗體技術(shù)與應用“JohnG.Huooell編著，1983。
哺乳動物細胞的糖脂是屬于鞘糖脂類，包括(a)被稱為神經(jīng)酰胺的類脂結(jié)構(gòu)，該酰胺是由一個稱為鞘氨醇的長鏈氨醇與脂肪酸以酰胺鍵結(jié)合構(gòu)成，(2)選自葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、巖藻糖和唾液酸的各種組合物，它們通過糖苷鍵與結(jié)構(gòu)(a)結(jié)合。它們當中，攜有唾液酸殘基的糖脂被叫作神經(jīng)節(jié)苷脂。
絕大多數(shù)該類化合物多位于細胞外膜，最新研究認為神經(jīng)節(jié)苷脂在接收信息，識別，受體動能，分化，增殖，癌變或其他細胞行為方面都起重要作用。
神經(jīng)節(jié)苷脂中，GD3神經(jīng)節(jié)苷脂已知為神經(jīng)細胞分化的抗原，并進一步鑒定為人黑色素瘤細胞的腫瘤相關(guān)抗原。
由于單克隆抗體具有針對一種特異抗原的高度特異性，因此能如上述高敏感檢測該抗原。如果得到一種單克隆抗體對GD3是特異的，則可應用該抗體診斷癌癥和免疫治療，以及用來解釋糖鏈在細胞功能中的作用。
因此，本發(fā)明的首要目的是提供能產(chǎn)生對GD3神經(jīng)節(jié)苷脂上的一個特異抗原決定簇特異的單克隆抗體的雜交瘤，該苷脂被確定與一種癌-人類黑色素瘤細胞有關(guān)。
本發(fā)明另一個目的是提供生產(chǎn)這種雜交瘤的方法。
本發(fā)明再一個目的是提供對GD3神經(jīng)節(jié)苷脂上特異抗原決定簇顯示特異性的單克隆抗體。
本發(fā)明人進行了一系列研究，以排除不利方面，發(fā)現(xiàn)在細胞融合技術(shù)中可將純化的GD3神經(jīng)節(jié)苷脂用作抗原，制備能產(chǎn)生所需單克隆抗體的雜交瘤，從而完成了本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供能產(chǎn)生對含唾液酸的糖脂特異的單克隆抗體的雜交瘤，該糖脂帶有內(nèi)含α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供生產(chǎn)能制備一種單克隆抗體的雜交瘤的方法，該方法包括將用一種含唾液酸的糖脂(該糖脂攜有內(nèi)含α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸殘基)免疫動物得到的B細胞(ⅰ)(即B淋巴細胞)與骨髓瘤細胞(ⅱ)融合。
根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，還提供了對含唾液酸的糖脂特異的單克隆抗體，該糖脂攜有內(nèi)含α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸殘基作為抗原決定簇，該單克隆抗體是用上述雜交瘤生產(chǎn)的。


圖1表示用酶標抗體技術(shù)測定的該單克隆抗體對抗原GD3和GM3決定簇的特異性。
圖2和圖3表示各種神經(jīng)節(jié)苷脂對本發(fā)明單克隆抗體的抗原特異性。
圖4表示用于本發(fā)明單克隆抗體分類的圖解。
本發(fā)明將在下面進一步詳述。
本發(fā)明的雜交瘤是根據(jù)Koehle和Millstein的方法(見“自然”1975)通過一種抗原免疫動物，再從該動物得到融合B細胞而產(chǎn)生。這里的抗原是如攜有內(nèi)含α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸殘基的神經(jīng)節(jié)苷脂，優(yōu)選的是攜有內(nèi)含α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸殘基的神經(jīng)節(jié)苷脂的糖脂。如
用本發(fā)明的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體將含有α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸識別為抗原決定簇，并與其特異結(jié)合。因此，用該雜交瘤生產(chǎn)的單克隆抗體顯示與攜有含α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸殘基的含唾液酸糖脂有很高的反應性，特別是與GD3和GM3神經(jīng)節(jié)苷脂。此外，該單克隆抗體對任何不同動物來源的含唾液酸糖脂均顯示同一特異性。
用前述含唾液酸糖脂抗原免疫的動物可以是任何動物。作為特定例子，可舉家兔，人類，小鼠和大鼠，最好為小鼠Balb/C。
生產(chǎn)本發(fā)明單克隆抗體的B細胞(B淋巴細胞)最好來源于脾細胞。另一方面，用于本發(fā)明的骨髓瘤細胞來源于任何動物，如人類，小鼠，大鼠和家兔。優(yōu)選小鼠，最好是來源于Balb/C小鼠的骨髓瘤細胞(X63-Ag8.653)。這些骨髓瘤細胞增殖力特別強，從而當其與B細胞融合得到的雜交瘤細胞可連續(xù)不斷地產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體。
本發(fā)明的雜交瘤細胞可通過下述方法制備。
首先將GD3神經(jīng)節(jié)苷脂經(jīng)腹膜內(nèi)，皮下，或靜脈注射于小鼠以免疫，最好是靜脈注射。在此免疫過程中，可使用完全佐劑或不完全佐劑作為一種加強免疫劑，如油劑，乳化劑，死結(jié)核桿菌，殺死的沙門氏菌或其混合物，優(yōu)選的是殺死的明尼蘇達沙門氏菌作為佐劑經(jīng)腹膜內(nèi)，皮下或靜脈注射。這些佐劑最好以生理上可接受的組合液，如磷酸鹽緩沖鹽水等形式應用。
在此免疫過程，要注意到用自身成分很難使動物對免疫敏感，因此原則上要選用遺傳學上與抗原物質(zhì)親緣較遠的動物。然而，免疫也可在體外進行以避免這種困難。
然后，將B細胞與骨髓瘤細胞融合，作為融合劑可用聚乙二醇和HVJ，最好是分子量6000的聚乙二醇。此外，最好用HAT基質(zhì)作為培養(yǎng)基，這樣較容易將雜交瘤細胞與殘留的未融合細胞分開。
另外，要用甲基纖維素技術(shù)，軟瓊脂糖技術(shù)或有限稀釋技術(shù)將所得雜交瘤細胞克隆，以分離出所需單個雜交瘤細胞克隆。
可用常規(guī)方法檢驗所得雜交瘤細胞的抗體效價，選擇那些抗體效價高的雜交瘤細胞，將其貯存。
本發(fā)明雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體可用于探測人或動物癌組織中天然產(chǎn)生的糖脂抗原。因此，該單克隆抗體可用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和放射免疫試驗(RIA)之中以檢測與癌相關(guān)聯(lián)的神經(jīng)節(jié)苷脂。該單克隆抗體還可用于親合層析中以純化與其結(jié)合的抗原。若將該單克隆抗體以放射性同位素標記，則可用以診斷腫瘤或鑒定其正確部位，高劑量還可以治療腫瘤。也可與化療劑結(jié)合加強對癌細胞的毒性。本發(fā)明的單克隆抗體可用于治療和診斷具有該抗原的人或諸如小鼠的動物。本發(fā)明的單克隆抗體也有希望用于神經(jīng)細胞的基礎(chǔ)研究及其它臨床應用。
將用下面的例子更詳細地解釋本發(fā)明，但它們不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
例(A)抗原的制備(1)GD3和GM3神經(jīng)節(jié)苷脂的提取和純化將豬腎上腺組織于冷丙酮中被勻漿化并干燥后，以常規(guī)方法將該干燥制品用氯仿甲醇萃取。
所得樣品堿化處理后，GD3神經(jīng)節(jié)苷脂用DEAE-葡聚糖A-25離子交換樹脂和Latrobeads柱純化。
GM3神經(jīng)節(jié)苷脂的制備過程為離心肝素化的狗血清，以磷酸鹽緩沖鹽水(PBS(-))沖洗所得沉淀物三次，冷凍干燥，然后將其用氯仿甲醇萃取。純化操做按上述同法進行。
GD1a，GD1b和GQ1b購自DIATRON公司，半乳糖-神經(jīng)酰胺神經(jīng)節(jié)苷脂和葡萄糖-神經(jīng)酰胺神經(jīng)節(jié)苷脂購自Sigma公司，GT1b和GM2神經(jīng)節(jié)苷脂購自FUNaKOSHI公司，它們未經(jīng)再純化而直接使用。
這些神經(jīng)節(jié)苷類糖脂溶于氯仿-甲醇(1∶1(V/V)或乙醇中，-20℃下貯存(2)動物將6只雌性、6周齡Balb/C品系小鼠在常規(guī)條件下飼養(yǎng)后用于實驗。
(3)抗原溶液的制備自豬腎上腺提取和純化得到的GD3神經(jīng)節(jié)苷脂和用醋酸(重量比為1∶4)及二乙醚處理的明尼蘇達沙門氏菌R595被混合于PBS(-)中，使GD3神經(jīng)節(jié)苷脂濃度為100μg/ml，該溶液作為抗原液使用。
(4)培養(yǎng)基培養(yǎng)基NissuiRPMI1640(購自Nissui公司，東京，日本)作為培養(yǎng)基使用。用前向其中加入硫酸卡那霉素和胎牛血清(FBS)，佟濃度分別為50μg/ml和10%。HAT培養(yǎng)基加熱下向100ml蒸餾水中加入0.0388g胸腺嘧啶和0.1361g次黃嘌呤使其溶解，所得溶液(a)作為比實用溶液濃縮100倍的貯存液保存于20℃下備用。0.0176g氨基喋呤溶解于100ml蒸餾水中并滴加小量1N的氫氧化鈉液，然后該液被用RPMI1640液稀釋10倍，所得溶液(B)作為比實用溶液濃縮100倍的貯存液于-20℃下避光保存。
HAT培養(yǎng)基系將上述二種母液分別以1/100體積加于含10%FBS的RPMI1640液中制成現(xiàn)用。
此外，HT培養(yǎng)基系將貯存液(a)以1/100容量加于含10%FBS的RPMI1640液中制成。
(5)親代細胞作為供細胞融合的親代細胞，使用取自Balb/C小鼠的骨髓瘤細胞(C63-Ag8-6·5·3細胞)。這些細胞置于含10%FBS的RPMI1640培基中再次培養(yǎng)，同時加入6-硫代鳥嘌呤于該培養(yǎng)基中(終濃度為3μg/ml)以抑制細胞突變體的產(chǎn)生。
(B)雜交瘤的制備(1)免疫方法雌性、6周齡Balb/C小鼠按下列免疫程序向靜脈內(nèi)注射下列免疫原溶液來免疫(注射劑量用神經(jīng)節(jié)苷脂量表示)首次5μg，首次后第四天10μg，第七天15μg，第十二天20μg，第七十九天20μg。在最后一次免疫后第三天處死小鼠以摘除脾臟，制備單個脾細胞懸液，由此隨后用于細胞融合。
免疫原溶液自豬腎上腺提取和純化的GD3神經(jīng)節(jié)苷脂100μg與作為佐劑的明尼蘇達沙門氏菌R595 400μg混合于不含Ca2+和Mg2+的PBS(-)1ml中，所得溶液適當稀釋后作為免疫原溶液使用。
(2)細胞融合上述所得脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞的融合按Kohler和Millstein方法進行。更確切地說用1×108脾淋巴細胞與2×107骨髓瘤細胞在含50%聚乙二醇(PEG6000)的培養(yǎng)基中融合。
(3)雜交瘤的選擇和繁殖細胞融合后，所得細胞培養(yǎng)于HAT培基中(次黃嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶)，37℃和5%CO2下培養(yǎng)。
由此產(chǎn)生的雜交瘤已保存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，登記號ATCCHB9475。
(C)單克隆抗體與神經(jīng)節(jié)苷脂反應性的鑒定96孔平底塑料板(購自Falcon公司)在用前以乙醇預處理。向每孔內(nèi)吸量加入已用乙醇稀釋的抗原溶液(免疫原溶液)50μl，使GD3神經(jīng)節(jié)苷脂濃度調(diào)整為20μg/ml(最適濃度)，然后，溶劑被蒸發(fā)，再向每孔加入含1%卵清蛋白的PBS(-)溶液200μl，并在室溫下靜置30分鐘。振蕩并傾棄溶液，然后加入50μl雜交細胞瘤培養(yǎng)液的上清液作為原始抗體，該板在室溫下靜置1.5小時。隨后從孔內(nèi)移除該原始抗體，向孔內(nèi)加入150μl PBS(-)溶液來沖洗，共三次，并在加入100μl/每孔含1%卵清蛋白的PBS(-)溶液后在室溫下靜置30分鐘。移除該液后，向每孔加入50μl經(jīng)含1%卵清蛋白的PBS(-)溶液稀釋至最適濃度的第二抗體，并在室溫下靜置1.5小時。如對原始抗體那樣，每孔也以PBS(-)液沖洗三次，再加入反應液100μl/孔，以引起在黑暗中的反應。反應液是將鄰苯二胺(OPD)和過氧化氫(H2O2)分別以0.4mg/ml和0.01%濃度溶于檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(PH＝5)中而制成。向每孔中加入8N的硫酸30μl以終止該反應，然后，終溶液經(jīng)比色計在500nm波長下檢測。作為第二抗體，可使用以辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG，IgM和IgA抗體。
所獲結(jié)果顯示于圖1，其中實心環(huán)代表GM3神經(jīng)節(jié)苷脂，空心環(huán)代表GD3神經(jīng)節(jié)苷脂。
如圖1所見，GD3和GM3神經(jīng)節(jié)苷脂都與本發(fā)明的單克隆抗體以高敏感性發(fā)生抗原-抗體反應。如此，GD3和GM3神經(jīng)節(jié)苷脂都帶有對應于本發(fā)明之單克隆抗體的抗原決定簇。在這一點上，GD3神經(jīng)節(jié)苷脂與該單克隆抗體的反應性高于GM3神經(jīng)節(jié)苷脂。據(jù)此認為GD3神經(jīng)節(jié)苷脂具有對本發(fā)明的單克隆抗體有更高特異性的一個表位或抗原決定簇。
(2)TLC免疫染色技術(shù)二氧化硅凝膠薄層層析板(TLC(poly gram SIL G))被切割成適當大小的片，并用一小滴于氯仿-甲醇(1∶1(V/V))中的糖脂液沾染。依賴于目的，凝膠板用一種顯色液來沖洗顯影，如氯仿-甲醇-水(60/40/10 V/V)，氯仿-甲醇-0.5%CaCl2(55/45/10;V/V)溶液，或氯仿-甲醇-2.5NNH40H(60/40/9;V/V)溶液，然后置于含1%卵清蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮(K-30)的PBS(-)溶液中4℃下過夜。隨后，室溫下振蕩2小時，同時浸于原始抗體溶液之中。以PBS(-)充分沖洗之后，再被浸于含1%卵清蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮(K-30)的PBS(-)溶液中室溫靜置30分鐘。該板吸干后再浸于已預先用含3%聚乙烯吡咯烷(K-30)的PBS(-)稀釋到最適濃度的第二抗體溶液之中，振蕩2小時，再用PBS(-)充分沖洗后加入反應液。該反應液的制備系將4mg4-氯-1-萘酚溶解于甲醇1ml之中，再加入50毫摩爾的tris(羥甲基)-氨基甲烷，200毫摩爾NaCl和5ml緩沖液(PH＝7.4)，然后再加過氧化氫使其終濃度為0.01%。用水沖洗該板來終止反應，隨后空氣中干燥。
(3)對本發(fā)明的單克隆抗體特異的抗原決定簇的鑒定由TLC染色技術(shù)(苔黑酚染色)(A)和TLC免疫染色技術(shù)(B)所獲各種類型糖脂的免疫反應及定性試驗結(jié)果顯示于圖2。從圖2所示結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，第5道的GD3神經(jīng)節(jié)苷脂具有對本發(fā)明的單克隆抗體特異的抗原決定簇。
此外，被活化的霍亂弧菌唾液酸分解產(chǎn)生的CDH(Gal-GlC-Cer)在施以TLC免疫染色時未能于第3道的GD3神經(jīng)節(jié)苷脂上檢出。這就明確地指出，CDH結(jié)構(gòu)不是本發(fā)明的單克隆抗體的抗原決定簇。此外，出現(xiàn)于TLC免疫染色第3道的著色帶表明為不受上述唾液酸酶的作用的GD3神經(jīng)節(jié)苷脂。圖2中，第1道的CMH表示Gal-Cer和Glc-Cer，第4道的CTH表示，Gal-Gal-Glc-Cer。
由此可見，這些結(jié)構(gòu)不是對應于本發(fā)明單克隆抗體的抗原決定簇，因為它們不被TLC免疫染色技術(shù)所染色。
如上所見發(fā)現(xiàn)，對應于本發(fā)明單克隆抗體的抗原決定簇是N-乙酰神經(jīng)氨酸殘基。
圖2的每一道如下(1)第1道CMH(Gal-Cer，Glc-Cer1μg(人腦)(2)CDH(活化的霍亂弧菌唾液酸酶作用于GD3) 1μg(3)第3道CDH1μg(4)第4道CTH(化學人工合成產(chǎn)物)1μg(5)第5道GD31μg用TLC免疫染色技術(shù)染色各種帶有N-乙酰神經(jīng)氨酸殘基的神經(jīng)節(jié)苷脂所得結(jié)果總結(jié)在表1如下。
表1TLC免疫染色試驗結(jié)果抗原(100微微克分子)ATCCHB9475GM3++++++GD3++++++GD1a++GD1b+GT1b++GQ1b+++未檢出樣品578nm對照710nm抗體效價+＜20，00020，000＜++＜10，00040，000＜+++＜60，00060，000＜++++＜80，00080，000＜+++++＜100，000100，000＜++++++(4)針對本發(fā)明的單克隆抗體的抗原決定簇的鑒定如圖2，圖3顯示了由TLC染色技術(shù)(A)和TLC免疫染色技術(shù)(B)所得各種類型糖脂的免疫反應和定性試驗結(jié)果。圖3中，第2和3道表明了天然形成的神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)果，換言之，即帶有α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸。這些道清楚地表明了帶有α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸對本發(fā)明的單克隆抗體有強烈特異性。
此外，第4和5道顯示了化學合成的N-乙酰神經(jīng)氨酸衍生物的結(jié)果。這些結(jié)果指出，人工合成的神經(jīng)節(jié)苷脂不具有本發(fā)明的單克隆抗體對應的特異性。
綜合分析本觀察和條目(3)所得結(jié)果，結(jié)論是本發(fā)明的單克隆抗體識別作為抗原決定簇的N-乙酰神經(jīng)氨酸的α2→3鍵。
圖3中的各道詳述如下(1)第1道GM31μg(2)第2道N-乙酰神經(jīng)氨酸1μg(NANA)α2→3半乳糖
β1→1神經(jīng)酰胺(3)第3道N-乙酰神經(jīng)氨酸1μg(NANA)α2-3半乳糖α1→1神經(jīng)酰胺(4)第4道N-乙酰神經(jīng)氨酸0.5μg(NANA)β2→3半乳糖α1→1神經(jīng)酰胺(5)第5道N-乙酰神經(jīng)氨酸1μg(NANA)β2→3半乳糖β1→1神經(jīng)酰胺(6)第6道CD31μg(5)定性免疫擴散技術(shù)(Ouchterlony技術(shù))圖4顯示了免疫擴散技術(shù)所得結(jié)果。從圖4可見，由本發(fā)明的雜交瘤細胞所分泌的單克隆抗體是IgM類抗體。本方法所用的抗血清抗MIgM，抗MIgG1，抗MIgG2a，抗MIgG2b和抗MIgG3購自Miles公司。
(1)抗MIgM(2)抗MIgG1(3)抗MIgG2a(4)抗MIgG2b(5)抗MIgG3(6)本發(fā)明的單克隆抗體是IgM類抗體這一事實也被用酶標抗體技術(shù)檢測的結(jié)果所證實，本方法結(jié)果總結(jié)表Ⅱ如下。
表Ⅱ第二抗體雜交瘤細胞分泌抗體+-抗鼠IgM0.977±0.0790.066±0.007抗鼠IgG10.131±0.011 0.062±0.011抗鼠IgG2a0.137±0.013 0.109±0.010抗鼠IgG2b0.121±0.003 0.072±0.006抗鼠IgG30.131±0.007 0.046±0.003OD于500nm抗原GD3500μg/每孔第三抗體辣根過氧化物酶-羊抗兔Ⅰg結(jié)合物
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生對攜有含α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸殘基的含唾液酸的糖脂特異的單克隆抗體的雜交細胞瘤。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的雜交瘤，該雜交瘤細胞為ATCCHB9475。
3.制備能生產(chǎn)對攜有含α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸殘基的含唾液酸的糖脂特異單克隆抗體的雜交細胞瘤的方法，包括用(ⅰ)攜有含α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸殘基和含唾液酸的糖脂免疫動物得到B細胞或淋巴細胞，與(ⅱ)骨髓瘤細胞融合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中通過細胞融合所得的雜交細胞瘤進一步克隆。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，所述含唾液酸的糖脂是神經(jīng)節(jié)苷脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，所述的神經(jīng)節(jié)苷脂是GD3神經(jīng)節(jié)苷脂或GM3神經(jīng)節(jié)苷脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述動物是Balb/c小鼠。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述B細胞是Balb/c小鼠的脾細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述骨髓瘤細胞來源于人，大鼠或小鼠。
10.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中的骨髓瘤細胞來源于Balb/c小鼠。
11.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中的細胞融合時所用融合劑是聚乙二醇。
12.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，用作免疫佐劑的是明尼蘇達沙門氏菌R595。
13.對攜有含α2→3鍵為抗原決定簇的N-乙酰神經(jīng)氨酸的含唾液酸的糖脂特異性的單克隆抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的單克隆抗體，其中含唾液酸的糖脂是神經(jīng)節(jié)苷脂。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的單克隆抗體，其中的神經(jīng)節(jié)苷脂是GD3或GM3。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的單克隆抗體，它為IgM型免疫球蛋白分子。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的單克隆抗體，用于純化神經(jīng)節(jié)苷脂。
18.根據(jù)權(quán)利要求13的單克隆抗體，其中與黑色素瘤細胞表面抗原特異反應的。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的單克隆抗體，用于治療黑色素瘤患者。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的單克隆抗體，用于血清學診斷。
全文摘要
揭示了能產(chǎn)生對攜有含α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸的含唾液酸的糖脂特異的單克隆抗體的雜交細胞瘤。該雜交瘤可通過將用攜有含α2→3鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸的含唾液酸的糖脂免疫動物得到B細胞或淋巴細胞，將其與骨髓瘤細胞融合。通過該雜交瘤細胞制備的單克隆抗體可用于純化神經(jīng)節(jié)苷脂，治療黑色素瘤和血清診斷。
文檔編號C12N5/20GK1042734SQ8810788
公開日1990年6月6日 申請日期1988年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1987年11月17日
發(fā)明者永井克孝, 山本英樹, 高田欣二, 伊藤正善, 志鳥善保 申請人:美克德株式會社