專利名稱：一種云芝糖肽(psp)的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種云芝糖肽(Polysaccharide-pepetideofCoriodevorsicolor簡稱PSP)的生產(chǎn)方法。
自七十年代起，各國對真菌多糖及其生產(chǎn)方法研究甚多。研究成果表明，在擔(dān)子菌綱多孔菌科中有眾多的屬、種能提取到具有抗癌活性的多糖。在1985年召開的第14屆國際化療會議上，屬于這類抗癌多糖的研究文獻(xiàn)就有68篇。查閱文獻(xiàn)，已報導(dǎo)的專利共6篇。其中4篇涉及云芝菌株特性及培養(yǎng)基碳氮源比例與菌絲體產(chǎn)量的關(guān)系;涉及到從云芝深層培養(yǎng)菌絲體中提取抗癌多糖的專利有1977年的美國4051314專利和1981年的美國4289688專利2篇。其中，美國4051314專利的云芝深層培養(yǎng)基的碳源為麥芽膏，培養(yǎng)時間240小時，制得的有效成份是葡聚糖(Glucan);美國4289688專利介紹的云芝深層培養(yǎng)基的氮源為蛋白胨和酵母膏，但由于采用靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)時間需要600小時(25天)，其有效成份結(jié)合蛋白多糖(Proteinboundpolysaccharide)的提取采用硫酸銨鹽析法，該產(chǎn)物抑制的瘤譜為動物Sarcoma-180和Ehrlich細(xì)胞。分析上述兩項(xiàng)專利，尚存在以下不足之處培養(yǎng)時間長、培養(yǎng)基配方成本高、提取物抑瘤譜窄，也未見對人體癌細(xì)胞的抑癌作用。
本發(fā)明旨在創(chuàng)造一種發(fā)酵時間短、培養(yǎng)基成本低廉、菌絲體內(nèi)B組分高的云芝糖肽(PSP)的生產(chǎn)方法，從而獲得一種具有廣泛抑制人癌細(xì)胞與提高機(jī)體免疫功能的無毒免疫調(diào)節(jié)劑-云芝糖肽(PSP)。
本發(fā)明方法采用如下技術(shù)、步驟實(shí)現(xiàn)發(fā)明任務(wù)。
一、菌株的選育與特征本發(fā)明使用的菌株是從中國吉林、湖南、四川、廣東、福建、云南、浙江、上海等地分離和蒐集的46株云芝(Coriolusversicolor)中經(jīng)篩選、馴化而得到的一株優(yōu)良菌株，它特別適合于深層發(fā)酵，在培養(yǎng)過程中會散發(fā)出濃郁的水果香味。其沉沒菌絲體不是絲狀而呈球狀。中國云芝菌株Cov-1對培養(yǎng)基的適應(yīng)性強(qiáng)，可用廉價原料作碳、氮源。所產(chǎn)糖肽能直接抑制人癌細(xì)胞的增殖。
本發(fā)明使用的中國云芝菌株Cov-1，可用普通真菌篩選技術(shù)和液體深層培養(yǎng)、馴化技術(shù)在彩絨革蓋菌〔Coriolusversicolor(Fr)Quel)中選育。
二、菌株的培養(yǎng)本發(fā)明采用三級通氣發(fā)酵法生產(chǎn)云芝菌絲體，因而發(fā)酵周期短，每次生產(chǎn)只需48-72小時。與靜止培養(yǎng)法比，不僅生產(chǎn)規(guī)模大，時間也縮短5～10倍。本技術(shù)的生產(chǎn)流程如下
種子罐、繁殖罐和發(fā)酵罐的投料量為70%，接種量為10%，罐溫24-30℃，通氣量1∶0.5～1∶1.0(V/V)，攪拌轉(zhuǎn)速100～200rpm。發(fā)酵氮源不用蛋白胨和酵母膏，碳源也不用麥芽膏，而是選用黃豆餅粉、花生餅粉和糖蜜。種子罐和繁殖罐的發(fā)酵時間為48小時，發(fā)酵罐的發(fā)酵時間為60～72小時。
三、云芝糖肽(PSP)的提取從云芝菌絲體中提取抗癌多糖主要有鹽析法(硫酸銨鹽)和噴霧干燥法。前者需要經(jīng)透析、脫鹽，工藝復(fù)雜，不利于生產(chǎn)。后者方法雖簡單，但所得產(chǎn)品因未經(jīng)分離，成份混雜，糖肽含量低。本發(fā)明采用乙醇醇析法，即用1份云芝菌絲體熱水提取濃縮液和3份95%食用乙醇，在0～4℃下沉淀8小時的方法提取云芝糖肽(PSP)。本方法簡便，所得糖肽成份也較純。
四、云芝糖肽(PSP)的藥效試驗(yàn)及慢性毒性試驗(yàn)用上述發(fā)明方法獲得的云芝糖肽(PSP)抗癌活性強(qiáng)，不僅能抑制動物腫瘤(Sarcoma-180、Ehrlich細(xì)胞)的生長，且能抑制人肺癌、胃癌、單核細(xì)胞白血病和淋巴瘤的增殖。用標(biāo)記前體摻入法測試，云芝糖肽(PSP)能阻抑Ehrlich腹水癌細(xì)胞RNA和DNA的合成。用體外培養(yǎng)法試驗(yàn)證明，云芝糖肽(PSP)能直接使人肺癌細(xì)胞發(fā)生畸變，如細(xì)胞核腫大、多核、染色質(zhì)凝集、核膜粗糙等。下表1列舉了云芝糖肽(PSP)對人和動物腫瘤細(xì)胞的抑制率。
此外，用本方法獲得的云芝糖肽(PSP)，還能明顯地提高荷瘤機(jī)體的免疫球蛋白(IgG)、補(bǔ)體C3和血清溶血素(HC30)的含量。下表2列舉了云芝糖肽(PSP)對荷瘤(S-180)小鼠免疫功能的影響。
表1.
PSP濃度作用時間腫瘤細(xì)胞抑制率%體外試驗(yàn)1mg/ml48小時人胃癌(7901)38.11mg/ml72小時人肺癌(CPC)39.41mg/ml72小時人淋巴瘤(SLY)39.51mg/ml72小時人白血病(MEL)63.51mg/ml72小時鼠白血病(P.388)96.32mg/ml60分鐘Ehrlich腹水癌RNA合成80.32mg/ml120分鐘Ehrlich腹水癌DNA合成38.5體內(nèi)試驗(yàn)50μg/ml21天Sarcoma-18064(小鼠品(Cip×10)系、ICR)100μg/ml(PO×10)13天Sarcoma-18052表2.
IgG(μg/10ml) 補(bǔ)體C3(μg/10ml) 血清溶血素(HC30)對照18±373±18316±100加PSP(1mg/kg、PO×10) 21±1＊95±12＊422±55＊＊＊表示P＜0.01＊＊表示P＜0.05
云芝糖肽(PSP)對腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能也有明顯的促進(jìn)作用。用注射環(huán)磷酰胺小鼠作試驗(yàn)，云芝糖肽(PSP)能抵抗由環(huán)磷酰胺引起的白血球降低和食欲減退的作用。用醋酸扭體法及熱板法試驗(yàn)，云芝糖肽(PSP)有明顯的鎮(zhèn)痛效果?？傊?，用本方法獲得的云芝糖肽(PSP)，不僅抑制人癌細(xì)胞增生，而且能降低和消除由化療和放射治療引起的毒副反應(yīng)。
云芝糖肽(PSP)的產(chǎn)生菌為無毒的中國云芝菌株Cov-1，生產(chǎn)所用培養(yǎng)基和乙醇溶劑均無毒性，后處理中的丙酮和無水乙醚是極易揮發(fā)的物質(zhì)，云芝糖肽的成品中不會殘留。經(jīng)用哺乳動物靈長目猴子作慢性毒性試驗(yàn)證明，大劑量服用PSP半年，動物均無毒性反應(yīng)。長期服用PSP的病人證明，PSP不僅不會產(chǎn)生任何毒副反應(yīng)，反而能增強(qiáng)病員機(jī)體的抗癌免疫能力。
本發(fā)明的一種云芝糖肽(PSP)的生產(chǎn)方法，能獲得高活性的有抑制人癌細(xì)胞與提高負(fù)瘤機(jī)體免疫功能的云芝糖肽(PSP)，概括起來有以下六點(diǎn)特色和實(shí)用效果1.本發(fā)明的云芝糖肽(PSP)的生產(chǎn)方法，以中國云芝菌株Cov-1為菌種，采用通氣發(fā)酵法，能在2-3天內(nèi)培養(yǎng)大量云芝菌絲體，比靜止培養(yǎng)法10-25天快5-8倍。
2.本發(fā)明采用黃豆餅粉、花生餅粉等廉價原料代替昂貴的蛋白胨、酵母膏作氮源，大大降低了生產(chǎn)成本。
3.本發(fā)明采用醇析法提取抗癌多糖，比用硫酸銨鹽析法提取的工藝更為簡化，比用噴霧干燥法所得的產(chǎn)品成份更純。
4.本發(fā)明用Cov-1菌株生產(chǎn)的云芝糖肽(PSP)含有較多的B組分，不僅能抑制動物腫瘤細(xì)胞，而且能抑制人肺癌、胃癌、淋巴瘤及單核細(xì)胞白血球病等細(xì)胞的增生。
5.用本發(fā)明方法獲得的云芝糖肽(PSP)能明顯提高機(jī)體抗癌免疫能力，增強(qiáng)吞噬功能，提高耐缺氧能力，提高IgG、補(bǔ)體C3、溶血素HC30值及白血球數(shù)。
6.用本發(fā)明方法獲得的云芝糖肽(PSP)，能明顯降低化療放療引起的毒副反應(yīng)，提高食欲，緩解疼痛，提高耐缺氧能力。
下面提供本發(fā)明方法的三個實(shí)施例，以進(jìn)一步闡述發(fā)明方法的技術(shù)與步驟。
實(shí)施例1.
取用液氮保存的中國云芝Cov-1菌株，移植在PDA斜面培養(yǎng)基上，25℃培育10天。PDA配方如下馬鈴薯煮汁＊960ml葡萄糖20g瓊脂20gpH6.5＊去皮馬鈴薯200g，加水煮沸5分鐘后取汁。滅菌1.2kg/cm230分鐘。
取斜面菌種，將中國云芝Cov-1菌株菌絲體移入裝有100ml液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，25℃下往復(fù)振蕩5天，沖程4cm，振蕩頻率100rpm。將搖瓶培養(yǎng)物合并，以壓差法移接入50～100ml種子罐中，罐內(nèi)裝量70%(V/V)，接種量10%(V/V)，通氣培養(yǎng)2天后移入500L3～1000L3繁殖罐。繁殖罐菌絲長濃后，再以1∶10的體積比擴(kuò)大繁殖到發(fā)酵罐。罐溫24-30℃，通氣量1∶1(V/V)，機(jī)械攪拌速度100～200rpm。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方為糖蜜40g黃豆餅粉20gMgSO41.0gK2HPO41.0gCaCO35.0gVB11000μg水加至1000ml發(fā)酵罐繁殖60-72小時后，醪液經(jīng)板框壓濾，得云芝菌絲體濾餅。將濾餅加水10倍后，用細(xì)胞搗碎機(jī)打碎細(xì)胞，然后加90～99℃熱水回流浸取3-5小時，將浸取液再經(jīng)真空薄膜濃縮，取1份濃縮液加3份95%乙醇，在0～4℃條件下醇析8小時。取醇析物加水(1∶100重量比)溶解后，用葡萄糖凝膠(Sephadex-G75)進(jìn)行層析分離，收集既含多肽(用紫外230nm法測定)，又含多糖(用蒽酮法測定)的部分，再經(jīng)真空濃縮和冷凍干燥后即可獲得褐色粉末狀的云芝糖肽(PSP)。
實(shí)施例2.
取礦油保存下的中國云芝Cov-1菌株，移植于GMY培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)。GMY培養(yǎng)基配方
葡萄糖10g酵母膏4g麥芽汁(糖度16)110ml水加足至1000mlpH自然瓊脂20g將在GMY培養(yǎng)基上活化的中國云芝Cov-1菌株的菌絲體移入內(nèi)裝50ml培養(yǎng)基的250ml三角瓶內(nèi)，用旋轉(zhuǎn)式搖瓶機(jī)培養(yǎng)4天，轉(zhuǎn)速200rpm，隨后擴(kuò)大接種入血清瓶中，並通入無菌空氣。通氣量為1∶1(V/V)，25℃下培養(yǎng)3天后即可移入50-100L3的種子罐中，繁殖后再擴(kuò)大培養(yǎng)于10t自吸式發(fā)酵罐中。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下糖蜜3%葡萄糖1%花生餅粉2%K2HPO40.1%KH2PO40.1%MgSO40.1%通氣發(fā)酵2.5天后，用離心法濾去醪液。將沉淀物烘干磨碎，加入100倍熱水(90-95℃)，回流浸取4小時。將熱水浸取物經(jīng)濃縮后用加入3倍體積的95%乙醇，低溫下醇析6小時，醇析物用無水丙酮洗滌3次，再用無水乙醚洗滌3次，于50℃下烘干。處理過的醇析物用薄層雙板層析法檢驗(yàn)(用茚三酮和茴香醛顯色)，其多肽顯示的Rf值應(yīng)與多糖顯示的Rf值相一致，證明所提取的云芝糖肽是連接著多肽的多糖體。
實(shí)施例3.
取低溫保藏的中國云芝Cov-1斜面菌種一支，移入裝有50ml麥芽汁培養(yǎng)基的1500ml培養(yǎng)瓶中，通氣培養(yǎng)5天。其培養(yǎng)基配方為黃豆芽煮汁＊1000ml葡萄糖10gK2HPO40.5gKH2PO40.5gMgSO40.1gpH6.5＊用200g黃豆芽加水煮10分鐘后取汁。
然后依次接入50ml種子罐、500ml繁殖罐及5噸發(fā)酵罐中通氣培養(yǎng)2-3天。將發(fā)酵醪經(jīng)壓濾后收得的濕菌絲體用100℃熱水浸取3小時。將浸取液直接通過超濾膜(10Kd)。在4kg/cm2氮?dú)鈮毫ο聻V除小于1萬分子量的物質(zhì)，然后用150Kd濾膜壓濾，收集其流出液，流出液經(jīng)醇析后即為分子量為10萬左右的云芝糖肽(PSP)粗品。本品用酚硫酸法及勞里法測定均呈陽性反應(yīng)，含葡萄糖30-40%，含多肽15-25%。
按照上述實(shí)施例1.2.3.方法生產(chǎn)的云芝糖肽，不僅能使腫瘤患者的腫癌縮小或消失，而且能明顯提高患者的白血球數(shù)，緩解疼痛，提高食欲。以下是部分服用用本方法生產(chǎn)的云芝糖肽的治療效果。
病例1惡性淋巴瘤(B型，小裂細(xì)胞型)沈×× 女 44歲記者 1985年12月患鼻咽部惡性淋巴瘤，白血球3800/mm3。用鈷60放射治療后，味覺消失，食欲驟降。后用化學(xué)藥物治療，療程未到 1/2 ，白血球下跌到2000/mm3。加服沙肝醇，利血生，鵝血片，茜草雙酯等升白血球藥物后亦未見顯效，白血球數(shù)始終徘徊在2000-3000/mm3間，化療無法繼續(xù)進(jìn)行。1986年4月起應(yīng)用PSP，服藥兩周后，胃口頓開，白血球數(shù)上升到5200/mm3，體力漸漸恢復(fù)。1986年9月起已重上文壇，采訪寫作。
病例2惡性黑色素瘤閔×× 女 45歲二胡演奏家 1983年檢查出患有惡性黑色素瘤，在上海腫瘤醫(yī)院用手術(shù)及化學(xué)藥物治療(治療方案CCNV)?；熀蠖靖狈磻?yīng)大，每天劇烈嘔吐7-8次，白血球下降至4000以下，精神萎糜，食欲低下。后加服PSP，第二天嘔吐次數(shù)就減少，精神有好轉(zhuǎn)，食欲漸見提高，白血球上升，穩(wěn)定在5800-6000/mm2，至今已連服2年半，總劑量2738g?，F(xiàn)在已恢復(fù)健康，1987年起重上舞臺，不僅在國內(nèi)，而且還赴新加坡及香港地區(qū)多次獨(dú)奏公演。
病例3轉(zhuǎn)移性腹膜癌吳×× 女 37歲 1986年9月檢查得知右下腹腫塊明顯，大5.5×5.0cm2，質(zhì)硬，表面粗糙，伴有腹水及梗阻性便秘，不能進(jìn)食，白血球數(shù)3800/cm3，抽腹水時發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，經(jīng)用抗癌139注射無明顯療效。后加服PSP治療，達(dá)126g時檢查腹水基本消退，腫塊縮小至3.0×3.0cm2，白血球數(shù)明顯上升到5200/cm3，大便通暢，食欲良好。
病例4惡性淋巴瘤IVB褚×× 男 65歲軍隊(duì)離休干部 1983年因竇房結(jié)綜合癥安裝了埋藏式心臟起博器，1985年6月又在上海中山醫(yī)院診斷患有惡性淋巴瘤，腫塊位於腹膜后主動脈處，大98×100mm3，立即進(jìn)行COP化學(xué)藥物治療，共6個療程，后轉(zhuǎn)上海腫瘤醫(yī)院，用COMP方案化療13個療程。開始化療時，腸胃道反應(yīng)嚴(yán)重，骨髓明顯抑制，食欲減退。后加服PSP(每天1.6-2.4g)，腸胃道反應(yīng)逐漸消失，骨髓抑制癥狀改善，經(jīng)過19個療程的化療后，白血球仍持續(xù)穩(wěn)定在4000/mm3以上。病人自我感覺良好，平時很少感染。1987年4月檢查，腫塊消失，隨后停止化療，改用CB1348維持治療，並繼續(xù)加服PSP，累計(jì)口服2190g，目前病情穩(wěn)定，至今已活3年又9個月。
病例5晚期食道癌李×× 男 58歲患食道癌，右上縱隔轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶腫塊7×9cm2，壓迫食道，鋇劑通不過，進(jìn)食困難，聲音嘶啞。1986年10月27日用CO60，加PSP(每天口服3g)進(jìn)行綜合治療，至第二周時，因PSP短缺而中途停服，病人即訴說“食欲差”“精神疲憊”“人軟無力”，不能堅(jiān)持治療，后又獲PSP，服后次日病人即覺“精神好轉(zhuǎn)”“飯食增加”，從而完成了治療計(jì)劃。至12月22日照光檢查，原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶已完成緩解，腫塊消失，病人進(jìn)食正常，發(fā)音恢復(fù)如常。至今健在。
病例6胃癌陸×× 男 64歲 1987年9月常州中醫(yī)醫(yī)院胃鏡檢查及病理診斷患胃竇部大彎管狀腺癌。1987年10月行根治手術(shù)。術(shù)后用FM方案治療。化療前白血球數(shù)為4000/mm3。第一次化療總量5-Fu 1500mg，絲裂霉素16mg，給藥后白血球數(shù)下降至1200/mm3，病人精神疲憊，納差，消瘦，不得不中斷化療。經(jīng)用常規(guī)升白藥物(提高白血球數(shù)量的藥物)兩周后，白血球數(shù)未見回升。后改用PSP，每日三次，每天2.0克，口服兩周后，白血球數(shù)上升到3500/mm3，全身癥狀改善。繼續(xù)服用PSP，並恢復(fù)化療(FM方案)，每周檢查血象兩次，均在正常值范圍，至化療結(jié)束，白血球數(shù)始終穩(wěn)定在5000-6000/mm3。病人胃納好轉(zhuǎn)，精神恢復(fù)，睡眠改善，體重增加。
病例7胃癌張××女76歲1984年12月經(jīng)X光消化道透視、胃鏡檢查及細(xì)胞培養(yǎng)，確診為胃癌Ⅳ期。1985年3月，腹部開始陣痛。每日服用止痛片及安眠藥，仍止不住。后發(fā)展到每天必須打阿托品針劑並口投安眠藥。因劇痛，病人無法忍受，多次要求施行安樂死術(shù)。1985年4月開始服用PSP。3天后腹痛明顯改善，7天后腹部劇痛基本停止。阿托品停用，安眠藥也不必服用，病人只覺腹部有隱痛感，能忍受。病人反應(yīng)服用PSP后自我感覺良好，精神好轉(zhuǎn)，食欲也有提高。
病例8重癥肝炎鄒××男12歲1987年3月出現(xiàn)進(jìn)行性黃疸及腹水。肝功能異?！睟I10mg%，TTT12μ，ZnT20μ，GPT100μ，HBsAg(-)〕，在常州一傳染病醫(yī)院住院部經(jīng)保肝治療，輸血漿及服中藥等措施治療，均無好轉(zhuǎn)，病癥日益惡化。5月底轉(zhuǎn)至常州中醫(yī)醫(yī)院。體檢癥狀黃疸明顯，肝臟右肋下未能觸及，脾臟2cm，腹水征(+)，Mass(-)。加服PSP后兩周(每天服PSP1.5g)，黃疸逐漸消退，尿量增加，隨之，腹水開始消退。一月后復(fù)查肝功能，BI為6mg%，TTT10μ，ZnT20μ，GPT80μ，全身癥狀開始明顯好轉(zhuǎn)，至服PSP后三月，患者黃疸明顯消退，肝臟右肋下可觸及2cm，質(zhì)地返軟，脾肋下觸及3cm左右，腹水癥(-)，肝功能復(fù)查，全部正常，食欲佳，精神好，已恢復(fù)正常活動。
權(quán)利要求
一種具有抑制人癌細(xì)胞與提高負(fù)瘤機(jī)體免疫功能的云芝糖肽(PSP)生產(chǎn)方法，其特征在于1、生產(chǎn)菌株Cov-1是從中國和各地分離的46株云芝(coriolusversicolor)中經(jīng)篩選、馴化后獲得的一株優(yōu)良菌株，其適宜于通氣發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中會散發(fā)出濃郁的水果香味，其沉沒菌絲呈球狀。
2.把(1)所述的Cov-1菌株逐級引入通氣發(fā)酵罐，通氣量為1∶0.5～1∶1.0(V/V)，攪拌速度為100～200rpm，發(fā)酵時間為60～72小時。
3.按(1)所述的菌株Cov-1在通氣發(fā)酵中是從黃豆餅粉或花生餅粉為氮源;以糖蜜和葡萄糖為碳源。
4.按(2)、(3)所述的培養(yǎng)物過濾得菌株Cov-1的菌絲體，破碎后，在90～100℃熱水中浸取3～5小時，得到菌絲體浸取液。
5.由(4)得到的浸取液經(jīng)濃縮后，用1∶3-4(V/V)比例的乙醇在0～4℃溫度下醇析6～8小時，得醇析物。
6.由(5)得到的醇析物經(jīng)干燥處理，即可獲得褐色粉末狀的云芝糖肽(Polysaccharide-pepetide of Coriolus versicolor簡稱PSP)。
全文摘要
本發(fā)明是一種云芝糖肽(PSP)的生產(chǎn)方法。它采用通氣發(fā)酵法，經(jīng)60～70小時培養(yǎng)，從中國云芝cov-1菌株的菌絲體中，用熱水浸取和醇析提取獲得的一種具有抑制癌細(xì)胞與提高機(jī)體免疫功能的糖肽。
文檔編號C12P21/00GK1034957SQ8910547
公開日1989年8月23日 申請日期1989年2月1日 優(yōu)先權(quán)日1989年2月1日
發(fā)明者楊慶堯 申請人:上海師范大學(xué)