專利名稱：固定化細(xì)胞生產(chǎn)l-蘋果酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為用固定化的微生物細(xì)胞生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，更具體的說本發(fā)明涉及將含延胡索酸酶的細(xì)胞固定化，通過該酶的作用將底物反丁烯二酸轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸。
L-蘋果酸廣泛用于食品，醫(yī)藥等領(lǐng)域，在食品工業(yè)中用作酸味劑，可配制多種飲料和食品。因其有抑菌和輔助抗氧化作用，還可用作防腐劑。醫(yī)藥上可用于治療肝功能不全。還可用作除垢劑，驅(qū)蟲劑。此外可作為螢光增白劑的合成原料。全世界每年產(chǎn)量約3.5萬噸，它是國際市場上的暢銷貨。
延胡索酸酶又稱富馬酸酶，存在于一些微生物，如酵母、細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)，能催化反丁烯二酸轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸
已知一些用固定化微生物細(xì)胞將反丁烯二酸轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸的方法。西德專利2450137公布了一種用固定化細(xì)胞生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，用聚丙烯酰胺凝膠包埋產(chǎn)延胡索酸酶的微生物細(xì)胞，在柱式反應(yīng)器中連續(xù)轉(zhuǎn)化反丁烯二酸鹽為蘋果酸鹽。Yamamoto等報(bào)導(dǎo)用聚丙烯酰胺凝膠包埋產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)(Europ J.App l.Microbiol.3，169-183 1976)連續(xù)化生產(chǎn)L-蘋果酸，I.Takata等(Enzyme Microb.Technol.，Vol.2，30-36，1980)報(bào)導(dǎo)用卡拉膠包埋黃色短桿菌(B.flavum)，連續(xù)生產(chǎn)L-蘋果酸。楊廉婉等(微生物學(xué)報(bào)20(3)296-302，1980)研究了比較用聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂凝膠和明膠三種膠包埋產(chǎn)延胡索酸酶的皺褶假絲酵母C90，表明用聚丙烯酰胺凝膠包埋優(yōu)于用瓊脂凝膠或明膠，可用于連續(xù)化生產(chǎn)L-蘋果酸。以上報(bào)導(dǎo)的這些固定方法都是用的單一載體，聚丙烯酰胺凝膠中的單體有毒、抑制酶活力，而用卡拉膠包埋細(xì)胞，長時(shí)間使用固定化細(xì)胞易破碎。這些方法存在固定化細(xì)胞的延胡索酸酶活力回收率不高，固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度不夠理想等缺點(diǎn)。
本發(fā)明的目的在于提供一種用固定化細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，提高固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度，減少細(xì)胞漏失，使延胡索酸酶的活力回收率明顯提高(在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)條件下，延胡索酸酶的活力回收率90%以上)，制備的固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度好，彈性強(qiáng)，易于操作。
本發(fā)明的特征在于使用混合載體制備含延胡索酸酶的固定化細(xì)胞，先用多孔珍珠巖粉吸附細(xì)胞，再與聚乙烯醇凝膠混合包理，在低溫下固化。
本發(fā)明所用的微生物細(xì)胞可以是產(chǎn)生胞內(nèi)的延胡索酸酶的酵母、細(xì)菌等，在下述實(shí)驗(yàn)條件下，以皺褶假絲酵母(Candida rugosa)Cr10為好?，F(xiàn)以該菌株為例說明本發(fā)明的固定化細(xì)胞制備過程。
菌種保存在麥芽汁瓊脂斜面上，按微生物學(xué)常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)酵養(yǎng)基為0.3%NH4Cl，0.05%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%酵母膏，6%重液體石蠟和3%CaCO3，在旋轉(zhuǎn)搖床上30℃培養(yǎng)96小時(shí)。然后在4℃，每分鐘1萬轉(zhuǎn)離心10分鐘，收集細(xì)胞，稱重，加生理鹽水制成細(xì)胞懸浮液。每毫升細(xì)胞懸浮液中含有0.5克濕細(xì)胞。
細(xì)胞懸浮液中加入多孔珍珠巖粉(一種無機(jī)保溫材料)，細(xì)胞懸浮液與多孔珍珠巖粉的比例為每2毫升懸浮液加入0.3-1.0克多孔珍珠巖粉，即濕細(xì)胞與多孔珍珠巖粉的比例為10.3-1.0，充份攪拌使充份吸附，將聚乙烯醇事先溶解，制成凝膠液，加入聚乙烯醇凝膠溶液，使聚乙烯醇在溶液中的最終濃度為10-18%(按重量計(jì))，細(xì)胞濃度為10%(按重量計(jì))，多孔珍珠巖粉為3-10%。上述混合物在-20--30℃放置18-24小時(shí)，即制成固定化細(xì)胞。將制得的固定化細(xì)胞切成邊長2-3mm的小塊，用生理鹽水洗數(shù)次。用1M pH8.5的反丁烯二酸銨于30℃浸泡固定化細(xì)胞24小時(shí)后，裝在柱式反應(yīng)器中，催化底物轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸。
反丁烯二酸用氨水溶解，配成反丁烯二酸銨水溶液，流經(jīng)柱式反應(yīng)器。反丁烯二酸銨的濃度為1-1.5M，以1-1.25M為好，pH為8.5，以裝有100毫升固定化細(xì)胞的反應(yīng)器為例，流速以5-15毫升/小時(shí)為宜，在30℃條件下反應(yīng)，流出液為轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物L(fēng)-蘋果酸銨溶液。溶液經(jīng)酸化，沉淀出未反應(yīng)的反丁烯二酸，回收再利用。將L-蘋果酸銨溶液中加入氫氧化鈣，轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸鈣二水鹽，過濾烘干后加水做成懸浮液再加入硫酸溶液，形成硫酸鈣沉淀，除去硫酸鈣沉淀，得到L-蘋果酸水溶液，再經(jīng)過陽離子交換樹脂柱和陰離子交換樹脂柱，然后在60℃減壓濃縮，最終得到L-蘋果酸結(jié)晶。過濾掉母液(母液回收套用)，即得到L-蘋果酸結(jié)晶，在50℃烘干，得到白色結(jié)晶的L-蘋果酸。
測定自然細(xì)胞和固定化細(xì)胞的延胡索酸酶的表現(xiàn)活力(測定方法按楊廉婉等微生物學(xué)報(bào)20(3)296-302，1980)。固定化細(xì)胞的延胡索酸酶活力回收率的計(jì)算方法為固定化細(xì)胞的延胡索酸酶的表現(xiàn)活力/自然細(xì)胞的延胡索酸酶的表現(xiàn)活力×100%。
L-蘋果酸的定量測定用Goodman等人(Anal.Chem.29283，1957)的方法。
本發(fā)明用多孔珍珠巖粉吸附細(xì)胞，用聚乙烯醇包埋制備固定化細(xì)胞，方法簡便易行，成本低，制得的固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度好，彈性好。該方法可減少細(xì)胞的漏失，固定化細(xì)胞的延胡索酸酶的活力回收率高，達(dá)90%以上，固定化細(xì)胞的延胡索酸酶的活力可達(dá)12000微克分子/克·小時(shí)。用該固定化細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)L-蘋果酸，轉(zhuǎn)化率80%以上，無付產(chǎn)物。
實(shí)施例1將皺褶假絲酵母Cr10按常規(guī)方法接種培養(yǎng)，培養(yǎng)液在4℃，1萬轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集細(xì)胞，用生理鹽水懸浮，使每毫升菌懸液含0.5克濕細(xì)胞。測定自然細(xì)胞的延胡索酸酶的表現(xiàn)活力為13569.4微克分子/克·小時(shí)將40毫升上述細(xì)胞懸浮液(含20克濕細(xì)胞)加入12克多孔珍珠巖粉，充份混合、吸附，再加入18%的聚乙烯醇132克(含聚乙烯醇約24克)，加水至200克，攪拌，混合均勻后，置于-30℃，18小時(shí)固化，制備成固定化細(xì)胞，切成邊長2-3mm小塊，用生理鹽水洗三次，抽濾干，測定制得的固定化細(xì)胞的延胡索酸酶的表現(xiàn)活力為12664.9微克分子/克·小時(shí)，延胡索酸酶的活力回收率為93.3%。
將固定化細(xì)胞在30℃條件下，用1M pH8.5的反丁烯二酸銨水溶液浸泡24小時(shí)，過濾出固定化細(xì)胞，量取100毫升固定化細(xì)胞，裝入5×30厘米的反應(yīng)柱中，30℃反應(yīng)，加入pH8.5的1.25M的反丁烯二酸銨水溶液，以不同的速度流經(jīng)反應(yīng)柱，分別收集流出的蘋果酸銨溶液，測定底物轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果列于表1中。
表1 不同流速的反丁烯二酸銨轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸的轉(zhuǎn)化率反丁烯二酸銨溶液流速 轉(zhuǎn)化率(毫升/小時(shí)) (%)6 85.512 83.121 73.542 67.554 56.0從表中可以看出底物對(duì)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率在流速6毫升/小時(shí)達(dá)85.5%。
實(shí)施例2按實(shí)施例1的方法制備皺褶假絲酵母Cr10的固定化細(xì)胞，細(xì)胞濕重、多孔珍珠巖粉、聚乙烯醇分別為10%，6%和12%。自然細(xì)胞的延胡索酸酶的表現(xiàn)活力為13269.2微克分子/克·小時(shí)。固定化細(xì)胞酶的表現(xiàn)活力為12061.7微克分子/克·小時(shí)。該酶活力的回收率為90.9%。
取100毫升上述制備的固定化細(xì)胞，裝入5×30厘米的柱式反應(yīng)器中，在30℃用1.25M pH8.5的反丁烯二酸銨水溶液以每小時(shí)12毫升的流速流經(jīng)反應(yīng)柱，連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)30天，分次取樣測定轉(zhuǎn)化率(每隔一天測一次)。底物轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸的轉(zhuǎn)化率為80-82%，平均81.4%.
取1升柱中流出液，加200毫升濃鹽酸沉淀除去未轉(zhuǎn)化的反丁烯二酸(可回收再利用)，上清液加Ca(OH)2，至pH6.8(用掉Ca(OH)285.5克)，得到蘋果酸鈣二水鹽，抽濾，50℃烘干，得190克L-蘋果酸鈣二水鹽。加入1100毫升蒸餾水制成懸浮液，加入90毫升硫酸水溶液(3份98%的硫酸加入1份水配制)，邊加邊攪拌，形成硫酸鈣沉淀，過濾掉硫酸鈣沉淀，濾液通過180毫升732陽離子交換樹脂柱，再通過180毫升AmberliteIR-45陰離子交換樹脂柱，得到L-蘋果酸溶液，60℃減壓濃縮(濃縮到L-蘋果酸溶液的比重為1.37)，自然降溫到室溫，結(jié)晶出L-蘋果酸，50℃烘干，得到61.8克L-蘋果酸結(jié)晶。母液回收得到20.8克L-蘋果酸結(jié)晶，總收率70%，按楊廉婉等的方法(微生物學(xué)報(bào)20(3)296-302，1980)對(duì)得到的L-蘋果酸進(jìn)行質(zhì)量鑒定，結(jié)果列于表2。
表2 L-蘋果酸的質(zhì)量鑒定含量(%) 熔點(diǎn)(℃) 比旋光度[α]20D紙層析(在5%水溶液中) Rf值99.6 100-105 -2.2 0.46質(zhì)量鑒定符合國外文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種用固定化細(xì)胞生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，包括將反丁烯二酸經(jīng)細(xì)胞內(nèi)延胡索酸酶的催化作用轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸，其特征在于使用多孔珍珠巖粉和聚乙烯醇混合載體制備含延胡索酸酶的固定化細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是先用多孔珍珠巖粉與細(xì)胞懸浮液混合，吸附，再與聚乙烯醇混合包埋，在低溫下固化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于細(xì)胞(按濕重算)、多孔珍珠巖粉、聚乙烯醇三者的用量分別為10%，3-10%和10-18%，固化溫度為-20--30℃，固化時(shí)間為18-24小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于固定化微生物細(xì)胞可以為酵母、細(xì)菌，用發(fā)酵法制得。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所用的固定化細(xì)胞為皺褶假絲酵母Cr10，用發(fā)酵方法制得。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任選一項(xiàng)所述的方法，將pH8.5的1.25M的反丁烯二酸銨水溶液流經(jīng)固定化細(xì)胞填充的反應(yīng)柱，得到蘋果酸銨水溶液，經(jīng)純化、分離，得到L-蘋果酸白色結(jié)晶。
全文摘要
本發(fā)明為一種用固定化細(xì)胞以反丁烯二酸為原料生產(chǎn)L-蘋果酸的方法。將發(fā)酵得到的微生物細(xì)胞用多孔珍珠巖粉吸附，再用聚乙烯醇包埋，低溫固化。本方法可減少細(xì)胞的漏失，固定化細(xì)胞的延胡索酸酶回收率90％以上，產(chǎn)物對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率80％以上，固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度好，彈性好。
文檔編號(hào)C12N11/00GK1067451SQ9110360
公開日1992年12月30日 申請(qǐng)日期1991年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1991年6月4日
發(fā)明者楊廉婉 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所