一種利用多菌株固定化細胞組合物連續(xù)生產(chǎn)4-羥基肉桂醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多菌株固定化細胞組合物連續(xù)生產(chǎn)4?羥基肉桂醇的方法。該方法所用A菌株為重組菌株E.coli M15?4Cl?CCR，B菌株為重組菌株E.coli M15?CAD；具體操作步驟如下：1、菌株培養(yǎng)；2、菌株的固定化，分別制得A菌株固定化細胞顆粒和B菌株固定化細胞顆粒；3、固定化細胞連續(xù)生產(chǎn)4?羥基肉桂醇。本發(fā)明采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)進行4?羥基肉桂醇的生產(chǎn)，將多菌株固定化細胞組合物連續(xù)生產(chǎn)的方法運用于植物然代謝物的合成，具有重要的實踐意義。同時建立了4?羥基肉桂醇的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，為這類芳香族聚合物提供更有效的分析手段。
【專利說明】
-種利用多菌株固定化細胞組合物連續(xù)生產(chǎn)4-哲基肉桂醇的 方法
技術(shù)領域
[0001]本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領域，具體設及采用細胞固定化技術(shù)生產(chǎn)4-徑基肉桂醇的 方法。
【背景技術(shù)】
[000^ 4-徑基肉桂醇是一類植物天然代謝物，包括香豆醇，咖啡醇，松柏醇和芥子醇。它 們是多種植物次生代謝物生物合成的中間體，如香蘭素、木脂素等。其中香豆醇，松柏醇和 芥子醇是木質(zhì)素的=個基本組成單元，對于水分運輸、機械支持和植物病原體防御有重要 作用。此外，運類醇還有重要的醫(yī)藥價值。例如，松柏醇還是合成水飛劑賓的重要中間體，可 用于治療肝臟疾病。研究4-徑基肉桂醇類物質(zhì)對于探究與其相關(guān)的生物合成和加工過程十 分必要，是研究開發(fā)生物醫(yī)學類藥物至關(guān)重要的一步。
[0003] 從植物中直接提取運類醇的方法具有一定的局限性，如較長的生長周期，繁瑣的 分離步驟，低產(chǎn)率，W及易受環(huán)境因素影響等。利用化學合成法生產(chǎn)存在操作步驟繁瑣、產(chǎn) 率低、副產(chǎn)物多和難于純化等問題。利用微生物固定化細胞生產(chǎn)醇是化學合成法的另一種 替代方法。與傳統(tǒng)的合成技術(shù)相比較，細胞固定化技術(shù)具有W下主要優(yōu)點：（1)細胞密度高， 反應速度加快，有較高的生產(chǎn)能力；（2)細胞被固定化后，不會產(chǎn)生流失現(xiàn)象，分離純化過程 中菌體細胞易分離；（3)可W多次重復使用或連續(xù)使用；（4)對外界環(huán)境緩沖作用大，細胞不 受剪切效應影響，對抗污染能力提高；巧)無需輔酶再生，節(jié)約成本。
[0004] 現(xiàn)有固定化技術(shù)研究很多，但多研究局限于單一菌株的固定化。4-徑基肉桂醇生 產(chǎn)工藝設及巧巾主要的酶和相關(guān)技術(shù)過程:4-香豆酸:輔酶A連接酶(4化)將4-徑基肉桂酸轉(zhuǎn) 化為4-徑基肉桂酸輔酶A衍生物，肉桂酷輔酶A還原酶(CCR)將4-徑基肉桂酸輔酶A衍生物轉(zhuǎn) 化為4-徑基肉桂醒，肉桂醇脫氨酶(CAD)將4-徑基肉桂醒轉(zhuǎn)化為4-徑基肉桂醇。本發(fā)明將4- 徑基肉桂醇生產(chǎn)相關(guān)微生物分別固定化，形成多菌株固定化細胞組合物連續(xù)生產(chǎn)的方法， 提高了生產(chǎn)效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有4-徑基肉桂醇制備工藝上的不足，采用細胞固定化技術(shù)將4-徑基 肉桂醇生產(chǎn)相關(guān)的微生物菌株固定，形成多菌株固定化細胞組合物連續(xù)生產(chǎn)的方法，并且 建立了 4-徑基肉桂醇的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。
[0006] 多菌株固定化細胞組合物連續(xù)生產(chǎn)4-徑基肉桂醇(香豆醇，咖啡醇和松柏醇）的方 法，具體操作步驟如下： 1、菌株培養(yǎng) 所用菌株為A菌株和B菌株； A菌株為重組菌株怎M15-4C1-CCR，誘導后能高效表達融合雙功能酶4C1-CCR，具 有4C1和CCR兩種酶的催化活力，可將4-徑基肉桂酸轉(zhuǎn)化為4-徑基肉桂醒； B菌株為重組菌株怎.CO^ M15-CAD;誘導后能高效表達CAD,可將4-?基肉桂醒轉(zhuǎn)化為 4-徑基肉桂醇； LB固體培養(yǎng)基，Wg/L計，膜蛋白腺10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.5，氨節(jié)青霉素0.1，卡 那霉素0.025 ; LB液體培養(yǎng)基，Wg/L計，膜蛋白腺10，酵母提取物5，化Cl 10，瓊脂粉15， pH7.5，氨節(jié)青霉素0.1，卡那霉素0.025; 1.1、 A菌株的培養(yǎng)，將重組菌株怎.M15-4C1-CCR接種于LB固體培養(yǎng)基，活化;挑取 重組菌株單菌落接種于30mL含10化g/mL氨節(jié)青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，于37° C、200巧m振蕩培養(yǎng)過夜;取30mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于IL含10化g/mL氨節(jié)青霉素和25iig/ mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37° C、200rpm振蕩培養(yǎng)至控制0D600為0.6;向培養(yǎng)物中加 入誘導物異丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至終濃度0.4mmol/l，于28° C、200巧m誘導培養(yǎng)化； 1.2、 B菌株的培養(yǎng)，將重組菌株怎.M15-CAD接種于LB固體培養(yǎng)基，活化;挑取重組 菌株單菌落接種于30mL含10化g/mL氨節(jié)青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于 37°(：、200巧111振蕩培養(yǎng)過夜;取301111培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于比含10化肖/血氨節(jié)青霉素和254肖/血卡那 霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C JOOrpm振蕩培養(yǎng)至控制0D600為0.6;向培養(yǎng)物中加入誘導 物異丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至終濃度0.4mmol/l，于28° C、200巧m誘導培養(yǎng)地； 2、 菌株的固定化 2.1、 細胞的離屯、洗涂:取A菌株菌液1L、B菌株菌液1L，在轉(zhuǎn)速4000rpm/min條件下，離 屯、15min，傾去上清液，用IOmL 0.9%生理鹽水懸浮細胞，制得A菌株細胞懸浮液和B菌株細胞 懸浮液； 2.2、 取A菌株細胞懸浮液IOmL和B菌株細胞懸浮液IOmL,與75mL 2%的海藻酸鋼溶液均 勻混合，使用注射器滴入150mL 2%的化Cl2溶液中，固定化細胞顆粒直徑2.5mm，4°C冰箱放 置12h使其充分固化，傾去上清液，加入無菌水洗涂2次，制得A菌株固定化細胞顆粒和B菌株 固定化細胞顆粒，置于4° C冰箱中備用； 3、 固定化細胞連續(xù)生產(chǎn)4-徑基肉桂醇 3.1、 IOOmL反應體系組成：IOOmL含A菌株固定化細胞顆粒和B菌株固定化細胞顆粒的LB 液體培養(yǎng)基，終濃度為ImM的底物4-徑基肉桂酸(分別為香豆酸、咖啡酸和阿魏酸）；反應混 合物于37°C、200巧m避光振蕩反應2-lOh，反應后混合物用等體積乙酸乙醋萃取，有機相用 于產(chǎn)物分析； 3.2、 產(chǎn)物通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行分析。反相高效液相色譜柱為ZORBAX 300SB-C18柱（2.1X150mm，3.5皿；Agilent，San化Clara，CA，USA)，流動相為乙臘， 流速0. 10~0.15 mL/min，梯度洗脫的具體條件見表1，檢測波長為280皿;質(zhì)譜為配備ESI 源的離子阱質(zhì)譜化CQ DECA XP MAX),質(zhì)譜檢測的具體條件見表2; 表1.分離底物4-徑基肉桂酸和產(chǎn)物4-徑基肉桂醇的高效液相色譜流動相梯度洗脫條 件

產(chǎn)物產(chǎn)率的計算:產(chǎn)率(％)=任/Cs X 100% 式中任為反應后4-徑基肉桂醇的濃度，Cs為反應前底物的濃度； 香豆醇、咖啡醇、松柏醇的產(chǎn)率分別為53.7%，22.1，56.4%。
[0007]本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點： (1) 利用多菌株固定化細胞進行多酶體系的協(xié)同反應，實現(xiàn)了從酸到醇的連續(xù)生產(chǎn)； (2) 采用重組DNA技術(shù)所構(gòu)建的4C1-CCR酶分子，保留了 4C1酶分子和CC賄每分子各自的 酶活性，解除了細胞膜對中間產(chǎn)物(4-徑基肉桂酸CoA衍生物)進出細胞的阻礙； (3) 與固定化酶法相比較，免去了破碎細胞提取酶的步驟，無需輔酶再生，節(jié)約了成本， 簡化了設備投資； (4) 固定化細胞可W重復使用，減化游離細胞培養(yǎng)過程，還減少了營養(yǎng)基質(zhì)的浪費，并 且對外界環(huán)境緩沖作用大，細胞不受剪切效應影響，對抗污染能力提高； (5) 與化學合成法相比較，簡化了 4-徑基肉桂醇的生產(chǎn)工藝，直接將底物投入到固定化 細胞培養(yǎng)液中，大大減少了副產(chǎn)物的生成。
【附圖說明】
[000引圖1為本發(fā)明實施例1中利用重組菌株全細胞催化生產(chǎn)香豆醇的高效液相色譜圖 W及質(zhì)譜圖。A:反應初始時刻，底物香豆酸(SI)的高效液相色譜圖；B:反應一段時間后，底 物香豆酸（SI)和產(chǎn)物香豆醇(PO的高效液相色譜圖；C:香豆酸（SI)的二級質(zhì)譜圖；D:香豆 醇(Pl)的二級質(zhì)譜圖； 圖2為本發(fā)明實施例2中利用重組菌株全細胞催化生產(chǎn)咖啡醇的高效液相色譜圖W及 質(zhì)譜圖。A:反應初始時刻，底物咖啡酸(S2 )的高效液相色譜圖；B:反應一段時間后，底物咖 啡酸（SI)和產(chǎn)物咖啡醇(P2)的高效液相色譜圖；C:咖啡酸（S2)的二級質(zhì)譜圖；D:咖啡醇 (P2)的二級質(zhì)譜圖； 圖3為本發(fā)明實施例3中利用重組菌株全細胞催化生產(chǎn)松柏醇的高效液相色譜圖W及 質(zhì)譜圖。A:反應初始時刻，底物阿魏酸(S3)的高效液相色譜圖；B:反應一段時間后，底物阿 魏酸（SI)和產(chǎn)物松柏醇(P3)的高效液相色譜圖；C:阿魏酸（S3)的二級質(zhì)譜圖；D:松柏醇 (P3)的二級質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0009]下述下面結(jié)合實施例，進一步闡述對本發(fā)明： 實施例1 1、 菌株培養(yǎng) 所用菌株為A菌株和B菌株； A菌株為重組菌株怎M15-4C1-CCR，誘導后能高效表達融合雙功能酶4C1-CCR，具 有4C1和CCR兩種酶的催化活力，可將4-徑基肉桂酸轉(zhuǎn)化為4-徑基肉桂醒； B菌株為重組菌株怎M15-CAD;誘導后能高效表達CAD，可將4-徑基肉桂醒轉(zhuǎn)化為 4-徑基肉桂醇； LB固體培養(yǎng)基，Wg/L計，膜蛋白腺10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.5，氨節(jié)青霉素0.1，卡 那霉素0.025 ; LB液體培養(yǎng)基，Wg/L計，膜蛋白腺10，酵母提取物5，化Cl 10，瓊脂粉15， pH7.5，氨節(jié)青霉素0.1，卡那霉素0.025; 1.1、 A菌株的培養(yǎng)，將重組菌株怎.M15-4C1-CCR接種于LB固體培養(yǎng)基，活化;挑取 重組菌株單菌落接種于30mL含10化g/mL氨節(jié)青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，于37° C、200巧m振蕩培養(yǎng)過夜;取30mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于IL含10化g/mL氨節(jié)青霉素和25iig/ mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37° C、200rpm振蕩培養(yǎng)至控制0D600為0.6;向培養(yǎng)物中加 入誘導物異丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至終濃度0.4mmol/l，于28° C、200巧m誘導培養(yǎng)化； 1.2、 B菌株的培養(yǎng)，將重組菌株怎.M15-CAD接種于LB固體培養(yǎng)基，活化;挑取重組 菌株單菌落接種于30mL含10化g/mL氨節(jié)青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于 37°(：、200巧111振蕩培養(yǎng)過夜;取301111培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于比含10化肖/血氨節(jié)青霉素和254肖/血卡那 霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C JOOrpm振蕩培養(yǎng)至控制0D600為0.6;向培養(yǎng)物中加入誘導 物異丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至終濃度0.4mmol/l，于28° C、200巧m誘導培養(yǎng)地； 2、 菌株的固定化 2.1、 細胞的離屯、洗涂:取A菌株菌液1L、B菌株菌液1L，在轉(zhuǎn)速4000rpm/min條件下，離 屯、15min，傾去上清液，用IOmL 0.9%生理鹽水懸浮細胞，制得A菌株細胞懸浮液和B菌株細胞 懸浮液； 2.2、 取A菌株細胞懸浮液IOmL和B菌株細胞懸浮液IOmL,與75mL 2%的海藻酸鋼溶液均 勻混合，使用注射器滴入150mL 2%的化Cl2溶液中，固定化細胞顆粒直徑2.5mm，4°C冰箱放 置12h使其充分固化，傾去上清液，加入無菌水洗涂2次，制得A菌株固定化細胞顆粒和B菌株 固定化細胞顆粒，置于4° C冰箱中備用； 3、 固定化細胞連續(xù)生產(chǎn)香豆醇 3.1、 IOOmL反應體系組成：IOOmL含A菌株固定化細胞顆粒和B菌株固定化細胞顆粒的LB 液體培養(yǎng)基，終濃度為ImM的底物香豆酸;反應混合物于37° C、200rpm避光振蕩反應2-lOh， 反應后混合物用等體積乙酸乙醋萃取，有機相用于產(chǎn)物分析； 3.2、 產(chǎn)物通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行分析。反相高效液相色譜柱為ZORBAX 300SB-C18柱（2.1X150mm，3.5皿；Agilent，San化Clara，CA，USA)，流動相為乙臘， 流速0. 10~0.15 mL/min，梯度洗脫的具體條件見表3,檢測波長為280皿;質(zhì)譜為配備ESI 源的離子阱質(zhì)譜化CQ DECA XP MAX),質(zhì)譜檢測的具體條件見表4; 親3. A離底物吞巧瞞巧產(chǎn)物吞巧酶的高謝漏姑傷譜流動姑梯底雜脫條件
' 產(chǎn)物利用'高效液相色譜和M譜聯(lián)用法進占檢測，如圖1所示，香i酸和香豆醇的出峰時' 間分別為 25.41min 和 16.35min; 產(chǎn)物產(chǎn)率的計算:產(chǎn)率(％)=任/Cs X 100% 式中任為反應后香豆醇的濃度，Cs為反應前底物的濃度;香豆醇的產(chǎn)率為53.7%。
[0010] 實施例2 1、菌株培養(yǎng) 所用菌株為A菌株和B菌株； A菌株為重組菌株怎M15-4C1-CCR，誘導后能高效表達融合雙功能酶4C1-CCR，具 有4C1和CCR兩種酶的催化活力，可將4-徑基肉桂酸轉(zhuǎn)化為4-徑基肉桂醒； B菌株為重組菌株怎M15-CAD;誘導后能高效表達CAD，可將4-徑基肉桂醒轉(zhuǎn)化為 4-徑基肉桂醇； LB固體培養(yǎng)基，Wg/L計，膜蛋白腺10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.5，氨節(jié)青霉素0.1，卡 那霉素0.025 ; LB液體培養(yǎng)基，Wg/L計，膜蛋白腺10，酵母提取物5，化Cl 10，瓊脂粉15， pH7.5，氨節(jié)青霉素0.1，卡那霉素0.025; 1.1、 A菌株的培養(yǎng)，將重組菌株怎.M15-4C1-CCR接種于LB固體培養(yǎng)基，活化;挑取 重組菌株單菌落接種于30mL含10化g/mL氨節(jié)青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，于37° C、200巧m振蕩培養(yǎng)過夜;取30mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于IL含10化g/mL氨節(jié)青霉素和25iig/ mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37° C、200rpm振蕩培養(yǎng)至控制0D600為0.6;向培養(yǎng)物中加 入誘導物異丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至終濃度0.4mmol/l，于28° C、200巧m誘導培養(yǎng)化； 1.2、 B菌株的培養(yǎng)，將重組菌株怎.M15-CAD接種于LB固體培養(yǎng)基，活化;挑取重組 菌株單菌落接種于30mL含10化g/mL氨節(jié)青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于 37°(：、200巧111振蕩培養(yǎng)過夜;取301111培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于比含10化肖/血氨節(jié)青霉素和254肖/血卡那 霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C JOOrpm振蕩培養(yǎng)至控制0D600為0.6;向培養(yǎng)物中加入誘導 物異丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至終濃度0.4mmol/l，于28° C、200巧m誘導培養(yǎng)4h; 2、 菌株的固定化 2.1、 細胞的離屯、洗涂:取A菌株菌液1L、B菌株菌液1L，在轉(zhuǎn)速4000rpm/min條件下，離 屯、15min，傾去上清液，用IOmL 0.9%生理鹽水懸浮細胞，制得A菌株細胞懸浮液和B菌株細胞 懸浮液； 2.2、 取A菌株細胞懸浮液IOmL和B菌株細胞懸浮液IOmL,與75mL 2%的海藻酸鋼溶液均 勻混合，使用注射器滴入150mL 2%的化Cl2溶液中，固定化細胞顆粒直徑2.5mm，4°C冰箱放 置12h使其充分固化，傾去上清液，加入無菌水洗涂2次，制得A菌株固定化細胞顆粒和B菌株 固定化細胞顆粒，置于4° C冰箱中備用； 3、 固定化細胞連續(xù)生產(chǎn)咖啡醇 3.1、 IOOmL反應體系組成：IOOmL含A菌株固定化細胞顆粒和B菌株固定化細胞顆粒的LB 液體培養(yǎng)基，終濃度為ImM的底物咖啡酸;反應混合物于37° C、200rpm避光振蕩反應2-lOh， 反應后混合物用等體積乙酸乙醋萃取，有機相用于產(chǎn)物分析； 3.2、 產(chǎn)物通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行分析。反相高效液相色譜柱為ZORBAX 300SB-C18柱（2.1X150mm，3.5皿；Agilent，San化Clara，CA，USA)，流動相為乙臘， 流速0. 10~0.15 mL/min，梯度洗脫的具體條件見表5,檢測波長為280皿;質(zhì)譜為配備ESI 源的離子阱質(zhì)譜化CQ DECA XP MAX),質(zhì)譜檢測的具體條件見表6; 表5.分離底物咖啡酸和產(chǎn)物咖啡醇的高效液相色譜流動相梯度洗脫條件
產(chǎn)物利用高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用法進行檢測，如圖2所示，咖啡酸和咖啡醇的出峰時 間分別為10.28min和6.65min; 產(chǎn)物產(chǎn)率的計算:產(chǎn)率(％)=任/Cs X 100% 式中任為反應后咖啡醇的濃度，Cs為反應前底物的濃度;咖啡醇的產(chǎn)率為22.1%。
[00川實施例3 1、菌株培養(yǎng) 所用菌株為A菌株和B菌株； A菌株為重組菌株怎.CO^ M15-4C1-CCR，誘導后能高效表達融合雙功能酶4C1-CCR，具 有4C1和CCR兩種酶的催化活力，可將4-徑基肉桂酸轉(zhuǎn)化為4-徑基肉桂醒； B菌株為重組菌株怎M15-CAD;誘導后能高效表達CAD，可將4-徑基肉桂醒轉(zhuǎn)化為 4-徑基肉桂醇； LB固體培養(yǎng)基，Wg/L計，膜蛋白腺10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.5，氨節(jié)青霉素0.1，卡 那霉素0.025 ; LB液體培養(yǎng)基，Wg/L計，膜蛋白腺10，酵母提取物5，化Cl 10，瓊脂粉15， pH7.5，氨節(jié)青霉素0.1，卡那霉素0.025; 1.1、 A菌株的培養(yǎng)，將重組菌株怎.M15-4C1-CCR接種于LB固體培養(yǎng)基，活化;挑取 重組菌株單菌落接種于30mL含10化g/mL氨節(jié)青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，于37° C、200巧m振蕩培養(yǎng)過夜;取30mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于IL含10化g/mL氨節(jié)青霉素和25iig/ mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37° C、200rpm振蕩培養(yǎng)至控制0D600為0.6;向培養(yǎng)物中加 入誘導物異丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至終濃度0.4mmol/l，于28° C、200巧m誘導培養(yǎng)化； 1.2、 B菌株的培養(yǎng)，將重組菌株怎.M15-CAD接種于LB固體培養(yǎng)基，活化;挑取重組 菌株單菌落接種于30mL含10化g/mL氨節(jié)青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于 37°(：、200巧111振蕩培養(yǎng)過夜;取301111培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于比含10化肖/血氨節(jié)青霉素和254肖/血卡那 霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C JOOrpm振蕩培養(yǎng)至控制0D600為0.6;向培養(yǎng)物中加入誘導 物異丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至終濃度0.4mmol/l，于28° C、200巧m誘導培養(yǎng)地； 2、 菌株的固定化 2.1、 細胞的離屯、洗涂:取A菌株菌液1L、B菌株菌液1L，在轉(zhuǎn)速4000rpm/min條件下，離 屯、15min，傾去上清液，用IOmL 0.9%生理鹽水懸浮細胞，制得A菌株細胞懸浮液和B菌株細胞 懸浮液； 2.2、 取A菌株細胞懸浮液IOmL和B菌株細胞懸浮液IOmL,與75mL 2%的海藻酸鋼溶液均 勻混合，使用注射器滴入150mL 2%的化Cl2溶液中，固定化細胞顆粒直徑2.5mm，4°C冰箱放 置12h使其充分固化，傾去上清液，加入無菌水洗涂2次，制得A菌株固定化細胞顆粒和B菌株 固定化細胞顆粒，置于4° C冰箱中備用； 3、 固定化細胞連續(xù)生產(chǎn)松柏醇 3.1、 IOOmL反應體系組成：IOOmL含A菌株固定化細胞顆粒和B菌株固定化細胞顆粒的LB 液體培養(yǎng)基，終濃度為ImM的底物阿魏酸;反應混合物于37° C、200rpm避光振蕩反應2-lOh， 反應后混合物用等體積乙酸乙醋萃取，有機相用于產(chǎn)物分析； 3.2、 產(chǎn)物通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行分析。反相高效液相色譜柱為ZORBAX 300SB-C18柱（2.1X150mm，3.5皿；Agilent，San化Clara，CA，USA)，流動相為乙臘， 流速0. 10~0.15 mL/min，梯度洗脫的具體條件見表7,檢測波長為280皿;質(zhì)譜為配備ESI 源的離子阱質(zhì)譜化CQ DECA XP MAX),質(zhì)譜檢測的具體條件見表8; 親7_ 4V離底物耐魂酸巧產(chǎn)物換曲酶的高謝漏相傷譜流動相梯底濁脫條化

' 產(chǎn)物利用高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用法進行檢測，如圖3所示，阿魏酸和松柏醇的出峰時I 間分別為 32.40min 和 23.24min; 產(chǎn)物產(chǎn)率的計算:產(chǎn)率(％)=任/Cs X 100% 式中任為反應后松柏醇的濃度，Cs為反應前底物的濃度;松柏醇的產(chǎn)率為56.4%。
【主權(quán)項】
1.多菌株固定化細胞組合物連續(xù)生產(chǎn)4-羥基肉桂醇的方法，其特征在于具體操作步驟 如下： 1、 菌株培養(yǎng) 所用菌株為A菌株和B菌株； A菌株為重組菌株Ecoii M15-4C1-CCR，誘導后能高效表達融合雙功能酶4C1-CCR，具 有4C1和CCR兩種酶的催化活力，可將4-羥基肉桂酸轉(zhuǎn)化為4-羥基肉桂醛； B菌株為重組菌株i coii Ml5-CAD;誘導后能高效表達CAD，可將4-羥基肉桂醛轉(zhuǎn)化為 4-羥基肉桂醇； LB固體培養(yǎng)基，以g/L計，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.5，氨芐青霉素0.1，卡 那霉素0.025 ; LB液體培養(yǎng)基，以g/L計，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，瓊脂粉15， PH7.5，氨芐青霉素0.1，卡那霉素0.025; 1.1、 A菌株的培養(yǎng)，將重組菌株E M15-4C1-CCR接種于LB固體培養(yǎng)基，活化;挑取 重組菌株單菌落接種于30mL含100yg/mL氨芐青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，于37° C、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜;取30mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于1L含100yg/mL氨芐青霉素和25yg/ mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37° C、200rpm振蕩培養(yǎng)至控制0D600為0.6;向培養(yǎng)物中加 入誘導物異丙基硫代半乳糖苷IPTG至終濃度0.4mmol/L,于28° C、200rpm誘導培養(yǎng)8h; 1.2、 B菌株的培養(yǎng)，將重組菌株E Ml5-CAD接種于LB固體培養(yǎng)基，活化;挑取重組 菌株單菌落接種于30mL含100yg/mL氨節(jié)青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于 37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜;取30mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于1L含100yg/mL氨芐青霉素和25yg/mL卡那 霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至控制0D600為0.6;向培養(yǎng)物中加入誘導 物異丙基硫代半乳糖苷IPTG至終濃度0.4mmol/L,于28° C、200rpm誘導培養(yǎng)4h; 2、 菌株的固定化 2.1、 細胞的離心洗滌:取A菌株菌液1L、B菌株菌液1L，在轉(zhuǎn)速4000rpm/min條件下，離 心15min，傾去上清液，用10mL 0.9%生理鹽水懸浮細胞，制得A菌株細胞懸浮液和B菌株細胞 懸浮液； 2.2、 取A菌株細胞懸浮液10mL和B菌株細胞懸浮液10mL，與75mL 2%的海藻酸鈉溶液均 勻混合，使用注射器滴入150mL 2%的CaCl2溶液中，固定化細胞顆粒直徑2.5mm，4°C冰箱放 置12h使其充分固化，傾去上清液，加入無菌水洗滌2次，制得A菌株固定化細胞顆粒和B菌株 固定化細胞顆粒，置于4° C冰箱中備用； 3、 固定化細胞連續(xù)生產(chǎn)4-羥基肉桂醇 3.1、 100mL反應體系組成：100mL含A菌株固定化細胞顆粒和B菌株固定化細胞顆粒的LB 液體培養(yǎng)基，終濃度為ImM的底物4-羥基肉桂酸(分別為香豆酸、咖啡酸和阿魏酸）；反應混 合物于37°C、200rpm避光振蕩反應2-10h，反應后混合物用等體積乙酸乙酯萃取，有機相用 于產(chǎn)物分析； 3.2、 產(chǎn)物通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行分析 反相高效液相色譜柱為201^4乂 30058-(：18柱（2.1\150 111111，3.5 4111;厶8丨161^， Santa Clara，CA，USA)，流動相為乙腈，流速0. 10~0.15 mL/min，梯度洗脫的具體條件見 表1，檢測波長為280 nm;質(zhì)譜為配備ESI源的離子阱質(zhì)譜(LCQ DECA XP MAX)，質(zhì)譜檢測的 具體條件見表2; 表1.分離底物4-羥基肉桂酸和產(chǎn)物4-羥基肉桂醇的高效液相色譜流動相梯度洗脫條 件表2. 3種底物4-羥基肉桂酸和3種產(chǎn)物4-羥基肉桂醇質(zhì)譜檢測條件產(chǎn)物產(chǎn)率的計算:產(chǎn)率(％)=〇>/β X 100% 式中〇>為反應后4-羥基肉桂醇的濃度，Cs為反應前底物的濃度； 香豆醇、咖啡醇、松柏醇的產(chǎn)率分別為53.7%，22.1，56.4%。
【文檔編號】C12N11/10GK105925625SQ201610413615
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月14日
【發(fā)明人】蓋穎, 劉淑欣, 蔣湘寧
【申請人】北京林業(yè)大學, 蓋穎