專利名稱：Ptp 1d一種新蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸的制作方法
本申請是美國申請系列No.07/956，315(1992年10月6日申請，該文獻(xiàn)以其全文引入本文作為參考)的部分繼續(xù)。
本發(fā)明，屬生物化學(xué)和細(xì)胞及分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP)，稱作PTP 1D。包括PTP 1D蛋白質(zhì)，為其編碼的核酸構(gòu)建體，含有核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體，含有或表達(dá)重組表達(dá)載體的細(xì)胞，生產(chǎn)和鑒別PTP 1D蛋白質(zhì)和DNA構(gòu)建體的方法，PTP 1D蛋白質(zhì)和糖蛋白特異性的抗體，以及用于篩選能與PTP 1D結(jié)合和抑制或刺激PTP 1D蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法。
蛋白質(zhì)磷酸化是一種調(diào)節(jié)不同細(xì)胞過程的基本機(jī)制。大多數(shù)的蛋白質(zhì)磷酸化作用發(fā)生在絲氨酸和蘇氨酸殘基，由于發(fā)現(xiàn)許多致癌基因產(chǎn)物和生長因子受體具有內(nèi)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTKase或PTK)活性，在酪氨酸殘基的磷酸化作用則引起人們極大的興趣?，F(xiàn)已確認(rèn)了蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化作用在生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞循環(huán)增進(jìn)及腫瘤轉(zhuǎn)化方面的重要性(Hunter等人.，Ann.Rev.Biochem.54987-930(1985);Ullrich等人，Cell 61203-212(1990);Nurse，Nature 344503-508(1990);Cantley等人，Cell 64281-302(1991))。
蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的磷酸化作用是磷酸化和去磷酸化反應(yīng)競爭的動力學(xué)過程。這些過程由PTKs(催化酪氨酸磷酸化)和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTPases或PTPs)(該酶特異性地使已磷酸化的蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基去磷酸化)的相互作用而調(diào)節(jié)的。因此，由PTK和PTP酶活性的平衡決定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的凈含量(Hunter，T.，Cell 581013-1016(1989))。
PTKs是一個(gè)大蛋白質(zhì)家族，包括許多生長因子受體和與絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白質(zhì)激酶享有共同祖先，但與其不同的潛在致癌基因(Hanks等人，Science 24142-52(1988))。已將許多PTKs與細(xì)胞循環(huán)誘導(dǎo)中的起始信號聯(lián)系起來(Weaver 等人.，Mol.Cell.Biol.114415-4422(1991))。
我們目前對PTKs改變基礎(chǔ)機(jī)制的大部分理解來自有跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的受體型PTKs(RPTKs)。認(rèn)為特異性配體子RPTK細(xì)胞外區(qū)的結(jié)合可誘導(dǎo)低聚合作用，增加酶(激酶)活性及激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Ullrich等人，同上文)。通過突變或超量表達(dá)的激酶活性的失調(diào)被認(rèn)為是細(xì)胞轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)的機(jī)制(Hunter等人，1985，同上;Ullrich等人，同上文)。
蛋白質(zhì)磷酸酶含有至少兩個(gè)明顯不同的族(Hunter，T.1989，同上文)蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTPs)。PTPs本身是一個(gè)族，包括至少兩個(gè)亞類。第一亞類包括低分子量的，細(xì)胞內(nèi)酶，含一個(gè)保守的催化磷酸酶區(qū)。該亞類的成員包括(1)胎盤PTP 1B(Charbonneau等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865252-5256(1989);Chernoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.872735-2789(1989));
(2)T細(xì)胞PTP(Cool等人;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865257-5261(1989));
(3)大鼠腦PTP(Guan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871501-1502(1990));
(4)神經(jīng)元磷酸酶(STEP)(Lombroso等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887242-7246(1991));和(5)細(xì)胞質(zhì)磷酸酶，含一個(gè)與細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)同源的區(qū)域(Gu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 885867-5871(1991);Yang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 885949-5953(1991))。自從純化，定序并克隆了第一個(gè)PTP后，已迅速鑒別了其它可能的PTPs，并且其數(shù)量繼續(xù)穩(wěn)定增加。PTP族的大量已知成員表明在PTP-RPTK的相互作用中，可能有特異性。從幾個(gè)來源克隆了編碼一種新PTP(稱之為PTP 1C)的cDNA(Shen，S-H等人，Nature 352736-739(1991);Plutzky，J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891123-(1992);Yi，T.，等人，Mol.Cell.Biol.12836-846(1992);Matthews，R.J.等人，Molec.Cell.Biol.122396-(1992))。PTP 1C蛋白質(zhì)有一個(gè)單一的催化區(qū)和一對位于N末端的src-同源區(qū)，稱為SH2，說明PTK活性可能直接由SH2區(qū)介導(dǎo)的與一種PTP的相互作用調(diào)節(jié)。
第二個(gè)PTP亞類包括高分子量的，受體關(guān)連的PTPs，稱為RPTPs。RPTPs由(a)一個(gè)細(xì)胞內(nèi)催化區(qū)，(b)一個(gè)跨膜片段，和(c)一個(gè)推測的配體結(jié)合細(xì)胞外區(qū)組成(Gebbink，M.F.等人，F(xiàn)EBS Lett.290123-130(1991))。不同RPTPs的推測“細(xì)胞外受體”區(qū)的結(jié)構(gòu)和大小是不同的，而細(xì)胞內(nèi)催化區(qū)是高度保守的。所有PTPs有兩個(gè)半聯(lián)的重復(fù)的催化磷酸酶同源區(qū)，但HPTPO例外，它只有一個(gè)(Tsai等人，J.Biol.Chem.26610534-10543(1991))。
一個(gè)RPTP，開始叫做白細(xì)胞共同抗原(LCA)(Palph，S.J.，EMBO.J.61251-1257(1987))，已被叫作其它名稱，包括T200(Trowbridge等人，Eur.J.Immunol.6557-562(1962))，用于B細(xì)胞形式的B220(Coffman等人，Nature 289681-683(1981))，小鼠異型標(biāo)記Ly-5(Komuro等人，Immunogenetics 1452-456(1975))，以及最近的CD45(Cobbold等人，Leucocyte Typing Ⅲ，McMichael等人，編，pp.788-803，1987)。LCA分子包括一個(gè)在所有白細(xì)胞和其造血前身細(xì)胞表面表達(dá)的高分子量糖蛋白族)Thomas，Ann.Rev.Immunol.7339-369(1989))，并且在動物物種間有顯著的序列同源性(Charbonneau等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857182-7186(1988))。認(rèn)為CD45在T細(xì)胞活化中起關(guān)鍵作用(有關(guān)綜述，參見Weiss A.Ann.Rev.Genet.25487-510(1991))。因此，在對應(yīng)于借助T細(xì)胞受體的反應(yīng)中，不能表達(dá)CD45的誘變T細(xì)胞克隆被功能性地?fù)p傷了(Weaver等人，1991，同上)。CD45PTP活性在PP56lck，淋巴細(xì)胞-特異的PTK的活化中起作用(Mustelin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866302-6306(1989);Ostergaard et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868959-8963(1989))。這些發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生下列假設(shè)T細(xì)胞活化作用涉及通過C末端酪氨酸殘基去磷酸化而激活PP56KK的磷酸酶。
另一種RPTP，白細(xì)胞共同抗原相關(guān)的分子，LAR(Streuli等人，J.Exp.Med.1681523-1530(1988)開始被鑒定為一種LCA同系物，其中細(xì)胞內(nèi)催化區(qū)有兩個(gè)催化區(qū)有兩個(gè)催化磷酸酶同源區(qū)(區(qū)Ⅰ和Ⅱ)。但是，僅有區(qū)Ⅰ表現(xiàn)出有磷酸酶活性(Streuli等人，EMBO J.9(8)2399-2407(1990))。化學(xué)誘導(dǎo)的LAR突變體(tyr1379→Phe)是溫度敏感型的(Tsai等人，J.Biol.Chem.266(16)10534-10543(1991))。
鼠RPTP，稱為mRPTPμ有一個(gè)與LAR有共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的細(xì)胞外區(qū)(Gebbink等人，同上文)。克隆了RPTPμ的人同系物，且將該基因定位于人的第18號染色體上。以cDNA克隆的序列為基礎(chǔ)，預(yù)測了兩種果蠅PTPs，稱為DLAR和DPTP(Streuli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868698-8702(1989))。編碼另一種果蠅RPTP，DPTP99A的cDNA也已被克隆并進(jìn)行了特征鑒定(Hariharan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8811266-11270(1991))。
其它的RPTPs實(shí)施包括RPTP-α，β，γ和ξ(Krueger等人，EMBO J.93241-3252(1990)，Sap等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876112-6116(1990)，Kaplan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 877000-7004(1990)，Jirik等人，F(xiàn)EBS Lett.273239-242(1990)，Mathews等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 874444-4448(1990)，Ohagi等人，Nucl.Acids Res.187159(1990))。PCT公開WO 92/01050公開了人RPTP-α，β，和γ，以及在這三種RPTPs以及該蛋白質(zhì)族的其它成員的保守區(qū)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)同源性的性質(zhì)。鼠RPTP-α的細(xì)胞內(nèi)區(qū)與其他PTPs的催化區(qū)同源。RPTP-α的142個(gè)氨基酸細(xì)胞外區(qū)(包括信號肽)有高含量的絲氨酸和蘇氨酸(32%)和8個(gè)可能的N-糖基化位點(diǎn)。已經(jīng)在真核宿主中生產(chǎn)并表達(dá)了編碼RPTP-α的cDNA克隆。用針對RPTP-α的多克隆抗體(通過用合成的RPTP-α肽免疫而生產(chǎn)的)檢測RPTP-α蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞和組織中的自然表達(dá)。該抗體檢測細(xì)胞中的130KDa蛋白質(zhì)，所述細(xì)胞已用編碼部分RPTP-α的cDNA克隆轉(zhuǎn)染。
通過用編碼兩個(gè)LCA PTP區(qū)的一個(gè)探針篩選肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系(HepG2)cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)RPTP，HEPTP(Jirik等人，F(xiàn)ASEB J.4A2082，Abstr.2253(1990))。HEPTP基因似乎可在各種人和鼠細(xì)胞系及細(xì)胞中表達(dá)。
在共同申請的，相關(guān)美國專利申請系列No.07/923，740(1992，8，5申請，該文獻(xiàn)全文引入本文作為參考)中公開了PTPs的PTP D亞家族。
已鑒別了已知PTPs催化區(qū)中的保守氨基酸序列(Krueger等人.，EMBO J.9324-3252(1990);Yi等人，Mol.Cell.Biol.12836-846(1992)，兩篇文獻(xiàn)均全文引入本文作為參考)。本文將這些氨基酸序列稱為“一致序列”。Yi等人排列了LCA，PTPIB，TCPTP，LAR，DLAR，HPTPα，HPTPβ和HPTPγ的催化磷酸酶區(qū)序列，鑒別為下列“一致序列”(參見Yi等人，同上文，圖2(A)1-2行)1.DYINAS/N [SEQ ID NO.1]2.KCXXYWP [SEQ ID NO.2]Krueger等人排列了PTPIB，TCPTP，LAR，LCA，HPTPα，HPTPβ，HPTPγ，HPTPε和HPTPξ，DLAR及DPTP的催化磷酸酶區(qū)序列，鑒定為下列“一致序列”(參見Krueger等人，同上文，圖7，1-2行)1.D/NYINA S/N [SEQ ID NO.3]2.KCXXYW P [SEQ ID NO.2]在比較PTP 1D，csw(螺旋狀的)和PTP 1C序列的內(nèi)含物時(shí)揭示出在含SH2區(qū)的磷酸酶中保守序列QGP被改變?yōu)镼GC酪氨酸殘基的去磷酸化其本身可作為一種重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制而起作用。因此，用酪氨酸激酶的src族，C末端酪氨酸的去磷酸化激活了激酶活性(Hunter，T.，Cell 491-4(1987))。在成熟促進(jìn)因子(MPF)激酶的有絲分裂活化中，酪氨酸的去磷酸化可能是一個(gè)強(qiáng)制步驟(Morla等人，Cell 58193-203(1989))。
蛋白質(zhì)酪氨酸激酶和磷酸酶之間的相互作用在發(fā)送信號中所涉及的細(xì)胞因子包括僅含scr同源區(qū)(稱之為SH2和SH3)的多肽底物，或與酶活性結(jié)合(Koch，C.A.等人，Science 252668(1991);Russell，R.B.等人，F(xiàn)EBSLett.30415(1992))。例如磷酸脂酶Cγ是基于與RPTK的細(xì)胞質(zhì)相互作用及稱RPTK細(xì)胞質(zhì)區(qū)磷酸化而被激活的(Margolis，B.等人，Cell 571101-1107(1989);Meisenhelder，J.等人，Cell 571109(1989);Burgess，W.H.等人，Mol.Cell.Biol.104470(1990);Nishibe，S.等人，Science 2501253(1990))。若認(rèn)為PTPs是PTKs的調(diào)節(jié)子，但發(fā)送級聯(lián)信號的磷酸酪氨酸的這些重要組分的激活仍是未知的(Fischer，E.H.等人，Science 253401(1991);Pot，D.A.等人，Biochem.Biophys.Acta 113635(1992))。
大量PTP族成員(見上文描述)的存在說明，特定PTPs和PTKs之間的相互作用可能是特異性的。上文討論的PTP 1C分子的結(jié)構(gòu)包括，除一個(gè)催化區(qū)外，還有一對位于N末端的SH2區(qū)。這些SH2區(qū)的存在說明PTK活性可能直接由SH2區(qū)介導(dǎo)的與PTP的相互作用來調(diào)節(jié)。
上述觀察說明本領(lǐng)域需要了解調(diào)節(jié)PTP活性的機(jī)制。需要進(jìn)一步分析PTPs之間的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，以便獲得對大量重要疾病包括癌和糖尿病中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，細(xì)胞循環(huán)增進(jìn)和細(xì)胞生長，腫瘤轉(zhuǎn)化及基本改變的重要認(rèn)識。
本發(fā)明人在本文描述了鑒別、克隆并定序一種一新的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP)(稱為PTP 1D)，它在結(jié)構(gòu)上明顯不同于以前大量報(bào)道的PTPs，與PTP 1C有71%的序列相似性。
因此，本發(fā)明提供一種PTP 1D蛋白質(zhì)，或其功能衍生物，其中，若PTP 1D蛋白質(zhì)是一種天然產(chǎn)物，則PTP 1D蛋白質(zhì)基本上沒有與其天然相關(guān)的其它蛋白質(zhì)或糖蛋白。
優(yōu)選地，PTP 1D蛋白質(zhì)含有與圖2所示的氨基酸序列(SEQ ID NO4)有71%或更多相同性的氨基酸序列。更優(yōu)選的，PTP 1D含有SEQ ID NO4。
可以通過生化純化方法生產(chǎn)，或可通過化學(xué)方法或在原核或真核宿主中的重組方法制備，并提供基本上沒有與之天然相關(guān)和/或已修飾氨基酸的其它蛋白質(zhì)的基本純的PTP 1D蛋白質(zhì)。
PTP 1D蛋白質(zhì)的功能衍生物包括一個(gè)片段，一個(gè)具有添加或取代氨基酸的蛋白質(zhì)或肽，具有任何結(jié)合的缺失，添加，或取代氨基酸的PTP 1D蛋白質(zhì)，以便PTP 1D蛋白質(zhì)具有所需的生物活性。
本文也提供一種重組核酸構(gòu)建體，它含有編碼PTP 1D蛋白質(zhì)，或編碼其功能衍生物的核苷酸序列。上述核酸構(gòu)建體可以是cDNA或基因組DNA分子。它最好是一種表達(dá)載體，如質(zhì)粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸構(gòu)建體編碼PTP 1D并含有圖2所示的核苷酸序列[SEQ ID NO5]。
同時(shí)提供一種分離及純化的核酸構(gòu)建體，它含有編碼PTP 1D蛋白質(zhì)的核苷酸序列。最好，該核苷酸序列是SEQ ID NO5。
本發(fā)明包括用，或含，上述表達(dá)載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核及真核宿主細(xì)胞。
也提供制備PTP 1D蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)能表達(dá)PTP 1D蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞，(b)表達(dá)PTP 1D蛋白質(zhì);和
(c)從培養(yǎng)物中回收PTP 1D蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也涉及對PTP 1D蛋白質(zhì)的抗原決定簇特異性的抗體，包括，多克隆，單克隆，或嵌合抗體。
本發(fā)明另外還涉及檢測細(xì)胞中PTP 1D的存在或測量細(xì)胞中其數(shù)量的方法，該方法包括(a)將細(xì)胞或其提取物與對PTP 1D蛋白質(zhì)的抗原決定簇特異性的抗體接觸;和(b)檢測抗體與細(xì)胞或其提取物的結(jié)合，或測量結(jié)合的抗體數(shù)量，由此，確定PTP 1D蛋白質(zhì)的存在或測量其量。
也提供用于檢測含核酸的樣品中，是否存在編碼正?；蛲蛔働TP 1D蛋白質(zhì)的核酸序列的方法，包括(a)在雜交條件下，將樣品，或其提取物與編碼至少部分正常或突變PTP 1D蛋白質(zhì)的寡核苷酸探針接觸;和(b)檢測探針與樣品核酸雜交，由此檢測核酸序列的存在。
最好，在步驟(a)前，上述方法包括選擇性擴(kuò)增編碼至少部分正?；蛲蛔働TP 1D蛋白質(zhì)的核酸數(shù)量這一步驟。
本發(fā)明還涉及用于鑒定能與PTP 1D蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物的方法，該方法包括(a)將PTP 1D蛋白質(zhì)，或一個(gè)其化合物結(jié)合的部分，附著到一個(gè)固相基質(zhì)上;
(b)將猜測含該化合物的樣品與基質(zhì)結(jié)合的PTP 1D蛋白質(zhì)，糖蛋白質(zhì)或其部分接觸，以使該化合物結(jié)合，并洗滌掉任何未結(jié)合的物質(zhì);和
(c)檢測是否存在與固相基質(zhì)結(jié)合的化合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供從復(fù)合混合物中分離能與PTP 1D蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物的方法，該方法包括(a)將PTP 1D蛋白質(zhì)或其化合物結(jié)合的部分附著到固相基質(zhì)上;
(b)將復(fù)合混合物與基質(zhì)結(jié)合的PTP 1D蛋白質(zhì)，糖蛋白或其部分接觸，以使化合物結(jié)合，并洗滌掉未結(jié)合的物質(zhì);和(c)從固相基質(zhì)上洗脫結(jié)合的化合物，由此分離該化合物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種用于確定一種化合物是否能刺激或抑制PTP 1D的磷酸酪氨酸磷酸酶活性的方法，該方法包括(a)將所述化合物與純化形式，膜制品中的，或全活或固定細(xì)胞中的PTP 1D蛋白質(zhì)，或PTP 1D蛋白質(zhì)的酶活性片段接觸;
(b)將步驟(a)的混合物培養(yǎng)一段時(shí)間，使該化合物足以刺激或抑制酶活性;
(c)測量PTP 1D蛋白質(zhì)，糖蛋白或片段的磷酸酪氨酸磷酸酶活性;
(d)將酶活性與未用該化合物培養(yǎng)的PTP 1D蛋白質(zhì)、糖蛋白或片段比較，由此確定該化合物是否刺激或抑制該活性。
本發(fā)明也涉及用于治療或防止與不正常PTP 1D蛋白質(zhì)有關(guān)的疾病的藥物組合物，該組合物含有PTP 1D蛋白質(zhì)，或其功能衍生物，及藥物學(xué)可接受的載體。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，該藥物組合物用于治療或防止與反常的具有缺陷性酶活性的PTP 1D蛋白質(zhì)有關(guān)的疾病，該組合物含有可有效刺激PTP 1D的磷酸酪氨酸磷酸酶活性數(shù)量的化合物及藥物學(xué)可接受的載體。
也提供一種用于治療或防止與具有超常酶活性的不正常PTP 1D蛋白質(zhì)有關(guān)的疾病的藥物組合物，該組合物含有可有效抑制PTP 1D磷酸酪氨酸磷酸酶活性數(shù)量的化合物，以及藥物學(xué)可接受的載體。
本發(fā)明包括用于治療或防止與主體中不正常PTP 1D蛋白質(zhì)有關(guān)的疾病的方法，包括給該主體施用上述的藥物組合物。


圖1表示編碼部分新PTP的克隆(稱之為P158)的序列。表示出了DNA序列[SEQ ID NO6]和推測的氨基酸序列[SEQ ID NO7]。
圖2表示PTP 1D完全的cDNA序列[SEQ ID NO5]和推測的氨基酸序列[SEQ ID NO4]。
圖3表示圖2的序列，上有SH2和PTP區(qū)并用框架框出，后面用陰影表示。為了方便在末端密碼子TGA(1908-1911)與多聚腺苷酸化信號之間的約4.7Kb未表示。
圖4是顯示在幾種人組織中表達(dá)的PTP 1D的印跡。
圖5是顯示在人乳房癌細(xì)胞系中表達(dá)的PTP 1D的印跡。
圖6是內(nèi)源表達(dá)PTP 1D的人乳房癌細(xì)胞系SH-BR-3和T-47-D溶解產(chǎn)物的Western印跡(將7.5%聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上)。用通過GST-PTP 1D融合蛋白免疫而制備的兔抗血清探測該印跡。
圖7表示在293系的人胚腎成纖維細(xì)胞中，PTP 1D和PTP 1C的瞬時(shí)超量表達(dá)對RPTK酪氨酸磷酸化的影響。用標(biāo)明的配體將細(xì)胞刺激10分鐘，溶解，用SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，并用單克隆的抗磷酸酪氨酸抗體5E2探測。標(biāo)明了分子量標(biāo)記物。
圖8表示PTP 1D和PTP 1C與EGF受體相關(guān)的PTKs的關(guān)系。用50ng/ml EGF刺激后，用mAb108.1免疫沉淀受體材料。沉淀物在7.5%SDS-PAGE上電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，并用抗PTP 1D和PTP 1C的兔抗血清混合物探測(上組)。僅用PTPs轉(zhuǎn)染13和14道的樣品。下面一組表示經(jīng)沉淀的RPTKs的放射自顯影分析。標(biāo)明了分子量標(biāo)記。
圖9顯示通過激活的EP-R使PTP 1D磷酸化。將來自僅表達(dá)PTP 1D或一起表達(dá)PTP 1D和EP-R嵌合體的293細(xì)胞轉(zhuǎn)染體的PTP 1D的免疫沉淀物用抗磷酸酪氨酸抗體免疫吸印，表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞作為負(fù)對照。
圖10表示體外測量圖9所示細(xì)胞溶解物的PTP 1D磷酸酶活性的結(jié)果。圖中表示了對于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用兩種平行測量方法測得的代表性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。免疫沉淀物來自用對照質(zhì)粒(白條)，PTP 1D表達(dá)載體(畫有交叉陰影線的棒條)或PTP 1D和EP-R表達(dá)質(zhì)粒一起(點(diǎn)畫的棒條-EGF;黑棒條+EGF)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
下表列出了蛋白質(zhì)化學(xué)家通常使用的及本文所用的氨基酸的單字母縮寫。
氨基酸 符號 氨基酸 符號甘氨酸 G 精氨酸 R丙氨酸 A 賴氨酸 K纈氨酸 V 組氨酸 H亮氨酸 L 苯丙氨酸 F異亮氨酸 I 酪氨酸 Y絲氨酸 S 色氨酸 W蘇氨酸 T 脯氨酸 P半胱氨酸 C 絲氨酸或天冬氨酸 S/N甲硫氨酸 M 天冬氨酸或天冬酰胺 D/N天冬氨酸 D 異亮氨酸或纈氨酸 I/V天冬酰胺 N 未限定 X谷氨酸 E谷氨酰胺 Q本發(fā)明人先前鑒定了一個(gè)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTPs)的新亞家族(‘PTP-D亞家族’)。PTP-D家族成員有明顯不同于以前報(bào)告的PTPs的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明人現(xiàn)已克隆并定序了另一種PTP，叫做PTP-1D(圖2)。
術(shù)語“亞家族”用于說明在上述說明的特定氨基酸殘基上，結(jié)構(gòu)相關(guān)的一組PTPs。
“以前定義的氨基酸一致序列”是指在Krueger等上(同上文)，和Yi等人(同上文)描述的已知PTPs的催化磷酸酶區(qū)中保守的氨基酸序列。
因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及有氨基酸序列SEQ ID NO4的PTP 1D蛋白質(zhì)，或其功能衍生物。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是天然產(chǎn)生的哺乳動物PTP-1D。另一實(shí)施方案含有重組的哺乳動物PTP-1D。還有另一實(shí)施方案是化學(xué)合成的哺乳動物PTP-1D蛋白質(zhì)。在固相支持物上合成所需序列多肽并隨后將其從支持物上分離的方法是本領(lǐng)域已知的。
優(yōu)選的本發(fā)明PTP-1D蛋白質(zhì)是來源于人的。
天然產(chǎn)生的PTP-1D蛋白質(zhì)最好基本沒有與之天然相關(guān)的其它蛋白質(zhì)或糖蛋白?！盎緵]有其它蛋白質(zhì)或糖蛋白”表示PTP-1D蛋白質(zhì)已純化掉至少90%(重量計(jì))，如果需要甚至至少99%的與之天然相關(guān)的其它蛋白質(zhì)和糖蛋白，且因此基本沒有它們。
含PTP 1D蛋白質(zhì)的細(xì)胞、組織或液體經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)，例如，使用固定了與蛋白質(zhì)結(jié)合的單克隆抗體(mAb)的免疫吸附柱進(jìn)行免疫親和層析可完成上述純化。
其它有用類型的親和純化法利用一種用于PTP的固相底物，該P(yáng)TP結(jié)合催化磷酸酶區(qū)，或利用與受體型PTP蛋白的細(xì)胞外受體區(qū)結(jié)合的配體。換種方法，或另外，用標(biāo)準(zhǔn)方法，如硫酸銨沉淀，分子篩層析，和離子交換層析的組合純化PTP-1D蛋白質(zhì)。
應(yīng)理解，可以從各種細(xì)胞或組織源中，用生化方法純化本發(fā)明的哺乳動物PTP 1D蛋白質(zhì)。為了制備天然產(chǎn)生的PTP 1D蛋白質(zhì)，如腦組織，特別是人源的組織，是優(yōu)選的。編碼PTP-1D的核酸的或蛋白質(zhì)的優(yōu)選組織來源是細(xì)胞系SK-BR-3，或人乳房癌系，BT-474和T-47-D。
由于可以分離或合成編碼PTP 1D蛋白質(zhì)的基因，所以，如果需要，可以在原核生物或非哺乳動物真核生物中，合成基本沒有哺乳動物源的其它蛋白質(zhì)或糖蛋白的PTP 1D蛋白質(zhì)。按本發(fā)明的設(shè)想，在哺乳動物細(xì)胞，如轉(zhuǎn)染的COS，NIH-3T3，或CHO細(xì)胞中生產(chǎn)的重組PTP 1D蛋白質(zhì)，例如，要么是天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列，要么是有氨基酸缺失、插入、取代或其組合的修飾的蛋白質(zhì)序列。若天然產(chǎn)生的PTP 1D蛋白質(zhì)是用重組方法生產(chǎn)的，則提供基本沒有與之天然相關(guān)的其它蛋白質(zhì)和糖蛋白的PTP-1D。
本文也提供PTP-1D蛋白質(zhì)的功能衍生物。“功能衍生物”是指該蛋白質(zhì)的“片段”、“變異體”、“類似物”或“化學(xué)衍生物”，這些術(shù)語定義在下文。按照本發(fā)明，允許其應(yīng)用的功能衍生物保留了至少部分PTP-1D蛋白質(zhì)的功能，例如與PTP 1D蛋白質(zhì)特異性抗體的反應(yīng)活性，PTP酶活性或配體結(jié)合活性。
術(shù)語“片段”用于說明得自PTP-1D，最好是人PTP-1D的多肽，并且有天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列?？梢酝ㄟ^全長蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水解裂解而生產(chǎn)上述片段。最好通過適當(dāng)修飾編碼PTP-1D蛋白質(zhì)的DNA序列以便在C-末端，N-末端，和天然序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸，而用重組方法得到該片段。
PTP-1D蛋白質(zhì)的片段可用于篩選作為拮抗劑或興奮劑(如下文定義)的化合物。應(yīng)理解，上述片段可保留天然蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特征部分。上述保留的特征的實(shí)例包括(a)PTP催化活性;(b)底物特異性;(c)在完整細(xì)胞中與其它分子的相互作用;(d)PTP-1D的調(diào)節(jié)功能;或(e)與天然蛋白質(zhì)或其抗原決定簇的特異性抗體結(jié)合。
在本發(fā)明范圍內(nèi)的另一種功能衍生物是含附加氨基酸的PTP-1D變異體，通過適當(dāng)修飾DNA編碼序列以便在C末端，N末端，及天然序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)加入編碼一個(gè)或多個(gè)氨基酸的密碼子，而從天然產(chǎn)生的PTP 1D蛋白質(zhì)得到所述變異體。應(yīng)理解，有附加氨基酸的上述變異體保留了如上描述的天然PTP 1D的一個(gè)或多個(gè)特征部分。
優(yōu)選的變異體是有取代氨基酸的變異體，通過適當(dāng)修飾或突變DNA編碼序列以使在C末端，N末端，以及天然氨基酸序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，而從天然產(chǎn)生的PTP 1D蛋白質(zhì)得到所述變異體。應(yīng)理解，有上述取代氨基酸的變異體保留了如上定義的，天然PTP-1D蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特征部分。
還可以完成任何組合的缺失，插入及取代以得到PTP 1D功能衍生物的最后構(gòu)建體，條件是最后構(gòu)建體具有完整PTP 1D蛋白質(zhì)(如上描述的)至少一種所需的活性或功能。
上述實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明要求的范圍。
明顯地，在編碼PTP 1D蛋白質(zhì)的DNA所進(jìn)行的修飾或突變必須不會改變閱讀框架，并且最好不會產(chǎn)生可產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)(參見歐洲專利公開No.EP75，444)。
在遺傳水平，通過位點(diǎn)特異性誘變(按由Adelman等，DNA 2183(1983)舉證的)編碼所述序列的DNA中的核苷酸，生產(chǎn)修飾的編碼序列，此后在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)該重組DNA，從而制備有缺失，插入或取代氨基酸殘基的PTP 1D的功能衍生物(見下文)。PTP-1D蛋白質(zhì)的功能衍生物通常表現(xiàn)出與天然蛋白質(zhì)性質(zhì)上相同的生物活性。
在另一實(shí)施方案中，用本領(lǐng)域熟知的方法，通過直接化學(xué)合成，可以很方便地制備帶有氨基酸缺失、插入或取代(或其組合)的PTP-1D蛋白質(zhì)的功能衍生物。
本發(fā)明也包括一種從另一種PTP構(gòu)建的“嵌合”PTP分子，其中用與PTP-1D同源的序列代替一種或多種特異性的氨基酸序列。上述嵌合分子的一個(gè)實(shí)施例是含有得自另一個(gè)受體型PTP的配體-結(jié)合細(xì)胞外區(qū)的PTP 1D蛋白質(zhì)，將該細(xì)胞外區(qū)移植到本發(fā)明PTP 1D蛋白部分上。其它嵌合分子包括(a)含有本發(fā)明PTP-1D蛋白質(zhì)催化磷酸酶區(qū)的另一種PTP。在這種情況下，優(yōu)選的氨基酸數(shù)為220到260之間;
(b)一種PTP 1D蛋白質(zhì)其中一部分或幾部分催化區(qū)已被其它PTPs，如PTP-D亞家族的成員，的同源部分取代。
按本文所用，術(shù)語“同源序列”的定義是在兩種或多種PTPs中，在一級序列位于相似位置的序列，并可表現(xiàn)出序列同源性。應(yīng)強(qiáng)調(diào)“同源序列”并不限于有高度同源性的兩個(gè)序列。
嵌合分子可用作為說明結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系以及鑒定與PTP 1D蛋白質(zhì)相互作用的特定化合物如藥物的工具。因此，有用的嵌合分子是其中一個(gè)分子的特定部分已經(jīng)被位于相似位置，但不同的，來自另一個(gè)，換句話說同源的，分子的序列所取代的分子。交換部分會常常代表表現(xiàn)出很大不同的分子部分。優(yōu)選的嵌合分子包括，但不限于，含配體-結(jié)合細(xì)胞外區(qū)的PTP 1D蛋白質(zhì)，所述細(xì)胞外區(qū)是表皮生長因子(EGF)受體，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)受體等等。遺傳工程方法加工的嵌合受體是本領(lǐng)域熟知的(參見如，Riedel.等人，Nature 324628-670(1986))。
PTP 1D蛋白質(zhì)或肽的“嵌合衍生物”含有不是蛋白質(zhì)正常部分的其它嵌合部分。蛋白質(zhì)或肽的共價(jià)修飾物包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。通過將肽的靶氨基酸殘基與有機(jī)衍生劑反應(yīng)，可將上述修飾物導(dǎo)入分子中，所述的有機(jī)衍生劑能與選擇的側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)。
半胱氨酸殘基通常與α-鹵乙酸鹽(和相應(yīng)的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)，以得到羧甲基或羧酰氨甲基衍生物。半胱氨酸殘基也可通過與溴三氟丙酮，α-溴-β(5-咪唑基)丙酸，氯乙酰磷酸，N-烷基馬來酰亞胺，3-硝基-2-吡啶基二硫化物，甲基2-吡啶基二硫化物，對氯高汞苯甲酸，2-氯汞基-4-硝基苯酚，或氯-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑反應(yīng)而衍生。
組氨酰殘基可通過在PH5.5-7.0時(shí)與焦碳酸二乙酯反應(yīng)而衍生，因?yàn)樵撛噭┫鄬τ诎腚装滨?cè)鏈有特異性的。對溴苯甲酰甲基溴也是有用的;該反應(yīng)最好在PH6.0，0.1M卡可酸鈉中反應(yīng)。
將賴氨酰和氨基末端殘基與琥珀或其它羧酸酐反應(yīng)。用這些試劑衍生有作用或逆轉(zhuǎn)賴氨酰殘基的電荷。其它適于衍生含α-氨基殘基的試劑包括亞氨酸酯如methyl picolinimidate;磷酸吡哆醛;吡哆醛;氯硼氫化物;三硝基苯磺酸;O-甲基異脲;2，4-戊二酮;和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸的反應(yīng)。
精氨酰殘基可通過與一種或幾種常規(guī)試劑反應(yīng)而修飾，這些試劑包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮，1，2-環(huán)己二酮，和茚三酮。由于胍功能基團(tuán)的高PKa，所以精氨基殘基的衍生需要在堿性條件下完成反應(yīng)。此外，這些試劑可以與賴氨酸基團(tuán)以及精氨酸的ε-氨基反應(yīng)。
酪氨酰殘基是熟知的修飾靶，可用于通過與芳香重氮化合物或四硝酸甲烷反應(yīng)導(dǎo)入光譜標(biāo)記。通常，用N-acetylimidizol和四硝基甲烷分別形成O-乙?；野滨：?-硝基衍生物。
通過反應(yīng)碳化二亞胺(R1-N-C-N-R1)如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基(4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳化二亞胺選擇性地修飾羧基側(cè)基團(tuán)(天冬氨?；蚬劝滨?。此外，通過與銨離子反應(yīng)，將天冬氨酰和谷氨酰殘基變成天冬酰胺?；凸劝滨０孵；?。
經(jīng)常將谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基脫酰氨基變成相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基。另外，在溫和的酸性條件下，將這些殘基脫酰氨基。這些殘基的兩種形式之一均落在本發(fā)明范圍內(nèi)。
用雙功能試劑衍生可用于將PTP-1D蛋白質(zhì)或肽交聯(lián)到水不溶性固體介質(zhì)或其它大分子載體。通常使用的交聯(lián)劑包括，例如1，1-雙(重氮基乙?；?-2-苯乙烷，戊二醛，N-羥基丁二酰胺酯，如含4-疊氮基水楊酸的酯，同雙功能亞氨酸酯，包括二琥珀酰亞胺基酯，如3，3′-二硫雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)，和雙功能的馬來酰亞胺如雙-N-馬來酰亞胺-1，8-辛烷。衍生劑如甲基-3-(對-疊氮基苯基)dithiolpropioimcdate產(chǎn)生能在光存在的條件下，形成交聯(lián)的光可激活的中間產(chǎn)物。將在美國專利Nos.3，969，287;3，691，016;4，195，128;4，247，642;4，229，537和4，330，440中描述的反應(yīng)性水不可溶性基質(zhì)如溴化氰激活的碳水化合物和反應(yīng)底物用于蛋白質(zhì)固定。
其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥化作用，絲氨?；蛱K氨酰殘基羥基的磷酸化作用;賴氨酸，精氨酸，和組氨酸側(cè)鏈α-氨基的甲基化作用(Creighton，T.E.，PROTEINSSTRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))，N末湍胺的乙?；饔茫约澳承┣闆r下，C末端羧基的酰胺化作用。
上述衍生的部分可改善溶解性，吸附性，生物半衰期等等。該部分另外還有消除或減弱蛋白質(zhì)任何不期望的副作用等等。能介導(dǎo)上述作用的部分被公開在，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th et.，Mack Publishing Co.Easton PA(1980)中。
另一方面，本發(fā)明涉及核酸構(gòu)建體，它含有編碼PTP-1D蛋白質(zhì)，或編碼有氨基酸缺失和/或取代的PTP-1D蛋白質(zhì)的核苷酸序列。最好該核酸構(gòu)建體含有圖2所示的序列。
本發(fā)明還涉及以表達(dá)載體，如重組表達(dá)載體形式的上述核酸，以及含所述表達(dá)載體的原核和真核宿主細(xì)胞。
也提供用于表達(dá)編碼PTP 1D蛋白質(zhì)的核酸的方法。通過在有助于表達(dá)編碼PTP 1D的上述DNA的條件下，在適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來生產(chǎn)PTP-1D蛋白質(zhì)。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)知道如何使用未充分實(shí)驗(yàn)的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體和寡核苷酸，鑒定并克隆與本文描述的PTP 1D蛋白質(zhì)有序列同源性的人或其它種類哺乳動物的其它PTPs。
此外，本發(fā)明核酸的操作使得可將特定受體PTP的特定配體結(jié)合的細(xì)胞外區(qū)移植到PTP-1D的部分蛋白質(zhì)上，得到上述的嵌合蛋白質(zhì)。
可以將編碼PTP-1D蛋白質(zhì)，編碼其功能衍生物，如有氨基酸缺失、插入或取代的變異體，或編碼上文描述的嵌合PTP 1D蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體用于基因治療。導(dǎo)致疾病或失調(diào)的不正常或功能障礙的PTP-1D蛋白質(zhì)可以通過輸注或移植所需譜系的已被轉(zhuǎn)染并能表達(dá)正常PTP-1D蛋白質(zhì)的細(xì)胞(如造血細(xì)胞)而被代替?？商鎿Q地，或另外，可將能把嵌合PTP 1D蛋白質(zhì)和與所需配體結(jié)合的受體部分(如EGF)一起表達(dá)的細(xì)胞用于上述基因治療。
可通過任何各種方法，如DNA或RNA合成，或更好是通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)作為本發(fā)明重組DNA分子的核酸構(gòu)建體，由，例如Wu等人(Prog.Nucl.Acid.Res.Molec.Biol.21101-141(1978))公開了合成上述分子的技術(shù)。由Sambrook等人(MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，Second Edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))公開了按上述方法構(gòu)建重組分子的步驟。
最好處理本發(fā)明重組DNA分子的3′末端以便其不適于聚合。可通過用化學(xué)方法封阻末端，或通過修飾末端堿基以便使其在結(jié)構(gòu)上干擾聚合作用而完成上述處理。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過固定3′末端，例如通過將其結(jié)合到固體支持物(如，玻璃，塑料，乳膠等)上來完成上述處理。該支持物可以是任何形式的，例如片，棒條，球形，卵形等等。上述固定方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，將重組DNA分子的3′末端共價(jià)結(jié)合到固相支持物上。用一個(gè)空間區(qū)以將探針延伸出固相支持物只要(1)它不在空間上妨礙重組分子的任何功能或特征，和(2)該空間區(qū)序列不參與檢測中的雜交或聚合反應(yīng)。一般需將幾個(gè)，最好大量的上述重組DNA分子固定到支持物上。
用代表部分PTP-1D蛋白質(zhì)編碼序列的寡核苷酸篩選細(xì)胞或組織中存在的編碼PTP 1D的基團(tuán)并克隆所述基因。由，例如，Wu等人(同上文)公開了合成所述寡核苷酸的技術(shù)。
由于遺傳密碼是簡并的，因此可用一個(gè)以上的密碼子編碼一個(gè)特定的氨基酸(Watson，J.D.等人，MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE，4th Ed.，Benjamin/Cummings Publishing Co.，Menlo Park，CA(1987))。因此，可鑒定能編碼一種或多種氨基酸的一種或多種不同的寡核苷酸。通過考慮不正常堿基配對的關(guān)系及在真核細(xì)胞中實(shí)際使用的特定密碼子(以編碼特定的氨基酸)的頻率來估計(jì)特定寡核苷酸事實(shí)上構(gòu)成實(shí)際×××-編碼序列的可能性。上述“密碼子使用原則”(Lathe等人，J.Molec.Biol.1831-12(1985))的使用，可鑒別含有理論上最可能編碼PTP-1D序列的核苷酸序列的一種寡核苷酸或一套寡核苷酸。雖然偶而地，一種氨基酸序列可能僅由一種寡核苷酸編碼，但通常，該序列可能由任何一組相似的寡核苷酸編碼。而該組所有成員均可編碼肽片段，但該組中僅有一種含等于該基因的核苷酸序列。由于該成員甚至在存在該組其它成員的條件下，與DNA雜交，因此，在相同的方法中，可用未分離組的寡核苷酸，其中人們用一種寡核苷酸以克隆編碼所需蛋白質(zhì)的基因。
可以用理論上“最可能”編碼PTP 1D片段序列的寡核苷酸或一組寡核苷酸鑒定互補(bǔ)寡核苷酸或一組互補(bǔ)寡核苷酸序列，所述互補(bǔ)序列能與“最可能的”序列或一組序列雜交?？梢杂煤鲜龌パa(bǔ)序列的一種寡核苷酸作為探針以鑒定并分離PTP-1D基因(Sambrook等人，同上文)。
將能編碼PTP-1D基因片段(或與所述寡核苷酸或一組寡核苷酸互補(bǔ))的一種適宜的寡核苷酸，或一組寡核苷酸，鑒定(用上述方法)，合成并用本領(lǐng)域熟知的方法與得自能表達(dá)PTP 1D基因的細(xì)胞的DNA制品，最好是cDNA制品雜交。用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的方法(Belagaje等人，J，Biol.Chem.2545765-5780(1979);Maniatis等人，InMOLECULAR MECHANISMS IN THE CONTROL OF GENE EXPRESSION，Nierlich等人，eds.Academic Press NY，1976;Wu等人，同上文;Khorana，R.G.，Science 203614-625(1979))，可合成與“最可能的”PTP 1D編碼序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸分子?？捎米詣雍铣蓛x完成DNA合成。由Sambrook等人(同上文)，及Haymes等人(InNUCLEIC ACID HYBRIDIZATION，APPACTICAL APPROACH，IRL Press，Washington，DC，1985)公開了核酸雜交技術(shù)，上述文獻(xiàn)均引入本文作為參考。
如上述描述的技術(shù)或與上述相似的技術(shù)也能成功地克隆人醛脫氫酶基因(Hsu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823771-3775(1985))、fibronectin基因(Suzuki等人，EMBO J.42519-2524(1985))，人雌激素受體基因(Walter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 827889-7893(1985))、組織型血纖維蛋白溶酶原激活子(Pennica等人，Nature 301214-221(1983))和人產(chǎn)期胎盤堿性磷酸酶互補(bǔ)DNA(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA828715-8719(1985))。
在另一種克隆PTP-1D基因的方法中，通過將來自能表達(dá)PTP 1D的細(xì)胞的DNA，最好是cDNA克隆到表達(dá)載體中，從而制備表達(dá)載體文庫。然后從該文庫中篩選能表達(dá)蛋白質(zhì)的成員，所述蛋白質(zhì)與PTP-1D蛋白質(zhì)特異性的配體，最好是抗體結(jié)合，并含有編碼與PTP-1D(或其片段)相同氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在該實(shí)施方案中，從能夠表達(dá)PTP-1D蛋白質(zhì)的細(xì)胞中提取并純化DNA，最好是cDNA。將純化的DNA切成片段(通過剪切，核酸內(nèi)切酶消化等等)以得到DNA或cDNA片段庫。然后將來自該庫的片段克隆到表達(dá)載體中，以便得到其成員各含一個(gè)特有的克隆DNA或DNA片段的表達(dá)載體基因組文庫。
“表達(dá)載體”是(由于存在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)譯控制序列)表達(dá)已被克隆至載體中的DNA(或cDNA)分子，由此生產(chǎn)蛋白質(zhì)的載體。若將表達(dá)載體導(dǎo)入至適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，則會發(fā)生克隆序列的表達(dá)。對于原核表達(dá)載體，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是任何能表達(dá)克隆序列的原核細(xì)胞。類似的，對于真核表達(dá)載體，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是任何能表達(dá)克隆序列的真核細(xì)胞。重要的是，由于真核DNA可含有間隔序列，并且由于上述序列不能在原核細(xì)胞中正確地被加工，所以最好使用來自能表達(dá)PTP-1D的細(xì)胞的cDNA以便生產(chǎn)原核基因組表達(dá)載體文庫。由Sambrook等人(同上文)公開了制備cDNA及生產(chǎn)基因組文庫的方法。
可將編碼本發(fā)明PTP 1D蛋白質(zhì)，其功能衍生物或其嵌合分子的DNA序列根據(jù)常規(guī)技術(shù)與載體DNA重組，所述的常規(guī)技術(shù)包括用平整末端或交錯(cuò)末端進(jìn)行連接，限制酶消化以提供適當(dāng)?shù)哪┒?，?jīng)如合適的堿性磷酸酶處理而填平粘性末端以避免不需要的連接，并用適當(dāng)?shù)倪B接酶連接。上述操作技術(shù)，公開于Sombrook等人(同上文)，并是本領(lǐng)域熟知的。
如果核酸構(gòu)建體含有帶轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)信息的核苷酸序列且所述序列可被“操作連接”成核苷酸編碼序列，則說該核酸構(gòu)建體如DNA“能表達(dá)”多肽。“可操作連接”指一種連接，其中，以允許轉(zhuǎn)錄(和最終，轉(zhuǎn)譯)的所述方式連接調(diào)節(jié)DNA序列和要表達(dá)的DNA序列?；虮磉_(dá)所需的調(diào)節(jié)區(qū)的精確性質(zhì)可隨生物的不同而變化。通常，在原核生物中，需要“啟動子區(qū)”，它含有啟動子(指導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄的開始)和DNA序列(轉(zhuǎn)錄時(shí)，該序列發(fā)出蛋白質(zhì)合成起始的信號)。啟動子是可結(jié)合RNA聚合酶并促進(jìn)“可操作連接”核酸序列轉(zhuǎn)錄的雙鏈DNA或RNA序列。上述調(diào)節(jié)區(qū)一般包括涉及轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯開始的5′-非編碼序列，如TATA盒，帽序列，CAAT序列等等。
如果需要，可保留通過上述方法得到的，編碼序列的3′非編碼區(qū)，作為其轉(zhuǎn)錄末端調(diào)節(jié)序列，如終止和聚腺苷酸化作用。若在表達(dá)宿主細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄終止信號的功能不令人滿意，則在那個(gè)宿主細(xì)胞中的3′功能區(qū)可被取代。
如果兩個(gè)DNA序列間連接的性質(zhì)不會(1)導(dǎo)致框移突變的引入;(2)干擾啟動子區(qū)指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的能力，或(3)干擾編碼序列被轉(zhuǎn)錄的能力，則認(rèn)為兩個(gè)DNA序列(如啟動子區(qū)序列和PTP-1D蛋白質(zhì)編碼序列)是可操作連接的。如果啟動子能夠影響DNA序列的轉(zhuǎn)錄，則可將啟動子區(qū)與該DNA序列可操作地連接。
特定的RNA聚合酶表現(xiàn)出高度的啟動子特異性。對噬菌體T7，T3，和SP-6的RNA聚合酶特別了解，且它們表現(xiàn)出高度的啟動子特異性。對各上述RNA聚合酶特異性的啟動子序列也指導(dǎo)聚合酶只利用雙螺旋DNA模板兩條鏈中的一條。這種鏈選擇性(由啟動子序列的方向決定)決定轉(zhuǎn)錄方向。
若將兩個(gè)核酸分子序列以要么使其兩個(gè)序列均轉(zhuǎn)錄到相同的RNA轉(zhuǎn)錄本上，要么允許一個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本從一個(gè)序列開始延伸到第二序列中的方式彼此連接，則認(rèn)為這兩個(gè)核酸分子序列是“可操作連接的”。因此，若從啟動子序列開始的轉(zhuǎn)錄本，將產(chǎn)生操作連接的第二序列的RNA轉(zhuǎn)錄本，則兩個(gè)序列，如啟動子序列和任何其它“第二”核酸序列都是可操作連接的。為了進(jìn)行“可操作連接”，不必要將兩相序列相互直接相連。
本發(fā)明的啟動子序列可以是原核的，真核的或病毒的。適宜的啟動子是可阻遏的，或者，最好是組成型。適宜原核啟動子的實(shí)例包括能識別T4(Malik等人，J.Biol.Chem.2631174-1181(1984);Rosenberg等人，Gene 59191-200(1987);Shinedling等人，J.Molec.Biol.195471-480(1987);Hu等人，Gene 4221-30(1986))，T3，Sp6和T7(Chamberlin等人，Nature 228227-231(1970);Bailey等人，Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A.)80242814-2818(1983);Davanlook等人，Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A.)812035-2039(1984))聚合酶的啟動子;λ噬菌體的PR和PL啟動子(The Bacteriophage Lambda，Hershey，A.D.Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1973);Lambda Ⅱ，Hendrix，RW.，Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1980));大腸桿菌的trp，recA，熱休克;和LacZ啟動子;枯草桿菌的α-淀粉酶(Ulmanen等人，J.Bacteriol.162176-182(1985))和σ28-特異性啟動子(Gilman等人，Gene 3211-20(1984));芽孢桿菌噬菌體的啟動子(Gryczan，T.J.，InTHE MOLECULAR BIOLOGY OF THE BACILLI，Academic Press，Inc.，NY(1982));鏈霉菌屬啟動子(Ward等人，Mol.Gen.Genet.203468-478(1986));λ噬菌體int啟動子;pBR322β-內(nèi)酰胺酶的bla啟動子，以及pBR326氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因的CAT啟動子等等。有關(guān)原核啟動子的綜述參見Glick，B.R.(J.Indust.Microbiol.1277-282(1987));Cenatiempo，Y.(Biochimie 68505-516(1986));Watson等人，同上文;Gottesman，S.(Ann.Rev.Genet.18415-442)(1984))。
優(yōu)選的真核啟動子包括小鼠金屬硫因Ⅰ基的啟動子(Hamer等人.，J.Mol.Appl.Gen.1273-288(1982));SV40早期啟動子(Benoist等人，Nature 290304-310(1981));和酵母gal4基因啟動子(Johnston等人.，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)796971-6975(1982);Silver等人，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)815951-5955(1984))。所有上述文獻(xiàn)均引入本文作為參考。
強(qiáng)啟動子是優(yōu)選的。上述優(yōu)選啟動子的實(shí)例是識別T3，SP6和T7聚合酶的啟動子，小鼠金屬硫因Ⅰ基因的PL啟動子。對于真核表達(dá)PTP-1D最優(yōu)選的啟動子是，如在pLSV載體中控制轉(zhuǎn)錄的SV40啟動子(Livneh等人，(1986)J.Biol.Chem.26112490-12497)。上述聚合酶識別位點(diǎn)的序列由Watson等人(同上文)作了公開。
另一方面，本發(fā)明涉及能特異性地識別PTP 1D蛋白或能特異性識別PTP 1D蛋白質(zhì)抗原決定基的抗體。
可以將重組表達(dá)的或天然產(chǎn)生的PTP 1D蛋白質(zhì)，和/或該蛋白質(zhì)的特異性抗體用于診斷與PTP 1D不正常表達(dá)或失活有關(guān)的疾病或病狀的方法。本發(fā)明提供評估主體中，正常或突變PTP 1D蛋白質(zhì)的存在及其含量的方法。在個(gè)體中沒有，或更典型地，低水平表達(dá)的PTP 1D蛋白質(zhì)，或存在突變體PTP 1D蛋白質(zhì)，可作為對癌基因轉(zhuǎn)化及發(fā)展成癌敏感性的重要預(yù)測指標(biāo)。另外，PTP 1D的超量表達(dá)(可能歸因于對負(fù)調(diào)節(jié)不敏感的突變受體/酶系統(tǒng)，或歸因于體內(nèi)存在過量的刺激性配體)可作為對糖尿病敏感性的重要預(yù)測指標(biāo)。
可將本發(fā)明的抗體用于檢測細(xì)胞，細(xì)胞或組織提取物，或生物體液中，PTP 1D蛋白質(zhì)的存在，或測量PTP 1D蛋白質(zhì)的數(shù)量或濃度。
術(shù)語“抗體”是包括多克隆抗體，單克隆抗體(mAbs)，人性化或嵌合抗體，單鏈抗體，抗-獨(dú)特型(抗-Id)抗體，以及上述任何的抗原決定基結(jié)合片段。
多克隆抗體是從用抗原，如PTP 1D蛋白質(zhì)，或其抗原功能衍生物免疫的動物血清中衍生的抗體分子的異源種群。
可以用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的方法，得到對特定抗原基本上是同質(zhì)種群的單克隆抗體(參見，例如，Kohler等人，Nature 256495-497(1975)和美國專利申請No.4，376，110)。上述抗體可以是包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD的任何免疫球蛋白類和其任何亞類?？梢栽隗w外或體內(nèi)培養(yǎng)生產(chǎn)本發(fā)明mAb的雜交瘤。在活體中生產(chǎn)高效價(jià)的mAb使其成為目前優(yōu)選的生產(chǎn)方法。總之，將來自個(gè)體雜交瘤的細(xì)胞經(jīng)腹腔內(nèi)注射給已用姥鮫烷灌注的小鼠以產(chǎn)生含高濃度所需mAb的腹水?？梢杂帽绢I(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的柱層析法或親合層析法從上述腹水，或培養(yǎng)上清液中純化mAb，最好是IgM或IgG同型。
嵌合抗體是一種分子，其中，其不同部分來自不同動物種，例如，具有鼠mAb衍生的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的那些分子。嵌合抗體和其生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域熟知的(Cabilly等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 713273-3277(1984);Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984);Boulianne等人，Nature 312643-646(1984);Cabilly等人，歐洲專利申請125023(1984，11，14公開);Neuberger等人，Nature 314268270(1985);Taniguchi等人，歐洲專利申請171496(1985，2，19公開);Morrison等人，歐洲專利申請173494(1986，3，5公開);Neuberger等人，PCT申請WO86/01533(1986，3，13公開);Kudo等人，歐洲專利申請184187(1986，6，11公開);Sahagan等人，J.Immunol.1371066-1074(1986);Robinson等人，國際專利申請＃PCT/US86/02269(1987，5，7公開);Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443(1987);Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-218(1987);Better等人，Science1401041-1043(1988))。將這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。
為了人治療的目的，通過生產(chǎn)人恒定區(qū)嵌合體而將mAb或嵌合抗體人性化，其中，甚至部分可變區(qū)，特別是抗原結(jié)合區(qū)的保守區(qū)或骨架區(qū)是人源的，且僅有高度可變區(qū)是非人的(參見，如UK專利申請GB2188638A);Harris等人，PCT申請WO 9204381(3/19/1992);Riechmann等人，Nature 332323-327(1988))。
在另一實(shí)施方案中，抗體是單鏈抗體，它是通過經(jīng)氨基酸橋，將FV區(qū)的重和輕鏈片段連接，產(chǎn)生單連多肽而形成的(Bird，Science 242423-426(1988);Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988);和Ward等人，Nature 334544-546(1989))。
抗-獨(dú)特型(抗-Id)抗體是一種識別唯一的抗原決定基的抗體，所述抗原決定基通常與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)?？赏ㄟ^用特異于所制備的抗-Id的mAb免疫與該mAb來源于相同品種和獨(dú)特型(如小鼠品系)的動物，來制備該抗-Id抗體。通過生產(chǎn)針對這些獨(dú)特型抗原決定族的抗體(抗-Id抗體)，被免疫動物將識別并應(yīng)答免疫接種抗體的獨(dú)特型抗原決定簇。
也可以用抗-Id抗體作為“免疫原”誘導(dǎo)另一種動物中的免疫反應(yīng)，生產(chǎn)所謂抗-抗-Id抗體?？?抗-Id從抗原決定基上可以與誘導(dǎo)抗-Id的原始mAb相同。因此，通過使用抗mAb獨(dú)特型抗原決定簇的抗體，可以鑒別表達(dá)相同特異性抗體的其它克隆。
相應(yīng)地，可以用產(chǎn)生的抗本發(fā)明PTP 1D蛋白質(zhì)的mAb在適當(dāng)動物，如BALB/C小鼠中誘導(dǎo)抗-Id抗體。用來自上述免疫小鼠的脾細(xì)胞生產(chǎn)分泌抗-Id mAbs的抗-Id雜交瘤。此外，可將抗-Id mAb與載體如匙孔
血藍(lán)蛋白(KLH)結(jié)合并用于免疫其它的BALB/C小鼠。這些小鼠的血清將含有抗-抗-Id抗體，所述抗-抗-Id抗體具有PTP 1D抗原決定基特異性的原始mAb的結(jié)合特性。抗-Id mAb因此有其自己的獨(dú)特型抗原決定基，或“獨(dú)特型抗原決定基”結(jié)構(gòu)上與被評估的抗原決定基，如PTP-1D蛋白質(zhì)相似。
本文所用的術(shù)語“抗體”也包括能結(jié)合抗原的完整分子以及其片段，如，F(xiàn)ab和F(ab′)2。Fab和F(ab′)2沒有完整抗體的Fc片段，能更迅速地從循環(huán)中清除，并且與完整抗體相比，有較低的非特異性組織結(jié)合性(Wahl等人，J.Nucl.Med 24316-325(1983))。應(yīng)懂得，可將在本發(fā)明中有用的抗體的Fab和F(ab′)2及其它片段按照本文公開的用于完整抗體分子的方法檢測PTP 1D蛋白質(zhì)并確定其量。通?？赏ㄟ^用酶蛋白水解裂解如木瓜酶(生產(chǎn)Fab片段)或胃蛋白酶(生產(chǎn)F(ab′)2片段)生產(chǎn)上述片段。
可將本發(fā)明中有用的抗體，或抗體片段用于定量或定性地檢測表達(dá)PTP 1D蛋白質(zhì)的細(xì)胞的存在。可通過使用與光學(xué)顯微鏡、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，或熒光檢測法結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體(見下文)的免疫熒光技術(shù)完成上述內(nèi)容。
可將在本發(fā)明中有用的抗體(或其片段)在組織學(xué)上，如在免疫熒光或免疫電子顯微鏡中，用于原位檢測PTP 1D蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^從患者中取出組織學(xué)樣品，并用到本發(fā)明的標(biāo)記抗體上，完成原位檢測。最好通過將標(biāo)記抗體(或片段)涂到生物樣品上，使用該抗體。通過使用上述方法，不僅可確定PTP 1D蛋白質(zhì)的存在，而且可確定其在被檢組織中的分布。使用本發(fā)明，普通技術(shù)人員會很容易理解，可改變?nèi)魏卧S多種類的組織學(xué)方法(如染色方法)以便達(dá)到所述的原位檢測。用于PTP 1D蛋白質(zhì)的所述檢測法一般包括在存在能鑒定PTP 1D蛋白質(zhì)的可檢測標(biāo)記抗體的情況下，保溫生物樣品，如生物液體，組織提取物，新鮮收集的細(xì)胞如淋巴細(xì)胞或白細(xì)胞，或已在組織培養(yǎng)液中保溫的細(xì)胞，用本領(lǐng)域熟知的大量技術(shù)，檢測結(jié)合的抗體。
可將生物樣品與固相支持物或載體如硝酸纖維素，或能固定細(xì)胞，細(xì)胞顆?；蚩扇艿鞍踪|(zhì)的其它固相支持物接觸。然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌支持物，接著用可檢測標(biāo)記的PTP·1D特異性抗體處理。然后用緩沖液將固相支持物洗滌第二次以除去未結(jié)合的抗體?？赏ㄟ^常規(guī)方法檢測結(jié)合在固體支持物上的結(jié)合標(biāo)記量。
“固相支持物或載體”是能結(jié)合抗原或抗體的任何支持物。熟知的支持物或載體包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龍，淀粉酶，天然及改性的纖維素，聚丙烯酰胺，輝長巖，磁鐵礦。對于本發(fā)明的目的，載體的性質(zhì)要么在某種程度上是可溶要么不可溶。實(shí)際上，支持物可以有任何可能的結(jié)構(gòu)構(gòu)型，只要結(jié)合的分子能與抗原或抗體結(jié)合。因此，支持物的構(gòu)型可以是球形的，如珠，柱形的，在檢測試管的內(nèi)表面，棒條的外表面。另外，表面可以是平的如片，檢測帶狀等等。優(yōu)選的支持物包括聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員會知道許多適于結(jié)合抗體或抗原的其它載體，或通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)可確定它們。
根據(jù)熟知的方法，可以確定所給許多抗-PTP 1D抗體的結(jié)合活性。通過使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以確定每個(gè)檢測分析的操作和最佳檢測條件。
將PTP 1D特異性抗體可檢測標(biāo)記的一種方法之一是將所述抗體與酶連接并在酶免疫檢測(EIA)中使用(Voller，A，"The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)"，Diagnostic Horizons 21-7(1978))(Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，MD);Voller，A.等人，J.Clin.Pathol.31507-520(1978);Butter，J.E.，Meth.Enzymol.73482-523(1981);Maggio，E.(ed.，ENZYME IMMUNOASSAY，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L，1980;Ishikawa，E.等人，(eds.)ENZYME IMMUNOASSAY，Kgaku Shoin，Tokyo，1981)。與抗體結(jié)合的酶將以上述方式與適當(dāng)?shù)牡孜?，最好是產(chǎn)色底物反應(yīng)，以便產(chǎn)生如，通過分光光度測定法，熒光測定法或肉眼觀察法可檢測的化學(xué)部分。用于可檢測標(biāo)記抗體的酶包括(但不限于)蘋果酸脫氫酶，葡萄球菌核酸酶，δ-5-甾類異構(gòu)酶，酵母醇脫氫酶，α-磷酸甘油，脫氫酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，過氧化氫酶，葡糖-6-磷酸脫氫酶，葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。通過使用有關(guān)酶的產(chǎn)色底物的比色法，可完成檢測。通過將底物的酶反應(yīng)程度與相似制備的標(biāo)準(zhǔn)物肉眼進(jìn)行比較，也可未完成檢測。
可以用任何各種其它的免疫檢測法完成檢測。例如，通過放射性標(biāo)記抗體或抗體片段，使用放射免疫檢測法(RIA)(參見，如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，SeventhTraining Course on Padioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986，該文獻(xiàn)引入本文作為參考)可檢測PTP 1D蛋白質(zhì)。由于使用γ計(jì)數(shù)或閃爍計(jì)數(shù)或放射自顯影，所以可以檢測放射性同位素。
也可以用熒光化合物標(biāo)記抗體。若將熒光標(biāo)記的抗體置于適當(dāng)波長的光下，由于產(chǎn)生熒光則可檢測到其存在。最常使用的熒光標(biāo)記化合物是異硫氰酸熒光素，堿性蕊香紅，藻紅蛋白，藻藍(lán)蛋白，別藻藍(lán)素，o-苯二醛和熒光胺。
用發(fā)射熒光的金屬如152Eu，或其它鑭系金屬，將抗體作可檢測標(biāo)記。用金屬螯合基因如二亞乙基三胺基五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)，可將這些金屬附著到抗體上。
通過將抗體與化學(xué)發(fā)光化合物結(jié)合，也可將抗體作可檢測標(biāo)記。然后，通過檢測在化學(xué)反應(yīng)期間產(chǎn)生的發(fā)光的存在，確定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記抗體的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的實(shí)施是魯米諾，異魯米諾，theromatic acridinium ester，咪唑，吖啶鹽和草酸酯。
另外，也可用生物發(fā)光化合物標(biāo)記本發(fā)明的抗體。生物發(fā)光物質(zhì)是在生物系中發(fā)現(xiàn)的一種化學(xué)發(fā)光物質(zhì)類型，其中，催化蛋白質(zhì)提高化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。通過檢測發(fā)光的存在，確定生物發(fā)光蛋白質(zhì)的存在。用于標(biāo)記目的的重要生物發(fā)光化合物是蟲熒光素，蟲熒光素酶和水母發(fā)光蛋白。
本發(fā)明也涉及用于在主體中檢測編碼PTP 1D蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體，或編碼突變PTP 1D蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體的存在的方法，包括(a)在雜交條件下，將所述主體的細(xì)胞或其提取物與編碼至少部分所述正常或突變PTP 1D蛋白質(zhì)的寡核苷酸探針接觸;和(b)檢測所述探針與所述細(xì)胞核酸的雜交，由此檢測所述核酸構(gòu)建體的存在。
該方法可在步驟(a)前含有步驟(c)，即選擇性地?cái)U(kuò)增編碼PTP 1D蛋白質(zhì)的核酸的數(shù)量。最好，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR，見下文)完成擴(kuò)增。
用編碼PTP 1D蛋白質(zhì)各部分(見上文)的寡核苷酸探針檢測受試者細(xì)胞中有關(guān)編碼PTP 1D蛋白質(zhì)的DNA或RNA的存在情況。合成所述探針的技術(shù)由，例如，Wu等人(同上)作了公開。優(yōu)選的探針是針對編碼本發(fā)明PTP 1D蛋白質(zhì)的至少四個(gè)氨基酸殘基，且最好至少五個(gè)氨基酸殘基的核酸序列的探針(見下文實(shí)施例)?？梢杂盟鎏结樛瓿啥ㄐ曰蚨繖z測。例如，用Northern分析測量細(xì)胞或組織制品中PTP 1D mRNA的表達(dá)。
甚至對于從個(gè)體中得到的很少量的DNA，在用選擇性擴(kuò)增技術(shù)之后，也可以使用上述方法。早已掌握能擴(kuò)增純化核酸片段的重組DNA方法。通常，上述方法包括將核酸片段導(dǎo)入DNA或RNA載體，克隆擴(kuò)增載體，并回收擴(kuò)增的核酸片段。由Cohen等人(美國專利No.4，237，224)，和Sambrook等人，(同上文)提供了上述方法的實(shí)施(所述文獻(xiàn)引入本文作為參考)。
稱為“聚合酶鏈反應(yīng)”(PCR)的體外酶法能夠增加所需核酸分子的濃度(Mullis等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51263-273(1986);Erlich，H.，EP50424，EP84796，EP258017，EP237362;Mullis K.，EP201184;Mullis等人;U.S4，683，202;Erlich，H.U.S.4，582，788;和Saiki等人，US4，683，194)。
本發(fā)明也涉及鑒定化學(xué)或生物制品中存在的能與PTP 1D蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物的方法，包括(a)將PTP 1D蛋白質(zhì)或其化合物-結(jié)合的部分附著到固相基質(zhì)上;
(b)將化學(xué)或生物制品與步驟(a)中生產(chǎn)的固相基質(zhì)接觸，使該化合物結(jié)合，并洗滌掉任何未結(jié)合的物質(zhì);
(c)檢測與固相結(jié)合的化合物的存在，由此鑒定該化合物。
上述方法還可包括步驟(d)洗脫結(jié)合的化合物，由此分離該化合物。
術(shù)語“能與PTP 1D蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物”指與磷酸酶區(qū)催化位點(diǎn)外的PTP 1D相互作用的天然產(chǎn)生或合成生產(chǎn)的分子。(“催化位點(diǎn)”是指最小的，含有磷酸酶催化活性的PTP 1D連接部分。)上述化合物可直接或間接地調(diào)節(jié)PTP 1D蛋白質(zhì)的酶活性。上述化合物的實(shí)例是(ⅰ)一種天然底物，最初是與PTP 1D蛋白質(zhì)相互作用并是由PTP 1D蛋白質(zhì)去磷酸化的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì);(ⅱ)由其它細(xì)胞型產(chǎn)生的天然分子。
PTP 1D蛋白的“化合物-結(jié)合部分”是指催化位點(diǎn)外的分子部分。不是催化位點(diǎn)部分的PTP 1D的任何部分都可以是化合物-結(jié)合部分?？赏ㄟ^蛋白酶裂解，接著用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的常規(guī)純化方法純化，從天然產(chǎn)生的或重組表達(dá)的PTP 1D蛋白質(zhì)制備“化合物-結(jié)合部位”。另外，用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的重組技術(shù)，通過在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中僅表達(dá)PTP 1D的這些部分，可生產(chǎn)化合物-結(jié)合部分。
另一方面，本發(fā)明涉及篩選PTP“拮抗劑”(其定義為直接或間接抑制PTP 1D酶活性或活化的分子)的方法。另一方面，本發(fā)明涉及篩選PTP“興奮劑”(其定義為直接或間接提高PTP 1D蛋白質(zhì)酶活性或活化的分子)的方法。
本發(fā)明的PTP 1D蛋白質(zhì)在有關(guān)篩選藥物和其它試劑的方法中是有用的，所述藥物和其它試劑能激活或抑制磷酸酶活性，并由此影響細(xì)胞代謝的主要途徑。通過將完整的PTP 1D蛋白質(zhì)或其片段附著到固相基質(zhì)上，生產(chǎn)親合探針，根據(jù)這些生物產(chǎn)品或化學(xué)試劑的結(jié)合活性，可用該親合探針篩選所述生物產(chǎn)品或化學(xué)試劑有關(guān)的與PTP-1D相互作用的能力。然后以純化形式，從親合探針上洗脫結(jié)合的物質(zhì)。
可將PTP 1D蛋白質(zhì)，或有氨基酸缺失和/或插入和/或取代但保持磷酸酶活性的其功能衍生物用于檢測能增強(qiáng)或抑制磷酸酶活性的化合物?？梢栽隗w外系統(tǒng)中檢測被測化合物調(diào)節(jié)磷酸酶活性的能力，其中將檢測化合物加到純化的PTP 1D蛋白質(zhì)，或有酶活性的其功能衍生物中，并用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)酶學(xué)方法，測量對酶活性的影響。
可通過有限地蛋白水解處理天然產(chǎn)生的或重組表達(dá)的PTP 1D蛋白質(zhì)，來制備用于篩選的PTP 1D蛋白質(zhì)的適當(dāng)片段。另外，可以用重組技術(shù)生產(chǎn)PTP 1D的適宜片段。作為一個(gè)實(shí)例，它不以任何方式限制所要求的本發(fā)明的范圍，但最好是僅將催化區(qū)用于篩選目的。上述催化區(qū)(由對于酶活性必需的最小數(shù)目氨基酸組成)可用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的重組技術(shù)，在適當(dāng)?shù)乃拗?如大腸桿菌)中，單獨(dú)或作為融合蛋白的一部分而生產(chǎn)出來。
另外，可用活的或固定細(xì)胞，或得自活的或固定細(xì)胞的膜部分，在整細(xì)胞制品中測量一種化合物對PTP活性的作用。該方法可用于篩選直接作用于PTP 1D蛋白質(zhì)酶部分的化合物。將檢測化合物與表達(dá)高水平PTP 1D蛋白質(zhì)的細(xì)胞，如轉(zhuǎn)染的COS或NIH-3T3細(xì)胞，或與該細(xì)胞的膜制品一起培養(yǎng)。然后用本領(lǐng)域熟知的方法(Nonegger，等人，Cell 51199-209(1987);Margolis等人，同上文)測量細(xì)胞磷酸酪氨酸的數(shù)量。將結(jié)果與不存在檢測化合物時(shí)得到的結(jié)果，或者不存在或存在已知PTP 1D蛋白質(zhì)激活劑時(shí)得到的結(jié)果相比。在上述檢測中，可以測量在存在酪氨酸激酶激活劑的情況下，所檢測化合物的作用。刺激PTP活性的化合物將會導(dǎo)致磷酸酪氨酸數(shù)量的凈減少，而抑制PTP活性的化合物將會導(dǎo)致磷酸酪氨酸數(shù)量的凈增強(qiáng)。
就生長因子受體RPTKs，如表面生長因子受體(EGF-R)和血小板衍生的生長因子受體(PDGF-R)而言，酪氨酸磷酸化作用與細(xì)胞生長和癌基因轉(zhuǎn)化相連接。PTP的激活(導(dǎo)致去磷酸化)可作為防止或抑制生長的反調(diào)節(jié)機(jī)制，并且可能作為抗癌的一種內(nèi)生調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，這種受體-酶系統(tǒng)的突變或不調(diào)，可能促使其對癌的敏感性。
胰島素受體也是一種酪氨酸激酶，且在帶有胰島素受體的細(xì)胞中，酪氨酸的磷酸化可能與正常生理功能有關(guān)。與細(xì)胞生長和癌的情況相比，PTP的激活可能會抵消胰島素的影響。次正常的PTP水平或酶活性可能對除去正常反調(diào)節(jié)機(jī)制起作用?？墒?，可能更重要的是，希望PTP 1D的超活性或不適當(dāng)?shù)募せ羁梢种苹蛲耆乐挂葝u素對細(xì)胞的作用，而導(dǎo)致糖尿病(一種胰島素-抗性變種)。因此，對糖尿病的敏感性可能與PTP失調(diào)有關(guān)。
因此，本發(fā)明用于鑒別與細(xì)胞或組織有關(guān)的正?；蛲蛔働TP 1D基因，或測量PTP 1D蛋白質(zhì)數(shù)量或活性的方法可作為鑒別對癌癥，糖尿病敏感性，或與細(xì)胞中磷酸酪氨酸代謝改變有關(guān)的其它疾病的方法。
本發(fā)明也涉及在藥物組合物中使用(用本文描述的方法鑒別的)PTP 1D的拮抗劑或興奮劑，所述藥物組合物用于治療與PTP 1D的不正常表達(dá)有關(guān)的疾病或病狀。另外，可以用本文描述的藥物組合物治療與具有正常PTP 1D活性，但在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中缺失PTP 1D下游一個(gè)分子相關(guān)的疾病。通常，藥物組合物可以是系統(tǒng)或局部注射或輸注的形式，也可以是與適當(dāng)?shù)妮d體配制在一起用于注射或輸注。
本發(fā)明也涉及預(yù)防或治療與PTP 1D激活相關(guān)的疾病的方法，該方法包括給需要治療的患者施用有效劑量的(a)PTP 1D蛋白質(zhì)，或其功能衍生物(按上文描述的);
(b)PTP 1D抗原決定基特異性的抗體;或(c)刺激或抑制PTP 1D的PTP酶活性的分子或化合物。
在下文第11部分詳細(xì)描述了PTP 1D與特定PTKs的相互作用。以這些相互作用為基礎(chǔ)，本發(fā)明也包括鑒別與PTK相互作用的PTP 1D特異性位點(diǎn)的方法。用本文描述的方法，和本領(lǐng)域熟知的生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法，可以鑒別在這種相互作用中涉及的成分或蛋白質(zhì)。例如，可以通過位點(diǎn)特異性誘變編碼PTP 1D或激酶的DNA來破壞或抑制這兩種分子間的相互作用。期望在兩者之一或兩種蛋白質(zhì)中，相互作用的主要位點(diǎn)是磷酸化的酪氨酸殘基。一旦鑒定了這種位點(diǎn)根據(jù)所需的生物效果，本發(fā)明提供促進(jìn)或抑制這種相互作用的方法。因此，這種相互作用的拮抗劑可含有防止PTP 1D和激酶分子間相互作用的肽或其功能衍生物。興奮劑可促進(jìn)這種相互作用。
以上文為基礎(chǔ)，本發(fā)明還提供用于鑒別可阻斷PTP 1D和激酶相互作用的化合物，如小分子的檢測方法。例如，將共表達(dá)PTP 1D和所需酪氨酸激酶(其中兩種蛋白質(zhì)相互作用)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，與能抑制這種相互作用的試劑一起保溫，并測量對PTP 1D-激酶相互作用的影響。任何大量用于測量這種相互作用和其破壞作用的方法都是可行的，例如，下文第11部分中描述的方法。相似地，用與上述所述的有關(guān)潛在拮抗劑相同的方法，本發(fā)明提供一種鑒定并檢測興奮劑化合物的檢測方法，該化合物可穩(wěn)定并促進(jìn)PTP 1D-激酶相互作用，例如，激活磷酸酶酶促活性。
現(xiàn)已一般性地描述了本發(fā)明，通過參考下列實(shí)施例，將很容易理解相同的內(nèi)容，這些實(shí)施例是以說明的方式提供的，除非特別說明，否則不限制本發(fā)明的范圍。
6.實(shí)施例用PCR鑒別定義為PTP 1D的新PTP根據(jù)Chirgwin J.M等人(Biochemistry 185294-5299(1979))用硫氰酸胍處理溶解細(xì)胞系SK-BR-3(ATCC HTB30)人乳腺癌細(xì)胞的融合培養(yǎng)物。通過CsCl梯度離心分離全部的RNA。在寡(dt)柱上分離聚(A)+RNA(Aviv等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 691408-1412(1972))。用禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶(Boehringer-Mannheim)從5μg多聚(A)+RNA合成第一鏈cDNA。用標(biāo)準(zhǔn)條件(Erlich，H.E.，1989，同上文)使十分之一的cDNA經(jīng)PCR。將下列引物庫用于擴(kuò)增A.意義引物，相當(dāng)于氨基酸序列D/E/GS/ND/NYINA(SEQ ID NO8)，相當(dāng)于PTP 1B中的殘基63-69(CharbonneaU等人，1989，同上文)。
EcoRI1)GGAATTCGA(GATC)TC(GATC)GA(TC)TA(TC)AT(ACT)AA(TC)GC[SEQ ID NO9]2)GGAATTCGA(GATC)A(GA)(TC)GA(TC)TA(TC)AT(ATC)AA(TC)GC[SEQ ID NO10]3)GGAATTCGG(GATC)TC(GATC)(GA)A(TC)TA(TC)AT(ATC)AA(TC)GC[SEQ ID NO11]B.Antisense primer，corresponding to the amino acid sequence K C A/D Q/E Y W P[SEQ ID NO12]，corresponding to residues 120-126 in PTP-1B(Charbonneau et al.，supra)BamHI4)CGGGATCCGGCCA(AG)TA(TC)T(GC)(GATC)GC(AG)CA(TC)TT[SEQ ID NO13]5)CGGGATCCGGCCA(AG)TA(TC)T(GC)(GA)TC(AG)CA(TC)TT[SEQ ID NO14]
用10μg收集的引物，完成35個(gè)PCR循環(huán)(于37℃退火2分鐘;在72℃延伸1.30分鐘;在94℃變性1分鐘)。將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。
分離所需大小(-220bp)的片段，用限制酶Eco R I和BamHI將其消化，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Ausubel，F(xiàn).M.等人，eds.，Current Protocols，in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1988)將其亞克隆到pBluescript載體(Stratagene)中。通過使用Sequenase(United States Biochemical，Cleveland，Ohio，USA)的雙脫氧鏈終止法(Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467(1977))將亞克隆的PCR產(chǎn)物定序。
一個(gè)被稱為P158的克隆被鑒定為是新序列。在圖1中表示了該克隆的核苷酸和推測的氨基酸序列。
7.實(shí)施例PTP 1D的cDNA克隆用通過PCR鑒定的新PTP(標(biāo)明為PTP 1D)的部分cDNA序列從SK-BR-3細(xì)胞中篩選λzAPcDNA文庫。用ZAP cDNA盒(Stratagene，Cat.No.200400)，用5μg多聚(A)+RNA構(gòu)建這種單方向的文庫。
總之，使用Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶，用引物5′-CTCGAG(T)17-3′完成第一鏈的合成。用RNAse H，DNA聚合酶1，和T4DNA聚合酶在相同的試管中完成第二鏈的合成。甲基化后，加入EcoRⅠ連接物，在1%瓊脂糖凝膠上選擇cDNA制品的大小(＞1000bp)，并將其插入EcoRⅠ/Xhol預(yù)消化的λzAPⅡ臂中。所得的文庫有1.8×106個(gè)重組噬菌體的復(fù)雜性。
在標(biāo)準(zhǔn)過程后(Sambrook等人，同上文)，將約1.2×106的獨(dú)立的噬菌體克隆鋪在平板上并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。將濾膜與克隆p158的EcoRI/BamHI DNA片段雜交，所述片段已用50μCi[α32P]ATP和Random Primed DNA Labeling盒(Boehringer Mannheim，Cat No.1004760)作了放射性標(biāo)記。按制造商(stratagene)的說明，用體內(nèi)切割方法，簡化陽性噬菌體克隆亞克隆到pBluescript載體中的步驟。通過鏈終止法(在上文第5部分中描述的)將最長cDNA插入(-6.2kb)的編碼部分定序。
該序列在其5′末端有一個(gè)1560bp的開放閱讀框架。從710位到915的核苷酸序列與上述的PCR克隆相同。另外在PTP區(qū)，如新序列中458-464位的HCSAGIGR(相當(dāng)于PTP 1D序列中的214-220位)發(fā)現(xiàn)了其它的保守序列基元。該序列不含有帶上游終止密碼子的ATG。因此，用32P-標(biāo)記的寡核苷酸探針(寡＃218，5′-TTT CTT GTG CGT GAG AGC CTC AGC CAG CCT GGA GAC TTC GTG CTT TCT GTC C-3′)相當(dāng)于PTP 1C(Shen S-H等人，同上文)的658-709核苷酸，在低嚴(yán)緊度再篩選 SK-BR-3cDNA文庫。
發(fā)現(xiàn)含1200bp插入片段的克隆與開始鑒定的序列重疊，并131位核苷酸含一個(gè)ATG及在85位的含上游終止密碼子。
在圖2中列出了新克隆的完整的cDNA序列及預(yù)測的氨基酸序列。由于與PTP 1C和細(xì)胞溶質(zhì)的PTP 1B有關(guān)，因此，稱該新基因?yàn)镻TP 1D。預(yù)測的蛋白質(zhì)鏈的分子量為約70KDa。
PTP 1D氨基酸序列含有令人驚奇的序列基元。將PTP 1D與其它已知的細(xì)胞內(nèi)PTPs比較，本發(fā)明人能夠鑒別在不同高度保守的PTP區(qū)內(nèi)的插入?yún)^(qū)。而PTP 1C序列僅比PTP 1B和TC PTP長5個(gè)氨基酸，PTP 1D含有8個(gè)氨基酸的插入(相當(dāng)于SEQ ID NO4中的第317到324氨基酸)PTP 1BNASLIKMEEAQ RSYILTQGTC PTPNASLVDIEEAQ RSYILTQGPTP 1CNANYIKNQLLGPDENA KTYIASQGPTP 1DNANIIMPEFETXCNNSKPKKSYIATQGPTP 1D，csw(corkswrew)和PTP 1C的內(nèi)涵物在序列比較中表明，在含SH2區(qū)的磷酸酶中，保守序列QGP變成QGC。
將在標(biāo)明的位置，帶有3個(gè)或更多氨基酸插入的PTPs定義為新PTP亞家族的成員。
8.實(shí)施例通過Northern分析，在人細(xì)胞和組織中表達(dá)PTP 1D8.1 PTP 1D在正常組織中的表達(dá)。
分別從下列人組織中分離全部的RNA肝，骨骼肌，脾，膀胱，十二指腸，卵巢，腎，腦和胃。按上文所述分離多聚(A)+RNA，在含2.2M甲醛的瓊脂糖凝膠上分離并印在硝酸纖維素濾膜(Schleicher & Schuell)上。每道加5μg多聚(A)+。用(相當(dāng)于1-705核苷酸的PTP 1D序列的)32P-標(biāo)記的Eco RI/BglⅡ DNA片段雜交濾膜。按制造商的說明，用Random Primed DNA Labeling Kit(Cat.no.1004760，Boehringer Mannheim，Germany)完成標(biāo)記。隨后，用強(qiáng)化屏在-70℃使濾膜與X-線膠片接觸。圖4表明PTP 1D在人組織中的表達(dá)。
令人吃驚地是，發(fā)現(xiàn)PTP 1D能在許多不同組織中表達(dá)。最高表達(dá)是在腦中，而在骨骼肌、卵巢、和胃中表達(dá)較低。肝、十二指腸和腎僅含很低水平的轉(zhuǎn)錄本。用RNA從膀胱和脾中沒有可檢測的信號。
這種表達(dá)方式與有關(guān)PTP，PTP 1C的方式明顯相反。PTP 1C的表達(dá)是高度局限的，對于造血組織和細(xì)胞尤其明顯(Yi等人，同上文)。
8.2 PTP 1D在人乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)用上述方法，對來自幾種人乳腺癌細(xì)胞系的RNA完成Northern印跡分析。隨后，用人致癌HER2(從內(nèi)皮生長因子受體2型)的cDNA片段再探測Northern印跡。已經(jīng)表明HER2超表達(dá)直接與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和乳癌有關(guān)(Slamon，D.J.等人，Science 235177-182(1987))。在圖5中表示PTP 1D和HER2在人乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。
在大部分分析細(xì)胞系中本發(fā)明的新PTP 1D具有以馬HER2協(xié)調(diào)的方式被過量表達(dá)的顯著特征。因此，在MCF-7細(xì)胞中，兩者均以低水平表達(dá)，而在BT-474和T-47-D細(xì)胞中兩種基因均是超量表達(dá)的。
9.實(shí)施例檢測或測量細(xì)胞中的PTP 1D蛋白質(zhì)
9.1.生產(chǎn)具有PTP 1D特異性的抗體用適當(dāng)?shù)南拗泼赶昏b定噬菌體克隆之一的cDNA插入片段以釋放一個(gè)550bp的片段(相當(dāng)于圖2在PTP 1D序列中，226位到780位核苷酸)。將該DNA片段以框架形式克隆到pGEX-3X谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合載體(Pharmacia，Cat.no.27-4803-01)中。
在加3小時(shí)0.5mM異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)過夜培養(yǎng)后，誘導(dǎo)GST融合蛋白的細(xì)菌表達(dá)。通過在Glutathione Sepharose 4B(Pharmacia)上分批層析，從超聲波處理的細(xì)菌溶解產(chǎn)物的上清液中純化融合蛋白(Smith等人，同上文)。
通過注射在等體積完全弗代佐劑中的GST-PTP 1D融合蛋白(500μg)來免疫兔。用相同的抗原，將兔接種兩次。第二次接種后，用內(nèi)生表達(dá)PTP 1D的人乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3和T-47-D的溶解產(chǎn)物檢測兔血清在免疫沉淀(Westerm印跡)中的抗體反應(yīng)活性。將樣品載在7.5%聚丙烯酰胺凝膠上，并在電泳后，將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜(Schleicher & Schuell)上。用與上文相同的抗體探測印跡并按制造商的說明(Amersham International，UK;Cat.no、RPN 2108)用ECL Western印跡探測系統(tǒng)顯色。圖6中給出了結(jié)果。
發(fā)現(xiàn)抗血清來自這兩種細(xì)胞制品的免疫沉淀蛋白質(zhì)，包括相當(dāng)于PTP 1D的在約70KDa的峰。
10.實(shí)施例鑒定刺激或抑制PTP 1D酶活性的分子用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Ausubel等人，同上文)將含完整PTP 1D的編碼區(qū)，或其酶活性部分的cDNA插入哺乳動物表達(dá)載體pcDNA Ⅰ(Cat.no.V490-20，Invitrogen，San Diego，CA)，用由Gorman等人(Virology 171377-385(1989))描述的293細(xì)胞暫時(shí)表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)具有酶活性的PTP。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將293細(xì)胞在用10%(V/V)胎牛血清補(bǔ)充的Dulbecco′s Modified Eagle培養(yǎng)基(Gibco，Life Technologies，Ltd.Paisley，Scotaland)中，于5%CO2，37℃培養(yǎng)。
因此，將10μg含PTP 1D cDNA的質(zhì)粒構(gòu)建體與0.5ml 0.25M CaCl2和0.5ml ZXBBS[50mM，N，N-雙(2-羥乙基)-2氨基乙烷-磺酸(BES)，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4]混和，并用其按Chen等人(Mol.Cell.Biol.72745-2752(1987))所述方法，轉(zhuǎn)染在10cm陪氏培養(yǎng)皿中的1.5×106203細(xì)胞。在加入磷酸鈣-DNA沉淀后，將細(xì)胞在3%CO2下，于37℃培養(yǎng)24小時(shí)，然后用DMEM-FCS洗滌一次，并在新鮮培養(yǎng)基中，5%CO2下，于37℃再培養(yǎng)24小時(shí)。除去培養(yǎng)基，細(xì)胞溶解于1.0ml的溶解緩沖液(20mM HEPES PH7.5，150mM NaCl，10%甘油，1.0%Triton X-100，1.5mM MgCl2，4mM EGTA(Sigma EDZSS)，10μg/ml抑肽酶，1mM PMSF)。在4℃將細(xì)胞溶解產(chǎn)物以2500×g離心2分離。除去上清液并將100μl等份快速冷凍在液氮中并在-70℃貯存直到使用。
PTP 1D制品也可以是SK-BR-3細(xì)胞系(ATCC HTB30)的溶解產(chǎn)物，也可以從表達(dá)PTP 1D的其它細(xì)胞系或正常組織中，按上文所述得到這種蛋白質(zhì)。
用三種不同的底物評估PTP酶活性的潛在抑制劑或刺激劑(1)磷酸對硝基苯酯(pNP-P，Sigma 104-0);(2)32P-標(biāo)記的Raytide(Oncogene Science Inc.，Manhasset，NY);或(3)32P-標(biāo)記的牛髓磷脂堿性蛋白(MBP)。對發(fā)現(xiàn)可降低或增加本發(fā)明PTP抗一種或多種這些底物活性的物質(zhì)作進(jìn)一步分析。
基本按Tonks，N.K.等人(J.Biol.Chem.2636731-6737(1988))所述測定PTP 1D對pNP-P的酶活性。使用微滴定板，將10μl上述的293溶解產(chǎn)物與100μlpNP-P(各30和100mM)一起在室溫下溫育。用Dynatech M R500讀數(shù)器每隔1分鐘讀一次吸收值。在加入pNP-P前5分鐘，將需分析有關(guān)刺激或抑制活性的物質(zhì)加到PTP 1D/293細(xì)胞溶解產(chǎn)物中。
基本按Krueger等人(同上文)所述測定PTP 1D對32P-標(biāo)記的RaytideTM的活性。按制造商的說明(Oncogene Science)，稍有很小的修改，使用酪氨酸激酶p60c-arc用32P標(biāo)記合成的肽Raytide?？傊畬?μlp60c-arc與20μl Raytide(1mg/ml)和108μl激酶緩沖液[50mM HEPES PH7.5含10mM MgCl2，0.2%(V/V)β-巰基乙醇，30μM ATP和50μCi[γ32P]ATP]混合。將混合物在37℃溫育16小時(shí)，然后，加入500μl在20mM NaH2PO4和100μl 5mg/ml乙?；Ｑ灏椎鞍字械?0%(W/V)三氯乙酸(TCA)，以中止反應(yīng)。將混合物離心，用20%TCA/20mM NaH2PO4將沉淀洗滌3次，最后再溶解在0.2M Tris-Cl pH8.0中。
用與上述Raytide相似的方法(Guan等人，Nature 350359-362(1991))。標(biāo)記髓磷脂堿性蛋白(Sigma Chemical Co.)在60μl含下列組分的反應(yīng)液中標(biāo)記30μg MBP50mM HEPES緩沖液pH7.5，10mM MgCl2，0.067%β-巰基乙醇，0.05mM含150μCi[γ32P]ATP和4單位p43v-abl激酶(Oncogene Science)的ATP。將混和物在30℃溫育60分鐘，并通過將冰冷TCA加到20%的最終濃度來中止反應(yīng)。在冰上30分鐘后，用20%TCA將沉淀洗滌3次并再溶于100μl H2O。
用Raytide或MBP作酶檢測，將5μl濃縮的(10×)PTP緩沖液(25mM HEPES pH7.3，5mM EDTA，10mM二硫蘇糖醇)與下列物質(zhì)混合(a)5μl32P-標(biāo)記的Raytide或MBP(相當(dāng)于10-20×104cpm);(b)分別5，10和25μl的PTP-1D/293細(xì)胞溶解產(chǎn)物，和(c)加H2O到50μl的最終體積。在37℃溫育30分鐘后，中止反應(yīng)。在Raytide的情況下，通過加入如下的0.75ml酸性炭混和物(Krueger等人，同上文)來中止反應(yīng)0.9M HCl，90mM焦磷酸鈉，2mM NaH2PO4，4%(v/v)Norit A(Sigma)。混和并離心后除去400μl的上清液，測量放射活性。若使用MBP作為底物，則加入20%TCA(最終體積)來中止反應(yīng)。測量32P上清液的數(shù)量。
在檢測開始前5分鐘將有待分析其刺激劑或抑制劑活性的物質(zhì)加入到PTP-D1/293細(xì)胞裂解物中。
采用上面方法鑒定能刺激或抑制PTP 1D的PTP活性的分子或試劑。
11.實(shí)施例PTP 1D與蛋白質(zhì)酪氨酸激酶的相互作用為了研究在完整細(xì)胞PTP 1D的特定功能，檢測PTP 1D的底物特異性及其與一組RPTKs的關(guān)系并與PTP 1C進(jìn)行比較。使用在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中發(fā)展的一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)可允許多轉(zhuǎn)染基因的共超表達(dá)。
11.1RTKases與PTP 1D的共表達(dá)將在巨細(xì)胞病毒啟動子為基礎(chǔ)的載體中PTP 1D cDNA表達(dá)構(gòu)建體與7種RPTKs的表達(dá)質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染到人293胚腎細(xì)胞中。在HER2/neu和pl45c-klt的情況下，使用嵌合受體HER1-2和EK-R，其中各自相應(yīng)的激酶功能在EGF-R細(xì)胞外區(qū)的控制下(Lee，J.等人，EMBO J.8167(1989);Herbst，R.等人，J.Biol.Chem.26619908(1991))(圖7)。
或者單獨(dú)用RPTK表達(dá)質(zhì)?；蚺c人PTP 1D或小鼠PTP 1C表達(dá)載體(Gorman，C.M.等人，Virology 171377(1989);Lammers R.等人，J.Biol.Chem 26516886(1990))一起轉(zhuǎn)染半會合293細(xì)胞(人胚腎成纖維細(xì)胞;ATCC CRL1573)。血清饑餓24小時(shí)后，用適當(dāng)?shù)呐潴w將細(xì)胞刺激10分鐘(圖7)并溶解。用SDS-PAGE分離等分的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上并用單克隆抗-磷酸酪氨酸抗體5E2探測。用ECL檢測系統(tǒng)(Amersham)將印跡顯影。標(biāo)明分子量標(biāo)記物。
在這些實(shí)驗(yàn)中，配體對PDGF-R和EGF-R磷酸化作用明顯消失，是歸因于在該系統(tǒng)中，這些受體的很高水平的超量表達(dá)以及其基礎(chǔ)活性的原有活化。令人吃驚地是，在去磷酸活性中，檢測到PTP 1D與PTP 1C相比有顯著的不同，盡管它們有大約相等的，高表達(dá)水平。
PTP 1C的共表達(dá)引起胰島素受體(I-R)和胰島素類似的生長因子-1受體(IGF-1-R)的超量表達(dá)的PDGF-Rα和β亞單位及β亞單位和未加工前體的部分或完全去磷酸化，但對EGF-R和HER1-2磷酸化狀態(tài)有邊際效應(yīng)。
相反，PTP 1D對任何檢測的RPTKs沒有明顯的作用，除對EK-R嵌合體有弱的去磷酸化活性(圖7，14-16泳道)。
11.2 PTP與PTKase和特定相互作用當(dāng)檢測PTPs與共表達(dá)的RPTKs的可能關(guān)系時(shí)，會出現(xiàn)不同的情況。該結(jié)果說明，PTP 1C和PTP 1D與不同的激酶區(qū)特異性地相互作用。
為了標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，檢測有EGF-R細(xì)胞外區(qū)的三種嵌合RPTKs(HER1-2，EK-R，EP-R)(Seedorf.K.等人，J.Biol.Chem.26612424(1991))作為EGR-R本身(圖8)。
血清饑餓后，用[35S]-L-甲硫氨酸代謝標(biāo)記過夜，并用50ng/ml EGF刺激10分鐘，用單克隆抗體108.1(對EGF-R細(xì)胞外區(qū)特異性的)免疫沉淀EGF-R和嵌合受體。該方法消除了生長因子或抗體特性方面可能的差別對實(shí)驗(yàn)的影響，并可定量地比較結(jié)果。粗略地洗滌沉淀，在SDS樣品樣緩沖液中煮沸，并用7.5%SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上后，用抗PTP 1D和PTP 1C產(chǎn)生的兔抗血清混合物，探測印跡。通過用由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Pharmacia)和分別的PTP 1D的部分N末端序列(殘基28-219)或PTP 1C的部分N末端序列(殘基55-302)組成的融合蛋白免疫兔，來得到這些抗血清。
如在圖8中所示(上組)，PTP 1C僅與HER1-2嵌合體(泳道6)有關(guān)。相反，PTP 1D與HER2/neu(HER1-2)和PDGF-Rβ(EP-R)胞質(zhì)區(qū)有很大的關(guān)系，且與EGF-R和c-kit(EK-R)有較低的親和性。值得注意地，分別由EGF-R，HER1-2和EK-R產(chǎn)生的泳道2，5和8中的68KDa PTP帶移到泳道11中較高的近似M說明磷酸化作為與活化的EP-R相互作用的結(jié)果。
11.3 PTP 1D的酪氨酸磷酸化和磷酸酶活性的刺激為了檢測PTP 1D是否能作為PDGF-Rβ激酶的底物，用上述的PTP 1D和EP-R轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過抗-PTP 1D抗體免疫沉淀、PAGE和用抗磷酸酪氨酸抗體免疫印跡分析細(xì)胞溶解產(chǎn)物，用293細(xì)胞轉(zhuǎn)染的載體作負(fù)對照。
圖9表明清晰的PTP 1D帶的配體誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化，該帶現(xiàn)遷移至169KDa，也檢測到約180KD的較大的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的弱共沉淀，可能是EP-R嵌合體(Seedorf，K.等人，J.Biol.Chem.26612424(1991))。
特定特異性的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑涉及順次的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，該作用會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)修飾，底物構(gòu)型的改變，但在某些情況下是酶活性的改變。因此，完成實(shí)驗(yàn)以檢測通過PDGF-Rβ激酶酪氨酸磷酸化是否影響PTP 1D的催化活性。在TCA中底物沉淀后，通過測量其從32P-多聚(Glu-Tyr)釋放磷酸的能力。檢測來自共表達(dá)EP-R和PTP 1D的293細(xì)胞的等份抗PRP 1D免疫沉淀物的磷酸酶活性(Tung，H.Y.L.等人，Anal.Biochem.161412(1987))。將與Protein A-Sepharose(Pharmacia)結(jié)合的免疫復(fù)合物與32P-標(biāo)記的底物(10，000cpm)一起在37℃溫育標(biāo)記的時(shí)間(參見圖10)。用1.5體積20%TCA沉淀后，通過Cerenkov計(jì)數(shù)確定上清液中32P的釋放。圖10中表示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用兩種平行測量法得到的典型實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。在含共表達(dá)的EP-R的樣品中，增強(qiáng)了免疫沉淀的PTP 1D的基礎(chǔ)活性，配體刺激完整的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，則該活性顯著地增加。較高的PTP 1D活性(甚至在沒有配體的情況下所見到的)反映了這些條件下(圖9)的其磷酸化狀態(tài)并且是歸因于超量表達(dá)的EP-R激活的結(jié)果。第一次，這些結(jié)果清楚地說明通過直接與配體-活化的RPTK相互作用，及通過配體-活化的RPTK的酪氨酸磷酸化，調(diào)節(jié)PTP催化活性。
11.4.討論為了研究PTP靶特異性和活性調(diào)節(jié)的問題，本發(fā)明人研究了本發(fā)明新PTP(稱為PTP 1D，得自SK-BR-3乳癌細(xì)胞)的功能性質(zhì)。PTP 1D和同源PTP，PTP 1C，與一組七種不同結(jié)構(gòu)亞型的RPTKs的共表達(dá)令人驚奇地揭示出帶PTPs的兩種結(jié)構(gòu)相似的SH2區(qū)的不同特性。
PTP 1C對自身磷酸化的EGF-R，HER2/neu，I-R，IGF1-Rα和β，PDGF-R，及SCF-R/c-kit胞質(zhì)區(qū)表現(xiàn)出混雜的活性，導(dǎo)致部分或完全的去磷酸化，PTP 1D在相同的實(shí)驗(yàn)中沒有活性。這是特別未預(yù)料到的，由于兩種PTPs均在幾種乳癌細(xì)胞系中共表達(dá)，確定，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)有力地說明，這些PTP 1C和PTP 1D的不同調(diào)節(jié)功能。
這些結(jié)果產(chǎn)生幾種可能性在RPTK的信號下降調(diào)節(jié)中，PTP 1D可能沒有一點(diǎn)作用;另外在檢測的激酶中間PTP 1D的特異性RPTK靶可能不存在。此外，由PTP 1C表明的明顯缺乏特異性可能(a)由不正常的超量表達(dá)(可能引起超活化且明顯失去特異性)造成，或(b)反映了對其它因子的需要，所述因子對于限定特異性是必需的，但不存在于293胚成纖維細(xì)胞中。
在與RPTK胞質(zhì)區(qū)形成復(fù)合物的能力方面，PTP 1D和PTP 1C之間存在明顯的不同。因此，若PTP 1C僅與一種含HER2/neu胞質(zhì)區(qū)的嵌合EGF-受體共沉淀時(shí)，則PTP 1D表現(xiàn)出與有關(guān)所有檢測受體親和性的廣譜的相互作用(圖8)。該結(jié)果與完整轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，在去磷酸化RPTKs方面PTP 1D的近乎失活相反(圖7)。
本發(fā)明人對這些結(jié)果作如下解釋可能PTP 1D經(jīng)其SH2序列與活化PDGF-Rβ胞質(zhì)區(qū)中的磷酸酪氨酸殘基緊密地相互作用，由此保護(hù)它的不發(fā)生去磷酸化。這樣保護(hù)受體不會失活。依次，將PTP 1D酪氨酸磷酸化，激活其催化功能并可能導(dǎo)致正信號調(diào)節(jié)的活化。這種解釋從果蠅csw PTP的遺傳研究中得到支持，該csw PTP與PTP 1D同源，并從RPTK編碼基因，torso的下游起作用，并在果蠅胚的末端結(jié)構(gòu)說明中，明顯地與raf同系物和轉(zhuǎn)錄因子(tailess和huckebein)合作(Perkins，L.A.等人，Cell 70225(1992))。
以前的報(bào)道已表明，在體外和完整細(xì)胞中LAR和CD45PTPs可用作Ser/Thr和酪氨酸激酶的底物(Pot D.A.等人，J.Biol.Chem.26619688(1991);Stover，D.R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887704(1991))。此外，在其催化活性的調(diào)節(jié)中，已暗示了CD45的Ser/Thr磷酸化，由于在用Ca++離子載體處理的T淋巴細(xì)胞中，CD45磷酸化的程度和其活性均有降低(Ostergaard，H.L.等人，Science 2531423(1991))。
相反，上文列舉的結(jié)果說明在完整細(xì)胞中由PDGF-Rβ激酶引起的PTP 1D酪氨酸磷酸化的增加與其催化活性成比例增強(qiáng)有關(guān)。因此，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)(1)代表重要的PTP與特異性PTK靶相互作用的第一個(gè)實(shí)例，和(2)提供有關(guān)通過PDGF-R激酶，PTP活性的酪氨酸磷酸化-介導(dǎo)的調(diào)節(jié)的跡象。
與果蠅中csw/torso基因相似，PTP與PTK的這種相互作用會導(dǎo)致對PDGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的正影響。上述理論發(fā)現(xiàn)支持在T細(xì)胞受體復(fù)合物內(nèi)發(fā)送信號的lck酪氨酸激酶涉及CD45(Mustelin T.等人，Oncogene 5809-813(1990))，并且在本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室的該發(fā)現(xiàn)中，發(fā)現(xiàn)src族的PTKs可由PTP 1α和PTP 1D誘導(dǎo)的去磷酸化活化(參見，Zheng，X.M.等人，Nature 359336(1992))。這些發(fā)現(xiàn)指出了PDGF-R，src-型PTKs，和PTP 1D之間相互作用的重要性，并開辟了研究作為PDGF-R特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基礎(chǔ)的精確機(jī)制的新方法。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)不僅指明了導(dǎo)致RPTKs產(chǎn)生信號的分子基礎(chǔ)，而且提供了PTPs在涉及細(xì)胞增殖、包括癌的疾病中的作用的線索。
上文引述的所有文獻(xiàn)均引入本文作為參考，無論特定插入與否。
現(xiàn)已全部描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)理解，在未偏離本發(fā)明精神及范圍和未作詳細(xì)實(shí)驗(yàn)的相同參數(shù)、濃度和條件下可完成本發(fā)明。
與其具體的實(shí)施方案相結(jié)合描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解，能夠進(jìn)一步對其修改。本申請打算覆蓋通?；诒景l(fā)明原理并包括上述背離本發(fā)明公開的任何變異體，用途或改制物，由于它們與本發(fā)明有關(guān)，在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的或常規(guī)實(shí)踐并可用于在如下權(quán)利要求范圍內(nèi)，在前所述的基本特征。
序列目錄(1)一般資料(ⅰ)申請人Ullrich，AxelVogel，Wolfgang(ⅱ)發(fā)明題目PTP 1D一種新的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(ⅲ)序列數(shù)19(ⅳ)相關(guān)地址(A)收件人PENNIE & EDMODS(B)街道1155 Avenue of Americas(C)城市New York(D)州New York
(E)國家美國(F)郵政編碼10036(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC 兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOD/MS-DOS(D)軟件Patent In Release ＃1.0，Version ＃1.25(ⅵ)目前的申請資料(A)申請?zhí)朥S08/018，129(B)申請日16-FEB-1993(C)分類號(ⅷ)代理人/代理資料(A)名字Misrock，S Leslie(B)注冊號18，872(C)參考/DOCKET號7683-017(ⅸ)通訊資料(A)電話(212)790-9090(B)傳真(212)869-8864/9741(C)電傳6614/PENNIE(2)SEQ ID NO1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度6個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置6(D)其它資料/標(biāo)記＝Xaa/注＝“Xaa＝Ser或Asn”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1Asp Tyr Ile Asn Ala Xaa15(2)SEQ ID NO2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置3
(C)其它資料/標(biāo)記＝Xaa/注＝“Xaa＝任何氨基酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2Lys Cys Xaa Xaa Tyr Trp Pro1 5(2)SEQ ID NO3的資料(ⅰ)序列特征(A)長度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置1(D)其它資料/標(biāo)記＝Xaa/注＝“Xaa＝Asp或Asn”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3Xaa Tyr Ile Asn Ala Xaa15(2)SEQ ID NO4的資料(ⅰ)序列特征
(A)長度2790個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置130…1911(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4
(2)SEQ ID NO5的資料(ⅰ)序列特征(A)長度593個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5
(2)SEQ ID NO6的資料(ⅰ)序列特征(A)長度177個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS
(B)位置1…177(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6
(2)SEQ ID NO7的資料(ⅰ)序列特征(A)長度59個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7
(2)SEQ ID NO8的資料(ⅰ)序列特征
(A)長度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置1(D)其它資料/標(biāo)記＝Xaa/注＝“Xaa＝Asp或Glu或Gly”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置2(D)其它資料/標(biāo)記＝Xaa/注＝“Xaa＝Ser或Asn”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置3(D)其它資料/標(biāo)記＝Xaa/注＝“Xaa＝Asx”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8Xaa Xaa Xaa Tyr Ile Asn Ala(2)SEQ ID NO9的資料
(ⅰ)序列特征(A)長度27個(gè)氨基酸(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9GGAATTCGAN TCNGAYTAYA THAAYGC(2)SEQ ID NO10的資料(ⅰ)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10GGAATTCGAN ARYGAYTAYA THAAYGC(2)SEQ ID NO11的資料(ⅰ)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11GGAATTCGGN TCNRAYTAYA THAAYGC(2)SEQ ID NO12的資料(ⅰ)序列特征(A)長度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置3(D)其它資料/標(biāo)記＝Xaa/注＝“Xaa＝Ala或Asp”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置4(D)其它資料/標(biāo)記＝Xaa/注＝“Xaa＝Gln或Glu”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO12Lys Cys Xaa Xaa Tyr Trp Pro(2)SEQ ID NO13的資料(ⅰ)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)位置20(D)其它資料/標(biāo)記＝N/注＝“N＝G，A，T或C”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO13CGGGATCCGG CCARTAYTSN GCRCAYTT(2)SEQ ID NO14的資料(ⅰ)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知
(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO14CGGGATCCGG CCARTAYTSR TCRCAYTT(2)SEQ ID NO15的資料(ⅰ)序列特征(A)長度23個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO15CTCGAGTTTT TTTTTTTTTT TTT(2)SEQ ID NO16的資料(ⅰ)序列特征(A)長度52個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO16TTTCTTGTGC GTGAGAGCCT CAGCCAGCCT GGAGACTTCG TGCTTTCTGT CC
(2)SEQ ID NO17的資料(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO17
(2)SEQ ID NO18的資料(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO18
(2)SEQ ID NO19的資料(ⅰ)序列特征
(A)長度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO19
權(quán)利要求
1.一種PTP 1D蛋白質(zhì)，或其功能衍生物，其中，若所述PTP 1D蛋白質(zhì)是天然產(chǎn)生的，則所述PTP 1D蛋白質(zhì)基本沒有與之天然相關(guān)的其它蛋白質(zhì)或糖蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的PTP 1D蛋白質(zhì)，它含有與圖2所示的PTP 1D氨基酸序列(SEQ ID NO4)至少有71%序列相同性的氨基酸序列。
3.一種PTP 1D蛋白質(zhì)，含有圖2所示的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
4.一種重組核酸構(gòu)建體，含有編碼PTP 1D蛋白質(zhì)或編碼其功能衍生物的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的重組核酸構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列是cDNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的重組核酸構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列是基因組DNA序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的重組核酸構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列編碼PTP 1D蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的重組核酸構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列是圖2中所示的序列(SEQ ID NO5)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的重組核酸構(gòu)建體，它是表達(dá)載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的重組核酸構(gòu)建體，它是載體。
11.權(quán)利要求10的重組核酸構(gòu)建體，它是質(zhì)粒。
12.一種分離并純化的核酸構(gòu)建體，它含有編碼PTP-1D蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的分離的和純化的核酸構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列是圖2中所示的序列(SEQ ID NO5)。
14.用權(quán)利要求14的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞。
15.用根據(jù)權(quán)利要求14的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的真核宿主細(xì)胞。
16.制備PTP 1D蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在培養(yǎng)條件下;培養(yǎng)能表達(dá)所述PTP 1D蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞，(b)表達(dá)所述PTP 1D蛋白質(zhì);和(c)從所述培養(yǎng)物中回收所述PTP 1D蛋白質(zhì)。
17.一種PTP 1D蛋白質(zhì)特異性的抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的抗體是單克隆的。
19.檢測細(xì)胞中PTP 1D蛋白質(zhì)的存在并測量其數(shù)量的方法，該方法包括(a)將所述細(xì)胞或其提取物與PTP 1D蛋白質(zhì)特異性的抗體接觸;和(b)檢測所述抗體與所述細(xì)胞或其提取物的結(jié)合，或測量結(jié)合的抗體量。由此確定所述PTP 1D蛋白質(zhì)的存在或測量其數(shù)量。
20.一種用于檢測含核酸的樣品中存在的編碼至少部分所述正常或突變PTP 1D蛋白質(zhì)的核酸序列的方法，包括(a)在雜交條件下，將樣品或其提取物與編碼至少部分所述正?；蛲蛔働TP 1D蛋白質(zhì)的寡核苷酸探針接觸;和(b)測量所述探針與所述樣品核酸的雜交，由此檢測所述核酸序列的存在。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，在步驟(a)前還含有(c)選擇性地?cái)U(kuò)增編碼所述至少部分所述正常或突變PTP 1D蛋白質(zhì)的核酸的數(shù)量。
22.一種鑒別能與PTP 1D蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物的方法，所述方法包括(a)將所述PTP 1D蛋白質(zhì)，或其化合物-結(jié)合的部分附著到固相基質(zhì)上;(b)將懷疑其含有所述化合物的混合物與所述基質(zhì)-結(jié)合的PTP 1D蛋白質(zhì)，糖蛋白或其部分接觸，使所述化合物結(jié)合，并洗滌掉未結(jié)合的物質(zhì);和(c)從所述固相基質(zhì)上洗脫結(jié)合的化合物，由此分離所述化合物。
23.一種從復(fù)合混合物中分離能結(jié)合PTP 1D蛋白質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)將所述PTP 1D蛋白質(zhì)，或其化合物-結(jié)合的部分附著到固相基質(zhì)上;(b)將復(fù)合混合物與基質(zhì)結(jié)合的PTP ID蛋白質(zhì)，糖蛋白或其部分接觸，以使化合物結(jié)合，并洗滌掉未結(jié)合的物質(zhì);和(c)從固相基質(zhì)上洗脫結(jié)合的化合物，由此分離該化合物。
24.一種用于確定化合物是否能刺激或抑制PTP ID的磷酸酪氨酸磷酸酶活性的方法，所述方法包括(a)將該化合物與純化形式的膜制品中或整個(gè)活或固定細(xì)胞中的PTP 1D蛋白質(zhì)接觸，或與所述PTP 1D蛋白質(zhì)的酶活性片段接觸;(b)將步驟(a)的所述混合物保溫一段間隔使所述化合物足以刺激或抑制所述酶活性;(c)測量所述PTP 1D蛋白質(zhì)或片段的磷酸酪氨酸磷酸酶活性;和(d)將所述酶活性與未與所述化合物保溫的所述PTP 1D蛋白質(zhì)或片段的酶活性進(jìn)行比較，由此確定所述化合物是否刺激或抑制所述酶活性。
25.用于治療或防止與不正常PTP 1D蛋白質(zhì)有關(guān)的疾病的藥物組合物，所述組合物含有PTP 1D蛋白質(zhì)，或其功能衍生物，及藥物學(xué)可接受的載體。
26.一種用于治療或防止與具有酶活性缺陷的不正常PTP 1D蛋白質(zhì)有關(guān)的疾病的藥物組合物，所述組合物含有刺激PTP 1D磷酸酪氨酸磷酸酶活性有效量的化合物，和藥物學(xué)可接受的載體。
27.一種用于治療或防止與具有超常酶活性的不正常PTP 1D有關(guān)的疾病的藥物組合物，所述組合物含有抑制PTP 1D磷酸酪氨酸磷酸酶活性有效量的化合物，和藥物學(xué)可接受的載體。
28.一種用于治療或防止主體中與不正常PTP 1D蛋白質(zhì)有關(guān)的疾病的方法，包括給所述主體施用權(quán)利要求25，26或27的任何組合物。
全文摘要
一種新的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶被稱為PTP 1D的蛋白質(zhì)的。PTP 1D蛋白質(zhì)可以由重組方法生產(chǎn)，如用編碼本文提供的蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體的方法，也公開了對PTP 1D蛋白質(zhì)抗原決定基特異體的抗體。提供了鑒別與PTP 1D結(jié)合并抑制或刺激其酶活性的化合物的方法，含有PTP 1D的藥組合物，用上述組合物治療與PTP 1D蛋白質(zhì)有關(guān)的疾病的方法。
文檔編號C12P21/08GK1091469SQ93114840
公開日1994年8月31日 申請日期1993年10月6日 優(yōu)先權(quán)日1992年10月6日
發(fā)明者A·烏爾里希, W·福格爾 申請人:馬克斯普朗克科學(xué)促進(jìn)協(xié)會