專利名稱：促紅細(xì)胞生成素類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有至少一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)或至少有一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排的促紅細(xì)胞生成素類似物。本發(fā)明還涉及編碼所述促紅細(xì)胞生成素類似物的DNA順序，以及供類似物表達(dá)的重組質(zhì)粒和宿主細(xì)胞。
促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種與紅細(xì)胞祖先細(xì)胞成熟為紅細(xì)胞的過程有關(guān)的糖蛋白激素。它是調(diào)節(jié)循環(huán)中的紅血細(xì)胞水平所必需的。天然存在的促紅細(xì)胞生成素在胎兒期由肝臟產(chǎn)生，成人則由腎臟產(chǎn)生，它在血液中循環(huán)，刺激骨髓中紅血細(xì)胞的產(chǎn)生。貧血幾乎都是由于腎臟產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素減少而造成腎衰竭的結(jié)果?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，用遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)的重組促紅細(xì)胞生成素可有效地用于治療由慢性腎衰竭引起的貧血，這類技術(shù)涉及用編碼促紅細(xì)胞生成素的基因轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，再由該宿主細(xì)胞表達(dá)蛋白產(chǎn)物。
正常情況下，人尿中含低水平的促紅細(xì)胞生成素，而患有再生障礙性貧血的個(gè)體尿中促紅細(xì)胞生成素水平則升高。Miyake等人(J.Biol.Chem.，2525558，1977)曾用再生障礙性貧血個(gè)體的尿液作原料來純化人尿促紅細(xì)胞生成素。但迄今為止尚未證實(shí)尿促紅細(xì)胞生成素有治療作用。
授予Lin的美國專利4，703，008描述了促紅細(xì)胞生成素編碼基因的鑒定、克隆和表達(dá)，該專利的公開內(nèi)容在此列為參考。授予Lai等人的美國專利4，667，016描述了一種從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化重組促紅細(xì)胞生成素的方法。由在重組質(zhì)粒上含有促紅細(xì)胞生成素基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主表達(dá)和回收生物活性重組促紅細(xì)胞生成素，使人們第一次可以得到適于在醫(yī)療上應(yīng)用的大量促紅細(xì)胞生成素。此外，由于了解了基因順序并能得到較大量的純化蛋白，對(duì)該蛋白的作用機(jī)理也有了更深入的了解。
真核細(xì)胞產(chǎn)生的許多細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白，都被一個(gè)或更多個(gè)寡糖基團(tuán)修飾。這種稱為糖基化的修飾作用能劇烈地影響蛋白的物理性質(zhì)，對(duì)蛋白的穩(wěn)定性、分泌和亞細(xì)胞定位也會(huì)起重要作用。正確的糖基化有時(shí)是生物活性所必需的。事實(shí)上，某些真核生物的基因在缺乏使蛋白糖基化的細(xì)胞過程的細(xì)菌(如大腸桿菌)中表達(dá)時(shí)，所回收到的蛋白由于缺少糖基化而沒有或幾乎沒有活性。
糖基化作用出現(xiàn)在多肽骨架的特異位置上，通常有兩類O連接的寡糖連在絲氨酸或蘇氨酸殘基上，而N連接的寡糖則連在作為順序Asn-X-Ser/Thr一部分的天冬酰胺殘基上，其中X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。N連接和O連接的寡糖的結(jié)構(gòu)以及每種類型中存在的糖殘基都是不同的。共同存在于兩類型中的一類糖是N-乙?；窠?jīng)氨酸(以下稱為唾液酸)。唾液酸通常是N連接和O連接寡糖的末端殘基，由于它帶有負(fù)電荷，可能會(huì)使糖蛋白具有酸性。
具有人促紅細(xì)胞生成素氨基酸順序1-165的人尿促紅細(xì)胞生成素和重組促紅細(xì)胞生成素(在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的)，都含有三個(gè)N連接寡糖鏈和一個(gè)O連接寡糖鏈，它們共占糖蛋白總分子量的約40%。N連接糖基化出現(xiàn)24、38和83位的天冬酰胺殘基，而O連接糖基化則出現(xiàn)在126位的絲氨酸殘基(Lai等，J.Biol.Chem.2613116，1986;Broudy等，Arch.Biochem.Biophys.265329，1988)。已證明寡糖鏈被末端唾液酸殘基修飾。對(duì)糖基化促紅細(xì)胞生成素進(jìn)行酶處理而脫除所有的唾液酸殘基后，導(dǎo)致體內(nèi)活性喪失，但并不影響體外活性(Lowy等，Nature 185102，1960;Goldwasser等，J.Biol.Chem.2494202，1974)。這一現(xiàn)象曾被解釋為無唾液酸促紅細(xì)胞生成素由于與肝無唾液酸糖蛋白結(jié)合蛋白相互作用而從循環(huán)中迅速清除(Morrell等，J.Biol.Chem.243155，1968;Briggs等，Am.J.Physiol.2271385，1974;Ashwell等，Methods Enzymol.50287，1978)。因此，促紅細(xì)胞生成素只有在被唾液酸化從而避免被肝結(jié)合蛋白結(jié)合時(shí)才具有體內(nèi)生物活性。
促紅細(xì)胞生成素的寡糖鏈中其他組分的作用還不十分確定。已證明，部分脫糖基化的促紅細(xì)胞生成素與糖基化形式相比，體內(nèi)活性大大降低，但卻保留了體外活性(Dordal等，Endocrinology 1162293，1985;Lin的上述專利)。但另一項(xiàng)研究則表明，如果使作為糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺或絲氨酸殘基發(fā)生突變，從而單獨(dú)或共同脫除N連接或O連接的寡糖鏈，則會(huì)使在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的突變蛋白的體外活性急劇下降(Dube等，J.Biol.Chem.26317516，1988)。
糖蛋白如促紅細(xì)胞生成素，可以用諸如等電聚焦(IEF)等技術(shù)分離成不同的帶電荷形式。粗制及部分純化的促紅細(xì)胞生成素制備物的IEF研究已有多方報(bào)道(Lukowsky等，J.Biochem.50909，1972;Shelton等，Biochem.Med.1245，1975;Fuhr等，Biochem.Biophys.Res.Comm.98930，1981)。在這些研究中用IEF最多鑒別出三個(gè)或四個(gè)具有促紅細(xì)胞生成素活性的部分，但其碳水化合物含量都未得到鑒定。此外，沒有對(duì)各部分的等電點(diǎn)與其生物活性之間作任何聯(lián)系。
在Miyake等人(同上)所討論的從人尿中純化尿促紅細(xì)胞生成素的過程中，據(jù)報(bào)道由羥磷灰石色譜法得到的兩個(gè)促紅細(xì)胞生成素部分具有相似的特異活性。這兩個(gè)部分被定名為Ⅱ和ⅢA。隨后對(duì)部分Ⅱ和ⅢA進(jìn)行的碳水化合物分析表明，部分Ⅱ的平均唾液酸含量比部分ⅢA要高(Dordal等，同上)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有確定唾液酸含量和生物活性的、經(jīng)過分離的促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。含有這些分子的藥物組合物應(yīng)具有醫(yī)療價(jià)值。
本發(fā)明涉及人促紅細(xì)胞生成素類似物，這些類似物包含至少包括一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的氨基酸順序。外加的糖基化位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致比人促紅細(xì)胞生成素更大數(shù)目的碳水化合物鏈和更高的唾液酸含量。本發(fā)明還提供另一些促紅細(xì)胞生成素類似物，這些類似物包含包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排的氨基酸順序。還提供了在促紅細(xì)胞生成素的羧基末端添加了一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的類似物，其中這種添加作用提供了至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。本發(fā)明還包括編碼這些促紅細(xì)胞生成素類似物的DNA順序，以及供類似物表達(dá)的重組質(zhì)粒和宿主細(xì)胞。


圖1顯示了不同重組促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的分析性等電聚焦凝膠。凝膠泳道1-11顯示了由泳道1的較弱酸性(pI較高)向泳道11的較強(qiáng)酸性(pI較低)排布的異構(gòu)體。在凝膠的最左邊和最右邊的泳道中還顯示了含有異構(gòu)體9-14混合物的純化重組促紅細(xì)胞生成素。
圖2顯示了每個(gè)促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的唾液酸數(shù)目與每個(gè)異構(gòu)體的體內(nèi)特異活性的關(guān)系，以每mg促紅細(xì)胞生成素多肽的單位數(shù)表示。在圖2A中，每個(gè)促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的濃度是用Bradford蛋白測(cè)定法測(cè)定的;在圖2B中，該濃度是利用280nm處的光吸收測(cè)定的;在圖2C中，該濃度是用RIA法測(cè)定的。
圖3顯示了各種重組促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的確定混合物的分析性等電聚焦凝膠，這些異構(gòu)體是用陰離子交換色譜法在不同條件下制備的。凝脈泳道1-6分別代表在用150mM乙酸pH4.7、150mM乙酸(未緩沖)、200mM乙酸pH4.7、250mM乙酸pH4.7、300mM乙酸pH4.7或300mM乙酸(未緩沖)洗滌Q-Sepharose快速流動(dòng)柱后在高鹽洗脫液中洗脫出的促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。該凝膠最左邊的泳道還示出了含有一種異構(gòu)體混合物的純化重組促紅細(xì)胞生成素，所述異構(gòu)體混合物是用Lai等人(同上)的實(shí)施例2所述的方法制得的，所不同的是用Q-Sepharose色譜法代替了DEAE-Agarose色譜法。
圖4顯示了促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體8-12的分離，分離方法是將細(xì)胞條件培養(yǎng)基加到Q-Sepharose柱上，用pH遞減而離子強(qiáng)度遞增的梯度進(jìn)行洗脫，從部分2到部分40的偶數(shù)部分中取等份試樣進(jìn)行分析性等電聚焦。該凝膠最左邊的泳道還示出了含有一種異構(gòu)體混合物的純化重組促紅細(xì)胞生成素，所述異構(gòu)體混合物是用Lai等人(同上)的實(shí)施例2所述的方法制得的，所不同的是用Q-Sepharose色譜法代替了DEAE-Agarose色譜法。
圖5顯示了人促紅細(xì)胞生成素的氨基酸順序。方塊表示連有N連接碳水化合物鏈的天冬酰胺殘基，星號(hào)表示被O連接碳水化合物鏈修飾的絲氨酸殘基。
圖6A、6B和6C顯示用于產(chǎn)生供構(gòu)建和分析人促紅細(xì)胞生成素類似物的質(zhì)粒的系列克隆步驟。這些類似物有一些如圖5所示的突變氨基酸，這些氨基酸提供了額外的糖基化位點(diǎn)。
圖7顯示了人順序促紅細(xì)胞生成素和所指出的促紅細(xì)胞生成素類似物的COS細(xì)胞上清液Western印跡分析。類似物[Asn9，Ser11]EPO、[Asn69]EPO、[Asn125，Ser127]EPO和[Pro124，Thr125]EPO是如實(shí)施例6所述構(gòu)建的。還顯示了不含額外碳水化合物鏈的其他類似物[Pro125，Thr127]EPO和[Asn126，Ser128]EPO以進(jìn)行比較。
圖8顯示了經(jīng)N-聚糖酶處理后的人順序促紅細(xì)胞生成素和所指明的促紅細(xì)胞生成素類似物的COS細(xì)胞上清液Western印跡分析。類似物[Thr125]EPO和[Pro124，Thr125]EPO是如實(shí)施例6所述構(gòu)建的。還顯示了類似物[Val126]EPO、[Pro124]EPO、[Pro125]EPO、[Thr127]EPO、[Pro125，Ser127]EPO和[Thr125，Ser127]EPO以進(jìn)行比較。
圖9顯示了由一種細(xì)胞培養(yǎng)基的Q-Sepharose和C4反相色譜得到的并集液2、3和4的等電聚焦凝膠，所述細(xì)胞培養(yǎng)基曾支持用含有[Thr125]突變的促紅細(xì)胞生成素cDNA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的生長。該凝膠左邊和右邊的泳道還示出了含有一種異構(gòu)體混合物的純化重組促紅細(xì)胞生成素，所述異構(gòu)體混合物是用Lai等人(同上)的實(shí)施例2所述的方法制得的，所不同的是用Q-Sepharose色譜法代替了DEAE-Agarose色譜法。
圖10顯示了重組人促紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)和選定的類似物的COS細(xì)胞上清液Western印跡分析。類似物的構(gòu)建描述于實(shí)施例6。較低的凝膠遷移率證實(shí)了類似物N9、N14、N18、N19、N21、N24和N39具有至少一個(gè)額外碳水化合物鏈。
圖11顯示了重組人促紅細(xì)胞生成素和EPON14在N-聚糖酶消化過程中的COS細(xì)胞上清液Western印跡分析。時(shí)間點(diǎn)取在0、4、12和45分鐘以及過夜消化后。
圖12顯示了EPON14類似物異構(gòu)體制備物的等電聚焦凝膠。低異構(gòu)體并集液含有每分子多半有6-12個(gè)唾液酸的EPO N14類似物，中異構(gòu)體并集液含有每分子多半有10-15個(gè)唾液酸的類似物N14，高異構(gòu)體并集液含有每分子多半有12-17個(gè)唾液酸的EPO N14類似物。
圖13顯示了重組人促紅細(xì)胞生成素、分離的異構(gòu)體14和EPON14類似物(異構(gòu)體15-17)給大鼠靜脈注射后的藥代動(dòng)力學(xué)。
圖14顯示了在不同量的未標(biāo)記rHuEPO、分離的異構(gòu)體14或EPO N14類似物存在下，125I標(biāo)記的重組人促紅細(xì)胞生成素與促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合的冷置換試驗(yàn)。
圖15顯示了小鼠血細(xì)胞比容試驗(yàn)，該試驗(yàn)比較了EPON14高異構(gòu)體并集液(0.036和0.0712μg)、分離的異構(gòu)體14(0.036和0.0712μg)、EPO177低異構(gòu)體并集液(0.0712μg)和rHuEPO(0.071μg)的活性。
本發(fā)明提供促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。按本發(fā)明得到的特定促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體及其性質(zhì)，可能會(huì)隨起始物的來源而變化。例如，得自尿的人促紅細(xì)胞生成素的異構(gòu)體不同于重組促紅細(xì)胞生成素的異構(gòu)體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子含有特定數(shù)目(即大于0的定數(shù))唾液酸的促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體，所述數(shù)目選自1-14。所述數(shù)目最好是9、10、11、12、13或14。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述數(shù)目大于14，最好是16-23。
這里所用的術(shù)語“促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體”是指具有單一等電點(diǎn)(pI)并具有相同氨基酸順序的促紅細(xì)胞生成素制備物。這里所用的術(shù)語“促紅細(xì)胞生成素”包括天然存在的促紅細(xì)胞生成素、來源于尿的人促紅細(xì)胞生成素，以及某些非天然存在的多肽，這些多肽具有與天然存在的促紅細(xì)胞生成素相似的氨基酸順序和糖基化作用，其相似程度足以使其具有使骨髓細(xì)胞提高網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅血細(xì)胞產(chǎn)量的體內(nèi)生物學(xué)性質(zhì)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，具有得自尿的人促紅細(xì)胞生成素氨基酸順序的重組促紅細(xì)胞生成素的不同異構(gòu)體，相應(yīng)于具有1-14個(gè)唾液酸的促紅細(xì)胞生成素分子，而純化的重組促紅細(xì)胞生成素中所含的每一種異構(gòu)體都具有與該異構(gòu)體所具有的唾液酸數(shù)目相關(guān)的體內(nèi)活性。
這一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素是已轉(zhuǎn)染到非人真核宿主細(xì)胞中的外源DNA順序的表達(dá)產(chǎn)物，也就是說，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素是“重組促紅細(xì)胞生成素”。重組促紅細(xì)胞生成素最好按共同擁有的美國專利4，703，008(Lin)所述的方法制備，該專利在此列為參考。重組促紅細(xì)胞生成素可以按共同擁有的Lai等人的美國專利4，667，016(在此列為參考)的實(shí)施例2所述的一般方法進(jìn)行純化，也可以按Lai等人的實(shí)施例2所述的方法，但用Q-Sepharose色譜法代替DEAE-Agarose色譜法來進(jìn)行純化。
按照Lai等人(同上)的實(shí)施例2純化的促紅細(xì)胞生成素，在用IEF法分析時(shí)主要含有6種異構(gòu)體。此外，用實(shí)施例4所述的色譜法曾檢測(cè)出至少一種酸性較強(qiáng)的額外異構(gòu)體。(這個(gè)酸性較強(qiáng)的異構(gòu)體在IEF凝膠上的遷移率＞14個(gè)唾液酸，可能含有非唾液酸負(fù)電荷，因?yàn)槟承╇姾赡苣褪芡僖核崦赶?。這些異構(gòu)體的唾液酸含量彼此不同。如實(shí)施例中所表明的，用制備性IEF分離出其中的10種異構(gòu)體，并測(cè)定其中5種的唾液酸含量，證實(shí)了上述結(jié)論。在測(cè)定過唾液酸含量的異構(gòu)體中，發(fā)現(xiàn)5種異構(gòu)體含有9、10、11、12或13個(gè)唾液酸殘基。
異構(gòu)體5-11(在這里每種異構(gòu)體以每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子的唾液酸數(shù)目命名)的促紅細(xì)胞生成素相對(duì)體內(nèi)比活與每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子的唾液酸殘基數(shù)目之間有某種關(guān)系。異構(gòu)體11-14具有大致相同的相對(duì)體內(nèi)比活。異構(gòu)體5-14的體內(nèi)活性用外缺氧(exhypoxic)紅細(xì)胞增多小鼠生物測(cè)定法測(cè)定，每個(gè)異構(gòu)體的含量則用Bradford蛋白測(cè)定法、280nm光吸收法或測(cè)定促紅細(xì)胞生成素的放射免疫測(cè)定法(RIA)來測(cè)定。以單位/ml表示的RIA測(cè)定結(jié)果(Egrie等，Immunobiology 172213，1986)除以212，770單位/mg促紅細(xì)胞生成素多肽(純化的促紅細(xì)胞生成素用RIA法測(cè)定的平均比活)，就得到分離的異構(gòu)體或異構(gòu)體混合物的蛋白濃度，是以mg促紅細(xì)胞生成素多肽/ml表示的。如實(shí)施例中所表明的，相對(duì)體內(nèi)比活從異構(gòu)體5到異構(gòu)體11逐步增加(見表2)。
這里所提到的體內(nèi)比活是相對(duì)體內(nèi)比活的測(cè)定結(jié)果，而不是絕對(duì)體內(nèi)比活的測(cè)定結(jié)果。就本申請(qǐng)的目的而言，比活只用于比較用相同測(cè)定法、采用相同條件測(cè)定的異構(gòu)體相對(duì)活性，所謂相同條件包括相同的內(nèi)標(biāo)、相同的動(dòng)物類型、計(jì)算比活時(shí)采用相同的數(shù)據(jù)分析方法、用相同的測(cè)定法測(cè)定蛋白含量。所報(bào)道的任何異構(gòu)體的任何體內(nèi)比活值都不代表該異構(gòu)體的固有值或絕對(duì)值。
本發(fā)明還提供含有兩種或更多種促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些組合物含有一種異構(gòu)體混合物，其中的各異構(gòu)體的每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子中含有大于預(yù)定數(shù)目的唾液酸，如每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子大于11個(gè)唾液酸或每分子大于12個(gè)唾液酸，例如異構(gòu)體12、13和14的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些組合物含有另一些異構(gòu)體混合物，其中的各異構(gòu)體的每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子中含有預(yù)定數(shù)目的唾液酸，例如每分子少于12個(gè)但多于8個(gè)唾液酸，例如異構(gòu)體9、10和11的混合物。本發(fā)明還提供各異構(gòu)體相對(duì)量相同或不同的促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體組合物。例如，異構(gòu)體9、10和11混合物中的各異構(gòu)體的量會(huì)是各種比例，例如1∶1∶1、2∶3∶1或20∶20∶1。
這些組合物最好含有少于4種異構(gòu)體的混合物，例如異構(gòu)體11、12和13的混合物、或12和14的混合物，或7和13的混合物。
為了制備促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的混合物，本發(fā)明還同時(shí)提供了分離選定的促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的方法。這些方法包括用諸如制備性等電聚焦等技術(shù)分離單個(gè)異構(gòu)體，或者用諸如離子交換色譜或色譜聚焦等技術(shù)制備每分子含有預(yù)定數(shù)目(如大于11個(gè))唾液酸的異構(gòu)體混合物。所有這些技術(shù)的原理都是根據(jù)電荷來分離蛋白質(zhì)。
一般來說，離子交換色譜和色譜聚焦涉及在能使某些或所有促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體與樹脂結(jié)合的條件下，將粗制人促紅細(xì)胞生成素(細(xì)胞條件培養(yǎng)基)或經(jīng)過純化的物質(zhì)加到樹脂柱上。對(duì)粗制促紅細(xì)胞生成素制備物來說，優(yōu)選在約pH7下將蛋白上柱;而對(duì)純化制備物來說，則可在pH7至約pH4下將蛋白上柱。用約pH4的緩沖液洗柱后，提高緩沖液的pH和鹽濃度，或采用pH遞減而約pH4下的離子強(qiáng)度遞增的梯度，洗脫出那些仍與離子交換柱結(jié)合的促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。對(duì)色譜聚焦來說，用pH遞減的梯度或通過用高濃度的鹽洗柱而從柱中洗脫出異構(gòu)體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用離子交換色譜法分離單個(gè)異構(gòu)體。例如，如實(shí)施例8所述用離子交換色譜法分離異構(gòu)體14。
本發(fā)明還包括某些人促紅細(xì)胞生成素類似物。這里所用的短語“人促紅細(xì)胞生成素類似物”是指人促紅細(xì)胞生成素氨基酸順序中有一個(gè)或更多個(gè)變化的促紅細(xì)胞生成素，這些變化導(dǎo)致唾液酸連接位點(diǎn)的數(shù)目增加。類似物是用定位誘變產(chǎn)生的，造成氨基酸殘基的添加、缺失或置換，從而增加或改變可供糖基化的位點(diǎn)。這些類似物可以具有比人促紅細(xì)胞生成素更多數(shù)目的碳水化合物鏈。
本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素類似物包含包括至少一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的氨基酸順序。唾液酸含量高于人促紅細(xì)胞生成素的類似物是通過添加糖基化位點(diǎn)而產(chǎn)生的，而這些糖基化位點(diǎn)不干擾生物活性所需的二級(jí)或三級(jí)構(gòu)象。人促紅細(xì)胞生成素類似物最好有1、2或3個(gè)額外N-糖基化或O-糖基化位點(diǎn)，從而添加1、2或3個(gè)額外N連接或O連接碳水化合物鏈。例如，用天冬酰胺置換69位的亮氨酸，得到順序Asn-Leu-Ser，該順序就成為第4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。這樣一種變化通?？蔀槊糠肿犹峁┳疃?個(gè)額外唾液酸。產(chǎn)生額外O-糖基化位點(diǎn)的變化的例子有125位的丙氨酸變?yōu)樘K氨酸;124位和125位的丙氨酸變?yōu)楦彼帷？梢詷?gòu)建出具有一個(gè)或更多個(gè)額外N連接和O連接鏈的類似物，例如表5中所述的類似物NO1和NO2。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明包括具有額外糖基化位點(diǎn)的許多其他人促紅細(xì)胞生成素類似物。
本發(fā)明還包括在某個(gè)糖基化位點(diǎn)碳水化合物連接量增加的類似物。這類類似物通常涉及與N連接或O連接位點(diǎn)很接近的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的置換。這些氨基酸變化的結(jié)果將使更大比例的促紅細(xì)胞生成素多肽具有碳水化合物修飾。糖基化位點(diǎn)可以是天然存在的，也可以通過突變產(chǎn)生。例如，類似物N13即使在88位引入一個(gè)糖基化位點(diǎn)也不產(chǎn)生額外的碳水化合物鏈。然而，分別在87位置換上絲氨酸和纈氨酸殘基的類似物N14和N18，則在88位有一個(gè)額外碳水化合物鏈。
本發(fā)明還提供從促紅細(xì)胞生成素的羧基末端延伸出一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的類似物，其中該羧基末端延伸提供至少一個(gè)額外碳水化合物位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使人絨毛膜促性腺激素(HCG)羧基末端的28個(gè)氨基酸與人促紅細(xì)胞生成素166位的天冬氨酸殘基融合而構(gòu)建出一種類似物。HCG羧基末端片段有4個(gè)O-糖基化位點(diǎn)(Kessler等，J.Biol.Chem.2547907，1979)。
表3、4和5列出了具有額外N連接和/或O連接碳水化合物鏈位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物。這些類似物在人促紅細(xì)胞生成素多肽鏈的不同位置上置換上了Asn-X-Ser/Thr順序，從而產(chǎn)生了N連接位點(diǎn)，或者引入了絲氨酸或蘇氨酸殘基，從而產(chǎn)生了O連接位點(diǎn)。
表6列出了加入了至少一個(gè)額外N連接碳水化合物鏈或一個(gè)額外O連接碳水化合物鏈，或者同時(shí)加入了額外N連接鏈和O連接鏈的那些類似物，這些額外鏈的加入得到了糖蛋白在SDS凝膠上遷移現(xiàn)象的證實(shí)(實(shí)施例7)。由表3-6可見，具有一個(gè)或更多個(gè)額外碳水化合物連接位點(diǎn)的類似物并不一定使促紅細(xì)胞生成素分子帶有額外碳水化合物鏈。例如，在123位和125位置換上蘇氨酸殘基導(dǎo)致加入一個(gè)O連接的碳水化合物鏈，而在其他位置置換上絲氨酸或蘇氨酸則不導(dǎo)致類似物帶有額外O連接鏈(見表4)。但是，在人促紅細(xì)胞生成素氨基酸順序的30、51、57、69、88、89、136和138位置換上天冬酰胺殘基，則導(dǎo)致在這些位點(diǎn)加入N連接鏈。HCG多肽片段與人促紅細(xì)胞生成素166位的天冬酰胺殘基的融合，產(chǎn)生一種至少有兩個(gè)額外O連接碳水化合物鏈的促紅細(xì)胞生成素-HCG融合分子。
本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素類似物還包括其氨基酸順序包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排的促紅細(xì)胞生成素。這里所用的糖基化位點(diǎn)重排是指人促紅細(xì)胞生成素中一個(gè)或更多個(gè)糖基化位點(diǎn)的缺失，以及一個(gè)或更多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)的加入。類似物R1、R2和R3是這種重排的例子，這些類似物是通過分別在24、38或83位缺失N連接位點(diǎn)和在88位加入一個(gè)N連接位點(diǎn)而構(gòu)建的。但是，還可能有許多其他類型的碳水化合物位點(diǎn)重排，所產(chǎn)生的類似物的糖基化位點(diǎn)數(shù)目也許比人促紅細(xì)胞生成素多，也許不比人促紅細(xì)胞生成素多。
分析了類似物R1、R2和R3的體內(nèi)生物活性，結(jié)果示于表7。在Asn88位引入一個(gè)N連接鏈，使得缺失了3個(gè)天然存在N連接位點(diǎn)中任一個(gè)的促紅細(xì)胞生成素恢復(fù)了生物活性。這些結(jié)果表明，可以改變碳水化合物鏈在促紅細(xì)胞生成素中的位置，從而產(chǎn)生有用的類似物而不顯著影響生物活性。
本發(fā)明還包括一些DNA順序，這些順序編碼具有額外N連接和/或O連接鏈位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物、具有至少一個(gè)碳水化合物鏈連接位點(diǎn)重排的類似物、以及從促紅細(xì)胞生成素的羧基末端延伸出一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的類似物。為了產(chǎn)生和改變碳水化合物連接位點(diǎn)而在人促紅細(xì)胞生成素DNA順序中引入變化所用的方法，公開于實(shí)施例6中。
這些促紅細(xì)胞生成素類似物可以是外源DNA順序的表達(dá)產(chǎn)生，即通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的，也可以是合成的產(chǎn)物。外源DNA順序包括編碼促紅細(xì)胞生成素類似物的cDNA、基因組DNA或化學(xué)合成DNA。還提供了用于表達(dá)所述類似物的重組DNA質(zhì)粒和真核宿主細(xì)胞。表達(dá)載體包括能夠在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)克隆DNA順序的任何載體，特別是用于在COS和CHO細(xì)胞中表達(dá)的那些載體。這些載體的例子包括本說明書的實(shí)施例6中所述的質(zhì)粒pEC和pDEC△。表達(dá)促紅細(xì)胞生成素類似物的COS和CHO宿主細(xì)胞的培養(yǎng)，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來進(jìn)行。
來源于促紅細(xì)胞生成素類似物的分離的異構(gòu)體和異構(gòu)體混合物，是用上述制備人促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的方法制得的。這些方法可以包括等電聚焦、離子交換色譜和色譜聚焦。優(yōu)選用離子交換色譜法來制備來源于促紅細(xì)胞生成素類似物的單個(gè)異構(gòu)體和異構(gòu)體混合物。
增加促紅細(xì)胞生成素上碳水化合物鏈的數(shù)目，并因此而增加每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子的唾液酸數(shù)目，可以產(chǎn)生一些優(yōu)越的性質(zhì)，例如溶解度提高、更能耐受蛋白水解作用、免疫原性下降、血清半壽期增長、生物活性提高。
分析了表達(dá)促紅細(xì)胞生成素類似物的CHO細(xì)胞條件培養(yǎng)基的體內(nèi)生物活性，結(jié)果示于表6。所測(cè)試的若干類似物的活性比人促紅細(xì)胞生成素高3倍或更多。具體地說，在30位或88位有一個(gè)額外N連接碳水化合物鏈的類似物顯示出比人促紅細(xì)胞生成素高2-3倍的活性;而由于人促紅細(xì)胞生成素與HCG多肽片段融合而帶有額外O連接鏈的類似物，其活性至少高二倍。
純化出兩個(gè)帶有額外碳水化合物鏈的促紅細(xì)胞生成素類似物，并分離出具有不同唾液酸含量的異構(gòu)體混合物(實(shí)施例8)。將Thr125和Ser87Asn88Thr90(EPO N14)類似物分離成三個(gè)獨(dú)立的異構(gòu)體部分，并測(cè)定了每個(gè)部分的體內(nèi)生物活性。表8所示的結(jié)果證實(shí)，唾液酸含量較高的EPO N14異構(gòu)體部分的體內(nèi)活性較高。
在受體結(jié)合試驗(yàn)、藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)、以及測(cè)定小鼠血細(xì)胞比容增加的實(shí)驗(yàn)中，研究了EPO N14類似物的高唾液酸異構(gòu)體并集液與重組人促紅細(xì)胞生成素(異構(gòu)體9-14)。這些試驗(yàn)的結(jié)果表明，唾液酸含量、清除半壽期與提高受處理小鼠血細(xì)胞比容的能力之間有直接的關(guān)系。例如，如圖13、14和15所示，EPO N14高唾液酸異構(gòu)體并集液與分離的異構(gòu)體14或重組人促紅細(xì)胞生成素相比，體內(nèi)半壽期明顯增長，也促使血細(xì)胞比容增加得更多，盡管N14高唾液酸異構(gòu)體并集液與受體的結(jié)合不那么強(qiáng)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及哺乳動(dòng)物(例如中國倉鼠卵巢，CHO)宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞優(yōu)先合成每分子含有高于特定數(shù)目的唾液酸(例如每分子大于10個(gè)唾液酸)的人促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體或促紅細(xì)胞生成素類似物異構(gòu)體。促紅細(xì)胞生成素分子具有能限制該分子唾液酸含量的N連接和O連接寡糖結(jié)構(gòu)。例如，四分支N連接寡糖最常見的是提供4個(gè)可能的唾液酸連接位點(diǎn)，而二分支和三分支寡糖能夠在天冬酰胺連接位點(diǎn)取代四分支形式，通常至多只連有2個(gè)或3個(gè)唾液酸。O連接寡糖通常提供2個(gè)唾液酸連接位點(diǎn)。于是，假如所有三個(gè)N連接寡糖都是四分支的，則促紅細(xì)胞生成素分子能容納總共14個(gè)唾液酸殘基。從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中篩選出那些在重組促紅細(xì)胞生成素上優(yōu)先加入四分支鏈的細(xì)胞，從而盡量增多唾液酸連接位點(diǎn)的數(shù)目。
尿促紅細(xì)胞生成素的N連接寡糖所含的唾液酸，既以α-2，3連鍵也以α-2，6連鍵與半乳糖相連(Takeuchi等，J.Biol.Chem.2633657，1988)。一般來說，α-2，3連鍵的唾液酸是加到甘露糖α-1，6分支上的半乳糖上，而α-2，6連鍵的唾液酸是加到甘露糖α-1，3分支上的半乳糖上。加入這些唾液酸的酶(β-半乳糖苷α-2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶和β-半乳糖苷α-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶)能最有效地分別將唾液酸加到甘露糖α-1，6分支和甘露糖α-1，3分支上。
二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷型中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞是常用于生產(chǎn)包括重組促紅細(xì)胞生成素在內(nèi)的重組糖蛋白的宿主細(xì)胞。這些細(xì)胞不表達(dá)β-半乳糖苷α-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，所以不會(huì)在這些細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白的N連接寡糖上加入α-2，6連鍵的唾液酸(Mutsaers等，Eur.J.Biochem.156651，1986;Takeuchi等，J.Chromatogr.400207，1987)。所以，CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的重組促紅細(xì)胞生成素缺少與半乳糖2，6連接的唾液酸(Sasaki等，1987，同上;Takeuchi等，1987，同上)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，人促紅細(xì)胞生成素或促紅細(xì)胞生成素類似物是在用功能性β-半乳糖苷α-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的，從而使唾液酸以α-2，6連鍵摻入到半乳糖中。所得的異構(gòu)體將含有以α-2，3和α-2，6連鍵與半乳糖連接的唾液酸。有關(guān)創(chuàng)建經(jīng)過修飾的CHO細(xì)胞或其他哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的技術(shù)公開，參見Lee等，J.Biol.Chem.26413848，1989，該文獻(xiàn)在此列為參考。
本發(fā)明還包括一些藥物組合物，這些組合物含有治療有效量的特定異構(gòu)體或異構(gòu)體混合物，以及可用于促紅細(xì)胞生成素治療的合適稀釋劑、助劑和/或載體。也包括含有治療有效量的促紅細(xì)胞生成素類似物及合適稀釋劑、助劑和/或載體的藥物組合物。這里所用的“治療有效量”是指對(duì)給定病癥和給藥方案而言能產(chǎn)生療效的量。人促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體或促紅細(xì)胞生成素類似物優(yōu)選以腸胃外途徑給藥。所選擇的具體途徑將取決于所治療的病癥。人促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體或促紅細(xì)胞生成素類似物優(yōu)選作為某種制劑的一部分給藥，該制劑還含有合適的載體(如人血清清蛋白)、合適的稀釋劑(如緩沖鹽溶液)和/或合適的助劑。所需的劑量應(yīng)是足以提高患者的血細(xì)胞比容的量，該劑量將隨著所治療癥狀的嚴(yán)重程度、采用的給藥方法等而變化。
提供下列實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但這些實(shí)施例不應(yīng)誤認(rèn)為是限制發(fā)明范圍。實(shí)施例中所采用的體內(nèi)生物測(cè)定中所用的促紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)物是重組促紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)物，該標(biāo)準(zhǔn)物已相對(duì)于部分純化的尿促紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)物標(biāo)準(zhǔn)化。因此，只測(cè)定相對(duì)體內(nèi)比活。另外，體內(nèi)比活以“單位/ml”、“單位/mg”和“單位/A280”表示，而不以“IU/ml”、“IU/mg”和“IU/A280”表示，因?yàn)樗玫拇偌t細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)物尚未與任何現(xiàn)有的國際標(biāo)準(zhǔn)直接相關(guān)。
實(shí)施例1重組促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的分離如Lin(同上)所述制備重組促紅細(xì)胞生成素。按照共同擁有的Lai等人專利(同上)的實(shí)施例2所述的方法，純化作為第一次和第三次異構(gòu)體分離的起始原料使用的重組促紅細(xì)胞生成素。按照Lai等人(同上)的方法，用經(jīng)過修改的Q-Sepharose色譜法純化第二次和第五次分離的起始原料。這些制備物含有與來源于尿的人促紅細(xì)胞生成素具有相同氨基酸順序的重組促紅細(xì)胞生成素的異構(gòu)體混合物，主要含有異構(gòu)體9-14。第四次異構(gòu)體制備的起始原料，是Lai等人的實(shí)施例2中用5mM乙酸/1mM甘氨酸/6M脲洗滌陰離子交換柱過程中洗脫出的物質(zhì)。該部分含有帶少于或等于9個(gè)唾液酸的異構(gòu)體，并用Lai等人的實(shí)施例2所述的凝膠過濾色譜法進(jìn)行了進(jìn)一步純化，然后才用于制備性等電聚焦步驟。第六次異構(gòu)體制備使用的起始原料是帶有4-13個(gè)唾液酸殘基的重組促紅細(xì)胞生成素的純化制備物。該物質(zhì)按照Lai等人的實(shí)施例2進(jìn)行純化，但對(duì)離子交換柱的操作作了修改(用pH8.4的氯化鈉梯度洗脫重組促紅細(xì)胞生成素，并省去乙酸/脲洗滌)，使起始原料中所含的多數(shù)異構(gòu)體得以保留。
基本上按照LKB Application Note198，通過在粒狀凝膠板(Ultrodex，LKB)中進(jìn)行制備性等電聚焦而進(jìn)行六次不同的單個(gè)異構(gòu)體制備。使用Pharmalyte(Pharmacia)2.5-5兩性電解質(zhì)(Pharmacia)，凝膠板含有5M脲。
在第一次制備中，將6.8ml 20mM檸檬酸鈉/100mM氯化鈉pH7.0中的約20mg重組促紅細(xì)胞生成素加到凝膠上，于8瓦下聚焦約16小時(shí)。等電聚焦后，用凝膠板的紙接觸印跡來顯現(xiàn)凝膠中的異構(gòu)體條帶。制得印跡后，在固定液(40%甲醇/10%乙酸/10%TCA/3.5%磺基水楊酸)中浸泡三次(每次約10分鐘，室溫)使之固定，用40%甲醇/10%乙酸(30-60℃)處理一次(約10分鐘)，于60℃下在0.125%考馬斯藍(lán)R-250/40%甲醇/10%乙酸中染色15分鐘，然在7.5%甲醇/10%乙酸中脫色，以顯現(xiàn)出分離的異構(gòu)體。取出粒狀凝膠上含有異構(gòu)體(～50%樹脂)的區(qū)域，加入水(～16ml)，將該漿液倒入5.5×24.5英寸盤中，蒸發(fā)至凈重～40g。該制備物進(jìn)行第二次聚焦，并如上所述制備凝膠板的接觸印跡。從凝膠板上取下含有6個(gè)可辨認(rèn)異構(gòu)體的凝膠部分。
為了從凝膠中洗脫出異構(gòu)體，在每個(gè)異構(gòu)體上加含有10mM Tris-HCl pH7.0/5mM Chaps的溶液，生成一種漿狀物，將漿狀物置于一些小柱中，用Tris-Chaps緩沖液洗滌。收集流出液，分別加到裝有Vydac C4反相樹脂并在20%乙醇/10mM Tris-HCl pH7.0中平衡過的小柱上(開放柱型)。用20%乙醇/10mM Tris-HCl pH7.0、35%乙醇/10mMTris-HClpH7.0和65%乙醇/10mM Tris-HCl pH7.0將柱分步展開。在65%乙醇/10mM Tris中洗脫出的部分用10mM Tris-HCl pH7.0以1∶1稀釋，濃縮后，用Centricon-10(Amicon)微型濃縮器與10mM Tris-HCl pH7.0進(jìn)行緩沖液交換。基本上如LKB Technical Note250所述，在含有5M脲的聚丙烯酰胺凝膠中用Servalyte 3-5兩性電解質(zhì)(Serva)對(duì)上述制備物進(jìn)行分析性等電聚焦。
在第二次制備中，將6.5ml去離子水中的約26mg重組促紅細(xì)胞生成素加到凝膠上，于2.5瓦下聚焦25分鐘，在10瓦下聚焦約17小時(shí)。取下凝膠板上可見的聚焦蛋白條帶，成為11個(gè)不同的并集物。用去離子水將每個(gè)并集物調(diào)至約7.5ml，從每個(gè)所得并集物上清液中取20ml，如上所述進(jìn)行分析性等電聚焦。在每個(gè)并集物中加入5ml1.5MTris-HClpH8.8，將漿液分別置于一些小柱中，并使液相流過。將樹脂用約三倍體積的0.5M Tris-HCl pH7洗滌，洗滌液與流出液合并。將流出液濃縮，用分子量截留值為10，000道爾頓的Amicon一次性超濾裝置與20mM檸檬酸鈉/100mM氯化鈉pH7.0進(jìn)行緩沖液交換。然后使?jié)饪s后的溶液(約0.5ml)通過截留孔徑為0.22μm的乙酸纖維素濾膜。根據(jù)分析性等電聚焦的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個(gè)并集物主要含有單一異構(gòu)體10、11、12、13和14。
在第三次制備中，將21.8ml蒸餾水中的約30mg重組促紅細(xì)胞生成素加到凝膠上，于2瓦下聚焦25分鐘，于10瓦下聚焦20小時(shí)，于15瓦下聚焦15分鐘。用肉眼觀察相應(yīng)于各異構(gòu)體的蛋白條帶，并從凝膠板上取下這些條帶。在經(jīng)過凝膠分離的異構(gòu)體中加入蒸餾水，生成一種漿狀物，所得上清液用分析性等電聚焦法進(jìn)行分析。在每個(gè)漿狀物中加入等體積的1M Tris-HCl pH7.2，將懸浮液分別加到一些小柱中，并使液相過柱以洗脫異構(gòu)體。將每份流出液濃縮，并用截留分子量為10，000道爾頓的Amicon一次性超濾裝置與20mM檸檬酸鈉/100mM氯化鈉pH7.0進(jìn)行緩沖液交換。分析性等電聚焦凝膠顯示，所得到的并集物中主要含有單一異構(gòu)體9、10、11、12、13和14。
第四次異構(gòu)體制備使用含有異構(gòu)體3-9的促紅細(xì)胞生成素(如上所述制備)作為其起始原料。在基本上如前面對(duì)制備1-3所述進(jìn)行制備性等電聚焦之前，在Rotofor(Bio-Rad，Richmond，CA)液相等電聚焦槽中使兩性電解質(zhì)(Pharmalyte2.5-5)預(yù)分級(jí)，所得到的兩性電解質(zhì)范圍更適合起始原料的較低等電點(diǎn)。進(jìn)行預(yù)分級(jí)的方法是使6.7ml Pharmalyte2.5-5與15g脲混合，加入純化水使體積達(dá)到50ml。在Rotofor中使該混合物于10瓦和1℃下分級(jí)5.5小時(shí)，分別用0.1M磷酸和0.1M氫氧化鈉作陽極電解液和陰極電解液。在平板等電聚焦中使用測(cè)定pH在4.5和約6之間的兩性電解質(zhì)部分。
用Centrieluter(Amicon，Danvers，MA)和截留分子量為10，000的Centricon(Amicon)從異構(gòu)體中除去兩性電解質(zhì)，操作時(shí)采用下列參數(shù)0.18M Tris緩沖液pH8.8、100伏、25-30mA，3小時(shí)。然后用Sephadex G-25(Pharmacia)以凝膠過濾法使異構(gòu)體與0.1M氯化鈉進(jìn)行緩沖液交換。所得的5個(gè)并集物的分析性等電聚焦結(jié)果表明它們含有異構(gòu)體4、5、6、7和8。異構(gòu)體4聚焦出好幾個(gè)條帶，表明它可能經(jīng)歷過某種程度的降解。
第五次異構(gòu)體制備作了修改，在平板等電聚焦步驟中增加了預(yù)聚焦步驟。在這一修改中，蛋白不是在電泳前加到兩性電解質(zhì)/脲/凝膠混合物中，而是在凝膠中產(chǎn)生pH梯度后加到等電聚焦裝置中的。預(yù)聚焦75分鐘(1500伏-小時(shí))后，從陰極端取下2.25-4.25cm的凝膠段，與促紅細(xì)胞生成素溶液混合，再加回到凝膠板中。等電聚焦后，從凝膠板中洗脫出異構(gòu)體10、11、12、13和14，并用Centricon-10(Amicon)裝置用超濾法使其與兩性電解質(zhì)分離。
進(jìn)行預(yù)聚焦這一修改是為了使異構(gòu)體制備物的紫外吸收特性與起始的重組促紅細(xì)胞生成素更為相似。在分離的異構(gòu)體280nm和260nm光吸收的比例上可以看出這一光譜特性的改進(jìn)。制備物2和3(未經(jīng)預(yù)聚焦)的異構(gòu)體280nm光吸收與260nm光吸收的平均比例(A280/A260)為1.36±0.11，而制備物5和6(經(jīng)過預(yù)聚焦)的平均A280/A260比例為1.68±0.20。如果從計(jì)算中排除異構(gòu)體14，則制備物2和3與5和6的平均A280/A260比例分別為1.39±0.11和1.74±0.09。(異構(gòu)體14的光譜可能最不典型，因?yàn)樗暮孔钌?，因此更易受兩性電解質(zhì)組分微量污染的干擾，或者因?yàn)樗谄桨宓入娋劢惯^程中與電極最接近)。按照Lai等人的實(shí)施例2(如上所述作了修改，用Q-Sepharose作為陰離子交換樹脂)制備的重組促紅細(xì)胞生成素的平均A280/A260比例為1.91±0.04。
如上所述，第六次異構(gòu)體制備的起始原料是含有異構(gòu)體4-13的重組促紅細(xì)胞生成素制備物。按第四次制備的方法在Rotofor裝置中使兩性電解質(zhì)預(yù)聚焦。用測(cè)定pH在3.7和4.8之間的兩性電解質(zhì)部分進(jìn)行平板等電聚焦。按第五次制備的方法對(duì)平板進(jìn)行預(yù)聚焦，超濾(Centricon-10)除去載體兩性電解質(zhì)后得到異構(gòu)體9、10、11、12和13。
實(shí)施例2重組促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的唾液酸含量取如實(shí)施例1所述分離的異構(gòu)體和按Lai等人(同上)所述的方法純化的促紅細(xì)胞生成素(異構(gòu)體9-14的混合物)，與0.10-0.15M氯化鈉進(jìn)行緩沖液交換，并用經(jīng)過修改的Jourdian等人(J.Biol.Chem.246430，1971)的方法分析唾液酸含量。用0.35M硫酸在80℃下水解30分鐘，從糖蛋白上切上唾液酸殘基，溶液用氫氧化鈉中和，然后再進(jìn)行分析。為了估測(cè)促紅細(xì)胞生成素蛋白的含量，用具有人促紅細(xì)胞生成素氨基酸順序的重組促紅細(xì)胞生成素作為標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行Bradford蛋白測(cè)定(Bradford，Anal.Biochem.72248，1976)，并使用Bio-Rad提供的分析試劑和微量法操作步驟。結(jié)果示于表1，以每摩爾促紅細(xì)胞生成素的唾液酸摩爾數(shù)表示。異構(gòu)體按每個(gè)分子上的唾液酸數(shù)目命名，并從酸性最弱(異構(gòu)體9)到酸性最強(qiáng)(異構(gòu)體13)排布。異構(gòu)體9-13示于圖1的凝膠泳道6-10中。異構(gòu)體14的量不足以準(zhǔn)確測(cè)定唾液酸含量。該異構(gòu)體的唾液酸含量由其在IEF凝膠上相對(duì)于其他異構(gòu)體的遷移率來推測(cè)。異構(gòu)體5-8(制備4)的唾液酸含量尚未測(cè)定，但也同樣由其在IEF凝膠上的遷移率來推測(cè)。
表1促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體每摩爾促紅細(xì)胞生成素的唾液酸摩爾數(shù)異構(gòu)體1312.9±0.5異構(gòu)體1211.8±0.2異構(gòu)體1111.0±0.2異構(gòu)體109.8±0.3異構(gòu)體98.9±0.6異構(gòu)體混合物(9-14)11.3±0.2
實(shí)施例3重組促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的活性利用280nm光吸收法、Bradford蛋白測(cè)定法和測(cè)定促紅細(xì)胞生成素的RIA法，測(cè)定如實(shí)施例1所述分離的異構(gòu)體中重組促紅細(xì)胞生成素的含量。利用外缺氧紅細(xì)胞增多小鼠生物測(cè)定法(Cotes等，Nature 1911065，1961)，測(cè)定相對(duì)體內(nèi)生物活性。利用測(cè)定促紅細(xì)胞生成素的放射免疫測(cè)定法對(duì)促紅細(xì)胞生成素蛋白含量進(jìn)行定量，所得結(jié)果是某些異構(gòu)體的相對(duì)體內(nèi)比活較高，這是由于含有大量唾液酸的異構(gòu)體的免疫反應(yīng)性明顯下降，導(dǎo)致對(duì)促紅細(xì)胞生成素濃度估測(cè)偏低，因而對(duì)負(fù)電性最強(qiáng)的異構(gòu)體的相對(duì)體內(nèi)比活估測(cè)偏高。小鼠生物測(cè)定的測(cè)定結(jié)果(以單位/ml表示)除以相應(yīng)的蛋白濃度，就得到體內(nèi)比活，是以單位/mg促紅細(xì)胞生成素多肽表示的。這些比活示于表2。
在表2中，“n”是對(duì)比活值有貢獻(xiàn)的獨(dú)立異構(gòu)體制備物的數(shù)目。在大多數(shù)情況下，對(duì)每個(gè)異構(gòu)體制備物進(jìn)行多次體內(nèi)測(cè)定。相同的體內(nèi)數(shù)據(jù)對(duì)所有三欄的比活計(jì)算結(jié)果都有貢獻(xiàn)。由280nm光吸收、放射免疫測(cè)定效力或Bradford蛋白測(cè)定結(jié)果確定每毫克促紅細(xì)胞生成素多肽的活性單位數(shù)。在Bradford蛋白測(cè)定中，使用含有異構(gòu)體9-14的純化重組促紅細(xì)胞生成素作標(biāo)準(zhǔn)物。對(duì)于用Bradford蛋白測(cè)定法進(jìn)行的計(jì)算來說，“n”可能更小一些，因?yàn)槟承┲苽湮镌谶M(jìn)行Bradford測(cè)定時(shí)已不復(fù)存在。
在RIA測(cè)定和體內(nèi)測(cè)定中，用作標(biāo)準(zhǔn)物的是按照Lai等人(同上)所述的方法純化的、含有異構(gòu)體9-14混合物的促紅細(xì)胞生成素。
以單位/mg促紅細(xì)胞生成素多肽表示的相對(duì)比活，可以換算成單位/A280，換算方法是乘以0.807mg促紅細(xì)胞生成素多肽/A280。這一換算系數(shù)是把促紅細(xì)胞生成素的消光系數(shù)(1.345mg/A280)乘以促紅細(xì)胞生成素糖蛋白的蛋白含量(約為60%(重量)，Davis等，Biochemistry 262633，1987)而推算的，得出mg促紅細(xì)胞生成素多肽/A280(即，1.345mg促紅細(xì)胞生成素/A280×0.60mg多肽/mg促紅細(xì)胞生成素＝0.807mg多肽/A280)。此外，以單位/mg促紅細(xì)胞生成素多肽表示的比活，乘以系數(shù)0.60mg多肽/mg促紅細(xì)胞生成素糖蛋白，就可以得到以單位/mg促紅細(xì)胞生成素糖蛋白表示的比活。

表2的數(shù)據(jù)也圖示在圖2A、2B和2C中。這些數(shù)據(jù)表明，直到異構(gòu)體11，促紅細(xì)胞生成素的相對(duì)體內(nèi)活性都作為唾液酸含量的函數(shù)而增加。異構(gòu)體11-14具有基本相同的相對(duì)體內(nèi)生物活性。(這一點(diǎn)在異構(gòu)體14的濃度用Bradford測(cè)定值表示時(shí)最為明顯。Bradford值對(duì)異構(gòu)體14來說可能更為準(zhǔn)確，因?yàn)槠涞昧恳话爿^低，因此難以用A280法測(cè)定，而且如前面所討論的，負(fù)電性很強(qiáng)的異構(gòu)體在RIA中反應(yīng)性的下降最明顯)。含有較多唾液酸的促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的相對(duì)體內(nèi)比活較高，這很可能是由于這些異構(gòu)體的循環(huán)半壽期較長。用放射性碘(125I)標(biāo)記異構(gòu)體9和13，并測(cè)定其在大鼠體內(nèi)的清除速度。異構(gòu)體13的循環(huán)半壽期顯著長于異構(gòu)體9。
實(shí)施例4用Q-Sepharose色譜法選擇重組促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體混合物取按照Lin(同上)所述的方法生產(chǎn)重組促紅細(xì)胞生成素得到的細(xì)胞條件培養(yǎng)基，濃縮后用10mM Tris pH7.2透濾。用Bradford微量蛋白測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度，用牛血清清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)物。使19.6ml含40mg總蛋白的溶液含20μM CuSO4，用截留孔徑為0.45μm的濾膜過濾，再加到裝填有Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)、床體積為4ml(高1.05cm×直徑2.2cm)的柱上，該柱已用10mM Tris pH6.8-7.0在4℃下平衡過。上樣后，用兩個(gè)柱體積的相同緩沖液洗柱。柱的流速約為1ml/分。利用該方法設(shè)立6個(gè)獨(dú)立的柱，以選擇確定的促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體混合物。
用6-9個(gè)柱體積的低pH緩沖液洗柱，緩沖液的組成為1號(hào)柱150mM乙酸、1mM甘氨酸、20μM CuSO4、6M脲，用NaOH調(diào)至pH4.7;2號(hào)柱200mM乙酸、1mM甘氨酸、20μM CuSO4、6M脲，用NaOH調(diào)至pH4.7;3號(hào)柱250mM乙酸、1mM甘氨酸、20μM CuSO4、6M脲，用NaOH調(diào)至pH4.7;4號(hào)柱300mM乙酸、1mM甘氨酸、20μM CuSO4、6M脲，用NaOH調(diào)至pH4.7;5號(hào)柱150mM乙酸、1mM甘氨酸、20μM CuSO4、6M脲，6號(hào)柱300mM乙酸、1mM甘氨酸、20μM CuSO4、6M脲。用8-11個(gè)柱體積的10mM Tris-HCl、55mM NaCl、20μM CuSO4pH7洗滌每個(gè)柱，使柱的pH提高到約pH7。通過用10mM Tris-HCl、140mM NaCl、20μM CuSO4pH7.0洗柱，從柱中洗脫出確定的促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體混合物。
將每個(gè)柱中洗脫出的異構(gòu)體并集液濃縮，并且Centricon-10微型濃縮器與水進(jìn)行溶劑交換。這些濃縮并集液的分析性等電聚焦的結(jié)果示于圖3。凝膠泳道1-6分別代表從1-6號(hào)柱中洗脫出的確定促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體混合物。圖3最右邊的凝膠泳道中顯示的“異構(gòu)體混合物”代表如上所述加到Q-Sepharose柱上的細(xì)胞培養(yǎng)基，用5mM乙酸、1mM甘氨酸、20μM CuSO4、6M脲洗柱，利用上述方法從柱中洗脫促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體混合物。這個(gè)洗脫出的異構(gòu)體混合物按Lai等人(同上)所述的方法進(jìn)一步純化，然后進(jìn)行分析性等電聚焦。
實(shí)施例5利用低pH梯度在Q-Sepharose上對(duì)重組促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體進(jìn)行分級(jí)分離在另一種方法中，利用pH遞減但離子強(qiáng)度遞增的梯度來分離促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。將經(jīng)過濃縮透濾的含促紅細(xì)胞生成素的培養(yǎng)基，以約40mg總蛋白/ml凝膠的比例加到Q-Sepharose柱上。然后用約2個(gè)柱體積的10mM Tris-HCl pH7.0洗柱，再用約10個(gè)柱體積的2mM乙酸/1mM甘氨酸/20μM CuSO4/6M脲(pH約4.8)洗柱，除去污染蛋白和含少于約7個(gè)唾液酸殘基的促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。用從約2mM乙酸/6M脲/1mM甘氨酸/20μM CuSO4起始上升到40mM乙酸/6M脲/1mM甘氨酸/20μM CuSO4(pH約4)的梯度，從柱中洗脫出含約8至約12個(gè)唾液酸的異構(gòu)體。梯度的總體積約為40個(gè)柱體積。將每部分約為1個(gè)柱體積的各部分收集在裝有Tris緩沖液的容器中，緩沖液的體積足以使pH落在6-8.5范圍內(nèi)，從而避免了所收集的各部分長時(shí)間暴露于低pH下。從各部分中取等份試樣進(jìn)行分析性等電聚焦以監(jiān)測(cè)分離過程。圖4顯示了可用該方法實(shí)現(xiàn)的異構(gòu)體8-11的分離過程。用由10mM Tris-HCl、140mM NaCl、20mM CuSO4(pH7.0)組成的緩沖液洗滌，洗脫出在梯度結(jié)束時(shí)仍與柱結(jié)合的異構(gòu)體12-14。如Lai等人的實(shí)施例2所述，用反相色譜法及后續(xù)的凝膠過濾色譜法使異構(gòu)體(在梯度中間分離的或被氯化鈉溶液洗脫出的)脫除污染蛋白。
實(shí)施例6人促紅細(xì)胞生成素類似物的構(gòu)建人促紅細(xì)胞生成素氨基酸順序內(nèi)現(xiàn)有碳水化合物連接位點(diǎn)的位置示于圖5。使促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生額外糖基化位點(diǎn)的方法概述于圖6A-C，并敘述如下。
合成下列用于體外誘變的寡核苷酸引物[Asn4，Ser6]EPO5′CGCCCACCAAACCTCAGCTGTGACAGCCGA 3′[Asn9，Ser11]EPO5′ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3′[Asn69]EPO 5′ GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3′[Asn124]EPO 5′TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC 3′EPO 5′CAGATGCGAACTCATCTGCTCCAC 3′[Asn163，Ser165]EPO 5′AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTG 3′[Thr125]EPO 5′TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3′[Pro124，Thr125]EPO 5′CCTCCAGATCCGACCTCAGCTGC 3′劃下線的密碼子表示以括號(hào)中示出的氨基酸置換了野生型氨基酸的錯(cuò)配區(qū)。
構(gòu)建[Asn4，Ser6]EPO以在Asn4位加入一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。構(gòu)建[Asn9，Ser11]EPO以在Asn9位加入一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。構(gòu)建[Asn69]EPO以在Asn69位加入一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。構(gòu)建[Asn125，Ser127]EPO以在Asn125位加入一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。構(gòu)建[Thr125]EPO和[Pro124，Thr125]EPO以在Thr125位加入一個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。
含成下列用于體外誘變的寡核苷酸引物[Asn69，Thr71]EPO5′GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3′[Ser68，Asn69，Thr71]EPO5′CAGGGCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3′[Asn125，Thr127]EPO5′CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC 3′[Asn125，Thr127，Thr131]EPO5′ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3′[Pro124，Asn125，Ser127]EPO5′CCAGATCCAAATTCATCTGCTCCACTC 3′[Pro124，Asn125，Thr127]EPO5′CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3′[Thr125，Thr126]EPO 5′CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3′EPO從[Pro124，Thr125] EPO cDNA起始，用寡核苷酸引物5′AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3′產(chǎn)生[Pro124，Thr125，Thr126]EPO。用寡核苷酸引物5′TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3′產(chǎn)生[Pro124，Thr125，Thr126，Thr131]EPO。
構(gòu)建[Asn69，Thr71]EPO和[Ser68，Asn69，Thr71]EPO，以在Asn69位加入一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，并增強(qiáng)該位點(diǎn)的N-糖基化。構(gòu)建[Asn125，Thr127]EPO、[Asn125，Thr127，Thr131]EPO、[Pro124，Asn125，Ser127]EPO和[Pro124，Asn125，Thr127]EPO，以在Asn125位加入一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，并增強(qiáng)該位點(diǎn)的糖基化。構(gòu)建[Thr125，Thr126]EPO和[Pro124，Thr125，Thr126，Ser131]EPO，以在Thr125位加入一個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，并增強(qiáng)該位點(diǎn)的糖基化。
用于體外誘變的促紅細(xì)胞生成素DNA的來源是質(zhì)粒Hu13，這是pUC8中的一個(gè)人促紅細(xì)胞生成素cDNA克隆(Law等，Proc.Natl.Acad.Sci.836920，1986)。得自Hu13的質(zhì)粒DNA用Bst E Ⅱ和Bgl Ⅱ限制酶消化，所得的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用制造廠家(BIO 101公司)提供的Gene CleanTM試劑盒和方法，從凝膠中分離出810bp促紅細(xì)胞生成素DNA片段。如共同擁有的Lin的專利(同上)中所述，質(zhì)粒pBRgHuEPO含有促紅細(xì)胞生成素基因組基因，該基因作為BamHI片段插入在一種pBR322衍生物中。pBRgHuEPO也用BstE Ⅱ和BglⅡ消化，回收到6517bp載體片段。連接這兩個(gè)片段得到IGT1。為構(gòu)建pEC-1，用BamHI消化pDSVL(描述于共同擁有的Lin的專利(同上)中，并示于圖5B)，并在其中連入從含有促紅細(xì)胞生成素cDNA的IGT1中分離出的2.8kb BamHI片段。
為了產(chǎn)生供體外誘變的單鏈DNA，用BamHI和Bgl Ⅱ消化pEC-1，并分離出820bp促紅細(xì)胞生成素cDNA片段。將其連入m13mp18的BamHI位點(diǎn)中，得到m13-EC-1。如文獻(xiàn)所述(Kunkel等，Methods in Enzymol.154367，1987;Messing，Methods in Enzymol.10120，1983)，從用m13-EC-1感染的大腸桿菌RZ1032株的上清液中回收單鏈DNA。為進(jìn)行體外誘變，將約1μg單鏈DNA和0.2皮摩爾的一種上述合成引物與6μl緩沖液(250mM Tris pH7.8、50mM MgCl2、50mM二硫蘇糖醇)混合。為使引物與模板退火，用水將反應(yīng)體積調(diào)至10μl，將混合物在65℃下加熱5分鐘，然后冷卻至室溫。為進(jìn)行伸長反應(yīng)，加入各2.5μl的dTTP、dATP、dGTP、dCTP和ATP(均為10μM)，然后加入1μl(1單位)大腸桿菌DNA聚合酶(Klenow片段)和1μl(1單位)T4 DNA連接酶。然后混合物于14℃下保溫過夜，并如Messing(同上)所述用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Yanish-Perron等，Gene 33103，1985)。
為了用差示雜交法鑒定突變克隆，將營養(yǎng)瓊脂上的噬斑轉(zhuǎn)移到Gene Screen濾膜(New England Nuclear)上。將濾膜放在加熱燈下干燥，然后在含有1%SDS的6×SSC中于60℃下保溫1小時(shí)。為進(jìn)行雜交，將上述寡核苷酸引物(8皮摩爾)用T4多核苷酸激酶和γ-32P標(biāo)記的ATP進(jìn)行末端標(biāo)記，并與濾膜一起在6×SSC、0.5%SDS和100mg/ml鮭精DNA中保溫過夜，不同突變的保溫溫度如下[Asn124]突變37℃、[Asn4，Ser6]突變55℃、[Thr125]和[Pro124，Thr125]突變65℃、[Asn9，Ser11]和[Asn163，Ser165]突變70℃。第二天，在室溫下用6×SSC洗濾膜三次，然后進(jìn)行放射自顯影。如有必要，再用6×SSC在遞增的溫度下洗濾膜，直到檢測(cè)不到或幾乎檢測(cè)不到與具有野生型促紅細(xì)胞生成素cDNA順序的噬斑的雜交為止。鑒定出在這些條件下給出陽性雜交信號(hào)的克隆，并將其再轉(zhuǎn)染到JM109中，以分離純克隆。雙脫氧鏈終止順序分析結(jié)果表明，存在轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０?、絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸殘基的突變。
用沸騰法(Holmes等，Anal.Biochem.117193，1981)，從JM109轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中回收帶有[Asn4，Ser6]、[Asn9，Ser11]、[Asn69]、[Asn124]、[Asn125]、[Ser127]、[Asn163，Ser165]、[Thr125]和[Pro124，Thr125]突變的雙鏈m13 EC-1 DNA。用BstE Ⅱ和Xho Ⅱ消化這些DNA，并分離出810bp促紅細(xì)胞生成素DNA片段。將pEC-1用BstE Ⅱ消化，然后用Bgl Ⅱ部分消化，所得片段的5′端用細(xì)菌堿性磷酸酶在10mM Tris pH8中于60℃下脫磷酸化60分鐘。分離出缺少810bp BstE Ⅱ-Bgl Ⅱ片段的7kb載體片段，并使其與上述促紅細(xì)胞生成素片段連接。所得的質(zhì)粒(命名為pEC-X，其中X是類似物編號(hào))含有編碼促紅細(xì)胞生成素類似物的DNA，而該類似物在指定位置上帶有突變氨基酸殘基。
另外一種方法是，用體外誘變法構(gòu)建缺失氨基酸殘基41-55的促紅細(xì)胞生成素類似物(pEC34)。這樣得到一個(gè)較小的(775bp)含BstE Ⅱ-Bgl Ⅱ片段的EPO。如上所述將該片段插入pEC1中。為克隆促紅細(xì)胞生成素類似物，如上所述用BstE Ⅱ消化pEC34，用Bgl Ⅱ部分消化，脫磷酸化后分離載體。然后如上所述使7kb載體片段與促紅細(xì)胞生成素片段連接。用pEC34進(jìn)行克隆便于區(qū)分重組體和簡(jiǎn)單的再閉環(huán)物。再閉環(huán)物產(chǎn)生小于類似物的BstE Ⅱ-Bgl Ⅱ片段，這些再閉環(huán)物在瓊脂糖凝膠上很容易區(qū)分出來。
用這些一般方法構(gòu)建表3、4和5中所示的促紅細(xì)胞生成素類似物。給出了每個(gè)類似物的DNA順序變化，否則就是用于誘變的寡核苷酸引物的順序與人促紅細(xì)胞生成素的順序互補(bǔ)。
表3具有N連接碳水化合物鏈位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物類似物編號(hào)氨基酸置換順序變化N1 Asn4Ser6CGC→AACATC→AGCN2 Asn9Ser11AGC→AACGTC→AGCN3 Asn19Thr21GCC→AACGAG→ACGN4 Asn30Thr32GCT→AATCAC→ACGN5 Asn42CCA→AATN6 Ser42Asn43Thr45CCA→TCAGAC→AACAAA→ACAN7 Ser49TAT→TCTN8 Asn51Thr53TGG→AATAGG→ACGN9 Asn57Thr59GGG→AACCAG→ACGN10 Asn69CTG→AACN11 Asn69Thr71CTG→AACTCG→ACAN12 Ser68Asn69Thr71N11 加GCC→TCCN13 Asn88Thr90TGG→AATCCC→ACCN14 Ser87Asn88Thr90N13 加CCG→TCGN15 Ser87Asn88Thr90Thr92N14 加CAG→ACG
表3(續(xù))具有N連接碳水化合物鏈位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物類似物編號(hào)氨基酸置換順序變化N16 Ser87Asn88Thr90Ala162N14 加AGG→GCGN17 Asn88Ser90TGG→AATCCC→TCCN18 Val87Asn88Thr90CCG→GTGTGG→AATCCC→ACCN19 Ser87Asn88Gly89Thr90CCG→TCGTGG→AATGAG→GGGCCC→ACCN20 Asn89Ile90Thr91GAG→AACCCC→ATCCTG→ACGN21 Ser87Asn89Ile90Thr91N20 加CCG→TCGN22 Asn113Thr115GGA→AACCAG→ACGN23 Asn118Val121GCC→AACCCT→GTTN24 Asn121Ser122Thr123CCT→AATCCA→TCAGAT→ACTN25 Asn124GCG→AATN26 Ser122Asn124CCA→TCAGCG→AACN27 Asn125Ser127GCC→AACGCT→TCTN28 Asn125Thr127GCC→AACGCT→ACG
表3(續(xù))具有N連接碳水化合物鏈位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物類似物編號(hào)氨基酸置換順序變化N29 Leu121Ser122Asn125Thr127N28 加CCT→CTTCCA→TCAN30 Thr120Gly122Leu123Asn125Thr127N28 加TCC→ACCCGC→GGGGAT→CTCN31 Asn126Ser128TCA→AATGCT→TCTN32 Asn126Thr128Val129TCA→AATGCT→ACTCCA→GTAN33 Leu121Ser122Asn126Thr128Val129N32 加CCT→CTTCCA→TCAN34 Thr121Gly123Ser125Asn126Thr128Val129N32 加CCT→ACGGAT→GGGGCC→TCCN35 Ser129Asn130CCA→AGCCTC→AACN36 Asn132ACA→AACN37 Asn134Thr136ACT→AATGAC→ACCN38 Asn135GCT→AATN39 Asn136Thr138GAC→AACTTC→ACCN40 Asn137Thr139ACT→AATCGC→ACCN41 Asn138Thr140TTC→AACAAA→ACA
表3(續(xù))具有N連接碳水化合物鏈位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物類似物編號(hào)氨基酸置換順序變化N42 Asn144GTC→AACN43 Ser143Thr149Val150TTC→TCCCTC→ACCCGG→GTGN44 Gly148Thr149TTC→GGCCTC→ACCN45 Asn155CTG→AATN46 Asn163Ser165ACA→AATN47 Asn30Thr32Val87Asn88Thr90N4 和 N18N48 Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90N11 和 N14
表4具有O連接碳水化合物鏈位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物類似物編號(hào)氨基酸置換順序變化O1 Ser6ATC→AGCO2 Ser7TGT→TCCO3 Ser8GAC→AGCO4 Ser11GTC→TCTO5 Ser18GAG→TCGO6 Ser23GAG→TCGO7 Ser29TGT→AGCO8 Ser29TGT→TCTO9 Ser30GCT→TCTO10 Ser33TGC→TCAO11 Ser37GAG→TCGO12 Ser49TAT→TCTO13 Ser61GTA→TCAO14 Ser63GTC→TCCO15 Ser67CTG→TCGO16 Ser68GCC→TCCO17 Ser70CTG→TCGO18 Ser73GCT→TCTO19 Ser74GTC→TCTO20 Ser75CTG→TCGO21 Ser79GCC→TCCO22 Ser81TTG→TCGO23 Ser86CAG→TCGO24 Ser87CCG→TCGO25 Ser93CTG→TCGO26 Ser98GCC→TCCO27 Ser99GTC→TCCO28 Ser102CTT→TCTO29 Ser103CGC→AGT
表4(續(xù))具有O連接碳水化合物鏈位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物類似物編號(hào)氨基酸置換順序變化O30 Ser105CTC→AGCO31 Ser109CTT→TCTO32 Ser111GCT→TCTO33 Ser112CTG→TCGO34 Ser114GCC→TCCO35 Ser128GCT→TCTO36 Ser159TCG→GAGO37 Ser161TGC→TCCO38 Pro125Ser127GCC→CCCGCT→TCTO39 Thr62GAA→ACAO40 Thr64TGG→ACGO41 Thr65CAG→ACGO42 Thr88TGG→ACGO43 Thr90CCC→ACCO44 Thr92CAG→ACGO45 Thr100AGT→ACTO46 Thr110CGG→ACGO47 Thr115CAG→ACGO48 Thr123GAT→ACTO49 Thr124GCG→ACGO50 Thr125GCC→ACCO51 Thr125Ser127GCC→ACCGCT→TCTO52 Thr125Thr126GCC→ACATCA→ACAO53 Thr126TCA→ACCO54 Thr127GCT→ACTO55 Thr130CTC→ACC
表4(續(xù))具有O連接碳水化合物鏈位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物類似物編號(hào)氨基酸置換順序變化O56 Thr131CGA→ACAO57 Thr136GAC→ACCO58 Thr140AAA→ACAO59 Pro124Thr125GCG→CCGGCC→ACCO60 Pro124Thr125Thr126O59 加TCA→ACCO61 Pro124Thr125Thr126Thr131O60 加CGA→ACAO62HCG C末端延伸表5具有N連接和O連接碳水化合物鏈位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物類似物編號(hào)氨基酸置換順序變化Ser87Asn88Thr90N14和O62NO1HCG C末端延伸Asn30Thr32Val87Asn88Thr90N47和O62NO2HCG C末端延伸把促紅細(xì)胞生成素cDNA插入到pDEC△中，構(gòu)建出命名為pDEC-X(其中X是類似物編號(hào))的質(zhì)粒。pDEC△是質(zhì)粒pDSα2的衍生物，而表達(dá)載體pDSα2一般性描述于PCT申請(qǐng)WO90/14363中。pDEC△是由pDSα2用下列步驟得到的(1)用HindⅢ消化pDSα2DNA，用大腸桿菌DNA聚合酶(Klenow片段)和dNTP處理HindⅢ粘性末端，重新連接平末端載體，從而使pDSα2的HindⅢ位點(diǎn)缺失。所得質(zhì)粒為pDSα2△H。
(2)用Sal Ⅰ消化pDSα2△H，并在其中連入一個(gè)帶有SV40拼接信號(hào)并在該拼接信號(hào)的3′端連有Sal Ⅰ接頭的合成寡核苷酸。該合成寡核苷酸具有下列順序5′TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC 3′所得質(zhì)粒為pDSα2△H拼接物。
(3)用Sal Ⅰ消化pDSα2△H拼接物，并用T4DNA聚合酶和dNTP處理粘性末端使其成為平末端。用同樣的方法使820bp BamHI-Bgl Ⅱ人促紅細(xì)胞生成素cDNA片段成為平末端，并使其與質(zhì)粒連接。所得質(zhì)粒為pDEC-1。
(4)用Kpn Ⅰ和Pvu Ⅱ消化pDEC，并用綠豆核酸酶處理粘性末端而使其成為平末端。重新連接該質(zhì)粒從而缺失切下的Kpn Ⅰ-PvuⅡ片段，得到質(zhì)粒pDEC△。
用BstEⅡ完全消化pDEC△，然后用Bgl Ⅱ進(jìn)行部分消化，制得pDEC-X質(zhì)粒。分離出缺少促紅細(xì)胞生成素編碼順序的載體片段，并使其與含有所需質(zhì)粒的810bpBstE Ⅱ-Bgl Ⅱ片段連接。
某些具有多個(gè)氨基酸變化的類似物的構(gòu)建過程詳述如下。
pDEC(N47)和pDEC(N48)的構(gòu)建由pDEC(N18)和pDEC(N4)構(gòu)建含有asn30 thr32 val87asn88和thr90突變的pDEC(N47)。用Hind Ⅱ和Bgl Ⅱ消化pDEC(N18)，并分離出一個(gè)445bp片段。用BstEⅡ和HindⅢ消化pDEC(N4)，并分離出一個(gè)377bp片段。將這兩個(gè)片段如上所述連入用BstE Ⅱ和Bgl Ⅱ切割過的pDEC△中，得到pDEC(N47)。
由pDEC(N14)和pDEC(N11)構(gòu)建含有asn69 thr71 ser87 asn88和thr90突變的pDEC(N48)。用Hind Ⅱ和Bgl Ⅱ消化pDEC(N14)，并分離出一個(gè)445bp片段。用BstE Ⅱ和HindⅡ消化pDEC(N11)，并分離出一個(gè)377bp片段。將這兩個(gè)片段如上所述連入用BstEⅡ和BglⅡ切割過的pDEC△中，得到pDEC(N48)。
pDEC(O62)(HCG-促紅細(xì)胞生成素融合體)的構(gòu)建由pECl和一個(gè)107bpStu Ⅰ-Bgl Ⅱ合成DNA接頭組裝pDEC(O62)，所述DNA接頭含有人絨毛膜促性腺激素羧基末端的28個(gè)氨基酸(ser-ser-ser-ser-lys-ala-pro-pro-pro-ser-leu-pro-ser-pro-ser-arg-leu-pro-gly-pro-ser-asp-thr-pro-ile-leu-pro-gln)(Pierce等，Ann.Rev.Biochem.50465，1981)。該接頭的順序如下5′CCTGTAGGACAGGGGACAGATCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCAGCCTTC-3′GGACATCCTGTCCCCTGTCTAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGAGGGGGGTCGGAAG-5′CAAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCACAATGA3′GTTCAGGTAGGGCTGAGGGCCCCGGGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGTGTTACTCTAG
用Stu Ⅰ和Bgl Ⅱ消化pEC1，并分離出610bpDNA片段。如上所述，用ATP和多核苷酸激酶使合成接頭磷酸化，并與pEC1片段一起連入已預(yù)先用BstE Ⅱ消化并用Bgl Ⅱ部分消化的pDEC△中。
pDEC(NO1)的構(gòu)建由pDEC(O62)(HCG-EPO)和pDEC(N14)(Ser87Asn88Thr90)組裝pDEC(NO1)。用StuⅠ和BglⅡ消化pDEC177，并用Genen-Clean分離出含有Ser87Asn88Thr90的610bp DNA片段。用Stu Ⅰ和Bgl Ⅱ消化pDEC(O62)，并分離出107bp片段。如上所述，將這兩個(gè)DNA片段連入已預(yù)先用BstE Ⅱ消化并用BglⅡ部分消化的pDEC△中。
pDEC(NO2)的構(gòu)建由pDEC(O62)(HCG-EPO)和pDEC(N47)(Asn30Thr32Val87Asn88Thr90)組裝pDEC(NO2)。用StuⅠ和BglⅡ消化pDEC(N47)，并用Gene CleanTM分離出含有Asn30Thr32Val87Asn88Thr90突變的610bp DNA片段。用Stu Ⅰ和Bgl Ⅱ消化pDEC(O62)，并分離出107bp片段。如上所述，將這兩個(gè)DNA片段連入預(yù)先用BstE Ⅱ消化并用BglⅡ部分消化的pDEC△中。
pDEC(N16)(Ser87Asn88Thr90Ala162)的構(gòu)建由pDEC(N14)(Ser87Asn88Thr90)和pDEC258(Ala162)組裝pDEC(N16)。pDEC258的構(gòu)建方法是利用上述體外誘變法，將162位的AGG密碼子變?yōu)镚CG。用StuⅠ和BglⅡ消化pDEC(N14)，并用Gene CleanTM分離出含有Ser87Asn88Thr90突變的610bpDNA片段。用StuⅠ和BglⅡ消化pDEC258，并分離出一個(gè)210bp片段。如上所述，將這兩個(gè)DNA片段連入預(yù)先用BstEⅡ消化并用BglEⅡ部分消化的pDEC△中。
pDEC(R1)、(R2)和(R3)的構(gòu)建為除去pDEC(N14)中的糖基化位點(diǎn)，用下列引物對(duì)含有ser87asn88和thr90突變的m13-EPO(N14)進(jìn)行如上所述的體外誘變5′GGAGGCCGAGCAGATCACGACGG3′ GLN245′CTTGAATGAGCAGATCACTGTCC3′ GLN385′CTGTTGGTCCAGTCTTCCCAG3′ GLN83所得質(zhì)粒命名為pDEC(R1)(gln24Ser87asn88thr90)、pDEC(R2)(gln38ser87asn88thr90)和pDEC(R3)(gln83ser87asn88thr90)。m13C-1也用上述寡核苷酸引物進(jìn)行體外誘變，得到pEC10(gln24)和pEC8(gln38)。用下列引物構(gòu)建pEC9(gln83)5′CCTGTTGGTCCAGTCTTCCCAGC3′ GLN83取相應(yīng)于[Asn4，Ser6]EPO、[Asn9，Ser11]EPO、[Asn69]EPO、[Asn124]EPO、[Asn125，Ser127]EPO、[Asn163，Ser165]EPO、[Thr125]EPO和[Pro124，Thr125]EPO的人促紅細(xì)胞生成素和類似物的cDNA克隆，以及表3、4和5所述類似物的cDNA克隆，用電穿孔法轉(zhuǎn)移到COS-1細(xì)胞(ATCC CRL-1650)中。從半?yún)R合培養(yǎng)皿上收集COS-1細(xì)胞，用培養(yǎng)基(Dulbecco改良基本培養(yǎng)基，含有5%胎牛血清和1%L-谷氨酰胺/青霉素/鏈霉素(Irvine Scientific))洗滌，并以4×106個(gè)細(xì)胞/ml再懸浮。將1ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移到電穿孔池(Bio-Rad)中，在100-200μg載體DNA和2-20μg編碼促紅細(xì)胞生成素類似物的質(zhì)粒DNA存在下，用Bio-Rad Gene Pulser于25μF和1600V下進(jìn)行電穿孔。電穿孔后的細(xì)胞以每個(gè)60mm組織培養(yǎng)皿2×106個(gè)細(xì)胞接種到5ml培養(yǎng)基中。接種2-4小時(shí)后，培養(yǎng)基換用5ml新鮮培養(yǎng)基。電穿孔3-5天后收集條件培養(yǎng)基。
實(shí)施例7促紅細(xì)胞生成素類似物的鑒定A.碳水化合物加入量的測(cè)定從如實(shí)施例6所述用促紅細(xì)胞生成素類似物cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞中取含5-20單位的一份上清液，在室溫下用兔抗促紅細(xì)胞生成素多克隆抗體免疫沉淀過夜。在免疫沉淀物中加入20-80μl1∶1蛋白A-Sepharose在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的溶液，并于室溫下保溫1小時(shí)。將樣品離心，用PBS洗滌，需要時(shí)用N-聚糖酶處理沉淀物，以脫除N連接碳水化合物鏈。樣品用15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，如文獻(xiàn)所述(Burnette等，Anal.Biochem.112195-203，1981;Elliott等，Gene79167-180，1989)，用小鼠抗促紅細(xì)胞生成素單克隆抗體的混合物進(jìn)行Western分析。一種這樣的抗體9G8A描述于文獻(xiàn)中(Elliott等，Blood 74Supp.1，A.1228，1989)。
對(duì)用[Asn69]EPO和[Asn125，Ser127]EPO cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞上清液進(jìn)行分析表明，蛋白大小比具有人順序的促紅細(xì)胞生成素有所增加。這種大小的增加表明有一個(gè)額外的N連接碳水化合物鏈(圖7)。用N-聚糖酶處理用[Thr125]EPO和[Pro124，Thr125]EPO cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞上清液的結(jié)果表明，蛋白大小比具有人順序的促紅細(xì)胞生成素有所增加。這種大小的增加表明有一個(gè)額外的O連接碳水化合物鏈(圖8)。其他選定類似物的Western印跡分析示于圖10。
為測(cè)定與EPO相連的N連接碳水化合物鏈的數(shù)目，進(jìn)行了部分N-聚糖酶消化。在CHO細(xì)胞中表達(dá)類似物或rHuEPO，并收集無血清條件培養(yǎng)基。各管含有40單位EPO(體積用H2O調(diào)至15μl)。在每只管中加入10μl 0.5%SDS，將每個(gè)樣品煮沸3分鐘。然后加入下列組分;10.8μl0.5M NaPO4pH8.6、5μl7.5%Nonidet P40和1.5μl250單位/毫升N-聚糖酶(Genzyme)。將樣品于37℃下保溫指定的時(shí)間。加入SDS-PAGE樣品緩沖液(見上)停止反應(yīng)，然后用抗EPO多克隆抗體和抗兔VectastainTM試劑盒(Vector Laboratories)進(jìn)行SDS-PAGE Western分析(10%丙烯酰胺)，用4-氯萘酚作底物。用該方法對(duì)人促紅細(xì)胞生成素和類似物N14進(jìn)行的N連接鏈的分析結(jié)果示于圖11。
B.促紅細(xì)胞生成素類似物活性的測(cè)定按Egrie等人(同上)的方法進(jìn)行RIA。用CLINIGENTMEIA試劑盒(R系統(tǒng)或D系統(tǒng))，利用制造廠家提供的方法進(jìn)行EIA。取表達(dá)促紅細(xì)胞生成素類似物的CHO細(xì)胞的上清液，或者如下所述由CHO細(xì)胞條件培養(yǎng)基制得的純化促紅細(xì)胞生成素，利用外缺氧紅細(xì)胞增多小鼠生物測(cè)定法(Cotes等，同上)測(cè)定促紅細(xì)胞生成素類似物的體內(nèi)生物活性。
用經(jīng)過修改的Iscove等人所述的紅細(xì)胞集落形成試驗(yàn)(J.Cell Physiol.83309-320，1974)測(cè)定體外促紅細(xì)胞生成素活性。在Ficoll-paque墊上部分純化來自人骨髓細(xì)胞的單核細(xì)胞，并在接種前用Iscove培養(yǎng)基洗滌以去掉粘附的細(xì)胞。培養(yǎng)基含有0.9%甲基纖維素，且不含任何牛血清清蛋白。培養(yǎng)8-10天后計(jì)數(shù)紅細(xì)胞集落。
利用RIA、EIA和紅細(xì)胞集落形成試驗(yàn)，在粗制COS細(xì)胞上清液中分析如實(shí)施例6所述在COS細(xì)胞中轉(zhuǎn)染和表達(dá)的促紅細(xì)胞生成素類似物。經(jīng)過上述測(cè)定法測(cè)定，純化的人順序促紅細(xì)胞生成素的體外活性與RIA活性差不多。類似物[Asn69]EPO、[Thr125]EPO和[Pro124，Thr125]EPO的體外活性與RIA活性差不多，并給出帶有額外碳水化合物鏈的證據(jù)(如A節(jié)中所測(cè)定的)。將編碼促紅細(xì)胞生成素類似物的cDNA克隆轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，對(duì)CHO細(xì)胞上清液進(jìn)行RIA或EIA及體內(nèi)生物測(cè)定，以此來進(jìn)一步分析[Thr125]EPO和類似物N14、N11、N14、N16、N18、N47、N48、O62、NO1和NO2。結(jié)果示于表6。在CHO細(xì)胞上清液中表達(dá)的類似物R1、R2和R3的體內(nèi)活性示于表7。
表6帶有額外碳水化合物鏈的促紅細(xì)胞生成素類似物體內(nèi)活性bEPO順序 N連接鏈aO連接鏈 RIA或EIA人 3c1d0.6Asn30Thr323至4cn.t. 1.1Asn51Thr534 n.t. n.t.
Asn57Thr594 n.t. n.t.
Asn694 減少en.t.
Asn69Thr714 n.t. 0.25-0.7Ser68Asn69Thr714 n.t. n.t.
Val87Asn88Thr904cn.t. 1.8Ser87Asn88Thr903至4c正常 1.0Ser87Asn88Gly89Thr904 n.t. n.t.
Ser87Asn88Thr90Thr924 減少en.t.
Asn89Ile90Thr914 n.t. n.t.
Ser87Asn89Ile90Thr914 n.t. n.t.
Ser87Asn88Thr90Ala1624 n.t. 1.8Asn136Thr1383至4 n.t. n.t.
Asn138Thr1403至4 n.t. n.t.
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr904至5 n.t. 0.025-0.25Asn30Thr32Val87Asn88Thr904至5c正常 1.8Thr1233 1和2fn.t.
Thr1253 1和2f0.7Pro124Thr1253 1和2fn.t.
HCG C 末端延伸3至少 3g1.0-1.3Ser87Asn88Thr90HCG 延伸4至少3g1.5Asn30Thr32Val87Asn88Thr90HCG 延伸4至5至少 3g0.8
表6附注a額外N連接鏈數(shù)目是如實(shí)施例7A所述根據(jù)類似物多肽在SDS凝膠上的遷移率來估測(cè)的。
b類似物體內(nèi)活性與促紅細(xì)胞生成素類似物量的比例?；钚詼y(cè)定是用小鼠血細(xì)胞增多生物測(cè)定法對(duì)類似物CHO細(xì)胞上清液進(jìn)行的。CHO細(xì)胞上清液中促紅細(xì)胞生成素類似物的量是如正文中所述用RIA或EIA法測(cè)定的。
c如實(shí)施例7A所述，在經(jīng)過部分N-聚糖酶消化后檢驗(yàn)SDS凝膠中的糖蛋白遷移率，從而確認(rèn)額外碳水化合物鏈的數(shù)目。
d70%的人促紅細(xì)胞生成素分子上有Ser126位的O連接鏈。
eO-糖基化減少的類似物在不到70%的分子上有Ser126位的碳水化合物鏈。
fThr123EPO在多于60%的分子上有兩個(gè)O連接鏈。Thr125EPO在約40%的分子上有兩個(gè)O連接鏈。Pro124Thr125EPO在多于80%的分子上有兩個(gè)O連接鏈。
g這些類似物有至少三個(gè)O連接鏈，可能有4個(gè)或5個(gè)。已知HCG本身有4個(gè)O連接鏈。
n.t.未測(cè)。
表7含有碳水化合物位點(diǎn)重排的人促紅細(xì)胞生成素和類似物的活性體內(nèi)活性EPO順序N連接鏈RIA或EIA人30.69Gln242 0.16Gln382 0.16Gln832 0.23Gln24Ser87Asn88Thr90(R1) 3 0.69Gln38Ser87Asn88Thr90(R2) 3 0.41Gln83Ser87Asn88Thr90(R3) 3 0.50Ser87Asn88Thr903至4 1.48體內(nèi)活性與RIA或EIA的比例如表6的附注a所述測(cè)定。
C.來源于促紅細(xì)胞生成素類似物的異構(gòu)體混合物的制備[Thr125]EPO(EPO O50)如實(shí)施例6的A節(jié)所述構(gòu)建促紅細(xì)胞生成素類似物[Thr125]EPO。用BstE Ⅱ和Bgl Ⅱ切割含有[Thr125]突變的質(zhì)粒pEC，并使該片段與pDEC△(pDSα2的衍生物，描述于實(shí)施例6)連接，從而分離出帶有[Thr125]突變的810bp促紅細(xì)胞生成素cDNA片段。
將含有[Thr125]促紅細(xì)胞生成素cDNA的質(zhì)粒pDEC△轉(zhuǎn)染到DHFR缺陷型CHO細(xì)胞中。將770ml CHO細(xì)胞條件培養(yǎng)基用分子量截留值為10，000道爾頓的膜濃縮，并用10mM Tris-HCl pH8.6透濾至終體積為34ml。從濃縮液中取17ml樣品加到在相同緩沖液中平衡過的Q-Sepharose快速流動(dòng)柱(床體積為5ml)上，并用0-250mM NaCl/10mM Tris-HCl pH8.6線性梯度洗脫。從柱中流出的各部分中取未經(jīng)處理的或用N-聚糖酶消化過的等份試樣，用SDS-PAGE或IEF法進(jìn)行分析，并根據(jù)各部分的異構(gòu)體和/或碳水化合物組成合并出幾個(gè)并集液(命名為2、3和4)。將每個(gè)并集液加到Vydac C4柱(214TPB 2030;直徑為1cm;床體積為1.8-2.5ml;0.34ml/分)上，并用兩個(gè)柱體積的20%乙醇/10mM Tris-HCl pH7.0洗滌。用20-94%乙醇/10mM Tris pH7.0線性梯度對(duì)柱進(jìn)行洗脫。制出并集液，用10mM Tris-HCl pH7.0稀釋，并加到Q-Sepharose快速流動(dòng)柱上。用10mM Tris-HCl pH7.0洗滌后，用20mM檸檬酸鈉/250mM NaCl pH7.0洗脫樣品。純化的[Thr125]并集液用IEF法進(jìn)行分析，結(jié)果示于圖9。還如上所述(Cotes等，同上)分析了這些并集液的體內(nèi)生物活性，結(jié)果示于表8。
Ser87Asn88Thr90EPO(EPO N14)制備1用由離子交換色譜、反相色譜和凝膠過濾色譜組成的三步法純化EPO N14類似物。在離子交換步驟中，合并某些部分得到具有高含量唾液酸的異構(gòu)體混合物。在反相色譜過程中又制得兩個(gè)并集液，其中含有帶或不帶聚集體的類似物。詳細(xì)的純化過程如下。
1.收集表達(dá)EPO N14類似物的CHO細(xì)胞條件培養(yǎng)基，用帶有YM10膜的攪拌槽(Amicon)濃縮約2.5倍，并用10mM Tris pH8.5透濾。
2.將濃縮后的培養(yǎng)基以0.2cm/分的流速以～12A280/ml樹脂加到Q-Sepharose FF(Pharmacia)柱上，該柱已用10mM Tris pH8.5平衡過。
3.加樣后，用3個(gè)柱體積的10mM Tris pH8.5洗柱，并用0-0.5M NaCl/10mM Tris pH8.5梯度洗脫50個(gè)柱體積。以1個(gè)柱體積為一個(gè)部分進(jìn)行收集。
4.從每個(gè)部分中取樣在pH3-5的IEF凝膠上進(jìn)行等電聚焦。根據(jù)IEF上的異構(gòu)體分布，制取主要含異構(gòu)體11-18的并集液。在并集液中加入EDTA使其終濃度為1mM。
5.將異構(gòu)體并集液以2.5cm/分的流速以～5A280/ml樹脂加到反相C4柱(Vydac)上，該柱已用20%乙醇/10mM Tris pH7.0平衡過。用1個(gè)柱體積的20%乙醇/10mM Tris pH7.0洗柱，用20-94%乙醇/10mM Tris pH7.0以1cm/分的流速洗脫30個(gè)柱體積。以0.2個(gè)柱體積為一個(gè)部分進(jìn)行收集。
6.從每個(gè)部分中取樣用非還原性12%SDS-PAGE進(jìn)行分析。根據(jù)SDS凝膠上是否觀察到有聚集體存在制取兩個(gè)獨(dú)立的并集液。1號(hào)并集液含有EPO類似物但不含聚集體。2號(hào)并集液既含有EPO類似物也含有聚集體。
7.用Centricon 10(Amicon)將1號(hào)并集液濃縮約65倍，將2號(hào)并集液濃縮約250倍。每個(gè)并集液都與20mM檸檬酸鈉/100mM NaCl pH7.0進(jìn)行緩沖液交換。
8.每個(gè)并集液分別在已用20mM檸檬酸鈉/100mM NaClpH7.0平衡過的HPLC Biosil SEC-250(BioRad)柱上進(jìn)行純化。以2.26cm/分的流速以＜6 A280/ml樹脂加入并集液。每次洗脫中收集相應(yīng)于單體類似物的峰。
9.測(cè)定每個(gè)并集液的光吸收，從每個(gè)并集液中取一部分進(jìn)行濃縮以進(jìn)行SDS-PAGE和IEF凝膠分析。1號(hào)并集液中有異構(gòu)體15-17的分布，用該并集液進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)和受體結(jié)合研究。
制備2用由離子交換色譜、反相HPLC和羥磷灰石色譜組成的三步法純化EPO N14類似物。在離子交換步驟中，將類似物分成含不同異構(gòu)體混合物的三個(gè)并集液。詳細(xì)的純化過程如下1.收集表達(dá)EPON14的CHO細(xì)胞上清液，用Filtron Mini-Ultrasette切向流動(dòng)裝置濃縮約10倍，并用10mM Tris pH8.5透濾。
2.將濃縮后的培養(yǎng)基以0.2cm/分的流速以～10A280/ml樹脂加到已用10mM Tris pH8.5平衡過的Q＝Sepharose FF(Pharmacia)柱上。
3.加樣后，用3個(gè)柱積的10mM Tris pH8.5洗柱，并用0-0.5M NaCl/10mM Tris pH8.5洗脫50個(gè)柱體積。以1個(gè)柱體積為一個(gè)部分進(jìn)行收集。
4.從每個(gè)部分中取樣在pH3-5的IEF凝膠上進(jìn)行等電聚焦。根據(jù)由IEF測(cè)定的異構(gòu)體分布，制得三個(gè)獨(dú)立的并集液，即低異構(gòu)體并集液(異構(gòu)體4-12)、中異構(gòu)體并集液(異構(gòu)體5-15)和高異構(gòu)體并集液(異構(gòu)體6-18)。
5.每個(gè)異構(gòu)體并集液分別在Vydac C4反相HPLC柱上進(jìn)行純化。用從0.1%TFA/H2O到0.1%TFA/75%乙腈的梯度，以每分鐘增加1%乙腈的速度使柱展開。
6.收集由每個(gè)并集液得到的類似物峰，用4倍體積的80mM Tris-HCl/20mM Tris堿稀釋，然后用耐溶劑性Centricon 3濃縮并與10mM Tris pH7.2進(jìn)行緩沖液交換。
7.每個(gè)樣品用10mM Tris pH7.2稀釋至2A280/ml，并加入等體積的4M鹽酸胍(GuHCl)、10mM CHAPS、10mM Tris pH7.2使樣品的終濃度為1A280/ml。將每個(gè)樣品加到用2MGuHCl、5mM CHAPS、10mM Tris pH7.2平衡過的羥磷灰石小型柱上。用平衡緩沖液洗柱，以1個(gè)柱體積為一個(gè)部分收集流出液。
8.測(cè)定各部分的光吸收，制備并集液，并用Centricon 10與10mM Tris pH7.2進(jìn)行緩沖液交換。測(cè)定每個(gè)并集液的光吸收。
用SDS-PAGE和IEF凝膠分析最終的并集液。IEF凝膠示于圖12。如實(shí)施例7A所述進(jìn)行RIA和體內(nèi)活性測(cè)定。最終異構(gòu)體并集液的體內(nèi)活性示于表8。在測(cè)定小鼠血細(xì)胞比容增加的實(shí)驗(yàn)中使用高唾液酸異構(gòu)體并集液。
表8由促紅細(xì)胞生成素類似物得到的異構(gòu)體的活性體內(nèi)活性EPO順序異構(gòu)體并集液 (U/mg肽a)Thr125異構(gòu)體 8-12 147,000b異構(gòu)體 9-15 215,000b異構(gòu)體 13-15 111,000bSer87Asn88Thr90異構(gòu)體 7-12 132,000±17,000異構(gòu)體 10-14233,000±39,000異構(gòu)體 12-17272,000±14,000a用1mg/ml溶液的消光系數(shù)，由Ser87Asn88Thr90EPO異構(gòu)體并集液的A280計(jì)算促紅細(xì)胞生成素肽的毫克數(shù)。
b未示出Thr125EPO異構(gòu)體并集液的標(biāo)準(zhǔn)差，因?yàn)榛钚詼y(cè)定只進(jìn)行一次或兩次。
實(shí)施例8EPON14類似物的生物學(xué)性質(zhì)在靜脈藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)、受體結(jié)合試驗(yàn)和血細(xì)胞比容研究中，比較了EPO N14類似物的異構(gòu)體并集液、重組人促紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)和分離的rHuEPO異構(gòu)體14的活性。如實(shí)施例7C所述制備EPO N14異構(gòu)體并集液。按Lai等人(同上)所述制備rHuEPO。如下純化rHuEPO異構(gòu)體14將由異構(gòu)體10、11、12、13、14和15的混合物組成的rHuEPO加到已用10mM Tris pH7.2平衡過的Q-Sepharose快速流動(dòng)柱(線度＝直徑2.2cm×高3.4cm)上。加樣后的柱用2mM乙酸/6M脲(“A”緩沖液)平衡，然后用為優(yōu)化異構(gòu)體13和14的純化而設(shè)計(jì)的多相梯度進(jìn)行洗脫。該梯度為0%-7.3%800mM乙酸/6M脲(“B”緩沖液)750ml、7.3%-11.4%“B”緩沖液750ml、11.4%-26.8%“B”緩沖液1250ml、26.8%-62.4%“B”緩沖液1250ml、62.4%-100%“B”緩沖液700ml。以12.5ml為一部分進(jìn)行收集，用氫氧化銨中和，然后用聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦法測(cè)定。將那些含有純異構(gòu)體14的部分合并在一起，用帶有YM-10膜的Amicon攪拌槽濃縮，然后與水進(jìn)行緩沖液交換。
A.靜脈藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行兩項(xiàng)獨(dú)立的研究，以把EPON14類似物(異構(gòu)體15-17)和分離的異構(gòu)體14的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與rHuEPO作比較。
在每項(xiàng)研究中，通過重約310-378g的雄性Sprague-Dawley大鼠的頸動(dòng)脈插管，靜脈注射1μCi125Ⅰ-分離的異構(gòu)體14、125Ⅰ-EPO N14類似物或125Ⅰ-重組人促紅細(xì)胞生成素(Amersham)。在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)采集0.3ml血，離心制備血清。于4℃下與90%乙醇一起保溫過夜后，測(cè)定0.1ml的每個(gè)血清樣品中125Ⅰ-EPO(重組人EPO、分離的異構(gòu)體14或EPO N14類似物)的濃度。用γ計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)每個(gè)血清樣品中乙醇沉淀的125Ⅰ-EPO，所得的藥代動(dòng)力學(xué)曲線示于圖13。利用PCNONLIN 4.0非線性回歸分析(Statistical Consultants，1992)測(cè)定每只大鼠的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并將每組的結(jié)果平均。EPO N14類似物和分離的異構(gòu)體14的藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果概括于表9。
由表9可見，EPO N14類似物的血清清除率與重組人促紅細(xì)胞生成素的血清清除率計(jì)算值相比有顯著性差異。重組人促紅細(xì)胞生成素的β半壽期最短，為3.10小時(shí)，而分離的異構(gòu)體14為3.97小時(shí)，EPON14類似物為4.36小時(shí)。重組人促紅細(xì)胞生成素組的清除半壽期也最短，為1.78小時(shí)，而分離的異構(gòu)體14為2.40小時(shí)，EPON14類似物為3.03小時(shí)。

B.受體結(jié)合試驗(yàn)用人紅白血病OCIM1細(xì)胞進(jìn)行冷置換試驗(yàn)(Papayannopoulou等，Blood 64(supp.1)∶116a，1984)，研究EPO N14類似物(異構(gòu)體15-17)與促紅細(xì)胞生成素受體的相互作用。使?jié)舛冗f增的未標(biāo)記EPO N14和恒定濃度的125Ⅰ-rHuEPO一起與OCIM1細(xì)胞一起保溫，測(cè)定與125Ⅰ rHuEPO競(jìng)爭(zhēng)與受體的結(jié)合所需的EPO N14的量。作為對(duì)照，還使?jié)舛冗f增的未標(biāo)記rHuEPO與恒定濃度的125Ⅰ-rHuEPO競(jìng)爭(zhēng)。
將未標(biāo)記的EPO N14在測(cè)定緩沖液中稀釋，并以0.03ng、0.1ng、0.3ng、1.0ng、3.0ng、10.0ng和30.0ng的量加入(按肽量計(jì))。在所有測(cè)定管中加入0.5ng125Ⅰ-重組人EPO，然后加約0.5×106個(gè)OCIM1細(xì)胞。然后將測(cè)定管在振蕩水浴中于37℃下保溫2小時(shí)。保溫后，溶液通過對(duì)苯二甲酸二丁酯/單丁酯油溶液離心，從與OCIM1細(xì)胞結(jié)合的125Ⅰ-rHuEPO中分離出未結(jié)合的125Ⅰ-rHuEPO。分離出細(xì)胞沉淀物，用γ計(jì)數(shù)法測(cè)定與細(xì)胞結(jié)合的125Ⅰ-rHuEPO的量。計(jì)算出與細(xì)胞特異結(jié)合的計(jì)數(shù)，用線性回歸分析法確定在不存在競(jìng)爭(zhēng)物條件下競(jìng)爭(zhēng)50%125Ⅰ-rHuEPO結(jié)合所需的未標(biāo)記蛋白的濃度。
三次測(cè)定的結(jié)果表明，使125Ⅰ-rHuEPO與OCIM1細(xì)胞的結(jié)合減少50%所需的未標(biāo)記EPO N14肽的量平均為2.67±0.73ng。在同樣的三次測(cè)定中，競(jìng)爭(zhēng)0.5ng125Ⅰ-rHuEPO的結(jié)合所需的未標(biāo)記rHuEPO的量平均為0.51±0.15ng。根據(jù)這些結(jié)果，與未標(biāo)記的r-HuEPO相比，競(jìng)爭(zhēng)125Ⅰ-rHuEPO與EPO受體的結(jié)合需要5.25倍過量的EPO N14(p＜0.01)。
進(jìn)行另一個(gè)實(shí)驗(yàn)以直接比較EPON14類似物、分離的異構(gòu)體14和重組促紅細(xì)胞生成素與促紅細(xì)胞生成素受體的結(jié)合。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，EPO N14類似物與受體的親和力低于分離的異構(gòu)體14。與未標(biāo)記的異構(gòu)體14相比，競(jìng)爭(zhēng)125Ⅰ-rHuEPO與受體的結(jié)合需要約2倍過量的EPO N14類似物(圖14)。
C.血細(xì)胞比容研究進(jìn)行體內(nèi)研究以比較EPO N14高和低異構(gòu)體并集液(由實(shí)施例7C所述的制備2制得)、分離的異構(gòu)體14以及重組人EPO增加受處理小鼠血細(xì)胞比容的能力。本研究中所用的EPON14高和低異構(gòu)體并集液的異構(gòu)體分布示于圖12。
給CD1小鼠(約30g)腹膜內(nèi)注射在0.25%小鼠血清清蛋白中配制的上述制備物之一，或注射安慰劑(含0.25%小鼠血清清蛋白的PBS)，每周注射三次，共注射六周。促紅細(xì)胞生成素制備物的劑量按肽量計(jì)算，因此，對(duì)EPON14高并集液、EPON14低并集液、異構(gòu)體14和r-HuEPO標(biāo)準(zhǔn)物來說，30g小鼠接受0.071μg肽/劑量。EPON14高并集液和異構(gòu)體14還包括0.036μg肽/劑量的另一個(gè)劑量組。在基線處用眶后放血法測(cè)定所有小鼠的血細(xì)胞比容，此后每周測(cè)定兩次。該實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采集所有動(dòng)物的血清，測(cè)定針對(duì)所注射產(chǎn)物的抗體。利用判定為中和抗體陰性的動(dòng)物的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)的分析。
如圖15所示，與其他制備物相比，用EPO N14高異構(gòu)體并集液處理的動(dòng)物所達(dá)到的按組平均的血細(xì)胞比容最高。異構(gòu)體14、重組人EPO和EPON14低異構(gòu)體并集液增加血細(xì)胞比容的程度較低。
為了更定量地比較不同的促紅細(xì)胞生成素制備物，計(jì)算了平均初始血細(xì)胞比容上升速率(0-11天)、曲線下面積(0-39天)和總血細(xì)胞比容增加(表10)。從其中的任何一個(gè)指標(biāo)來看，EPO N14高異構(gòu)體并集液按肽量計(jì)的活性都比所測(cè)試的任何其他制備物要高。EPO N14高異構(gòu)體并集液和異構(gòu)體14的活性都比重組人EPO要高。無論用任何分析方法進(jìn)行比較，EPO N14低并集液的活性都是最低的。

雖然本發(fā)明已就其優(yōu)選實(shí)施方案作了敘述，但本發(fā)明不應(yīng)僅限于所公開的實(shí)施方案，相反，本發(fā)明應(yīng)覆蓋所附權(quán)利要求書的要旨和范圍內(nèi)所包括的各種修改和代換，權(quán)利要求書的范圍應(yīng)做最寬的解釋以包容所有的這類修改和代換。
權(quán)利要求
1.一種人促紅細(xì)胞生成素類似物，該類似物包含包括至少一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的氨基酸順序。
2.權(quán)利要求1的類似物，其中糖基化位點(diǎn)是N連接碳水化合物鏈的位點(diǎn)。
3.權(quán)利要求1的類似物，其中糖基化位點(diǎn)是O連接碳水化合物鏈的位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求1的類似物，該類似物至少連有一個(gè)額外碳水化合物鏈。
5.權(quán)利要求4的類似物，其中碳水化合物鏈?zhǔn)荖連接碳水化合物鏈。
6.權(quán)利要求4的類似物，其中碳水化合物鏈?zhǔn)荗連接碳水化合物鏈。
7.權(quán)利要求1的類似物，該類似物是外源DNA順序的表達(dá)產(chǎn)物。
8.權(quán)利要求2的類似物，其中在人促紅細(xì)胞生成素氨基酸順序的30、51、57、69、88、89、136或138位中的任一位置置換上了天冬酰胺殘基。
9.權(quán)利要求3的類似物，其中在人促紅細(xì)胞生成素氨基酸順序的125位置換上了絲氨酸或蘇氨酸殘基。
10.一種人促紅細(xì)胞生成素類似物，該類似物選自Asn30Thr32EPO;Asn51Thr53EPO;Asn57Thr59EPO;Asn69EPO;Asn69Thr71EPO;Ser68Asn69Thr71EPO;Val87Asn88Thr90EPO;Ser87Asn88Thr90EPO;Ser87Asn88Gly89Thr90EPO;Ser87Asn88Thr90Thr92EPO;Ser87Asn88Thr90Ala162EPO;Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90EPO;Asn30Thr32Val87Asn88Thr90EPO;Asn89Ile90Thr91EPO;Ser87Asn89Ile90Thr91EPO;Asn136Thr138EPO;Asn138Thr140EPO;Thr125EPO;Pro124Thr125EPO.
11.一種在促紅細(xì)胞生成素的羧基末端添加了一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的類似物，其中添加部分包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。
12.權(quán)利要求11的類似物，其中添加部分包含一個(gè)得自人絨毛膜促性腺激素羧基末端的肽片段。
13.權(quán)利要求12的類似物，該類似物選自(a)在羧基末端延伸出如下氨基酸順序的人促紅細(xì)胞生成素Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln;(b)進(jìn)一步包含Ser87Asn88Thr90EPO的(a)中類似物;(c)進(jìn)一步包含Asn30Thr32Val87Asn88Thr90EPO的(a)中類似物。
14.一種人促紅細(xì)胞生成素類似物，該類似物包含包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排的氨基酸順序。
15.權(quán)利要求14的類似物，其中重排包括人促紅細(xì)胞生成素中任何N連接碳水化合物位點(diǎn)的缺失，以及人促紅細(xì)胞生成素氨基酸順序的88位N連接碳水化合物位點(diǎn)的加入。
16.權(quán)利要求15的類似物，該類似物選自Gln24Ser87Asn88Thr90EPO;Gln38Ser87Asn88Thr90EPO;Gln83Ser87Asn88Thr90EPO.
17.一種DNA順序，該DNA順序編碼包括至少一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的人促紅細(xì)胞生成素類似物。
18.一種DNA順序，該DNA順序編碼權(quán)利要求10的人促紅細(xì)胞生成素類似物。
19.一種DNA順序，該DNA順序編碼具有至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排的人促紅細(xì)胞生成素類似物。
20.一種DNA順序，該DNA順序編碼權(quán)利要求16的人促紅細(xì)胞生成素類似物。
21.一種DNA順序，該DNA順序編碼權(quán)利要求13的人促紅細(xì)胞生成素類似物。
22.一種真核宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞已用權(quán)利要求17或19的DNA順序轉(zhuǎn)染，從而使該宿主細(xì)胞能表達(dá)人促紅細(xì)胞生成素類似物。
23.一種組合物，該組合物包含治療有效量的權(quán)利要求1、10、11或14中任一項(xiàng)的促紅細(xì)胞生成素類似物，以及可藥用的稀釋劑、助劑或載體。
全文摘要
公開了具有至少一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)或至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排的促紅細(xì)胞生成素類似物。本發(fā)明還涉及編碼所述促紅細(xì)胞生成素類似物的DNA順序，以及供類似物表達(dá)的重組質(zhì)粒和宿主細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1105030SQ94109128
公開日1995年7月12日 申請(qǐng)日期1994年8月15日 優(yōu)先權(quán)日1993年8月17日
發(fā)明者S·G·埃利奧特, T·E·伯恩 申請(qǐng)人:安姆根有限公司