專利名稱：篩選未知有機(jī)體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及篩選有機(jī)體之核酸的方法，其核酸的核苷酸序列是未知的，本發(fā)明尤其涉及應(yīng)用核苷酸的測(cè)序來鑒定有機(jī)體的方法。
背景核苷酸的測(cè)序方法提供了不同豐度的序列信息。從核苷酸測(cè)序所得到的信息，可以用作測(cè)定有機(jī)體基因組的一級(jí)序列信息的來源，并且一旦弄清楚其核苷酸序列，就可作為表達(dá)所測(cè)序之基因和診斷含有所測(cè)序基因之有機(jī)體的基礎(chǔ)。然而，還有核苷酸測(cè)序的其他用途的預(yù)期優(yōu)點(diǎn)，它們不需要待測(cè)序有機(jī)體方面的知識(shí)。
本發(fā)明的概要本發(fā)明提供一種篩選含有核酸之樣品的方法，以確定其核苷酸序列未知的有機(jī)體的存在，該方法包括測(cè)定樣品中的所有核酸的序列，由測(cè)序步驟中獲得的核苷酸的序列與已知有機(jī)體的核苷酸序列進(jìn)行比較；鑒定與已知核苷酸序列不對(duì)應(yīng)之核苷酸序列的連續(xù)區(qū)域；和確定所述核苷酸序列的連續(xù)區(qū)域是其核苷酸序列未知的有機(jī)體的核苷酸序列。
按照本發(fā)明的方法可以包括測(cè)序步驟，包括通過與已知序列的探針雜交來測(cè)序核酸的步驟。
本發(fā)明的優(yōu)選方法包括確定步驟，包括構(gòu)建一寡核苷酸探針的步驟，所述寡核苷酸探針具有存在于未知序列而不存在于已知序列中的連續(xù)核苷酸序列或其互補(bǔ)物；在嚴(yán)格雜交的條件下將標(biāo)記的寡核苷酸探針暴露于懷疑含有這種寡核苷酸序列的樣品；并鑒定樣品中標(biāo)記的寡核苷酸探針和核酸之間是否存在先前雜交復(fù)合物。嚴(yán)格雜交條件是本領(lǐng)域內(nèi)所了解的那些導(dǎo)致探針與完全配對(duì)但不錯(cuò)配的核苷酸序列進(jìn)行雜交的條件。
按照本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括第二比較步驟，其中核苷酸序列的第二連續(xù)區(qū)域與已知的核苷酸序列相比較。
按照本發(fā)明的確定步驟可含有如下步驟在嚴(yán)格雜交條件下將樣品暴露于與未知核苷酸序列部分互補(bǔ)但不與已知核苷酸序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針；和將含有與標(biāo)記寡核苷酸雜交的核酸組分與樣品的其他組分相分離。根據(jù)本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括顯微鏡檢查含有標(biāo)記的寡核苷酸探針組分的步驟，將含有標(biāo)記的寡核苷酸探針之組分中的核酸測(cè)序，和/或第二暴露步驟，其中在嚴(yán)格雜交條件下將標(biāo)記的寡核苷酸探針暴露于第二樣品。
根據(jù)本發(fā)明的方法可包括第二個(gè)暴露步驟，此步驟含有從第二個(gè)體得到樣品或從同一個(gè)體得到的第二樣品的步驟。
詳細(xì)的描述用于分離和克隆這種核苷酸測(cè)序的核酸和方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員熟知的。例如參見Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.1-2，John Wiley&Sons Publs.(1989)；和Sambrook等人，Molecular Coning A LaboratoryManual，第二版，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Press(1989)，這兩篇文獻(xiàn)均并入本文作為參考。
雜交測(cè)序(“SBH”)是一種可由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的很多方法實(shí)施的發(fā)展得很成熟的技術(shù)。特別是下列涉及雜交測(cè)序技術(shù)的文獻(xiàn)并入本文作為參考Drmanac等人，U.S.專利No.5,202,231-1993年4月13日公開Drmanac等人，Genomics，4，114-128(1989)；Drmanac，等人Proceedings of the First Int′1.Conf.Electrophoresis Supercomputing Human Genome Cantor，DR&Lim HA eds，World Scientific Pub.Co.，Singpore，47-59(1991)；Drmanac et al.，Science，260，1649-1652(1993)；Lehrach et al.，GenomeAnalysisGenetic and Physical Mapping，1，39-81(1990)，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Drmanacet al.，Nucl.Acids Res.，4691(1986)；Stevanovic etal.，Gene，79，139(1989)； Panuesku et al.，Mol.Biol.Evol.，1，607(1990)；Drmanac et al.，DNA and/Cell Biol.，9，527(1990)；Nizetic et al.，Nucl.Acids Res.，19，182(1991)；Drmanac et al.，J.Biomol.Struct.Dyn.，5，1085(1991)；Hoheisel etal.，Mol.Gen.，4，125-132(1991)；Strezoska et al.，Proc.Nat′1.Acad.Sci.(USA)，88，10089(1991)；Drmanac et al.，Nucl.Acids Res.，19，5839(1991)；and Drmanac et al.，Int.J.Genome Res.，1，59-79(1992)。
人們可應(yīng)用SBH技術(shù)，得到已知有機(jī)體的全部或部分基因組之核苷酸序列的信息。在此方法中，很多已知長度的寡核苷酸探針(有些可達(dá)7個(gè)單體)，在雜交的條件下，分別暴露在待測(cè)序的樣品中。人們可以應(yīng)用不到總數(shù)的已知長度的可能的探針，來進(jìn)行各種技術(shù)試驗(yàn)，并且可以應(yīng)用不只一種長度的探針在雜交條件下暴露，以改進(jìn)這些結(jié)果。SBH技術(shù)可與凝膠測(cè)序一起，以獲得一種未知樣品序列的全部信息。
根據(jù)本發(fā)明，SBH技術(shù)可應(yīng)用于核酸樣品，以測(cè)定得自于一種未知核苷酸序列的有機(jī)體的樣品中是否含有核酸。優(yōu)選的樣品可含有一個(gè)以上的基因組。樣品中的核酸得到的核苷酸序列，可與可被排除考慮的已知有機(jī)體基因組的核苷酸序列相比。從一種樣品得到的連續(xù)核苷酸序列，其序列與已知有機(jī)體的任何已知核苷酸序列均不相對(duì)應(yīng)，由此鑒定存在以前未知的有機(jī)體。
通過SBH技術(shù)得到先前未知的有機(jī)體的核苷酸序列，然后制成標(biāo)記的寡核苷酸探針，以斷定有機(jī)體是否存在，并且作為鑒定和分離先前未知的有機(jī)體的手段?？梢詰?yīng)用諸如過濾、離心和色譜技術(shù)來將這種有機(jī)體與另一些已知有機(jī)體分離開?？梢詰?yīng)用標(biāo)記寡核苷酸探針作為標(biāo)志，以鑒定分離組分中先前未知有機(jī)體的存在，從而得到純化的有機(jī)體樣品。為了驗(yàn)證先前有關(guān)未知的有機(jī)體存在的最初測(cè)定，并且為了證實(shí)得到此有機(jī)體的核苷酸序列，不管愿望圓滿程度如何，都可測(cè)序此有機(jī)體的這些純化樣品。
用SBH技術(shù)對(duì)先前未知的有機(jī)體進(jìn)行鑒定也可以用于確定致病有機(jī)體的診斷過程中。同樣，本發(fā)明的方法可用以鑒定諸如土壤、空氣和水的樣品中的新有機(jī)體。人們可用這一測(cè)定來篩選具有從土壤、空氣或水的樣品所觀察到的合意或不合意作用的有機(jī)體(例如污染物的降解或硝化作用)。同樣，通過應(yīng)用本發(fā)明的方法可以檢測(cè)在食物中具有有益或有害作用的有機(jī)體。例如，若有一種合意的表型，通過SBH技術(shù)可鑒定出具有合意性質(zhì)的微生物，甚至在樣品中存在合意表型的情況下，用根據(jù)SBH技術(shù)為基礎(chǔ)構(gòu)建的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交的相關(guān)存在，將未知有機(jī)體從混合物中分出。
實(shí)施例從顯出疾病癥狀的患者抽取血樣，按照本發(fā)明來篩選。將懷疑含有可能引起疾病癥狀的微生物的血樣組分預(yù)先處理，得到具有篩選用途的cDNA文庫。這種制備可以包括載體DNA的克隆和通過PCR技術(shù)來擴(kuò)增克隆的核酸。
在SBH方法應(yīng)用之后，得到序列的信息。此序列的信息是代表寡核苷酸探針的核苷酸序列重疊區(qū)域(一區(qū)域是由重疊多于一個(gè)的探針序列而形成的連續(xù)序列)的核苷酸序列，所述探針與樣品之克隆的DNA雜交。例如排除了來自GENBANK(BBN Laboratories，Inc.10Moulton Street，Cambridge，MA)或另一核苷酸序列信息來源的已知核苷酸序列之后，再剩下的序列需進(jìn)一步作如下檢測(cè)。
在一些例子中，來自二個(gè)以上克隆的序列可以部分重疊，表明有分支點(diǎn)的存在。這一分支點(diǎn)可表明樣品的有機(jī)體中有二個(gè)相似的核苷酸序列片段，或可表明樣品中的二個(gè)或多個(gè)有機(jī)體中有一個(gè)共同的部分序列。通過分支點(diǎn)的每一個(gè)分支的序列都與已知序列相比。如果一分支序列的核苷酸序列與有機(jī)體的已知核苷酸序列不一致，該分支核苷酸序列的測(cè)定作為一未知有機(jī)體的鑒別標(biāo)準(zhǔn)。
與已知核苷酸序列的有機(jī)體之核苷酸序列有不相對(duì)應(yīng)的重疊序列的不連續(xù)區(qū)域，可說明片段序列是存在的，或者可說明存在不止一個(gè)有機(jī)體。這些序列的不連續(xù)區(qū)域可與來自已知有機(jī)體的核苷酸序列相比，并且達(dá)到來自所述樣品的序列與已知序列不相一致的程度，從而證實(shí)至少有一個(gè)有機(jī)體存在。
用合成寡核苷酸探針來證實(shí)未知有機(jī)體的存在，此探針相當(dāng)于來自一未知有機(jī)體的核苷酸序列之連續(xù)區(qū)域的獨(dú)特部分，或者相當(dāng)于此序列的互補(bǔ)序列。人們將這一探針應(yīng)用于此樣品中，以證實(shí)樣品中存在已被測(cè)定序列。這一探針還可用于來自第一個(gè)樣品所出自的同一個(gè)體的另一個(gè)樣品；來自與第一個(gè)個(gè)體有相似診斷疾病癥狀的第二個(gè)個(gè)體的樣品，和從第三個(gè)個(gè)體取出的樣品，他和第一個(gè)個(gè)體的診斷癥狀不相同。從同一個(gè)體和第二個(gè)個(gè)體但不是第三個(gè)個(gè)體得到的樣品中，其核苷酸序列的存在證實(shí)是先前未知有機(jī)體的序列。
合成寡核苷酸探針然后用于鑒定來自被證實(shí)的含有上述核酸之個(gè)體的樣品組分。應(yīng)用顯微鏡技術(shù)檢查這組分的內(nèi)容物與具有先前未知有機(jī)體的核苷酸序列相同或互補(bǔ)的標(biāo)記探針雜交的情況，肉眼檢出先前未知的有機(jī)體。有人應(yīng)用分離技術(shù)于含有先前未知有機(jī)體的組分，通過本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員所熟悉的純化方法得到組分，以示蹤先前未知有機(jī)體的存在，此純化方法能將樣品中的先前未知有機(jī)體與已知有機(jī)體分離出來。
一旦從樣品中分離出另一些有機(jī)體，應(yīng)用雜交測(cè)序獲得先前未知有機(jī)體核酸的全部核苷酸序列。
已根據(jù)特定實(shí)施方案來描述了本發(fā)明。但是，在考慮了本發(fā)明說明書和權(quán)利要求后本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行修飾和改進(jìn)。例如，盡管應(yīng)用SBH的優(yōu)選方法已在此舉例說明，但是凝膠測(cè)序或其他核苷酸的測(cè)序技術(shù)，可以單獨(dú)應(yīng)用或彼此結(jié)果或與SBH結(jié)合應(yīng)用。據(jù)此，本發(fā)明的改變和修飾都應(yīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.篩選含有核酸的樣品以確定其核苷酸序列未知之有機(jī)體的存在的方法，包括下列步驟對(duì)樣品中所有核酸進(jìn)行測(cè)序；該測(cè)序步驟所得到的核苷酸序列與已知有機(jī)體的核苷酸序列相比較；鑒定與已知核苷酸序列不對(duì)應(yīng)的核苷酸序列的連續(xù)區(qū)域；和，確定所述核苷酸序列之連續(xù)區(qū)域是其核苷酸序列未知之有機(jī)體的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述測(cè)序步驟包括通過與已知序列的探針雜交來測(cè)序核酸序列的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述確定步驟包括構(gòu)建一寡核苷酸探針，所述探針含有存在于未知序列而不存在于已知序列中的連續(xù)核苷酸序列或其互補(bǔ)物；在嚴(yán)格雜交條件下將標(biāo)記的寡核苷酸探針暴露于懷疑含有寡核苷酸序列的樣品；和鑒定樣品中標(biāo)記的寡核苷酸探針和先前未知的核酸之間雜交復(fù)合物的存在。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括第二比較步驟，其中將核苷酸序列的第二連續(xù)區(qū)域與已知核苷酸序列相比。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的確定步驟包括步驟在嚴(yán)格的雜交條件下將樣品暴露于與所述未知核苷酸序列部分互補(bǔ)但不與已知核苷酸序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針；和將含有與標(biāo)記寡核苷酸雜交的核酸組分與樣品的其他組分相分離。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，進(jìn)一步包括顯微鏡檢含有標(biāo)記寡核苷酸探針的組分的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，進(jìn)一步包括在含有標(biāo)記寡核苷酸探針的組分中測(cè)序核酸的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，進(jìn)一步包括第二暴露步驟，其中在嚴(yán)格的雜交條件下，將標(biāo)記的寡核苷酸探針暴露于第二個(gè)樣品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中該第二暴露步驟包括從第二個(gè)體得到樣品的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中該第二暴露步驟包括從同一個(gè)體得到的第二樣品的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過將樣品中核酸的核苷酸序列與已知的核苷酸序列進(jìn)行比較，然后確定樣品中存在未知核苷酸序列從而鑒定未知有機(jī)體的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1143977SQ94195059
公開日1997年2月26日 申請(qǐng)日期1994年7月25日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月23日
發(fā)明者L·S·格盧伯 申請(qǐng)人:希斯克有限公司