專利名稱：攜帶編碼殺蟲蛋白質(zhì)融合基因的表達載體及其轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白質(zhì)的新的DNA序列，包含所說DNA序列的融合基因構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達載體，被所說的表達載體轉(zhuǎn)化的植物細胞，以及由所說的細胞產(chǎn)生的對昆蟲表現(xiàn)有毒性的轉(zhuǎn)基因植物及其后代包括植物種子及植物組織。
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，下文中簡稱為B.t.)是一種能形成芽孢的革蘭氏陽性土壤芽孢桿菌，已知其可產(chǎn)生對多種昆蟲，如鱗翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和雙翅目(Dipterans)等作物害蟲有毒性的伴孢結(jié)晶蛋白質(zhì)(Aronson，Microbiol.Rev.501-141968)。B.t.產(chǎn)生的毒素代表了一大類用于控制植物害蟲的蛋白質(zhì)(Klausner，Bio/Technoloqy 2408-419)。由于B.t毒素殺蟲的專一性和高度選擇性，所以對植物和包括人在內(nèi)的動物沒有毒害，而且是環(huán)境可以接受的。因此，使用B.t毒素的生物殺蟲技術(shù)，在控制若干植物害蟲中具有廣泛的應(yīng)用前景。
基于B.t.毒素的性質(zhì)，多年前就已經(jīng)生產(chǎn)了有關(guān)在商業(yè)上出售的含有蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的孢子及結(jié)晶蛋白質(zhì)的商品殺蟲制劑(商品名為DIPEL和THURICIDE)。這種商品B.t.殺昆蟲劑可有效地對抗五十種以上的鱗翅目害蟲(Wilcox，et al.Protein Engineering，Inouye and Sarma(Eds.)Academic Press，NY，1968)。然而，使用B.t.毒素制劑的一個重要限制是由于所說的結(jié)晶蛋白質(zhì)或δ-內(nèi)毒素在環(huán)境中被降解，而需要重復(fù)生產(chǎn)和重復(fù)應(yīng)用這種殺蟲制劑，從而為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的實際應(yīng)用帶來困難，并大大增加了生產(chǎn)成本。
隨著DNA重組技術(shù)發(fā)展，自70年代后期以來，許多實驗已將B.t.毒素基因?qū)氲讲煌参锝M織的細胞中，并已在被轉(zhuǎn)化的細胞和植物中表達了嵌合基因，從而可由轉(zhuǎn)基因植物本身產(chǎn)生所說的生物殺蟲劑，在無需重復(fù)使用的情況下，賦予植物以對抗或控制敏感昆蟲蠶食者的能力。已經(jīng)證明利用基因操作技術(shù)導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物中的工程化遺傳特性是穩(wěn)定的，并且證明可通過正常孟德爾遺傳將工程化改造的遺傳特性(例如殺蟲能力)傳遞給轉(zhuǎn)基因植物的后代。
棉花是導(dǎo)入B.t.殺蟲蛋白質(zhì)基因，也可以有效地產(chǎn)生抗蟲能力的典型靶作物。棉花作為一種重要的經(jīng)濟作物，在中國、美國、以色列及歐洲其他一些國家，每年因棉花蟲害造成的經(jīng)濟損失是十分巨大的。棉花的鱗翅目害蟲包括棉鈴蟲(Heliothis virescens)、紅鈴蟲(Heliothis zeae)等。Umbeck等人(Bio/Technology，5262-266，1987)曾利用煙草模型，成功地完成了植物的基因轉(zhuǎn)化和再生。前已證明B.t.結(jié)晶體蛋白質(zhì)本身是由一種稱為前毒素的130-160千道爾頓(KDa)的大蛋白質(zhì)組成的。該前毒素只有在經(jīng)過蛋白酶水解(在昆蟲腸道內(nèi)被水解切割)后，才能產(chǎn)生對靶昆蟲有特異毒性的分子量約55至75KDa的活性肽毒素。缺失分析證明，前毒素的毒性部分定位于前毒素的氨基端，并且可制成氨基和羰基端融合體而不會丟失其殺蟲活性。
鑒于上述事實，Vaeck等人(Nature 32833-37，1987將編碼B.t.毒素蛋白質(zhì)的DNA序列修飾或剪切成約1/2長度然后整合到煙草基因組中并成功地生產(chǎn)出抗蟲煙草植株。Fischhoff等人(Bio/Technology 5807-813，1987)用類似的方法成功地產(chǎn)生了被B.t.殺蟲基因轉(zhuǎn)化的蕃茄植株。Barton，K.A.和Umbeck，P.F.(PCT 89004868)描述了能夠在植物細胞中表達B.t.δ-內(nèi)毒素氨基端部分(約700氨基酸)的嵌合基因的構(gòu)建，以及用攜帶所說嵌合基因的重組載體轉(zhuǎn)化植物細胞，以產(chǎn)生表達該毒素的轉(zhuǎn)基因植物的方法。然而，上述現(xiàn)有技術(shù)都沒有用Western印跡法檢測到被導(dǎo)入的嵌合基因的表達產(chǎn)物。因此可見，天然B.t.毒素基因在植物中表達太低，很難使被轉(zhuǎn)化的植物獲得抗蟲性。
Willbur等人(Plant Physiol.921-11，1990)的研究表明，低等生物體細菌和高等生物體植物在密碼子的使用上存在很大差異。例如密碼子XXC/G(其中兩個X各自選自A、G、C和T)在植物中的使用率為45％-73.5％，而在蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克HD-1變種(B.t.kurstaki HD-1)(Cry IA(b))的毒素基因中僅為24％。另外，有證據(jù)表明，植物中的tRNA很難提供細菌基因在植物細胞中的充分翻譯。而且，在B.t.毒素結(jié)構(gòu)基因中存在不利于在植物中轉(zhuǎn)錄出完整mRNA的不穩(wěn)定的ATTTA和AATAA等序列，轉(zhuǎn)錄出的mRNA因不完整，故翻譯出的蛋白質(zhì)無殺蟲活性。
Perlak等人(Bio/Technology 8939-942，1990)按照雙子葉植物優(yōu)化密碼子，以化學(xué)合成方法合成衍生于B.t.(kurstaki HD-1，Cry IA(b))和HD-73，Cry IA(c))的合成基因。其中所說的合成基因中，3′端的1/2序列被缺失且改變了部分保守序列的密碼子。所得到的基因序列包含相當(dāng)于編碼615氨基酸序列的1845bp。將該序列連接到帶有2個增強子的花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)啟動子的下游，借助植物農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)轉(zhuǎn)化到雙子葉植物棉花細胞中，并再生出抗蟲棉花植株。其中毒素蛋白質(zhì)表達量(約占葉子中可溶性蛋白質(zhì)的0.05％-0.1％)約為編碼天然B.t毒素蛋白質(zhì)基因的表達量的50-100倍。然而，由于其所構(gòu)建的重組表達載體中合成基因是單基因單方向表達的，抗蟲率僅為72％-76％，觀察到的棉花植株在生長的中后期抗棉鈴蟲能力也不甚理想。
另外，藤本英也等人(CN 1073717A)按照適合于單子葉植物的密碼子，以化學(xué)和酶學(xué)方法合成了編碼來自B.tKurstaki HD-1變種Cry IA(b)的B.t.毒素基因，其包含2171bp(相當(dāng)于編碼724個氨基酸的B.t.δ-內(nèi)毒素活性部分)。以電穿孔法將攜帶處于CaMV35S啟動子控制下的所述基因的重組載體轉(zhuǎn)化到水稻原生質(zhì)體中，再生得到具有抗蟲性的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
為了研究B.t.基因序列中各個區(qū)段的密碼子改變對其表達效率的影響，Perlak等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA883324-3328，1991)選擇了9個區(qū)域?qū)蛐蛄凶鞲鞣N不同的修飾，并觀察這種修飾序列在煙草和蕃茄植物中的表達效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5′端700bp范圍內(nèi)含有4個修飾區(qū)域的情況下，所得表達效率為含全部9個修飾區(qū)域的基因的表達效率的大約80％。在用3′端截短為1/2序列的基因轉(zhuǎn)化的植物中沒有測出基因的表達。當(dāng)用在5′端246-283bp間經(jīng)過修飾的基因轉(zhuǎn)化植物時，表達效率僅為包含全部9個修飾區(qū)域的基因的表達效率的53％-80％。Perlak等人的研究還進一步顯示，上述修飾過的天然基因在雙子葉植物中的表達效率低于相應(yīng)的合成的基因的表達效率。因此，利用靶植物的優(yōu)化密碼子，設(shè)計并合成利于與優(yōu)選的表達調(diào)控元件連接或再組合，并適于在靶植物細胞中表達的B.t.殺蟲蛋白質(zhì)編碼序列是至關(guān)重要的。
為了使外源B.t.毒素基因產(chǎn)物在植物細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上獲得有效表達，在包含編碼區(qū)的外源DNA序列側(cè)翼必須連接有適當(dāng)?shù)谋磉_調(diào)節(jié)和控制元件。這些控制元件包括啟動子、增強子、終止子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的未翻譯部分和多聚腺苷酸化序列、以及便于在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中篩選被轉(zhuǎn)化細胞的選擇標(biāo)記基因等。常用的植物細胞轉(zhuǎn)錄啟動子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子和根瘤農(nóng)桿菌T-DNA的胭脂堿合成酶啟動子。這些啟動子在大多數(shù)植物細胞中都是有效的，但其插入位點和插入的拷貝數(shù)目不同，將對其下游的蛋白質(zhì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性產(chǎn)生很大影響。
迄今通常用于轉(zhuǎn)化植物細胞的方法是基于植物病原體根瘤農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的獨特性質(zhì)。根瘤農(nóng)桿菌在其對植物的致病過程中將其包含的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的一部分(通常稱為T-DNA)導(dǎo)入被感染植物宿主的基因組中。另外，也可使用其他一些植物細胞轉(zhuǎn)化技術(shù)，將重組DNA直接摻入植物細胞的胞質(zhì)，插入植物的基因組中。其中一種方法是以電穿孔法破壞植物細胞的細胞膜，進而使水溶液中的DNA被攝入植物原生質(zhì)體內(nèi)。另外，也可以使用基因槍或超聲波等基因轉(zhuǎn)移裝置將外源DNA物理擊入可再生的植物胚胎組織或植物種系發(fā)生細胞中的方法。然而，據(jù)發(fā)明人所知，迄今尚沒有利用子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物受精胚囊的方法將重組體殺蟲外源基因?qū)胫参?如棉花)胚細胞中以獲得具有抗蟲性植物的成功例子。
本發(fā)明涉及編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的DNA序列，包含所說的DNA序列的融合基因構(gòu)建體，用所說的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞組織和整株植物的方法，以及由此產(chǎn)生的對植物害蟲具有控制和毒殺能力的轉(zhuǎn)基因植物，特別是對鱗翅目昆蟲例如棉鈴蟲具有顯著毒殺作用的轉(zhuǎn)基因棉花。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供編碼B.t.kurstaki HD-1和HD-73殺蟲蛋白質(zhì)基因的DNA序列。
眾所周知，植物細胞與原核細胞及其他動物來源的真核細胞在密碼子使用和偏愛性上有著很大差異。在通過DNA重組技術(shù)使植物細胞、組織或整株植物產(chǎn)生所需的抗蟲毒素和相應(yīng)活性時，這種差異將對殺蟲蛋白質(zhì)(B.t.δ-內(nèi)毒素)的表達水平和進而產(chǎn)生的植物抗蟲活性具有不可忽視的影響。
另外，鑒于前已證明的，C/G的高含量對于外源基因在植物細胞獲得高表達的重要影響，我們研究并設(shè)計了相應(yīng)于B.t毒素蛋白質(zhì)中每一個氨基酸的密碼子XXC/G(其中每個X分別選自A、G、C、T)的最佳組合方式。同時，還從總體上充分考慮到合成基因中各氨基酸之密碼子的一致性分布和各密碼子的總體聯(lián)合用法。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在植物細胞中表達時，合成的基因DNA序列中如存在ATTTA序列和AATAA及AATAAT序列，將在某種程度上干擾基因序列的表達和多聚腺苷酸化序列的錯誤加入。
因此，本發(fā)明人基于已知的B.t.kurstaki HD-1和HD-73殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列，經(jīng)過大量深入的研究工作，仔細分析了全部64個密碼子(包括三個終止密碼子TAA、TAG、TGA)的優(yōu)選用法，和相應(yīng)的每種氨基酸密碼子的優(yōu)選用法。設(shè)計并合成不僅包含植物細胞優(yōu)化密碼子，而且在對上述XXC/G密碼子組成進行適當(dāng)修飾后，使其中XXC/G聯(lián)合使用率大于53.5％，G＋C含量大于48.1％的長度約1758個和1824個堿基對的，大約編碼有586個和608個氨基酸的B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列。因此，本發(fā)明提供了編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列，該序列具有附

圖1中所示的核苷酸64-1824個或1-1824個核苷酸。在本發(fā)明一個特別優(yōu)選實施方案中，該核苷酸序列中所有編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)中各氨基酸的密碼子都是適于植物細胞表達的優(yōu)化密碼子及其組合。根據(jù)本發(fā)明的一個更為具體的優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的被修飾的合成的B.t殺蟲蛋白質(zhì)基因序列中，以XXC和XXG(其中X各自代表A、G、C、T)為代表的密碼子的聯(lián)合使用率大于53.5％，并且其G＋C含量在48.1％以上。
為了得到本發(fā)明的適于在單子葉植物和雙子葉植物，特別是棉花植物中表達的編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的基因序列，我們按常規(guī)DNA合成技術(shù)合成了具有不同長度和不同的克隆位點及酶切位點的多個寡核苷酸片段。然后按照前述原則，分別組合并連接這些片段。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的基因序列由九個預(yù)先合成的寡核苷酸片段組成，所說的序列中包含足夠的便于使所說的基因序列與其他調(diào)控元件連接或便于對所說的基因序列進行修飾的多克隆位點和其他相關(guān)酶切位點。
本發(fā)明的編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的DNA序列基本是基于上述密碼子優(yōu)化原則和提供相應(yīng)酶切位點的需要，按照已知的DNA序列合成方法，使用適當(dāng)?shù)腄NA合成裝置合成的。但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，為本發(fā)明的目的，也可以基于天然B.t殺蟲蛋白質(zhì)基因的野生序列，以核苷酸定點誘變技術(shù)、PCR酶促合成等技術(shù)制得本發(fā)明的具有圖1所示核苷酸序列的編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的DNA序列及其同源序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及包含編碼B.t.殺述所達表的DNA序列及為在受體植物中有效地表達所述殺蟲蛋白體所需之調(diào)節(jié)及控制元件的融合基因構(gòu)建體。
如前所述，為了在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上有效地在受體植物細胞中表達外源基因產(chǎn)物，包含B.t.殺蟲蛋白質(zhì)編碼區(qū)的外源DNA序列的側(cè)翼必須連接有適當(dāng)?shù)氖笵NA轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA的啟動子序列，以及加在啟動子5′端的增強啟動子轉(zhuǎn)錄能力的增強子序列。
增強在DNA指導(dǎo)下經(jīng)轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生的mRNA在植物細胞中的翻合結(jié)力的糖體衍生的翻合增強序列、使mRNA在核糖體結(jié)合位點的翻譯過程在任何讀碼情況下均能正確終止的多聯(lián)終止密碼子序列、便于對植物細胞經(jīng)轉(zhuǎn)錄過程得到的mRNA進行正確切割與加工的mRNA切割與加工序列，以及直接加到mRNA 3′端上入多速mRNA一這化入加使腺苷酸化序列及促使加入這一多聚腺苷酸化序列的類似多聚腺苷酸化信號序列。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明進一步提供適于在植物中表達B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的融合基因構(gòu)建體，所說的融合基因構(gòu)建體在其5′至3′方向上包含1.5′端非編碼區(qū)；2.編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的氨基端部分的約586個和608個氨基酸的核苷酸序列或其同源序列；以及3.3′端非編碼區(qū)根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，在本發(fā)明的融合基因構(gòu)建體中，所說的5′端非編碼區(qū)由兩個增強子序列，一個啟動子序列，一個衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因的翻譯增強序列，和一個外源基因在植物細胞內(nèi)翻譯過程中起促進作用的編碼核糖體結(jié)合蛋白質(zhì)的序列組成。
根據(jù)本發(fā)明的另一個特別優(yōu)選的實施方案，所說的5′端非編碼區(qū)由四個以相反方向連接的增強子序列，兩個啟動子序列，兩個衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因編碼區(qū)的翻譯增強序列，及兩個核糖體結(jié)合蛋白質(zhì)編碼序列組成，如圖39所示。因此，在本發(fā)明的這一實施方案中，本發(fā)明提供適于在植物細胞中表達B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的所謂”加倍雙向”融合表達載體。
在本發(fā)明的融合基因表達載體中，除了上述本發(fā)明的B.t殺蟲蛋白質(zhì)的DNA編碼序列外，其他位于所說編碼序列兩側(cè)翼(即5′和3′端邊界區(qū)域)的用于調(diào)節(jié)和控制該編碼序列在植物細胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列都是本領(lǐng)域已知的和容易得到的。例如，本發(fā)明使用的所說的衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因編碼區(qū)的翻譯增強序列是Ω序列。Ω序列由68bp組成，富集TTAAC序列，5′端有一個UAUUUUUACAACAAT序列以及4個UUAC序列，這些序列在蛋白質(zhì)合成的翻譯過程中構(gòu)成核糖體和rRNA結(jié)合位點(Richards et al.，Eur.J.Biochem.84513-519，1987)。其中本發(fā)明使用的促進外源基因在植物細胞內(nèi)翻譯過程的編碼核糖體結(jié)合蛋白質(zhì)的序列是如Kozak等人描述的Kozak序列(Kozak et al.，Nucleic Acids Research12857-872，1984；Cell，44283-292，1986)。
適于與本發(fā)明B.t.殺蟲蛋白質(zhì)編碼序列連接，并在植物細胞中啟動該編碼DNA序列轉(zhuǎn)錄開始的啟動子包括組成型、誘導(dǎo)型、組織或器官特異性或發(fā)育階段特異性啟動子。例如它們包括但不只限于花椰菜花葉病毒(CaMV)35S或19S啟動子，mannopine合成酶(MAS)啟動子，胭脂堿合成酶和章魚堿合成酶啟動子，玉米乙醇脫氫酶啟動子，以及二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶小亞基啟動子等。其中，本發(fā)明優(yōu)選的是CaMV35S啟動子。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，在本發(fā)明的融合基因構(gòu)建體中，所說的3′端非編碼區(qū)包括一個多聯(lián)終止密碼子序列，一個mRNA切割序列和一個mRNA切割后加工序列，一個類似多聚腺苷酸化信號序列及多聚腺苷酸化序列。這些調(diào)節(jié)和控制序列可以是載體質(zhì)粒載體中天然固有的，或在其被轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)目寺∷拗髦兄?，在dNTP及適當(dāng)?shù)腄NA合成酶和DNA連接酶的存在與作用下，利用各種已知的技術(shù)加入的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的編碼區(qū)具有如圖1中所說的核苷酸序列或其同源序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的編碼序列及其5′和3′端側(cè)翼序列是以化學(xué)方法合成的。
然而，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，上述這些3′端調(diào)控序列，基本上都是根據(jù)我們的預(yù)先設(shè)計而人為合成的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，建立在大量理論研究工作基礎(chǔ)上的這一實踐本發(fā)明的實施方案，必將更有利于提高我們制備的B.t.殺蟲蛋白質(zhì)編碼序列在植物細胞中的表達效率及其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。
例如，在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，我們設(shè)計并合成了直接連接于前述B.t.殺蟲蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因3′端的寡核苷酸5′-TAAGTAGGTGA-3′組成的多聯(lián)終止密碼子序列在該包含十一個核苷酸的短序列中，包括有三個終止密碼子(劃下線部分)。從而既使在對其左翼的結(jié)構(gòu)基因序列的翻譯過程出現(xiàn)錯讀，也將得以正確終止。另外，在本發(fā)明的融合基因構(gòu)建體的3′端非編碼區(qū)中，我們設(shè)計并在上述多聯(lián)終止密碼子的3′側(cè)連接有一個多聚腺苷酸化poly(A)序列。這樣將避免即使在轉(zhuǎn)錄后加工過程中由于未知機制不能加入該poly(A)序列時所導(dǎo)致的不利于mRNA穩(wěn)定的問題。
另外，適用于本發(fā)明融合基因構(gòu)建體還可以包括衍生于花椰菜花葉病毒，Nopaline(Nos)基因及其類似物的終止子。在本發(fā)明的一個實施方案中，我們使用了Nos基因的終止子。
為了提高本發(fā)明的表達B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的基因在單子葉禾木科植物中的表達效率，可在結(jié)構(gòu)基因與啟動子序列之間加入適當(dāng)大小的內(nèi)含子序列，例如，玉米乙醇脫氫酶基因的第一內(nèi)含子(參見Gene and Development 11183-12001987)、衍生于蓖麻植物的過氧化氫酶基因的第一內(nèi)含子(參見Tanaka et al.，Nucleic Acids Research 186767-6770，1990)等。
可使用本領(lǐng)域中已知的方法將本發(fā)明的適于在植物細胞中表達B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的融合基因構(gòu)建體連接到任何一種可在植物細胞自我復(fù)制并進行上述表達的載體上。這樣的載體例如包括衍生于pUC19的質(zhì)粒pGUC20，pBI121.1和pBI121.2(Jefferson，et al.，EMBO J.163901，1987)，衍生于大腸桿菌的質(zhì)粒載體pUC18、pUC19(Gene 1031985)，以及經(jīng)過不同的修飾而造成不同的多克隆酶切位點的一系列統(tǒng)稱為pGEM的質(zhì)粒載體(由Promega公司生產(chǎn))。上述各種質(zhì)粒載體，特別適用于攜帶上述本發(fā)明融合基因構(gòu)建體的載體是pUC19、pGUC20和pBI121.1及pBI121.2，后者特別適于作為制備加倍雙向重組表達載體的工具質(zhì)粒載體或起始質(zhì)粒載體。
當(dāng)然，如前所述，為了正確地選擇和鑒定被轉(zhuǎn)化的植物細胞，本發(fā)明的上述重組的融合表達載體還進一步含有選擇標(biāo)記和報告基因。所使用的選擇標(biāo)記和報告基因的兩側(cè)可帶有各自的調(diào)節(jié)序列，以促使它們在植物中的表達。適用的選擇標(biāo)記和報告基因是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。編碼選擇標(biāo)記的外源基因及其他基因可以包含于同一個表達載體中，或者包含于轉(zhuǎn)化時同時應(yīng)用的不同的載體中。本發(fā)明優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因并一同包含于同一個重組表達載體內(nèi)，從而保證了對被轉(zhuǎn)化細胞或植株選擇的可靠性。
根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定，申請人已于1995年12月22日將轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α宿主細胞中的本發(fā)明構(gòu)建的融合表達載體保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏登記號為CGMCC NO.0247。
如前所述，為了在植物細胞中特別是整株植物中表達殺蟲蛋白質(zhì)，以賦予整株植物及其種子和后代以殺蟲能力，必須使用適當(dāng)?shù)姆椒▽瓷鲜龇椒ㄖ苽涞臄y帶本發(fā)明的合成的編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的編碼序列的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)到適當(dāng)?shù)乃拗骷毎蛑参矬w內(nèi)。
將攜帶外源基因的重組載體導(dǎo)入宿主植物或其細胞內(nèi)的許多方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些方法包括但不只限于使用農(nóng)桿菌(Agrobaeterium)作為植物病原體所介導(dǎo)的Ti-質(zhì)粒的致病轉(zhuǎn)化法(Pathogenic transformation)、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移法以及外源基因的基因直接轉(zhuǎn)移法等。
一種特別令人感興趣的在整體植株中導(dǎo)入外源基因的方法是本發(fā)明改進的所謂子房注射植物受精胚囊法(參見Zhouet al.，等，Enzymol.Method.101433-481，1983)。該方法的基本操作步驟包括在成熟植株受精的適當(dāng)階段，在受精胚囊剛形成時，切斷植物部分，將外源基因涂抹于所說的切割斷面上或注入到受精子房內(nèi)的適當(dāng)部位，并恰好在胚囊的珠孔和珠心孔道開放及受精過程中，進入胚囊，與受精卵結(jié)合，進而整合到植物受精卵細胞的基因組中。盡管這種胚囊法成功的幾率相對與操作經(jīng)驗有關(guān)，但方法的操作步驟簡單，易于實現(xiàn)。而且也可較快地檢測到轉(zhuǎn)基因工程植株。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了將攜帶本發(fā)明的編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)DNA序列的融合表達載體導(dǎo)入植物體內(nèi)的方法，其特征在于當(dāng)受體植物恰好處于受粉后約8-24小時時，借助微量注射器，將所說重組表達載體導(dǎo)入植物胚囊內(nèi)，然后選擇和篩選被轉(zhuǎn)化的植物或其部分或所說植物的種子。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的注射是在植物受粉后約10—24小時進行的。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的用于注射攜帶外源基因的融合載體的是25-50微升的微量注射器。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了用融合基因表達載體轉(zhuǎn)化的對植物害蟲特別是鱗翅目昆蟲有抗性和殺死能力的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的融合基因表達載體包括1).5′端非編碼區(qū)；2).編碼與B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的氨基端部分同源的約586個和608個氨基酸的核苷酸序列或其同源序列；以及3).3′端非編碼區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的5′端非編碼區(qū)和3′端非編碼區(qū)分別具有如前所述的構(gòu)成元件及其功能。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的編碼區(qū)域具有如附圖1中所示的核苷酸序列或其等同功能性同源序列或突變體。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的編碼基因序列及其5′和3′端側(cè)翼序列是以化學(xué)方法合成的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的轉(zhuǎn)基因植物是轉(zhuǎn)基因棉花。
這里應(yīng)特別指出的是，雖然在本發(fā)明下述實施例中以轉(zhuǎn)基因棉花的產(chǎn)生舉例進一步詳細描述了本發(fā)明，但這絕不意味本發(fā)明制備的編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)基因的DNA序列及攜帶該DNA序列的重組融合表達載體只用于轉(zhuǎn)化和生產(chǎn)具有抗蟲能力的轉(zhuǎn)基因棉花。
因此，使用本發(fā)明的攜帶B.t.殺蟲蛋白質(zhì)編碼序列的，以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何一種方法導(dǎo)入任何已知的適于表達B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的植物或其組織或細胞中，以及由此而獲得的導(dǎo)入了外源殺蟲蛋白質(zhì)基因的，具有殺傷或控制植物敏感害蟲之能力的植物，其后代及其種子和植物部分，均包括在本發(fā)明之內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生對昆蟲害蟲有抗性和殺死能力的植物的方法，該方法包括1).合成包括編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)之氨基端序列的核苷酸序列或其同源序列，和其5′端及3′端非編碼區(qū)的融合基因序列；2).將步驟1)中合成的所說的融合基因序列與適當(dāng)?shù)闹参锉磉_載體連接，得到能夠在植物細胞或整株植物中表達所說的殺蟲蛋白質(zhì)的重組融合表達載體；3).將步驟2)中得到的重組融合表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到植物細胞內(nèi)并整合到所說植物細胞的基因組中；4).以細胞或組織培養(yǎng)技術(shù)由步驟3)得到細胞或其組織再生整株植物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生對害蟲有抗性和殺死能力的植物的方法，該方法包括1).合成包括編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)之氨基端氨基酸序列的核苷酸序列或其同源序列，和位于該序列的5′端及3′端非編碼區(qū)的融合基因序列；2).將步驟1)中合成的所說的融合基因序列與適當(dāng)?shù)闹参锉磉_載體連接，得到能夠在植物細胞或整株植物中表達所說的殺蟲蛋白質(zhì)的重組表達載體；3).將步驟2)中提到的重組表達載體導(dǎo)入到成熟的整株植物的受精卵細胞中并整合到其基因組中；
4).由步驟3)中得到的受精卵細胞發(fā)育成植物種子，并進而產(chǎn)生對昆蟲害蟲有抗性或殺死能力的植物及其后代。
根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案，其中為產(chǎn)生所說的轉(zhuǎn)基因植物的目的，將本發(fā)明的重組表達載體導(dǎo)入成熟受體植物受精卵細胞中的方法是如上文所述的，本發(fā)明人稱之為“子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物受精胚囊法”(簡稱“子房注射法”)的方法。
可用本發(fā)明的編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)之DNA序列的重組基因載體轉(zhuǎn)化的受體植物可以是雙子葉或單子葉植物，例如包括但不只限于棉花(例如陸地棉，海島棉、野生棉)和向日葵等錦葵科植物(Malvacoue)；玉米、水稻、小麥等禾木科植物(Gramineae)；苜蓿、大豆、三葉草、綠豆、豌豆等豆科植物(Leguminosae)；甘藍、蘿卜、油菜等十字花科植物(Cruciferae)；煙草、馬鈴薯、蕃茄、胡椒等茄科植物(Solwnaceae)；甜瓜、黃瓜等葫蘆科植物(Cucurbitaceae)；胡蘿卜、芹菜、歐洲防風(fēng)等傘形科植物(Umbelliferae)；甜菜等藜科植物(Chenopodiaceae)，以及各種觀賞植物、藥用植物和楊樹、松樹、葡萄樹等喬木和灌木植物。圖1顯示編碼殺蟲蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因序列。圖2顯示編碼殺蟲蛋白質(zhì)的合成基因及調(diào)控序列。圖3顯示合成基因的5′端調(diào)控序列。圖4顯示合成基因的3′端調(diào)控序列。圖5顯示2個增強子和35S啟動子的序列。圖6圖解顯示基因小片段合成結(jié)構(gòu)基因及構(gòu)建載體的程序。圖7顯示合成的GFMl-(1-8個)寡核苷酸片段及GFMl(片段1)雙鏈DNA序列。圖8顯示合成的GFM2-(1-10個)寡核苷酸片段和GFM2(片段2)雙鏈DNA序列。圖9顯示合成的GFM3-(1-8個)寡核苷酸片段和GFM3(片段3)雙鏈DNA序列。圖10顯示合成的GFM4-(1-9個)寡核苷酸片段和GFM4(片段4)雙鏈 DNA序列。圖11顯示合成的GFM5-(1-9個)寡核苷酸片段和GFM5(片段5)雙鏈DNA序列。圖12顯示合成的GFM6-(1-11個)宿寡核苷酸片段及GFM6(片段6)雙鏈DNA序列。圖13顯示合成的GFM7-(1-6個)寡核苷酸片段和GFM7(片段7)雙鏈DNA序列。圖14顯示合成的GFM8-(1-10個)寡核苷酸片段和GFM8(片段8)雙鏈DNA序列。圖15顯示合成的GFM9-(1-11個)寡核苷酸片段和GFM9(片段9)雙鏈DNA序列。圖16圖解顯示質(zhì)粒pGE35SP的構(gòu)建。圖17圖解顯示質(zhì)粒pG2E35SΩK的構(gòu)建。圖18圖解顯示質(zhì)粒pGΩK的構(gòu)建。圖19圖解顯示質(zhì)粒pGUT4A的構(gòu)建。圖20圖解顯示質(zhì)粒pGB-1的構(gòu)建。圖21圖解顯示質(zhì)粒pGB-2的構(gòu)建。圖22圖解顯示質(zhì)粒pGB-3的構(gòu)建。圖23圖解顯示質(zhì)粒pGB-4的構(gòu)建。圖24圖解顯示質(zhì)粒pGB1-2的構(gòu)建。圖25圖解顯示質(zhì)粒pGB1-3的構(gòu)建。圖26圖解顯示質(zhì)粒pGB1-4的構(gòu)建。圖27圖解顯示質(zhì)粒pGPB.t.F1-4的構(gòu)建。圖28圖解顯示質(zhì)粒pGB-5的構(gòu)建。圖29圖解顯示質(zhì)粒pGB-6的構(gòu)建。圖30圖解顯示質(zhì)粒pGB6-7的構(gòu)建。圖31圖解顯示質(zhì)粒pGB5-7的構(gòu)建。圖32圖解顯示質(zhì)粒pGB-8的構(gòu)建。圖33圖解顯示質(zhì)粒pGB8-9的構(gòu)建。圖34圖解顯示質(zhì)粒pGB5-9的構(gòu)建。圖35圖解顯示質(zhì)粒pGBPB.t.F1-9的構(gòu)建。圖36圖解顯示質(zhì)粒pGB.t.的構(gòu)建。圖37圖解顯示質(zhì)粒pGB4AB的構(gòu)建。圖38圖解顯示質(zhì)粒pGBI4AB的構(gòu)建。圖39圖解顯示質(zhì)粒pGBI4A2B的構(gòu)建。圖40顯示子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物受精胚囊示意圖。圖41顯示抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花的PCR檢測。圖42顯示抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花的Southern雜交檢測。
a)殺蟲蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因本發(fā)明的編碼殺蟲蛋白質(zhì)氨基端1-445個氨基酸序列，來于B.t.K.變種HD-1的殺蟲蛋白質(zhì)基因Cry IA(b)序列。編碼蟲蛋白質(zhì)羧基端446-608個氨基酸序列來源于B.t.K.HD-73的蟲蛋白質(zhì)基因序列(見圖1)。合成基因的64種密碼子中氨基酸的種編碼密碼子用法如表1所示；20種氨基酸中每種氨基酸的用法表2所示；合成基因編碼殺蟲蛋白質(zhì)氨基酸的密碼子用法如表3，示；合成基因密碼子XXC/G和適合于植物密碼子XXC/G以及原B.毒素密碼子XXC/G的使用如表4所示；合成基因編碼殺蟲蛋白質(zhì)基酸的密碼子適合于在植物中表達的密碼子用法和密碼子一致分布如表5所示。合成基因序列中已不存在干擾在植物細胞中表的ATTTA、AATAA、AATAAT序列(如圖1所示)。該基因不僅基本保了原B.t.毒素蛋白質(zhì)的氨基酸序列，更適合于在植物中表達的碼子用法和一致性，而且由于在合成基因的5′端和3′端非編碼加入了表達調(diào)控元件序列，從而使該基因更適合于在植物中高表達(參見圖2)。
表1.編碼殺蟲蛋白質(zhì)合成基因中密碼子的用法
表2.合成基因編碼殺蟲蛋白質(zhì)的20種氨基酸的用法
p><p>表3.合成基因編碼的20種氨基酸中各氨基酸密碼子的用法
表4.植物基因編碼氨基酸密碼子XXG/C的用法與合成B.t.、野生B.t.基因密碼子XXG/C的用法比較
表5.植物基因編碼氨基酸密碼子的用法與合成B.t.、野生B.t.基因密碼子的用法比較
<p>b)合成基因的5′端非編碼區(qū)序列合成基因5′端非編碼區(qū)的表達調(diào)控序列，對該基因在植物中的高效表達是致關(guān)重要的。Kay等人(Science 2361299-1302，1987)，Odell等人(Plant Mol.Biot.10263-273，1988)和方榮祥等人(The Plant Cell，1141-150，1989)的研究證明，5′端非編碼區(qū)的啟動子，更是致關(guān)重要的。在目前眾多的啟動子中，CaMV35S啟動子在植物整體中的表達效率最佳。Odell等進一步研究證明，將35S啟動子上游的增強子增加到2個，使報告基因(GUS)在植物中的表達水平提高8-10倍。因此本發(fā)明在構(gòu)建的融合基因中，在35S啟動子的上游增加了2個增強子序列，以利于合成基因的表達(如圖2所示)。
Richards等人(Eur.J.Biochem.84513-519，1978)分析和研究了TMV的Ω序列和功能。Ω序列由68bp組成，富集7個AAC序列且在5′端有一個UAUUUUUACAACAAT序列以及4個UUAC序列，這些序列是合成蛋白質(zhì)的翻譯過程中核糖體和rRNA的結(jié)合的位點(真核18SrRNA，原核16SrRNA)。所以Ω序列是提高蛋白質(zhì)表達量的又一關(guān)鍵序列之一。Kozak等人(Nucleic Acid.Res.12857-872，1984；Cell，44283-292，1986)在研究真核細胞rRNA翻譯蛋白質(zhì)的效率時發(fā)現(xiàn)，啟始密碼子ATG的上游邊界序列也非常重要。編碼相同蛋白質(zhì)的mRNA，使用不同的ATG邊界序列即所謂kozak序列，產(chǎn)生蛋白質(zhì)的效率不同。Lütcke等人(EMBO.J.6(1)43-48.1987)進一步分析研究了209種動物和61種植物mRNA的ATG邊界序列后發(fā)現(xiàn)，動物mRNA中ATG的邊界序列為CACCATG，而植物為AACA ATG G。這樣的結(jié)構(gòu)可形成一個環(huán)式結(jié)構(gòu)處在帽子結(jié)構(gòu)和啟始密碼之間，成為一個更有利于40S提前結(jié)合啟始的完成；也是一個蛋白質(zhì)結(jié)合帽子(Cap-binding-protein)結(jié)構(gòu)，更有利于RNA產(chǎn)生蛋白質(zhì)的速度和協(xié)助增強蛋白質(zhì)表達的能力。本發(fā)明在構(gòu)建載體時，在合成基因的同時插入了ATG與Kozak序列(AACA ATG G)，從而更加有利于提高合成基因在植物中表達的協(xié)同作用(如圖3所示)。c).合成基因的3′端非編碼區(qū)序列如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的真核生物基因的表達，除了5′端非編碼區(qū)的調(diào)控表達元件之外，基因3′端非編碼區(qū)的調(diào)控元件也是影響基因高效表達的重要因素。例如，基因轉(zhuǎn)錄成mRNA后，如果不能及時加入poly(A)尾巴，將會很快被3′-5′核酸外切酶降解掉。mRNA在細胞內(nèi)存在的半衰期越長，產(chǎn)生出的蛋白質(zhì)量就越多。為了延長mRNA的半衰期，轉(zhuǎn)錄后的mRNA就必須迅速在3′端加入poly(A)尾巴，以防止核酸外切酶的降解。因此本發(fā)明在合成基因的3′端非編碼區(qū)加入了一個合成的poly(A)序列。然而，Ingelbrecht等人(The Plant Cell，1671-680，1989)在提高外源基因在植物細胞中表達效率的研究中發(fā)現(xiàn)，在基因的3′端非編碼區(qū)僅有poly(A)信號序列，不一定能使外源基因得以高效表達。而在植物細胞中能高效表達的基因經(jīng)3′端缺失研究證明，在3′端都有類似AATAAA信號序列功能的3′端加工序列YGTGTTYY，(其中Y可代表T、C中的任何一種堿基)，將3′端加工序列與poly(A)信號序列聯(lián)用，可使基因的表達水平提高30-60倍。為了提高mRNA的穩(wěn)定性，延長mRNA的半衰期，Gallie等人(The Plant Cell 1301-311，1989)在基因3′端的非編碼區(qū)加入了一段加工序列，結(jié)果使基因表達水平提高了2-5倍。他們進一步研究證明，在基因的5′端加入Ω序列，同時在基因的3′端加入poly(A)序列聯(lián)合使用，結(jié)果使外源基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯水平提到了16-18倍。因此，本發(fā)明在合成基因的3′端進一步加入了合成的poly(A)序列，切割序列(CATTG)和3′端具有類似poly(A)信號的(TGTGTTTCT)加工序列(如圖4所示)。
給出以下實施例的目的是舉例詳細描述本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明待批權(quán)利范圍的限制。在本發(fā)明技術(shù)特征和待批權(quán)利要求范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作出某些等同的改動和顯而易見的改進。實施例一編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的制備1).寡核苷酸片段的制備為了合成編碼殺蟲蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因，我們首先將所說的基因分成9個大片段(GFM1-9)，然后再進一步把每個大片段的雙鏈DNA的兩條鏈分成堿基數(shù)目不同的若干寡核苷酸片段。寡核苷酸片段的制備可通過已知的標(biāo)準(zhǔn)方法(Matteucci etal J.Am.Chem.Soc.1033185-3192，1981；Beallcageet al Tetrahedron Lett.221859-1862，1981；Bioresearch公司DNA合成儀操作說明書)合成。本發(fā)明使用Bioresearch公司的DNA合成儀制備所有寡核苷酸片段。寡核苷酸片段合成后，用28％氨水去保護，然后從柱上洗脫下來后，按照Mcbridge等人的方法(Biotechniques 6362-367，1988)用寡核苷酸片段純化柱(OPC柱，Applied Biosystems)或Oligo反相純化柱純化合成的寡核苷酸片段。加入2/3體積冷無水乙醇，1/10體積醋酸鈉(3M，pH4.8)，混均勻后，置-70℃低溫下10分鐘，15000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，沉淀寡核苷酸片段。去掉上清液，冷凍抽干，加適量滅菌的去離子水后在DU70紫外分光光度計(Beckman公司)上測定含量并將所有寡核苷酸片段定量為3μg/μl。編號分組后放-30℃冰箱保存，用于制備雙鏈DNA片段。2.GFM1雙鏈DNA片段的制備從-30℃冰箱中取出編號為GFM1-(1-8)的8個寡核苷酸單鏈DNA片段，各取10μl分別對號加入到編號相同的GFM1-(1-8)8個1.5ml新的滅菌管中，0℃放置15分鐘。根據(jù)試劑(Pharmacia公司)使用說明分別加入T4多聚核苷酸激酶(終濃度70mM Tris-HCl pH7.6，10mM MgCl2，5mM DTT，67mM ATP)10×緩沖溶液10μl，再各加10個單位的T4多聚核苷酸激酶，補加滅菌去離子水使最終體積為100μl，混勻后在37℃反應(yīng)1小時，使GFM1-(1-8)8個寡核苷酸單鏈DNA片段的5′端磷酸化。
退火連接形成GFM1雙鏈DNA片段。因GFM1-(1-4)4個寡核苷酸單鏈DNA片段與GFM1-(5-8)4個寡核苷酸單鏈DNA片段是相互配對的互補鏈，所以進行退火連接后，可以形成GFM1雙鏈DNA片段。將磷酸化的GFM1-(1-8)8個寡核苷酸單鏈DNA片段，各取5μl放入同一個1.5ml滅菌的試管中，加10μl 10×緩沖液的T4DNA連接酶反應(yīng)液，并加入滅菌去離子水至90μl，混勻后，95℃放置10分鐘。慢慢降溫退火至室溫，在0℃下放置10分鐘，加入50單位的T4DNA連接酶(BoehringerMannheim公司)，并補加去離子水使終體積至100μl后，16℃過夜連接形成GFM1雙鏈DNA片段，并參于基因的合成。制備過程如圖6所示。
電泳分離GFM1雙鏈DNA片段。稱取2g低融點瓊脂糖粉(華美公司)，放入250ml三角瓶中，加100ml的1×TAE(0.04MTris-乙酸，0.001M EDTA，pH8.0)的滅菌電泳緩沖液配制成2％的凝膠。融化后，冷卻至約50℃左右加入100μl EB液溶(0.1mg/ml)，混均勻后倒入水平電泳槽中制膠，膠凝固后取出梳子，倒入TAE電泳緩沖液。將過夜連接后的GFM1混合溶液加至凝膠孔中，在4℃冰箱中，50伏電泳1.5小時后，在長波(360nm)紫外燈下，切下含有GFM1雙鏈DNA大片段的凝膠塊。放入滅菌的1.5ml小管中，加入200μl的TE(10mM Tris-HClpH7.2，1mM EDTA)緩沖液，放置65℃水浴30分鐘，待膠融化后，放入-180℃液氮中5分鐘。15000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液，得到電泳分離的GFM1雙鏈DNA大片段溶液。純化制備GFM1雙鏈DNA大片段。加等體積用TAE飽和的重蒸苯酚溶液至電泳分離的GFM1雙鏈DNA大片段溶液中，混勻后，0℃放置10分鐘。然后在4℃下1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取含有DNA大片段的上清液，再加等體積的苯酚∶氯仿(1∶1)溶液，混勻后，重復(fù)上述離心過程。取含有DNA片段的上清液，加適量的正丁醇混勻，1000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，去掉上清中的正丁醇溶液，保留下層DNA溶液，并重復(fù)上述過程。此過程的目的，一是去掉DNA中的EB，二是使體積濃縮，直至濃縮的體積約100μl時。加入1/10體積的醋酸鈉溶液(3M pH4.8)，加2/3體積的無水乙醇后置-70℃1小時并15000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。去上清后，收集沉淀的DNA片段，冷凍抽干，加適量的滅菌去離子水，在DU70紫外光光度計上測其含量，最后定量濃度為1μg/μ1，從而制得GFM1雙鏈DNA大片段，如圖7所示。
本發(fā)明合成的所有寡核酸單鏈DNA片段，都有各自的互補序列，退火時可使單鏈寡核苷酸形成配對互補的雙鏈DNA片段，并連接成大片段，直接產(chǎn)生出酶切位點的粘性末端或平末端。所以制備產(chǎn)生的GFM1雙鏈DNA片段的5′端帶有PstI酶切位點粘性末端，3′端帶有NsiI序列和HindIII平末端，可直接用于克隆到pUC19載體的PstI和HindIII位點進行序列分析。該片段序列如圖7所示。3.GFM2雙鏈DNA片段的制備按上文2中所述方法，從-30℃冰箱中取出編號為GFM2-(1-10)的10個寡核苷酸片段，進行磷酸化，退火連接形成GFM2雙鏈DNA大片段，大片段的瓊脂糖凝膠電泳分離并進一步純化后得到GFM2雙鏈DNA大片段。結(jié)果如圖8所示。GFM2雙鏈DNA大片段的5′端有NsiI的粘性末端，可與GFM1 3′端的NsiI粘性末端片段連接。3′端有HincII平端接頭可與載體pUC19質(zhì)粒上的HincII相連接，進行克隆和測序。該片段序列如圖8所示。4.GFM3雙鏈DNA大片段的制備按上文2中所述方法，從-30℃冰箱中取出編號為GFM3-(1-8)的8個寡核苷酸片段，進行磷酸化，退火連接并凝膠電泳分離，進一步純化獲得GFM3雙鏈DNA大片段。GFM3大片段DNA的5′端有HincII酶切的平端，3′端有XbaI酶切位點可直接用于克隆到pUC19載體的HincII和XbaI位點并進行克隆和測序。該片段序列如圖9所示。5.GFM4雙鏈DNA大片段的制備按上文2中所述方法，從-30℃冰箱中取出編號GFM4-(1-9)的9個寡核苷酸片段后，如上文所述，進行磷酸化，退火連接，電泳分離，進一步純化獲得GFM4雙鏈DNA大片段。GFM4雙鏈DNA大片段5′端有XbaI粘性末端，3′端有EocoRI酶切位點，可與pUC19載體的XbaI和EcoRI位點相連接，進行克隆和測序。該片段序列如圖10所示。6.GFM5雙鏈DNA大片段的制備按上文2中所述方法，從-30℃冰箱中取出編號為GFM5-(1-9)的9個寡核酸片段，如上文所述，進行寡核苷酸片段的磷酸化，退火連接，電泳分離和純化獲得GFM5雙鏈DNA大片段。GFM5大片段的5′端有HpaI平端接頭，3′端有AccI粘性末端，可直接克隆到pGUC20載體上并進行克隆和測序。該片段序列如圖11所示。7.GFM6雙鏈DNA大片段的制備按上文2中所述方法，從-30℃冰箱中取出編號為GFM6-(1-11)的11個寡核苷酸片段，進行5′端的磷酸化，退火連接并電泳分離和純化獲得GFM6的雙鏈DNA大片段。GFM6大片段的5′端AccI粘性末端和3′端有NcoI粘性末端位點，可直接克隆到pGUC20載體上并進行克隆和序列分析。該片段序列如圖12所示。8.GFM7雙鏈DNA大片段的制備按上文2中所述方法，從-30℃冰箱中取出編號為GFM7-(1-6)的6個寡核苷酸片段，進行5′端的磷酸化，退火連接并電泳分離純化獲得GFM7雙鏈DNA片段。GFM7大片段的5′端有NcoI粘性末端位點，3′端有PstI粘性位點，可直接進行克隆和序列分析。該片段序列如圖13所示。9.GFM8雙鏈DNA大片段制備按上文2中所述方法，從-30℃冰箱中取出編號為GFM8-(1-10)的10個寡核苷酸片段，5′端磷酸化，退火連接并電泳分離純化獲得GFM8雙鏈DNA大片段。GFM8大片段的5′端有PstI粘性末端和3′端SmaI平端可直接進行克隆和序列分析。該片段序列如圖14所示。10.GFM9雙鏈DNA大片段的制備按上文2中所述方法，從-30℃冰箱中取出編號為GFM9-(1-11)的11個寡核苷酸片段，進行5′端的磷酸化、退火連接并電泳分離和純化獲得GFM9雙鏈DNA大片段。該片段5′端為平端，可以與GFM8片段3′端的SmaI位點相連，其3′端有SacI粘性末端，可直接進行克隆和測序。該片段序列如圖15所示。11.編碼殺蟲蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的合成將測序正確的9個GFM1-9雙鏈DNA大片段進行亞克隆和拼接，合成編碼殺蟲蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，其全序列如圖1所示。實施例二表達調(diào)控元件的構(gòu)建1.加倍增強子元件的構(gòu)建Odell等人研究證明，35S啟動子上帶有增強基因表達的增強子序列，它位于35S啟動子的-90bp(EcoRV)和-393bp(AccI)酶切位點之間。所以用HindIII和SmaI酶切pBI121.1質(zhì)粒DNA(Jefferson et al EMBO.J.6(13)1301-1307，1987)后，可通過上文所說的凝膠電泳分離純化DNA片段的方法，分離純化出0.8Kb的DNA片段。該DNA片段攜帶有35S啟動子和1個增強子的序列。將該序列用于下文實施例三中所述的pG2E 35SΩ重組質(zhì)粒的構(gòu)建。人工合成一個含有HindIII酶切位點序列的正鏈引物(5′-CAAGCTTCATACAGAGCTCAATGAC-3′)和含有EcoRV酶切平端并與正鏈完全互補的負鏈引物(5′-ATCACATCAATCCACTTGC-3′)，通過PCR方法(Am.J.Hum.Genet.37172，1985)，以pBI121.1質(zhì)粒DNA為模板，在總體積100μl反應(yīng)混合物(10mMTris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.005％吐溫20，0.005％NP-40，0.001％明膠，4種各200μM的dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，2單位的Taq DNA聚合酶中進行30個反應(yīng)循環(huán)，每個循環(huán)93℃，45秒；55℃，1分鐘；72℃ 2分鐘。得到380bp雙鏈DNA片段。片段5′端含有HindIII酶切位點，3′端為EcoRV酶切位點。用于pG2E35SΩK的構(gòu)建如圖17所示。2.增強翻譯蛋白質(zhì)之表達的Ω和Kozak序列的制備用上文所述的合成寡核苷酸片段方法，合成了互為引物又互為模板序列的寡核苷酸單鏈DNA片段，并通過上文所說的PCR方法，合成了91bp含有Ω和Kozak序列的雙鏈DNA片段。該片段的5′端帶有BamHI酶切位點，3′端帶有合成編碼殺蟲蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的ATG啟始密碼子和Kozak序列。在ATG啟始密碼子下游的+7位置有PstI酶切位點，以用于組裝合成的編碼殺蟲蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因，如圖3所示。3.合成基因的3′端非編碼序列的制備(1)多聯(lián)終止密碼子序列的制備按上文所述的寡核苷酸片段合成方法，合成了兩條寡核苷酸片段，經(jīng)退火互補后形成如下所示的命名(UT)的多聯(lián)終止密碼子序列。該序列5′端含有一個XhoI酶切位點，可與合成基因3′端中的XhoI位點相連而不改變合成基因的讀碼框架。(UT)3′端含有一個HpaI平端酶切位點，可用于克隆多聚腺苷酸化序列(poly(A))，另外還帶有一個SacI酶切位點的粘性末端，可以直接連接到載體的SacI酶切位點上。(UT)序列XhoI HpaI SacI5′-CACTCGAGGC TGAGTAAGTA GGTGAGTTAA CGAGCT-3′(36b)3′-GTGAGCTCCG ACTCATTCAT CCACTCAATTGC-5′ (32b)(2)多聚腺苷酸化序列的制備按上文所述的制備寡核苷酸片段方法，合成了兩條寡核苷酸片段，退火后形成命名為poly(1A)的多聚腺苷酸化序列。該poly(1A)序列的5′端為平端，3′端含有一個DraI平端酶切位點和一個SacI酶切位點粘性末端，從而可用于克隆下一個poly(1A)片段。SacI酶切位點的粘性末端還可與載體上的SacI位點相連接。poly(1A)序列如下DraI SacI5′-AACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTAAAGAGCT-3′(39b)3′-TTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATTTC-3′(35b)(3)切割和加工調(diào)控序列的制備按上文所述合成寡核苷酸片段方法，合成如下所示的4條寡核苷酸片段GSP-15′-AACTTTGAGT ATTATGGCAT TGGAAAAGCCATTGTTCTGC TTGTAATTTA CTGTGTTCTT-3′(60b)GSP-25′-TCAGTTTTTG TTTTCGGACA TCAAGTT-3′ (27b)GSP-33′-TTGAAACTCA TAATACCGTA ACCTTTTCGG-5′(30b)GSP-43′-TAACAAGACG AACATTAAAT GACACAAGAAAGTCAAAAAC AAAAGCCTGT AGTTCAA-5′ (57b)按上文所述的方法經(jīng)磷酸化、退火連接并分離純化DNA片段后，獲得一條88bp的切割和類似AATAA的加工雙鏈DNA片段。該片段含有2個切割序列(CATTG)和1個加工(TGTGTTC)序列，它們在轉(zhuǎn)錄后的表達調(diào)控中起著重要的作用。該序列的5′端序列(AAC)和3′端序列(GTT)，可插入HpaI位點，而不使HpaI位點失活，仍保持了HpaI的酶切位點序列(GTTAAC)。該含有切割序列(Splicing sequence)和加工序列(Processingsequence)88bp的序列被命名為3′端GSP序列?？蓪?′端GSP序列片段直接克隆到pGUT4A質(zhì)粒中的HpaI位點上，得到了符合本發(fā)明設(shè)計要求的pGSPUT4A重組質(zhì)粒。pGSPUT4A重組質(zhì)粒攜帶有多聯(lián)終止密碼子序列(UT)，切割和加工序列(GSP)和多聚腺苷酸化序列poly(4A)，從而制得編碼殺蟲蛋白質(zhì)合成基因所需的3′端非編碼區(qū)的表達調(diào)控的元件序列(如圖4所示)。實施例三攜帶有非編碼區(qū)序列的重組質(zhì)粒的構(gòu)建1.重組質(zhì)粒pG2E35sPΩ的構(gòu)建按下述程序制備用于本發(fā)明的克隆載體pUC19首先在100ml LB培養(yǎng)基中(每升含10克NaCl，5克酵母提取物，10克胰蛋白胨，調(diào)pH至7.4)接種攜帶質(zhì)粒pUC19的大腸桿菌DH5α菌株(本實驗室保存)，置37℃振蕩培養(yǎng)約12小時。培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入250ml離心管中，在4℃，5000rpm離心5分鐘，收集沉淀的菌體。然后用STE溶液(含有0.1N NaCl，10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)洗滌一次，再次離心收集菌體沉淀。用堿變性法(J.Sambrooket al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)提取質(zhì)粒DNA。向菌體沉淀中加入5ml溶液I(50mM蔗糖，25mM Tris，10mM EDTA，pH8.0)，用旋渦混合器振蕩，以使菌體沉淀完全懸浮。然后向細胞懸液中加入10ml新配制的溶液II(含有0.2N NaOH，1％SDS)，蓋好離心管蓋后輕輕上下顛倒幾次，立刻冰上放置10分鐘。再向管內(nèi)加入7.5ml預(yù)冷的溶液III(3M KAc，pH4.8)，輕輕上下混勻數(shù)次，并在冰上放置15分鐘。然后4℃，10,000rpm離心15分鐘，收集上清液。向上清液中加入0.6倍體積的異丙醇，混勻并在室溫下放置10分鐘。在室溫下以10,000rpm離心10分鐘，用70％乙醇將所得到的沉淀洗2次，并再次離心，去除乙醇。真空抽干DNA沉淀，并溶解于1ml TE緩沖液(10mM Tris，lmM EDTA)中。向所得溶液中加入RNA酶A(Promega公司)至濃度為200μg/ml，并于37℃保溫0.5小時。將所得的DNA溶液分裝于幾個Eppendoff管中，分別用苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)、氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提。每次加入抽提液后，搖勻1分鐘，然后以12,000rpm離心10分鐘，小心吸回上層水相。最后再加入1/10體積的3MNaAc(pH4.8)和2倍體積的無水乙醇，混勻后在冰上靜置沉淀10分鐘。在4℃，12,000rpm離心10分鐘，除去上清，用70％乙醇洗DNA沉淀并真空抽干，然后重新溶解在200μl TE緩沖液中。取1μl樣品在0.8％瓊脂糖凝膠上進行電泳，以粗略確定pUC19質(zhì)粒DNA的濃度。
按如下程序及附圖16所示的方法構(gòu)建帶有1個增強子及一個35S啟動子的重組載體pGE35SP。在1.5ml Eppendoff管中加入2μl(約4μg)本實施例中所制備的pUC19質(zhì)粒DNA，2μl多用酶切緩沖液(multi-core buffer)(Promega公司)，10U限制性內(nèi)切酶SmaI(Promega公司，以下不再標(biāo)出)，加重蒸水至20μl總體積。將酶切反應(yīng)混合物于25℃水浴中保溫1.5小時。然后向該反應(yīng)體系中補加1μl限制性內(nèi)切酶HindIII(12U)，37℃保溫1.5小時后，65℃保溫20分鐘，以失活所用的限制性內(nèi)切酶。
然后，電泳回收pUC19 SmaI-HindIII大片斷，以去除SmaI-HindIII小片段對以后操作步驟的影響，將酶切后的DNA通過0.8％的瓊脂糖凝膠進行電泳，并在長波紫外燈(365nm)觀察DNA條帶的位置。切下含有約2.7Kb的DNA片段的膠塊。用凍融法回收該DNA片段，即先加200μl苯酚，液氮冷凍4分鐘，取出融化，混勻后再用液氮冷凍。如此反復(fù)四次。然后以12,000rpm離心10分鐘，吸取上層水相并再次用氯仿抽提一次。向所回收的約200μl上清中加入20μl 3M NaAc(pH4.8)和400μl無水乙醇，-20℃沉淀過夜。12,000rpm離心10分鐘，并用70％乙醇洗所得DNA沉淀，再以12,000rpm離心5分鐘。除去乙醇，真空抽干并用20μl重蒸水溶解沉淀的DNA。取1μl所回收的DNA，用DU70紫外分光光度計(Beckman公司)測260nm光吸收。經(jīng)計算，回收的DNA濃度為150ng/μl。然后將如此得到的載體DNA與所合成的2E-35S.P.片段相連接。在0.5ml Eppendoff管中進行如下連接反應(yīng)。反應(yīng)混合物包含14μl H2O，2μl連接酶10×緩沖液，1μl按上述方法所回收的載體DNA(約150ng)，2μl實施例2中所回收的1E-35S.P.DNA(約100ng)以及1.5μl T4 DNA連接酶(4.5U)(Promega公司)。連接反應(yīng)在18℃水浴中進行16～18小時。用所得到的連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
按下述方法制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。先用2ml LB培養(yǎng)基接種DH5α單菌落，并在37℃振蕩培養(yǎng)過夜。然后將DH5α菌體細胞轉(zhuǎn)入200ml LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)2～3小時，至OD600約為0.6。取出培養(yǎng)瓶并置冰上30分鐘。然后在無菌條件下將菌體懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管中，4℃，5,000rpm離心收集菌體細胞。然后加入40ml預(yù)冷的0.1M CaCl2，再次離心，去除上清液。加入8ml 0.1M CaCl2重新懸浮細胞沉淀，再加入1.2毫升甘油，混勻后按每管200μl分裝于1.5ml Eppendoff管中，置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 轉(zhuǎn)化時，取出三管感受態(tài)細胞，在冰上溶化后，一管加入10μl上述的連接產(chǎn)物；一管加入2μl連接時所用的經(jīng)SmaI和HindIII切過的pUC19載體DNA(陰性對照)；一管加入1μl未切的pUC19載體DNA(陽性對照)?；靹蚝笤诒戏胖眉s30分鐘。然后轉(zhuǎn)至42℃水浴中熱激90秒。再向各管中加入700μl液體LB培養(yǎng)基，在37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘，然后分別將將菌體懸浮液鋪敷在添加了100μg/ml氨芐青霉素的固體LB X-gal平板上(含800μgIPTG，600μg X-gal)，在37℃溫箱中保溫約18小時。保溫后，取出平板觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)陰性對照平板上幾乎沒有菌落，陽性對照平板上出現(xiàn)密集生長的藍色菌落。經(jīng)連接的DNA轉(zhuǎn)化的平板上出現(xiàn)許多白色的菌落。從該平板上選取白色菌落，接種于液體LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)12～18小時，然后小量提取質(zhì)粒DNA并用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI進行雙酶切鑒定。選擇酶切結(jié)果中出現(xiàn)2.7Kb和0.8Kb兩條DNA帶的克隆。如此得到定名為pGE35SP的重組質(zhì)粒(如圖16所示)。
接下來再將實施例2中經(jīng)PCR獲得的約380bp增強子DNA片段克隆到質(zhì)粒pGE35SP上，以構(gòu)建重組質(zhì)粒pG2E35SP。方法步驟如下在1.5ml Eppendoff管中進行如下酶切反應(yīng)5μl質(zhì)粒pG2E35SP(約10μg)，4μl酶切緩沖液G，限制性內(nèi)切酶AccI20U加雙蒸水至總體積為40μl。37℃保溫2小時，65℃保溫20分鐘。利用綠豆芽核酸酶(Mung Bean Nuclease，Promega公司)將反應(yīng)后的DNA的粘性未端切平。向酶切反應(yīng)體系中補加5μlM.B.10×緩沖液，1μl綠豆芽核酸酶(90U)，4μl H2O。37℃繼續(xù)保溫15分鐘。用等體積的苯酚、苯酚-氯仿、氯仿抽提純化反應(yīng)后的DNA，每次抽提后，均小心吸回上清液。然后加5μl3M NaAc(pH4.8)，用二倍乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗后，用17μl雙蒸水溶解DNA沉淀。向所得DNA沉淀中加入2μl酶切緩沖液B和1μl限制性內(nèi)切酶HindIII(16U)，于37℃反應(yīng)1小時。65℃加熱，20分鐘失活所用內(nèi)切酶之后，用2.0％瓊脂糖凝膠電泳回收約3.1kb的IindIII-AccI/M.B.大片段，并溶于20μl雙蒸水中。
接下來進行構(gòu)建重組質(zhì)粒pG2E35SP的連接反應(yīng)。在1.5mlEppendoff管中加入2μl所回收的pGE35SP HindIII-AccI/M.B.大片段(約100ng)，2μl實施例2中經(jīng)PCR而獲得的約380bp增強子DNA片段(約50ng)，2μl連接酶10×緩沖液，12.5μl雙蒸水，1.5μl T4 DNA連接酶(4.5U，Promega公司)。連接反應(yīng)在18℃進行16-18小時。仍按上述轉(zhuǎn)化方法，用所連接的DNA轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。所不同的是不需要在LB平板上加IPTG及X-gal。轉(zhuǎn)化后，提取質(zhì)粒DNA，選擇能切下約0.8kb的AccI-EcoRI片段的克隆。該重組質(zhì)粒定名為pG2E35SP。
然后采用雙脫氧法對所克隆上去的DNA片段進行序列分析，以確證所得到的重組質(zhì)粒攜帶有正確的雙倍增強子DNA序列。步驟如下將含有重組質(zhì)粒pG2E35SP的重組體細胞在添加有氨芐青霉素100μg/ml的LB固體平板上劃線。置37℃培養(yǎng)12～18小時后，選取單菌落并接種在5ml添加有氨芐青霉素100μg/ml的液體LB培養(yǎng)基中，置37℃振蕩培養(yǎng)12～18小時后，一部分做為菌種在4℃保存?zhèn)溆?。取大約1.2ml菌體懸浮液在1.5ml Eppendoff管中小量提取質(zhì)粒DNA(方法與實施例2中提取質(zhì)粒pUC19的方法相同)。并用苯酚以及氯仿抽提純化質(zhì)粒DNA。乙醇沉淀后，將DNA溶于20μl重蒸水中，作為測序的模板DNA。
按如下方法對模板DNA進行變性處理。取大約2μg待測序的質(zhì)粒DNA加H2O至32μl，再加入8μl 2M NaOH，輕輕混勻，于室溫(25℃)下放置10分鐘后，再加入7μl 3M NaAc(pH4.8)，4μlH2O和120μl無水乙醇，混勻并在冰上放置10分鐘。最后以12,000rpm離心10分鐘，除去上清，用70％乙醇將沉淀物洗滌兩次，真空抽干，并將殘留物重新溶解于10μl重蒸水中。然后加入2μl測序引物，2μl退火緩沖液(200mM Tris·HCl PH7.5，100mM MgCl2，250mM NaCl)，輕輕混勻，并瞬時離心。于65℃水浴中保溫5分鐘后，迅速轉(zhuǎn)至37℃水浴中保溫10分鐘，最后在室溫放置至少5分鐘，再次瞬時離心，完成模板DNA與引物的退火。
然后按下述程序完成測序反應(yīng)。在分別標(biāo)記A、C、G、T的四個Eppendoff管中分別加入2.5μl四種雙脫氧的終止反應(yīng)液(80uM dGTP，80uM dCTP，80uM dATP，80uM dTTP，8uMdd(A、C、G、T)TP，50mM NaCl)，置于37℃水浴中預(yù)熱。吸取2μl酶稀釋緩沖液，加到置于冰上的Eppendoff管中，向各管內(nèi)加入0.5μl測序用DNA聚合酶(Pharmacia公司)，混勻備用。立刻進行放射性同位素的標(biāo)記反應(yīng)，在上面得到的經(jīng)過退火后的含有變性模板及引物的管中(體積為14μl)加入3μl標(biāo)記混合液(180uM dGTP，dCTP，dATP，dTTP，50mM NaCl)，1μlα-32P標(biāo)記的dATP(10UCi)，以及2μl稀釋后的測序用T7DNA聚合酶，輕輕混勻后，室溫放置5分鐘。迅速向在37℃水浴中預(yù)熱的標(biāo)有A、C、G、T的四個管中分別加入4.5μl標(biāo)記反應(yīng)液，混勻、瞬時離心，于37℃放置5分鐘。然后向各管中分別加入5μl終止液(95％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚藍和0.05％二甲苯藍)，離心混勻，并于37℃放置2分鐘，以完成測序反應(yīng)。
使用DNA測序裝置(Bio-Rad公司)制備測序用的聚丙烯酰胺凝膠，并以聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行測序測定。取50ml膠液(每500ml含甲叉雙丙烯酰胺1.5g，丙烯酰胺28.5g，尿素240g，10×TBE緩沖液50ml)，加入180μl過硫酸銨和30μlTEMED(Sigma公司)，制備垂直板聚丙烯酰胺凝膠。在電泳裝置的上下槽中加入1×TBE作為電泳緩沖液(0.09M Tris-硼酸，100mM EDTA)，預(yù)電泳1小時，以使測序板溫度達到50℃左右。將上面制備好的待測樣品置于80～90℃水浴中變性2～3分鐘后，將樣品按C、A、T、G的順序分別加入到凝膠相鄰的上樣孔中，每個上樣孔中加2～3μl。電泳約2小時，溴酚藍走到板底部后，二次上樣，然后繼續(xù)電泳，以便讀出更多的序列。待二次上樣的溴酚藍再次走到板底部時，結(jié)束電泳。然后，用X-光片在-70℃冰箱中放射自顯影12～24小時。然后沖洗X光片，進行主序列的同源分析。下面所提及的序列分析均采用如上方法。
按下述程序及附圖18所示的步驟構(gòu)建攜帶有Ω序列的重組質(zhì)粒PGΩK。
在1.5ml Eppendoff管中進行如下酶切反應(yīng)2μl pUC19質(zhì)粒DNA(約4μg)，2μl酶切緩沖液E，12U BamHI，加雙蒸水至總體積20μl。將酶切反應(yīng)混合物置于37℃保溫1.5小時。向反應(yīng)后的混合物中加2μl NaAc溶液(3M pH4.8)，44μl無水乙醇，冰上放置10分鐘后，在4℃，12000rpm離心10分鐘。再用200μl 70％的乙醇洗所得DNA沉淀2次。真空抽干，除去乙醇，加入17μl雙蒸水溶解沉淀的DNA。再向管中加入2μl酶切緩沖液H，1μl PstI(12U)，于37℃繼續(xù)酶切1.5小時。65℃加熱，20分鐘將酶失活后，按上述回收pUC19 SamI-HindIII大片段的方法回收pUC19 BamHI-PstI大片段。接下來的連接反應(yīng)體系包含13μl H2O，2μl連接酶10×緩沖液，1μlpUC19 BamHI-PstI大片段(約100ng)，3μl所合成的Ω序列DNA片段(約50ng)，1μl(含3U)T4 DNA連接酶。將反應(yīng)物于16℃水浴中保溫16-18小時。然后用連接后的DNA轉(zhuǎn)化DH5α細胞。提取質(zhì)粒后，用HindIII及EcoRI進行雙酶切鑒定，選擇能切下約100bp小片段的克隆進行序列分析。將得到的正確的重組質(zhì)粒定名為pGΩK，然后按如下程序及附圖18所示的步驟構(gòu)建帶有5′端非編碼區(qū)調(diào)控序列的重組載體pG2E35SPΩ。用本實施例中回收pUC19 SmaI-HindIII 2.7kb大片段的方法，用SmaI及BamHI雙切重組質(zhì)粒DNA pG2E35SP，并回收pG2E35SP 3.5kb大片段。作為構(gòu)建pG2E35SPK的載體。
用HindIII酶切重組載體pGΩk的反應(yīng)體系包括5μl質(zhì)粒pGΩk DNA(20ug)，4μl酶切反應(yīng)緩沖液E，45U HindIII，加H2O至總體積40μl，37℃反應(yīng)2小時。65℃加熱20分鐘失活內(nèi)切酶。利用綠豆芽核酸酶(Mung Bean Nuclease，Promega公司)將反應(yīng)后的線性DNA的HindIII粘性未端切平。向酶切反應(yīng)體系中補加5μl M.B.10×緩沖液，1μl綠豆芽核酸酶(90U)，4μlH2O。37℃繼續(xù)保溫15分鐘。用等體積的苯酚、苯酚-氯仿、氯仿抽提純化反應(yīng)后的DNA，每次抽提后，均小心吸回上清液。然后加5μl 3M NaAc(pH4.8)，用二倍乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗后，用17μl雙蒸水溶解DNA沉淀。向所得DNA沉淀中加入2μl酶切緩沖液E和1μl限制性內(nèi)切酶BamHI(16U)，于37℃反應(yīng)1小時。65℃加熱20分鐘失活所用酶后，用2.0％瓊脂糖凝膠電泳回收約100bp的BamHI-HindIII/M.B.小片段，并溶于20μl雙蒸水中。
接下來進行構(gòu)建重組質(zhì)粒pG2E35SPK的連接反應(yīng)。在1.5mlEppendoff管中加入2μl所回收的pG2E35SP BamHI-SmaI大片段(約100ng)，4μl所回收的pGΩK BamHI-HindIII/M.B.小片段約50ng，2μl連接酶10×緩沖液，10.5μl雙蒸水，1.5μl T4 DNA連接酶(4.5U，Promega公司)。連接反應(yīng)在18℃進行16-18小時。仍按上述的轉(zhuǎn)化方法，用所連接的DNA轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。所不同的是不需要在LB平板上加IPTG及X-gal。轉(zhuǎn)化后，提取質(zhì)粒DNA，用PstI切成線性約3.6kb的克隆。該重組質(zhì)粒定名為pG2E35SΩK。如圖17所示。
2.包括3′端非編碼區(qū)調(diào)控序列的重組質(zhì)粒pGUTSP4A的構(gòu)建在1.5ml Eppendoff管中加入2μl(約4μg)本實施例中所制備的pUC19質(zhì)粒DNA，2μl多用酶切緩沖液(multi-corebuffer)(Promega公司)，限制性內(nèi)切酶SacI及HincII各10U，加重蒸水至20μl總體積。將酶切反應(yīng)混合物于37℃水浴中保溫1.5小時。65℃保溫20分鐘，以失活所用的限制性內(nèi)切酶。用0.8％瓊脂糖凝膠電泳回收2.7kb的pUC19 SacI-HincII大片段。連接反應(yīng)體系包含13μl H2O，2μl連接酶10×緩沖液，1μl pUC19 SacI-HincII大片段(約100ng)，3μl實施例2中合成的UT序列DNA片段(約50ng)，1μl(約3U)T4 DNA連接酶。將反應(yīng)混合物于16℃水浴中保溫16-18小時。然后仍按上述轉(zhuǎn)化方法，用連接后的DNA轉(zhuǎn)化DH5α細胞。提取質(zhì)粒后，選擇用XhoI能切開的克隆并進一步進行序列分析，得到了正確的帶有UTDNA片段的重組質(zhì)粒，并定名為pGUT。然后按下述程序構(gòu)建重組載體pGUTA在1.5ml Eppendoff管中加入2μl(約2μg)如上制備的pGUT質(zhì)粒DNA，2μl多用酶切緩沖液，限制性內(nèi)切酶SacI及HpaI各6U，加重蒸水至20μl總體積。將酶切反應(yīng)混合物于37℃水浴中保溫1.5小時。65℃保溫20分鐘。用0.8％瓊脂糖凝膠電泳回收2.74kb的pGUT SacI-HpaI大片段。接下來的連接反應(yīng)體系包含13μl H2O，2μl連接酶10×緩沖液，2μl所回收的pGUT SacI-HpaI大片段(約100ng)，2μl實施例2中所合成的Poly(1A)序列DNA片段(約50ng)，1μl(約3U)T4 DNA連接酶。將反應(yīng)物于16℃水浴中保溫16-18小時。然后仍按上述轉(zhuǎn)化方法，選擇轉(zhuǎn)化DH5α細胞。提取質(zhì)粒后，進一步進行序列分析，選擇正確地加入了Poly(A)DNA片段的重組質(zhì)粒，并定名為pGUTA。如圖19中所示。
然后構(gòu)建重組載體pGUT2A。用DraI和SacI雙酶切重組質(zhì)粒pGUTA的步驟為在1.5ml Eppendoff管中加入質(zhì)粒DNA pGUTA2μl(約2μg)，2μl緩沖液B，1μl(10U)限制性切酶DraI，加雙蒸水至總體積20μl。37℃切割1.5小時后用乙醇沉淀，用17μl雙蒸水溶解沉淀的DNA并補加2μl緩沖液J，1μl SacI(10U)。37℃繼續(xù)保溫1.5小時。65℃失活所用酶后，電泳回收pGUTA的約2.77kb DraI-SacI大片段。然后再連接上一個實施例2中所合成的一端為平末端，一端為SacI粘末端的Poly(1A)序列DNA片段。通過序列分析得到正確的插入了二個Poly(1A)序列DNA片段的重組質(zhì)粒pGUT2A。用上面DraI和SacI雙酶切重組質(zhì)粒pGUTA的方法雙酶切重組質(zhì)粒pGUT2A，并回收約2.79kb的pGUT2A DraI-SacI大片段，用于構(gòu)建重組質(zhì)粒pGUT4A。同時用上面HpaI和SacI雙酶切重組質(zhì)粒pGUT的方法大量雙酶切重組質(zhì)粒pGUT2A并回收pGUT2A的約50bp SacI-HpaI片段。然后連接到所回收的pGUT2A的約2.79kb DraI-SacI大片段上，通過序列分析鑒定獲得重組質(zhì)粒pGUT4A。如圖19中所示。
接下來進行重組質(zhì)粒pGUTSP4A的構(gòu)建。在1.5ml Eppendoff管中加入質(zhì)粒DNA pGUTSP4A 2μl(約2μg)，2μl緩沖液J，1μl(6U)HpaI限制性切酶，并加雙蒸水至總體積20μl。37℃保溫1.5小時，65℃再保溫20分鐘。其后的連接反應(yīng)體系包含13μl H2O，2μl連接酶10×緩沖液，1μl得自pGUT4A的HpaI-HpaI片段(約100ng)，3μl實施例2中合成的SP序列DNA片段(約50ng)，0.5μl(含1.5U)T4 DNA連接酶。將反應(yīng)混合物于16℃水浴中保溫16-18小時。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并選擇能用EcoRI、HindIII切下約230bp DNA片段的克隆并進行序列分析。將攜帶有整個3′端非編碼區(qū)調(diào)控序列的重組質(zhì)粒定名為pGUTSP4A。該重組質(zhì)粒的構(gòu)建，如圖19中所示。
實施例四攜帶GFM基因的重組載體的構(gòu)建為構(gòu)建帶有GFM基因的重組質(zhì)粒pGBPB.t.F1-9，共進行下述的16次克隆連接。
1.重組質(zhì)粒pGB-1的構(gòu)建(如圖20所示)。
在1.5ml Eppendoff管中進行如下酶切反應(yīng)5μl實施例1中制備的pUC19質(zhì)粒DNA(約10μg)，5μl多用酶切緩沖液，雙蒸水38μl，2μl限制性內(nèi)切酶HincII(20U)。37℃保溫2小時，65℃保溫20分鐘。將所得的用HincII切開的線性pUC19DNA保存待用。取酶切后的DNA用乙醇沉淀，70％乙醇洗過后，溶于17.5μlH2O中。向該DNA溶液中補2μl 10×緩沖液E，0.5μl PstI(5U)。37℃保溫1小時，再65℃保溫20分鐘。用實施例1中所述的電泳回收法回收pUC19的PstI-HincII大片段，并將實施例3中制備的pUC19與B.t.F-1片段(0.2kb)退火連接.連接體系包含13μl H2O，2μl連接酶10×緩沖液，2μl所回收的pUC19PstI-HincII大片段(100ng)，2μl合成的B.t.F-1片段(約50ng)，以及1.5μl T4 DNA連接(4.5U，Promega公司)。
18℃連接16-18小時后，按實施例1中的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞.提取質(zhì)粒并用HindIII、EcoRI雙酶切鑒定，選出能切下約200bp的克隆，并進一步進行序列分析。將獲得的帶有正確插入序列的重組質(zhì)粒定名為pGB-1。
2.重組質(zhì)粒pGB-2的構(gòu)建(如圖21所示)構(gòu)建重組質(zhì)粒pGB-2的連接反應(yīng)如下0.5μl步驟1中制備的用HincII切開的pUC19載體DNA(約100ng)，2μl實施例3合成的B.t.F-2 DNA片段(0.25kb，100ng)，1μl T4 DNA連接酶緩沖液及T4 DNA連接酶(3U)和6.5μl H2O。連接反應(yīng)在12℃進行6小時。同樣，重復(fù)步驟1中的轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的鑒定。選出能切下約250bp的克隆并進行序列分析。將獲得的帶有正確插入序列并且NsiI位點位于載體HindIII一側(cè)的重組質(zhì)粒，并將其定名為pGB-2。
3.重組質(zhì)粒pGB-3的構(gòu)建(如圖22所示)構(gòu)建重組質(zhì)粒pGB-2的連接反應(yīng)如下0.5μl步驟1中制備的用HincII切開的pUC19載體DNA，向其中補加0.5μl(5U)限制性內(nèi)切酶XbaI。37℃酶切2小時后，將酶失活，電泳回收pUC19的2.7kb XbaI-HincII大片段。構(gòu)建重組質(zhì)粒pGB-3的連接反應(yīng)如下12.5μl H2O，2μl 10×連接緩沖液，2μl回收的pUC19 HincII-XbaI大片段(約100ng)，2μl所合成的B.t.F-3片段(約50ng)，以及1.5μl T4DNA連接酶(4.5U，Promega公司)。連接反應(yīng)在18℃進行16-18小時。選擇能用EcoRI、HindIII切下約190bp DNA片段的克隆并進行序列分析。將該重組質(zhì)粒定名為pGB-3。
4.重組質(zhì)粒pGB-4的構(gòu)建(如圖23所示)載體pUC19 2.7kb XbaI-EcoRI大片段的獲得采用如下酶切反應(yīng)體系2μl質(zhì)粒pUC19 DNA(約4μg)，2μl多用酶切緩沖液，各10U限制性內(nèi)切酶XbaI及EcoRI，加雙蒸水至20μl總體積。37℃反應(yīng)1.5小時。電泳回收2.7kb DNA片段，并進行如下連接反應(yīng)13.5μl H2O，2μl 10×連接緩沖液，2μl所回收的pUC19 XbaI-EcoRI大片段DNA(約100ng)，2μl所合成的B.t.F-4片段(約75ng)，T4DNA連接酶0.5μl(1.5U)。于16℃保溫18-22小時。獲得定名為pGB-4的重組質(zhì)粒。
5.重組質(zhì)粒pGB1-2的構(gòu)建(如圖24所示)用NsiI切割重組質(zhì)粒pGB-1及pGB-2。酶切反應(yīng)體系為質(zhì)粒DNA 4μl(約5μg)，2μl緩沖液D，1μl(10U)限制性切酶NsiI，加雙蒸水至總體積20μl。37℃切割1.5小時后用乙醇沉淀，并用70％乙醇洗沉淀2-3次，用17μl雙蒸水溶解同時補加2μl緩沖液B，1μl(10U)限制性內(nèi)切酶HindIII，37℃1.5小時，然后65℃保溫15分鐘。用電泳回收方法分別制備pGB-1的2.7kb NsiI-HincII大片段和pGB-2 250bp NsiI-HincII小片段。二者退火連接以構(gòu)建重組質(zhì)粒pGB1-2。連接反應(yīng)體系包含2μl pGB1 NsiI-HincII大片段(約50ng)，2μl緩沖液，1.5UT4 DNA連接酶，加H2O到總體積20μl。將反應(yīng)物在15℃保溫16-18小時。轉(zhuǎn)化大腸桿菌并鑒定質(zhì)粒DNA后，選出能被切下約0.45kb的EcoRI-HindIII小片段的克隆，并定名為pGB1-2。
6.重組質(zhì)粒pGB1-3的構(gòu)建(如圖25所示)采用HincII及XbaI分別雙酶切重組質(zhì)粒pGB1-2及pGB-3。反應(yīng)體系均為4μl質(zhì)粒DNA(約4μg)，2μl多用酶切緩沖液，限制性內(nèi)切酶HincII及XbaI各10U。然后分別回收pGB1-2的3.15kb XbaI-HincII大片段及pGB-3的0.2kb XbaI-HincII小片段。用于以下的的連接反應(yīng)10.5μl pGB-3的XbaI-HincII小片段(約50ng)，2μl連接緩沖液，0.5μl T4 DNA連接酶(1.5U)。16℃連接16-18小時。轉(zhuǎn)化(涂敷的LB平板不需加IPTG及X-gal)大腸桿菌并鑒定質(zhì)粒DNA后，選出能切下0.65kb的HindIII-EcoRI片段的克隆，并命名為pGB1-3。
7.重組質(zhì)粒pGB1-4的構(gòu)建(如圖26所示)采用XbaI及EcoRI分別雙酶切重組質(zhì)粒pGB1-3及pGB-4。反應(yīng)體系均為4μl質(zhì)粒DNA(約4μg)，2μl多用酶切緩沖液，限制性內(nèi)切酶EcoRI及XbaI各10U。然后分別回收pGB1-3的3.35kb XbaI-EcoRI大片段及pGB-4的0.23kb XbaI-EcoRI小片段。用于以下的的連接反應(yīng)10.5μl pGB-3的XbaI-HincII小片段(約50ng)，2μl連接緩沖液，0.5μl T4 DNA連接酶(1.5U)。14℃連接18-20小時。按上述方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌并鑒定質(zhì)粒DNA后，選擇能切下約0.9kb的HindIII-EcoRI片段的克隆，獲得定名為pGB1-4的重組質(zhì)粒。
8.重組質(zhì)粒pGPB.t.F1-4的構(gòu)建(如圖27所示)用PstI分別酶切質(zhì)粒pG2E35SΩK和pGB1-4。酶切體系包含4μl質(zhì)粒DNA(約4μg)，2μl緩沖液H，0.5μl PstI(6U)，加H2O至總體積20μl。37℃保溫1小時后，用乙醇沉淀。70％乙醇洗2-3次，所得沉淀并再用17.5μl H2O重新溶解。分別向兩管DNA溶液中補加2μl緩沖液E和0.5μl限制性內(nèi)切酶HindIII(5U)，37℃繼續(xù)酶切1小時。分別電泳回收pG2E35SΩK的0.8kbHindIII-PstI小片段和pGB1-4的3.6kb的HindIII-PstI大片段。用于下面的連接反應(yīng)。在1.5ml Eppendoff管中加入6μl H2O，1.5μl pGB1-4的HindIII-PstI大片段(約100ng)，1μlpG2E35SPΩK的0.8kb HindIII-PstI小片段約60ng，1μl連接酶緩沖液，0.5μl T4 DNA連接酶(1.5U)。于16℃保溫16-18小時。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細胞并選擇能切下約1.5kb KindIII-EcoRI片段的克隆，命名為pGPB.t.F1-4。
9.重組質(zhì)粒pGB-5的構(gòu)建(如圖28所示)制備載體pGUC21質(zhì)粒DNA的方法同實施例1中制備質(zhì)粒DNApUC19的方法。帶有質(zhì)粒pGUC21的細菌由本實驗室保存。
在1.5ml的Eppendoff管中進行如下的酶切反應(yīng)5μlpGUC21質(zhì)粒DNA(約10ng)，緩沖液G 4μl，限制性內(nèi)切酶AccI2μl(20U)，加雙蒸水至總體積40μl。37℃保溫1小時。然后用乙醇沉淀反應(yīng)后的線性DNA，再用70％乙醇洗2-3次，并重新溶解于20μl H2O中。取10μl上面所得到的pGUC21質(zhì)粒DNA，向其中加入7μl H2O，2μl緩沖液J及1μl限制性內(nèi)切酶HpaI(10U)。置37℃酶切2小時。用電泳回收pGUC21約2.7kb HpaI-AccI大片段DNA，用于如下的連接反應(yīng)5.5μl H2O，2μlpGUC21 HpaI-AccI大片段(約100ng)，1μl如上制備的B.t.F-5片段(約50ng)，1μl連接酶緩沖液，0.5μl T4 DNA連接酶(1.5U)。于16℃連接16-18小時。按上述方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌并鑒定質(zhì)粒DNA后，選出能切下約200bp HindIII-EcoRI小片段的克隆，進一步經(jīng)過序列分析，將攜帶有正確插入片段的重組質(zhì)粒定名為pGB-5。
10.重組質(zhì)粒pGB-6的構(gòu)建(如圖29所示)取10μl步驟9中所得到的經(jīng)AccI切開的線性pGUC21質(zhì)粒DNA，在其中加入2μl緩沖液D，7μl H2O以及1μl NcoI(10U)，37℃保溫2小時?；厥誴GU21的2.7kb AccI-NcoI大片段DNA，進一步進行如下連接反應(yīng)5.5μl H2O，2μl pGUC21，NcoI-AccI大片段(約100ng)，1μl如上制備的B.t.F-6片段約(50ng)，1μl連接酶10×緩沖液，0.5μl T4 DNA連接酶(1.5U)。16℃連接16-18小時。按上述方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌并鑒定后，選出能切下約230bp的HindIII-EcoRI片段的克隆，進一步進行序列分析，所獲得重組質(zhì)粒定為pGB-6。
11.重組質(zhì)粒pGB6-7的構(gòu)建(如圖30所示)在1.5ml Eppendoff管中加入4μl如上制得的pGB-6質(zhì)粒DNA(約4μg)，2μl緩沖液H，0.5μl限制性內(nèi)切酶(5U)并加雙蒸水至總體積20μl。37℃保溫1小時，然后用乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗2-3次后，重新溶解沉淀的DNA于17.5μl H2O中，向其中加入2μl緩沖液D，0.5μl NcoI(5U)，37℃繼續(xù)酶切1小時，然后電泳回收pGB-6的2.93kb PstI-NcoI大片段。構(gòu)建重組質(zhì)粒pGB6-7的連接反應(yīng)包含5.5μl H2O，2μl所回收的pGB-6 PstI-NcoI大片段(約100ng)，1μl B.t.F-7片段(約50ng)，1μl T4 DNA連接酶10×緩沖液，0.5μl T4 DNA連接酶(0.5U)。16℃連接16-18小時后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并選出能切下約160bp HindIII-EcoRI片段的克隆。選擇恰當(dāng)?shù)臏y序引物進行序列分析。將所得到的攜帶有正確插入序列的重組質(zhì)粒定名為pGB6-7。
12.重組質(zhì)粒pGB5-7的構(gòu)建(如圖31所示)用PstI分別酶切質(zhì)粒pGB5和pGB6-7。酶切體系包含4μl質(zhì)粒DNA(約4μg)，2μl緩沖液H，0.5μl PstI(6U)，加H2O至總體積20μl。37℃保溫1小時后，用乙醇沉淀。70％乙醇洗2-3次，所得沉淀再用17.5μl H2O重新溶解。分別向兩管DNA溶液中補加2μl緩沖液G和0.5μl限制性內(nèi)切酶AccI(5U)。37℃繼續(xù)酶切1小時。分別電泳回收pGB5的2.88kb AccI-PstI大片段和pGB6-7的0.36kb AccI-PstI小片段。用于下面的連接反應(yīng)。在1.5ml Eppendoff管中加入6μl H2O，1.5μl pGB52.88kb AccI-PstI大片段(約100ng)，1μl pGB6-7的0.36kbAccI-PstI小片段(約60ng)，1μl連接酶緩沖液，0.5μl T4DNA連接酶(1.5U)。于16℃保溫16-18小時。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細胞并選擇能切下約0.54kb HindIII-EcoRI片段的克隆，并命名為pGB5-7。
13.重組質(zhì)粒pGB-8的構(gòu)建(如圖32所示)在1.5ml Eppendoff管中加入2μl pGUC21質(zhì)粒DNA(約4μg)，2μl緩沖液H，0.5μl PstI(5U)，加雙蒸水至總體積20μl。37℃酶切1小時，用乙醇沉淀，并用70％乙醇洗所得沉淀的DNA 2-3次，重新將DNA溶解于17μl H2O中。向其中加入2μl緩沖液J，0.5μl限制性內(nèi)酶切SmaI(5U)。于37℃繼續(xù)保溫1.5小時。然后電泳回收pGUC21的2.7kb PstI-SmaI大片段。取2μl(約100ng)所回收的DNA用于構(gòu)建重組質(zhì)粒pGB-8的連接反應(yīng)。反應(yīng)體系中含有5μl H2O，1μl如上合成的B.t.F-8(約50ng)，1μl 10×連接酶緩沖液，1μl T4 DNA連接酶(3U)。在18℃保溫16-18小時。連接后，仍用上面的轉(zhuǎn)化和鑒定方法，選擇能切下約200bp HindIII-EcoRI小片段的克隆。通過序列分析，得到攜帶有正確插入序列的被定名為pGB-8的重組載體。
14.重組質(zhì)粒pGB8-9的構(gòu)建(如圖33所示)用SmaI和EcoRI雙切重組質(zhì)粒pGB-8在1.5ml的Eppendoff管中含有4μl pGB-8質(zhì)粒DNA(約4μg)，2μl多用酶切10×緩沖液，1μl限制性內(nèi)切酶SmaI(10U)，加雙蒸水到總體積20μl。于25℃保溫1.5小時后，向反應(yīng)體系中補加1μl限制性內(nèi)切酶SacI，于37℃繼續(xù)保溫1小時，然后在65℃保溫20分鐘。電泳回收pGB-8的2.88kb SmaI-SacI大片段。在1.5mlEppendoff管中加入5μl H2O，2μl所回收的pGB-8 SmaI-SacI大片段DNA(約100ng)，如上合成制備的B.t.F-9片段1μl(約50ng)，1μl 10×連接酶緩沖液，1μl T4 DNA聚合酶(3U)。18℃連接16-18小時。然后通過轉(zhuǎn)化鑒定得到能切下約0.4kb的HindIII-EcoRI片段的克隆，該克隆定名為pGB8-9。
15.重組質(zhì)粒pGB5-9的構(gòu)建(如圖34所示)按如下步驟分別對重組質(zhì)粒pGB5-7和pGB8-9進行雙酶切。在1.5ml Eppendoff管中加入4μl質(zhì)粒DNA(約4μg)，2μl緩沖液J，1μl限制性內(nèi)切酶SacI(10U)，加雙蒸水至20μl。37℃保溫1.5小時后，向反應(yīng)體系中加入2μl緩沖液H，1μl限制性切酶PstI(10U)。37℃繼續(xù)反應(yīng)1.5小時。65℃保溫20分鐘后，分別電泳回收pGB5-7的3.24kb PstI-SacI大片段和pGB8-9的0.42kb PstI-SacI小片段。然后將這兩個片段退火連接。反應(yīng)體系中包含3.5μl H2O，1μl pGB5-7的3.24kb PstI-SacI大片段，(約100ng)，4μl pGB8-9的0.42kb PstI-SacI小片段的(約50ng)，1μl連接酶緩沖液，0.5μl T4 DNA連接酶。在16℃保溫16-18小時。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞并酶切鑒定所獲得的重組克隆，選擇能正確切下約0.96kb HindIII-EcoRI片段的克隆并定名為pGB5-9。
16.重組質(zhì)粒pGBPB.t.F1-9的構(gòu)建(如圖35所示)先用HindIII和HpaI雙酶切重組質(zhì)粒pGB5-9，并電泳回收約3.6kb的HindIII-HpaI大片段DNA。酶切的反應(yīng)體系包含pGB5-9質(zhì)粒DNA 2μl(約2μg)，2μl多用酶切緩沖液，HindIII及HpaI各5U，加H2O至總體積20μl。37℃保溫2小時。對重組質(zhì)粒pGBPB.t.F1-4進行如下操作先用EcoRI將該質(zhì)粒切開，再用綠豆芽核酸酶將切開的DNA的末端補平。進而用HindIII酶切并回收1.8kb HindIII-EcoRI/M.b.片段。具體操作步驟為在1.5mlEppendoff管中加入10μl pGBPB.t.F1-4質(zhì)粒DNA(約10μg)，5μl緩沖液H，2μl限制性內(nèi)切酶EcoRI(24U)，加雙蒸水至總體積50μl。37℃酶切1.5小時。65℃處理20分鐘。向反應(yīng)混合物中加入6μl綠豆芽核酸酶10×緩沖液，3.5μl H2O，0.5μl綠豆芽核酸酶(45U)。37℃保溫15分鐘，然后按實施例4中綠豆芽核酸酶處理后的操作步驟純化、沉淀并重新用17μl H2O溶解所得到的DNA。向其中加入2μl緩沖液E，1μl限制性內(nèi)切酶HindIII(10U)，并于37℃保溫1小時。65℃加熱20分鐘失活所用限制性內(nèi)切酶后，用0.8％瓊脂糖凝膠電泳回收約1.8kb的HindIII-EcoRI/M.B.片段。接下來的連接反應(yīng)體系包含5μl H2O，1μl pGB5-9的3.66kb HindIII-HpaI DNA(約100ng)，2μl 1.8kb的pGBPB.t.F1-4的HindIII-EcoRI/M.B.DNA片段(約150ng)，1μl連接酶緩沖液，1μl T4 DNA連接酶(20U)。18℃連接18-20小時。然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。用PstI酶切鑒定所得到的重組體，選擇能切下約1.2kb PstI-PstI片段的克隆，并定名為pGBPB.t.F1-4。實施例五.植物表達載體的制備1.質(zhì)粒pGB.t.的構(gòu)建(如圖36所示)取質(zhì)粒pGBPB.t.F1-9 5μg，3.5μl限制性內(nèi)切酶EcoRI(20U/μl)(Promega公司)，3.5μl EcoRI 10×酶切緩沖液，用重蒸水定容總體積至35μl。37℃水浴保溫1.5小時后補加2μ1 CIP(堿性磷酸酶，Boehringer Bannheim公司，1U/μl)，CIP10×緩沖液(Boehringer Mannheim公司)10μl，重蒸水53μl。37℃水浴保溫2小時。之后加2μl EDTA終止反應(yīng)，并用等體積苯酚、苯酚/氯仿及氯仿/異戊醇各抽提一次，最后水相加1/10體積3M NaAc(pH4.8)及2.5體積無水乙醇，混合后-20℃放置數(shù)小時。4℃下12000rpm離心10分鐘。沉淀物用冰冷的70％乙醇洗后冷凍抽干，并溶于適量無菌重蒸水中。
3′HindIII接頭序列設(shè)計如下AATTCAAGCTT。按上文所述文法合成該寡核苷酸片段并溶于適量重蒸水中，置94℃水浴10分鐘后使其緩慢冷卻至室溫，以使單鏈相互退火成雙鏈的3′HindIII接頭。取1μg退火產(chǎn)物，T4多聚核苷酸激酶(8U/μl，Promega公司)1.5μl，ATP(6mmol/L，Promega公司)，1.5μl，多聚核苷酸激酶10×緩沖液(Promega公司)1.5μl，用重蒸水定容總體積至15μl。37℃水浴保溫0.5小時。之后65℃水浴0.5小時滅活激酶。
取質(zhì)粒pGBPB.t.F1-9的EcoRI酶切并沉淀后的DNA 0.1μg，3′HindIII接頭加磷后混合物0.1μg，dATP(5mmol/L，Promega公司)1μl，T4 DNA連接酶(6U/μl，華美公司)1μl，T4 DNA連接酶10×緩沖液(華美公司)1μl，用重蒸水定容至總體積10μl，并于16℃水浴中保溫過夜。之后用該連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103菌株(本室保存)感受態(tài)細胞。
挑取已轉(zhuǎn)化的菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)，并按上述方法提取質(zhì)粒DNA。用HindIII酶切篩選陽性克隆體，瓊脂糖電泳可見約3kb的片段，從而得到質(zhì)粒pGB.t.。
2.質(zhì)粒pGB4AB的構(gòu)建(如圖37所示)取質(zhì)粒pGB.t.DNA 2μg，限制性內(nèi)切酶XhoI(華美公司，40U/μl)2μl，XhoI酶切10×緩沖液(華美公司)2μl，加重蒸水至總體積20μl。37℃水浴保溫1.5小時后，取2μl反應(yīng)混合物用于1％瓊脂糖凝膠電泳以觀察酶切情況，余下18μl反應(yīng)混合物加入1.8μl 3M NaAc(pH4.8)，40μl無水乙醇，混合后置-20℃沉淀。4℃下12000rpm離心10分鐘。用冰冷的70％乙醇洗沉淀后冷凍抽干。將沉淀物溶于適量無菌重蒸水中，加入2.5μl限制性內(nèi)切酶SacI(華美公司，20U/μl)，2.5μl SacI 10×酶切緩沖液(華美公司)，用重蒸水補加至25μl的反應(yīng)體積，37℃水浴保溫1.5小時。65℃水浴保溫10分鐘滅活SacI后加入2.5μ1 3M NaAc(pH4.8)，55μl無水乙醇，混合后置-20℃沉淀。4℃下12000rpm離心10分鐘。用冰冷的70％乙醇洗沉淀物后冷凍抽干。沉淀溶于10μl無菌重蒸水中。從pGUT4A質(zhì)粒DNA中，回收XhoI-SacI 3′端非編碼片段約0.3μg，加入T4多聚核苷酸激酶(8U/μl，Promega公司)1.5μl，ATP(6mmol/L，Promega公司)1.5μl，多聚核苷酸激酶10×緩沖液(Promega公司)1.5μl，用重蒸水定容至總體積15μl，37℃水浴保溫0.5小時。保溫后65℃水浴0.5小時以滅活激酶。
取質(zhì)粒pG4AB經(jīng)XhoI和SacI酶切并沉淀后得到的懸浮液1μl(約含DNA0.1μg)，加入磷酸化的3′-非編碼片段混合液7μl，T4 DNA連接酶(6U/μl，華美公司)1μl，T4 DNA連接酶10×緩沖液(華美公司)1μl。16℃水浴保溫過夜。之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103菌株(本室保存)感受態(tài)細胞。
挑取已被轉(zhuǎn)化的菌落接種培養(yǎng)后提取質(zhì)粒方法如上所述。用XhoI及SacI按本實例所述的方法酶切鑒定重組質(zhì)粒。經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)約230bp片段者即為陽性克隆，成功構(gòu)建了質(zhì)粒pG4AB。
3.質(zhì)粒pGBI4AB的構(gòu)建(圖38所示)取質(zhì)粒pG4AB 2μg，限制性內(nèi)切酶HindIII(華美公司，10U/μl)2.5μl，HindIII酶切10×緩沖液(華美公司)2.5μl，加重蒸水至總體積25μl。37℃水浴保溫2小時，之后進行1％瓊脂糖凝膠電泳以回收3.2kb片段，并用上文所述的方法回收及純化DNA。最后將DNA沉淀物溶于適量無菌重蒸水中。
取質(zhì)粒pBI121.1(本室保存)2μg，限制性內(nèi)切酶HindIII(10U/μl，華美公司)2μl，HindIII酶切10×緩沖液(華美公司)2μl，用重蒸水補至20μl。37℃水浴保溫2小時。取2μl反應(yīng)混合物用于0.7％瓊脂糖凝膠電泳以檢查酶切結(jié)果，余下的18μl混合物中加入1.8μl 3M NaAc(pH4.8)，40μl無水乙醇，混合后置-20℃沉淀。12000rpm，4℃離心10分鐘。用冰冷的70％乙醇洗沉淀物，冷凍抽干后重新懸浮于適量無菌重蒸水中。
取經(jīng)HindIII消化后回收的質(zhì)粒pBI121.1 0.2μg，經(jīng)電泳回收的約3.2kb片段0.2μg，T4 DNA連接酶(6U/μl，華美公司)1μl，T4 DNA連接酶10×緩沖液(華美公司)1μl，用重蒸水定容至10μl，并于16℃水浴中保溫過夜。之后用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103菌株(本室保存)感受態(tài)細胞。
挑取已轉(zhuǎn)化的菌落接種培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。用HindIII酶切鑒定重組質(zhì)粒。在1％瓊脂糖凝膠電泳上觀察到約3.2kb片段，從而得到成功構(gòu)建質(zhì)粒pGBI4AB。
4.質(zhì)粒pGBI4A2B的構(gòu)建(如圖39所示)取質(zhì)粒pG4AB 30μg，限制性內(nèi)切酶HindIII(華美公司，20U/μl)40μl，HindIII酶切10×緩沖液(華美公司)40μl，加重蒸水補足總體積400μl。37℃水浴保溫1.5小時后，取3μl反應(yīng)液用于1％瓊脂糖凝膠電泳以檢查酶切結(jié)果，在余下的反應(yīng)混合物加入40μl 3M NaAc(pH4.8)，1100μl無水乙醇，混合后置-20℃沉淀。12000rpm于4℃離心10分鐘。用冰冷的70％乙醇洗沉淀，將沉淀物冷凍抽干后懸浮于208μl無菌蒸餾水中。向懸浮液中加入限制性內(nèi)切酶EcoRI(20U/μl，華美公司)36μl后，EcoRI酶切10×緩沖液(華美公司)36μl。37℃水浴保溫1.5小時。向反應(yīng)混合物中加36μl 3M NaAc(pH4.8)，900μl無水乙醇，混勻后置-20℃沉淀。4℃下12000rpm離心10分鐘。用冰冷的70％乙醇洗沉淀，將沉淀物冷凍抽干并重新懸浮于16μl無菌重蒸水中。向懸浮液中加入2μl T4 DNA連接酶(6U/μl，華美公司)，2μl T4 DNA連接酶10×緩沖液(華美公司)后，于16℃水浴保溫過夜。向連接混合物中加入限制性內(nèi)切酶EcoRI(20U/μl，華美公司)5μl，EcoRI酶切10×緩沖液(華美公司)5μl，重蒸水20μl，于37℃水浴中保溫1.5小時。對反應(yīng)混合物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收約6.4kb的大片段。將回收后純化的DNA沉淀物重新懸浮于4μl無菌重蒸水中。
取質(zhì)粒pBI121.1(本室保存)3μg，加入限制性內(nèi)切酶EcoRI(20U/μl，華美公司)0.5μl，EcoRI酶切10×緩沖液(華美公司)2μl，用重蒸水定容至20μl并37℃水浴保溫1.5小時。保溫后向其中加入小牛堿性磷酸酶(CIP，1U/μl，BoehringerMannheim公司)0.5μl，CIP 10×緩沖液(Boehringer Mannheim公司)10μl，重蒸水70μl，于37℃水浴保溫1小時。之后加入2μl 0.5M EDTA終止反應(yīng)。分別用苯酚、苯酚/氯仿及氯仿/異戊醇抽提水相。向水相內(nèi)加入1/10體積3M NaAc(pH4.8)及2體積的無水乙醇，混勻后置-20℃沉淀。于4℃下12000rpm離心10分鐘。沉淀用冰冷的70％乙醇洗過。并冷凍抽干后，懸于20μl重蒸水中。
取4μl酶切并沉淀后懸浮的質(zhì)粒pBI121.1，加入4μl回收的6.4kb大片段，1μl T4 DNA連接酶(6U/μl，華美公司)，1μlT4 DNA連接酶10×緩沖液后。16℃水浴保溫過夜。用連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。挑取菌落接種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。用EcoRI酶切鑒定重組質(zhì)粒，并在0.8％瓊脂糖凝膠電泳圖譜上可觀察到6.4kb片段，結(jié)果表明已成功構(gòu)建了質(zhì)粒pGBI4A2B。實施例六用編碼殺蟲蛋白質(zhì)的合成基因重組體轉(zhuǎn)化植物并檢測其在植物中的表達1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化介導(dǎo)法1).無菌籽苗的制備先將棉花種子用去污劑水溶液洗10分鐘，然后將種子放入400ml加入了3滴吐溫20的30％ chlorox溶液中攪拌20分鐘。用滅菌蒸餾水洗2次后將種子浸入雙氧水中10分鐘，用滅菌蒸餾水洗3次，在無菌條件下，將種子放入1/2半固體的MS鹽中。種子于28℃黑暗中萌發(fā)3-10天。然后將子葉和胚軸切成段，放入含3％葡萄糖，2mg/L NAA，1mg/L激動素的固體MS培養(yǎng)基(MSS培養(yǎng)基)中，或者放在含3％葡萄糖，維生素B5，100mg/L肌醇、0.75mg/L MgCl2，0.1mg/L 2.4-D，及0.1或0.5mg/L激動素的Gelrite固體培養(yǎng)基(MST培養(yǎng)基)中，以形成愈傷組織。
將愈傷組織于25℃以16/8光周期保持于這二種培養(yǎng)基之一中，直到開始胚胎發(fā)生。胚胎發(fā)生的愈傷組織的繼代培養(yǎng)與開始時相同，但在用3％的蔗糖代替葡萄糖的培養(yǎng)基上進行。將體細胞胚胎移入不含植物生長調(diào)節(jié)劑但含0.75g/L MgCl2的Gelrite固體培養(yǎng)基中，使其萌發(fā)并生長成植株。
2).被轉(zhuǎn)化植物中殺蟲蛋白質(zhì)的表達將攜帶有編碼殺蟲蛋白質(zhì)合成基因的植物表達載體的農(nóng)桿菌在YEP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，第二天按1/100接菌到新的液體YEP培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至0D為0.1-0.3，并接種子葉和下胚軸切段。將外植體在含1/10濃度MS鹽的MSS或MST培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2-3天。用濾紙吸去外植體上多余的農(nóng)桿菌，再將外植體移至含500mg/L羧芐青霉素和30-100mg/L卡那霉素的MSS或MST培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)化的愈傷組織將在此培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)生胚，然后將該胚培養(yǎng)成植株。通過已知的檢測外源基因及基因表達方法，檢測植株轉(zhuǎn)化情況?？捎肞CR法，Southern、Northern或Western等印跡分析法檢測合成基因在植株中的表達。但生物抗蟲檢測可能是檢測殺蟲蛋白質(zhì)表達的最靈敏的最直接的并最具說服力的手段。2.子房注射植物受精胚囊的轉(zhuǎn)化編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)的合成基因在植物中的高效表達對于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物是最為關(guān)鍵的，但是外源基因轉(zhuǎn)化植物是否能獲得成功，也是致關(guān)重要的環(huán)節(jié)。在本發(fā)明之前，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、PEG法、電穿孔法等方法轉(zhuǎn)化植物雖然有許多成功的例子，但都存有不利的因素。如上述方法不僅受到實驗室條件和昂貴的儀器及費用極高等的限制，更重要的是上述方法都有一個不利的共性，那就是受到植物基因型的限制。目前在生產(chǎn)上發(fā)揮著重要作用的優(yōu)良植物品種，由于基因型的不同，不能通過愈傷途徑再生成植株；或再生植株極為困難。在這樣的情況下，本申請的發(fā)明人不僅廣泛研究和成功地制備了編碼B.t.毒素類似物的合成基因(GFM Gene)，首次利用該基因，通過植物受精胚囊注射轉(zhuǎn)化的技術(shù)或稱植物受精胚囊注射轉(zhuǎn)化法，成功地獲得了具有高抗蟲能力的抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花。雖然本發(fā)明優(yōu)選棉花作為子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物受精胚囊方法的起始植物，但并不限于棉花。子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物受精胚囊技術(shù)的優(yōu)點在于1).適合于所有植物的基因型；2).方法簡單，有效；3).不受實驗室條件、儀器的限制，且費用低；4).速度快，一年內(nèi)即可獲得轉(zhuǎn)基因植物種子及后代。
子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物受精胚囊技術(shù)或稱植物受精胚囊注射轉(zhuǎn)化技術(shù)(簡稱“子房注射法”)是在下文所述的基礎(chǔ)上建立的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知，胚囊是高等植物的雌性生殖結(jié)構(gòu)，內(nèi)有卵核，當(dāng)與精核受精后，子代在此得以形成。植物解剖學(xué)研究顯示，它的結(jié)構(gòu)如圖40所示。胚囊被二層珠被組織包被著，內(nèi)層稱為內(nèi)珠被，外層稱為外珠被，內(nèi)、外珠被不連續(xù)處的微孔稱為珠孔。珠孔至胚囊之間的珠心組織是致密的細胞層，只有在花粉管進入胚囊之前的一段時間內(nèi)，此處的珠心組織才退化形成一條由珠孔至胚囊的孔稱為珠心孔道。植物開花授粉后，花粉粒在柱頭上萌發(fā)出花粉管，沿著花柱向下生長，延伸。在其到達胚珠前，珠孔開始張大，珠心孔道開始形成。當(dāng)花粉管延伸到珠孔時，珠心孔道形成的直徑已是花粉管直徑的數(shù)倍，因此已到達珠孔的花粉管便可以順利通過珠心孔道進入胚囊，釋放出精核與卵核完成受精。此時，即可用外源基因注射子房，轉(zhuǎn)化受精胚囊。然后珠心孔道逐漸關(guān)閉，受精胚囊開始分裂，最終發(fā)育成子代。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，成熟的棉花植物一般在早晨7-8時開花，授粉，經(jīng)10小時左右花粉管通過珠孔和珠心孔道進入胚囊，釋放精核，完成雙受精后，珠心孔道逐漸封閉。在受精后的一段時間內(nèi)，受精卵細胞的質(zhì)膜系統(tǒng)和初生細胞壁尚未完善，此時的受精卵細胞在形態(tài)上近似于裸露的原生質(zhì)體，因而極易接受外源基因。
(1)外源基因轉(zhuǎn)化植物在本實例中，子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物受精胚囊的方法，是在棉花開花授粉后的大約10-24小時之間進行的。在珠心孔道封閉之前，用微量注射器將外源基因溶液注射到子房內(nèi)，外源基因溶液即可通過珠孔和珠心孔道，逐漸擴散到或在珠心孔道封閉的過程中被擠壓到剛受精后的胚囊內(nèi)。在受精卵分裂的過程中，外源基因被吸收整合到受精卵細胞的基因組中，從而完成外源基因?qū)牒驼线^程。
棉花是常異花授粉作物，為保持品種(系)的相對純度，在開花的前一天下午，將要在第二天開花的蕾用線扣緊，使花瓣不易張開，以使其自花授粉。開花后約10小時左右，即開花當(dāng)天的晚6點鐘左右花粉管進入胚囊后，即可進行外源基因的注射。注射前將花辨連同雄蕊剝?nèi)?，露出幼鈴，抹去幼鈴頂端的花柱，用微量注射器吸取預(yù)冷的外源基因溶液，從抹掉花柱的幼鈴的頂端，沿中軸垂直插入幼鈴大小的2/3處(如圖40所示)，再將微量注射器向上提到1/3的地方，留下約幼鈴1/3的插入空間，緩慢將注射裝置內(nèi)的外源基因溶液注射到插入空間內(nèi)。此后，外源DNA溶液將沿著珠孔和珠心孔道向受精胚囊內(nèi)擴散，或由于珠心孔在逐漸封閉而被擠壓進受精胚囊中而實現(xiàn)其整合。一般每個棉花幼鈴注射的外源基因溶液為10μl，DNA總量約為0.25-0.5μg。當(dāng)然，對于不同的植物可根據(jù)其子房內(nèi)胚珠數(shù)目的多少，適當(dāng)?shù)卦黾踊驕p少外源基因的注射量。外源基因注射后，為了防止和減少幼鈴的脫落，提高成鈴率，在幼鈴柄基部用毛筆涂沫40ppm的赤霉素或用浸有40ppm赤霉素的棉球夾在幼鈴柄基部和莖(枝)之間，同時將所說注射外源基因的幼鈴所在的枝條項端摘掉，以保持幼鈴的充分營養(yǎng)，從而將有利于成鈴和鈴內(nèi)種子的發(fā)育。
(2)化學(xué)組織法檢測外源殺蟲基因在植物中的表達本發(fā)明的基因加倍雙向高效植物表達載體除了攜帶有合成基因外，還帶有獨立表達的報告基因(GUS)。粗測報告基因在植物中表達可間接證明外源基因是否被轉(zhuǎn)入植物中。按Jeferson等人(1987)的方法檢測，發(fā)現(xiàn)約有1％左右由轉(zhuǎn)化種子生長出的籽苗中有GUS陽性反應(yīng)。結(jié)果如下列表6所示。
表6.GUS基因的表達分析
4.轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的分子生物學(xué)檢測(1).棉花總DNA的提取按下述程序制備棉花總DNA取棉花植株置黑暗處放置2-3天以降低糖類累積后，剪取幼嫩健康的棉葉3-5g，用含少許洗滌劑的清水洗滌葉片后再用大量清水洗去洗滌劑。再次用重蒸水清洗后置于濾紙上吸去葉面水珠。將葉片置研缽中，加少許Al2O3助磨劑，添加液氮，在低溫下研磨成粉末。將所得粉末移入已加有15ml植物DNA提取液(含100mM Tris-HCl pH8.0)，50mM EDTA(pH8.0)，250mM NaCl，1％SDS，0.25％β-巰基乙醇)中并于65℃預(yù)熱的50ml塑料離心管中，劇烈振蕩后置65℃水浴中保溫10分鐘，并不時倒管混合之。然后取出離心管將內(nèi)容物倒在冰水中。加入5ml預(yù)冷的5M KAc，輕輕顛倒混合，并在冰上放置0.5小時。12000rpm，4℃離心30分鐘。將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中。用等量酚/氯仿、氯仿/異戊醇抽提一次。在上清液中加入15ml預(yù)冷的異丙醇，仔細混勻后置-20℃ 0.5小時。10000rpm，4℃離心20分鐘。用冰冷的70％乙醇洗沉淀物2次并將沉淀物懸浮于700μl TE(10mM Tris.HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，并轉(zhuǎn)入1.5ml Eppendoff管中，15000rpm離心5分鐘。然后將上清轉(zhuǎn)入新的Eppendoff管中，加入RNase A(10mg/ml，Boehringer Mannheim公司)20μl，在37℃水浴中保溫20分鐘。之后用等量苯酚、苯酚/氯仿、氯仿/異戊醇抽提至無蛋白質(zhì)沉淀為止。向上清中加1/10體積3M NaAc(pH5.2)及2.5體積無水乙醇，溫和地混勻，-20℃靜置沉淀。13000rpm，4℃離心20分鐘。用冰冷的70％乙醇洗沉淀物后再次以13000rpm，4℃離心2分鐘以壓實沉淀物。棄去上清，將沉淀物冷凍抽干，并重新懸浮于適量無菌重蒸水中。取適量DNA溶液進行0.5％瓊脂糖凝膠電泳分析，以入DNA(華美公司，0.35μg/μl)做為標(biāo)準(zhǔn)分子量。所提取的棉花植物總DNA長度較為均一的寬帶，大小約在50～100kb之間。
(2).PCR檢測棉花植株總DNA中的B.t.殺蟲蛋白質(zhì)基因片段使用Promega公司的Taq DNA聚合酶進行轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定。所用的PCR反應(yīng)體系包含模板棉花植株葉DNA 2μl(約2μg)，10×PCR反應(yīng)緩沖液5μl，MgCl23μl(25mM)，dNTP各5μ1(100mM)，5′端引物及3′端引物各1μg(引物采用在基因設(shè)計合成過程中所合成的兩段分別為39b和27b的寡核苷酸片段，這對引物在B.t殺蟲蛋白質(zhì)基因上的距離約為0.8kb)。先于94℃水浴10分鐘，充分復(fù)性后再加入Taq DNA聚合酶1μl(30/μl)。加雙蒸水至總體積50μl，混勻并在反應(yīng)管上部覆蓋50μl礦物油。
采用GeneAmp PCR System 9600型PCR儀(PERKIN ELMER公司)，按如下反應(yīng)程序進行PCR93℃變性60秒，50℃退火60秒，72℃延伸2分鐘，共進行30次循環(huán)。之后取5μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物溶液進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果檢查到了800bp的PCR產(chǎn)物。(如附圖41所示)。結(jié)果證明合成的基因已轉(zhuǎn)化到植物細胞中。
(3).用于Southern印跡分析的DNA探針的制備取實施例五-(3)構(gòu)建的質(zhì)粒pBI4AB 30μg，加入限制性內(nèi)切酶PstI(16U/μl，華美公司)4μl，PstI酶切10×緩沖液(華美公司)4μl，用重蒸水定容至40μl。37℃水浴保溫1.5小時后經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳回收約1.4kb片段。將如此純化后的DNA沉淀懸浮于適量無菌重蒸水中。
用Pharmacia公司的NICKTM柱(內(nèi)含Sephadex G-50)按其作手冊用[α-32P]dATP對回收的DNA片段進行DNA缺口平移標(biāo)記及純化。純化的標(biāo)記探針經(jīng)沉淀后離心，最后的沉淀物重新溶于適量無菌重蒸水中。
(4).Southern印跡分析鑒定PCR產(chǎn)物用Southern雜交分析法(J.Sambrook et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press 1989)鑒定棉花植物葉DNA PCR擴增產(chǎn)物如下取適量步驟(2)PCR檢測的各擴增反應(yīng)產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳。紫外燈下觀察電泳情況并在凝膠上做標(biāo)記后紫外照相留用。之后切去凝膠四周無用部分，將凝膠置于變性溶液(含1.5M NaCl，0.5M NaOH)中于旋轉(zhuǎn)平臺上振搖浸泡45分鐘使DNA變性。之后用重蒸水大致漂洗凝膠，換用中和液(1M Tris.HCl(pH7.4)，1.5M NaCl)室溫中和，伴隨溫和的振動。更換一次中和液后繼續(xù)浸泡15分鐘。
此時可準(zhǔn)備一張Whatman 3MM濾紙包住一個玻璃平板，將其放于一方磁盤中的平臺上，使濾紙下緣浸入轉(zhuǎn)移緩沖液(10×SSC)中。當(dāng)濾紙全部浸透后用玻棒趕走濾紙與玻璃板之間的氣泡。裁出一張稍大于凝膠的硝酸纖維素濾膜，用重蒸水徹底浸潤后改用20×SSC液浸泡5分鐘以上。在濾膜上做與凝膠相應(yīng)的標(biāo)記。
從中和液中取出凝膠，背面朝上放于平臺上濕的3MM濾紙上，并趕走氣泡。用保鮮膜蓋住凝膠四周以防盤內(nèi)液體直接從邊緣滲透到上層紙巾。將浸潤的硝酸纖維素濾膜覆蓋住凝膠，以趕走氣泡。其上再蓋上兩張與凝膠大小相同并用2×SSC溶液浸潤的3MM濾紙，并趕走氣泡。最后再在上面放一厚疊裁好的紙巾，紙巾上壓一塊玻璃板，板上壓一重物(如500g的砝碼)以形成液體自液池經(jīng)凝膠向硝酸纖維素濾膜上行的流路，使凝膠中變性的DNA被洗脫遷移并吸附至纖維素濾膜上。維持液體毛細遷移8-24小時，每當(dāng)紙巾浸濕后須更換紙巾。
轉(zhuǎn)移結(jié)束后揭去紙巾及上面的3MM濾紙，翻轉(zhuǎn)凝膠和纖維素濾膜，放于一張于的3MM濾紙上。用鉛筆透過凝膠標(biāo)記出加樣孔在纖維素膜上的位置，之后剝離棄掉凝膠。用6×SSC溶液室溫浸泡濾膜5分鐘以除去濾膜上沾有的凝膠碎片。取出濾膜置紙巾上室溫晾干30分鐘以上。之后用兩張3MM濾紙夾住濾膜在真空爐中80℃干烤0.5～2小時。
按每平方厘米硝酸纖維素濾膜0.2ml用量配制適量預(yù)雜交液(含6×SSC，5×Denhardt試劑)，0.5％SDS，100μg/ml經(jīng)變性并斷裂剪切成片段的鮭魚精子DNA)。將烤干的濾膜浮于6×SSC液面上待其完全濕潤后沉入液面內(nèi)泡2分鐘。然后將濕濾膜裝入塑料袋中，加入配好的預(yù)雜交液，趕盡袋內(nèi)氣泡，用塑料封口機熱封住塑料袋口，置68℃水浴中保溫1～2小時。取步驟3制備的放射性標(biāo)記的合成基因的探針1.4kb(雙鏈DNA片段)適量，100℃水浴中保溫5分鐘使雙鏈變性后，立即置冰上驟冷以防復(fù)性。從水浴中取出雜交袋，迅速剪開一角，將變性的探針液加入預(yù)雜交液中，趕盡氣泡后重新封口，再用一新塑料袋封住雜交袋以防污染水浴，然后放回水浴中按所需雜交時間進行溫育。完畢后取出雜交袋，剪開袋口倒棄雜交液至廢物缸中，取出濾膜轉(zhuǎn)入大體積的2×SSC及0.5％SDS溶液中室溫浸泡5分鐘。之后將濾膜轉(zhuǎn)入大體積的2×SSC和0.1％SDS溶液中室溫浸泡15分鐘，伴隨溫和的搖動。之后，將濾膜轉(zhuǎn)至新配的大體積的0.1×SSC及0.5％SDS溶液中37℃溫育0.5～1小時，伴隨溫和的搖動。然后更換一次所泡溶液，并將盛溶液的容器轉(zhuǎn)入68℃水浴0.5～1小時。這時可用手提式探測器檢測膜上放射性活度值。最后再用0.1×SSC于室溫下短暫漂洗濾膜，之后取出濾膜放于紙巾上吸去大部分液體。這時的濾膜即可下托一張保鮮膜，放入曝光夾中壓上X光片及增感屏，置-70℃曝光適當(dāng)時間(幾小時至幾天)。對X光片進行顯影即可得到Southern陽性雜交的結(jié)果。(如附圖42所示)。結(jié)果證明，從轉(zhuǎn)基因植物中PCR擴增出的DNA片段，為合成基因的片段。
(5).植物總RNA的提取及mRNA的純化和Northern雜交按下述程序制備棉葉總RNA及純化mRNA植物總RNA提取方法(S.B.Gelrin et al.，Plant Moldcular Biology MannalB11-22，Kluwer Academic Publishers 1988)如下。采摘新鮮幼嫩的棉葉，稱重后放入盛有液氮的塑料離心管中，離心管則置于裝有液氮的容器內(nèi)。在另一離心管中加入等體積的RNA抽提緩沖液(含有100mM LiCl，1％SDS，100mM Tris-NaOH，pH9.0，10mMEDTA)加有0.1％的8-OH喹啉的重蒸苯酚，混合物置90℃水浴中預(yù)熱。先將研缽和桿用液氮預(yù)冷，之后將棉葉轉(zhuǎn)入研缽，在液氮液中研磨棉葉至均勻的細粉。取一在-80℃下預(yù)冷的三角瓶放在冰鹽混合物中，將磨好的細粉轉(zhuǎn)入三角瓶中，按每克植物鮮重加2ml的量加入混好的苯酚/抽提緩沖液，用力振搖三角瓶?？刹粫r地在90℃水浴上加熱直至不再含有冷凍材料的團塊而成為乳狀液。此時混合物的最終溫度應(yīng)在25～30℃之間。將三角瓶在旋轉(zhuǎn)搖床上室溫振搖，300rpm，5分鐘。每克植物材料補加1ml氯仿，繼續(xù)在室溫振搖15～30分鐘。將乳狀液從三角瓶中轉(zhuǎn)至離心管中，20000g離心30分鐘(25℃)。取水相至新的三角瓶中，每克植物材料加1ml氯仿后，在振蕩搖床上300rpm搖動，15分鐘。之后將液體轉(zhuǎn)入塑料離心管中，12000g離心15分鐘，25℃。上相轉(zhuǎn)至離心管中，加入1/3體積8M LiCl(已過濾滅菌)，混勻，置4℃沉淀RNA 16-48小時。最后離心12000g，4℃，30分鐘。用2M LiCl(已過濾滅菌)4℃下洗RNA沉淀一次，用80％乙醇洗沉淀2次，之后冷凍抽干。沉淀溶于適量重蒸水中，貯于-20℃。
按Pharmacia公司提供mRNA純化試劑盒所述方法，從總RNA中純化棉葉的mRNA，純化后的mRNA可稀釋后直接用于上文所說方法進行Northern印跡雜交結(jié)果有約2kb的陽性雜交帶出現(xiàn)，證明合成基因在植物中能夠得以轉(zhuǎn)錄和表達。
(6).植物蛋白質(zhì)的提取及Western雜交分析按下述方法(N.B.Carozszi et al.，Expression ofachimeric CaMV 35S Bacillus thuringiensis insecticidalprotein gene in transgenic tobacco.Plant Mol.Biol.20539-548，1992)提取植物蛋白質(zhì)，所用植物蛋白質(zhì)提取緩沖液含有50mM Na2CO3(pH9.5)，100mM NaCl，0.05％ Triton，0.05％Tween，1M苯甲基磺酰氟，(PMSF)，1μM抑酶肽(leupeptin)，10mM DTT。所得到的蛋白質(zhì)等量地點到硝酸纖維素濾膜上用于Western雜交分析。用于雜交制備方法為從表達所合成的B.t.基因的重組菌中提取B.t.蛋白質(zhì)作為制備一抗，然后取抗源100μg溶解于0.5ml緩沖液中加入等體積佐劑。采用肌肉內(nèi)注射法免疫家兔獲得抗體。Western blotting方法(M.J.Adang.etal.，The reconstruction and expression of a Bacillusthuringiensi s Cry IIIA gene in protoplasts and potatoplant s.Plant Mol.Biol.211131-1145，1993)如下所述。將所提取的待測蛋白質(zhì)樣品上樣進行聚丙烯酰胺電泳。然后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上。所用轉(zhuǎn)移緩沖液包含25mM(Tris-HCl，pH9.5)192mM甘氨酸，20％甲醇。轉(zhuǎn)膜后加入一抗(1％Moducyte)1小時。(抗體1∶100)，然后用TTBS(50mM Tris-HclpH7.5，200M NaCl，0.05％Tween)洗膜三次，每次5分鐘。然后在TTBS緩沖液中加入1∶7500的二抗(連接有堿性磷酸酶的抗兔IgG(Promega)。反應(yīng)30分鐘后，洗滌硝酸纖維素膜數(shù)次。配制以下三種溶液用于蛋白質(zhì)的染色，用10ml 0.001％二甲基甲酰胺溶解0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)，用10ml 70％二甲基甲酰胺溶解0.5g氮藍四唑(NBT)。磷酸酯酶緩沖液包含100mMNaCl，5mM MgCl2，100mM Tris，pH9.5，染色時取66μlNBT，10ml磷酸酯酶緩沖液，33μl BCIP，膜放入后，室溫平緩搖動溫育，至蛋白質(zhì)帶顏色濃度達到要求(約20分鐘)。有一條約68KDa主蛋白質(zhì)帶出現(xiàn)，與合成基因表達殺蟲蛋白質(zhì)分子量基本相同，結(jié)果證明，合成基因在植物能夠表達出殺蟲蛋白質(zhì)。
(8).重組植物的抗蟲性試驗用生物抗蟲方法進行抗蟲鑒定試驗，是上文所說方法中可能是最靈敏有效的方法。采摘R1代(當(dāng)代種子為R0代，種子發(fā)芽生長出的植株為R1代)植株頂部或枝頂展開的嫩葉二張，分別放在兩個培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放12頭三日齡幼蟲，置28℃恒溫室內(nèi)，于接蟲后72小時計算死蟲數(shù)，活蟲數(shù)，并觀察葉片受損程度，重復(fù)三次。計算死亡率或校正死亡率。
用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化晉棉7號和晉棉12號的北方棉花品種命名為國家抗蟲棉，簡稱GBJR。獲得的三個獨立系進行上文所說的抗蟲試驗，結(jié)果證明，合成基因能在植物中高效表達，并能遺傳給后代和種子，R2代抗蟲性接近正常的3∶1遺傳分離，最高抗蟲性可達90％左右。結(jié)果如表7所示。
表7.R1代和R2代(GBJR)室內(nèi)抗蟲試驗
用子房注射轉(zhuǎn)化植物受精胚囊方法，轉(zhuǎn)化2個棉花生產(chǎn)品種，獲得34株GUS陽性植株，具有高抗蟲性的植株有5個株系見表7，約占15％。其中以泗棉3號為啟始品種的高抗蟲性植株有4株(545，591，6369，1001)，中棉所12號為啟始品種的高抗蟲性植株有1株(1109)，這些獨立抗蟲棉花株系被命名為國家抗蟲棉，簡稱GR棉。南方品種的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉簡稱GNSR棉，北方品種的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，簡稱為GBZR棉的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉?？瓜x結(jié)果如表8所示。
由R1代GR棉產(chǎn)生的自交后代為R2代，如上文所說的方法進行的抗蟲試驗。來自不同群體的R2代，抗蟲性表現(xiàn)出較大差異，4個GNSR株系均有抗蟲性?？瓜x性在80％-100％的植株223株，占86.4％；抗蟲性在50％-100％的植株35株，占13.6％。GBZR 1個株系，抗蟲性在80％-100％的16株，占11％，抗性在50％-80％的34株，占21.7％；抗蟲性在20％-50％ 106株，占67.5％，小于20％的有1株，占0.6％，對照組植物沒有抗蟲性。以上結(jié)果證明，合成基因能在植物中高效表達，用注射外源基因轉(zhuǎn)植物受精胚囊方法得到的轉(zhuǎn)基因植株，抗蟲性能遺傳給后代和種子，但抗蟲性不成正常3∶1遺傳分離的比例，結(jié)果如表9所示。表8.R1代GNSR和GBZR室內(nèi)抗棉鈴蟲檢測<
>表9.R2代國家抗蟲棉(GR)株系群體抗蟲檢測(校正死亡率％)<
<p>檢測抗蟲棉在田間(網(wǎng)室)的抗蟲試驗結(jié)果見表9。結(jié)果證明與室內(nèi)檢測的結(jié)果基本一致。表現(xiàn)出較好的抗蟲性。表10.R2代田間(網(wǎng)室)整株接種調(diào)查<
>總之，本發(fā)明制備的編碼殺蟲蛋白質(zhì)的合成基因，有與植物相適應(yīng)的堿基序列，與高效表達調(diào)控元件序列重組，構(gòu)建成的基因加倍雙向高效植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和子房注射轉(zhuǎn)化植物受精胚囊方法轉(zhuǎn)化棉花及棉花生產(chǎn)品種，證明該合成基因能在植物中高效表達，并能將抗蟲性遺傳給后代和種子。獲得的具有高抗蟲能力的遺傳穩(wěn)定后的轉(zhuǎn)基因棉花，能夠應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.合成的編碼蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白質(zhì)或其部分的核苷酸序列及其同源序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸序列，特征在于其編碼蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白質(zhì)氨基端約586至608個氨基酸的多肽序列或其同源序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸序列，特征在于其具有如附圖1所示的核苷酸1至1824的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸序列，特征在于其具有如附圖1所示的核苷酸64至1824的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的核苷酸序列，特征在于其基本上是由適合于在植物細胞中表達的優(yōu)化密碼子組成的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的核苷酸序列，特征在于其中以XXC/G(式中X代表A、G、C、T)為代表的密碼子的聯(lián)合使用率大于53.5％。且G＋C含量大于48.1％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的核苷酸序列，特征在于該序列是以化學(xué)方法合成的。
8.適于在植物細胞中表達蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白質(zhì)或部分的融合基因構(gòu)建體，其中包含1). 5′端非編碼區(qū)；2).編碼蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白質(zhì)氨基端的約586和608個氨基酸的核苷酸序列或其同源序列；以及3). 3′端非編碼區(qū)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的融合基因構(gòu)建，其中所說的5′端非編碼區(qū)由兩個增強子序列，一個啟動子序列，一個衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因的翻譯增強序列，和一個編碼核糖體結(jié)合蛋白的序列組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的融合基因構(gòu)建，其中所說的5′端非編碼區(qū)由以相反方向連接的四個增強子序列，兩個啟動子序列，兩個衍于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因的翻譯增強序列，及兩個核糖體結(jié)合蛋白質(zhì)的編碼序列組成。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的融合基因構(gòu)建，其中所說的啟動子序列是CaMV35S啟動子序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10的融合基因構(gòu)建，其中所說的衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因的翻譯增強序列是Ω序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求9或10的融合基因構(gòu)建，其中所說的核糖體結(jié)合蛋白質(zhì)的編碼序列是Kozak序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求8的融合基因構(gòu)建，其中2)中所說的編碼序列具有如附圖1中所示的核苷酸1-1824的序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求8的融合基因構(gòu)建，其中2)中所說的編碼序列具有如附圖1中所示的核苷酸64至1824的序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求8的融合基因構(gòu)建，其中3)所說的3′端非編碼區(qū)由一個多聯(lián)終止子序列，一個融合基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的切割序列和一個融合基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工序列，一個類似多聚腺苷酸化信號序列，和一個多聚腺苷酸化序列所組成。
17.根據(jù)權(quán)利要求8的融合基因構(gòu)建，特征在于該融合表達載體的5′端非編碼區(qū)和蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白質(zhì)基因序列及3′端非編碼區(qū)均是以化學(xué)方法合成的。
18.根據(jù)權(quán)利要求8的融合基因構(gòu)建體，其中用于攜帶融合基因構(gòu)建體中的載體是帶有權(quán)利要求9的5′端非編碼區(qū)和權(quán)利要求16的3′端非編碼區(qū)序列，可作為任何外源基因在植物中高效表達的工具載體。
19.根據(jù)權(quán)利要求8的融合基因構(gòu)建，其中用于攜帶融合基因的載體選自質(zhì)粒載體pGUC20、pBI121.1和pBI121.2。
20.適于在植物細胞或整株植物中表達蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白質(zhì)的融合表達載體，其具體保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏登記號為CGMCC NO.0247的攜帶于大腸桿菌DH5α中的融合構(gòu)建體的特征。
21.將攜帶外源基因的融合表達載體導(dǎo)入成熟的植物體內(nèi)的方法，該方法包括恰好在所說的植物受精6-24小時左右，將所說的外源基因或其重組構(gòu)建體子房注射到所說植物受精胚囊中。
22.產(chǎn)生對害蟲有抗性或殺蟲能力的植物的方法，該方法包括1).合成包括編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)之氨基端序列的核苷酸序列，和其5′端及3′端非編碼區(qū)的融合基因序列；2).將步驟1)中合成的所說的融合基因序列與適當(dāng)?shù)闹参锉磉_載體連接，得到能夠在植物細胞或整株植物中表達所說的殺蟲毒素蛋白質(zhì)的重組表達載體；3).將步驟2)中得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到植物細胞內(nèi)并整合到所說植物細胞的基因組中；4).以細胞或組織培養(yǎng)技術(shù)由步驟3)得到細胞或其組織再生整株植物。
23.產(chǎn)生對害蟲有抗性或殺蟲能力的植物的方法，該方法包括1).合成包括編碼B.t.殺蟲蛋白質(zhì)之氨基端氨基酸序列的核苷酸序列，和位于該序列的5′端及3′端非編碼區(qū)的融合基因序列；2).將步驟1)中合成的所說的融合基因序列與適當(dāng)植物表達載體連接，得到能夠在植物細胞或整株植物中表達所說的殺蟲蛋白質(zhì)的重組表達載體；3).將步驟2)中提到的重組表達載體導(dǎo)入到成熟的整株植物的受精卵細胞中并整合到其基因組中；4).由步驟3)中得到的包含所說的重組表達載體的受精卵細胞發(fā)育成植物種子，并進而再生對昆蟲害蟲有抗性或殺傷能力的植物及其后代。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法，其中步驟1)中所說的融合基因序列具有權(quán)利要求1-6中任一項所限定的特征。
25.根據(jù)權(quán)利要求22和23的方法，其中步驟2)中所說的重組表達載體具有保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏登記號為(CGMCC)0247的攜帶于大腸桿菌DH5α宿主中的重組表達載體的特征。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所說的將步驟3)中得到的重組表達載體導(dǎo)入成熟的整株植物的方法是如權(quán)利要求21所限定的方法。
27.根據(jù)權(quán)利要求22和23的方法，其中所說的植物是單子葉植物。
28.根據(jù)權(quán)利要求22和23的方法，其中所說的植物是雙子葉植物。
29.根據(jù)權(quán)利要求22和23的方法，其中所說的植物是棉花植物。
30.根據(jù)權(quán)利要求8至19中任何一項的重組表達載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
31.由根據(jù)權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的植物種子。
32.由根據(jù)權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的植物組織。
33.由根據(jù)權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)基因植物，其為單子葉植物。
34.由根據(jù)權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)基因植物，其為雙子葉植物。
35.由根據(jù)權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)基因植物，其為棉花植物。
全文摘要
本發(fā)明提供了全合成的編碼蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白質(zhì)的DNA序列；包含所說的DNA序列的融合基因構(gòu)建體；用所說的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞、組織和整株植物的方法；以及由此產(chǎn)生的對植物昆蟲表現(xiàn)有毒性的轉(zhuǎn)基因植物及其后代和種子。特別是對鱗翅目昆蟲如棉鈴蟲有毒性作用的轉(zhuǎn)基因棉花植物。
文檔編號C12N15/82GK1134981SQ9511956
公開日1996年11月6日 申請日期1995年12月28日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月28日
發(fā)明者郭三堆, 倪萬潮, 徐瓊芳 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心