專利名稱:用復(fù)合固相酶制品生產(chǎn)d-氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及復(fù)合固相酶制品和使用該制品生產(chǎn)D-氨基酸的方法。尤其是本發(fā)明的復(fù)合固相酶制品對(duì)D-α-氨基酸的生產(chǎn)有用,D-α-氨基酸是抗生素生產(chǎn)的中間化合物,例如D-(對(duì)羥苯丙)甘氨酸用于抗生素、amoxyciuin和類似物的生產(chǎn)。
背景技術(shù):
旋光性D-氨基酸作為藥品的中間化合物時(shí)是重要的化合物,已知它們可經(jīng)過(guò)用乙內(nèi)酰脲酶(下文有時(shí)縮寫(xiě)成“Hale”)將5-取代的乙內(nèi)酰脲水解成相應(yīng)的D-N-氨甲酰基-α氨基酸的不對(duì)稱水解反應(yīng)(JP-B62-30785)與用D-N-氨甲?;?α氨基酸酰胺水解酶(下文有時(shí)縮寫(xiě)成“脫氯甲酰酶”或“DCase”)將所得的D-N-氨甲?;?α-氨基酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的D-α-氨基酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)(PCT/JP91/01696WO92/10579)相結(jié)合有效地生產(chǎn)。
另外,JP-A63-185382,WO92/00739和類似文獻(xiàn)公開(kāi)了使用這些酶以所謂的固相酶形式可更高效地進(jìn)行各個(gè)反應(yīng),其中固相酶在諸如離子交換樹(shù)脂和類似物的支持物上被固定化。
然而,為了進(jìn)行這些反應(yīng)使用了兩步反應(yīng),因?yàn)閮煞N酶的最適和穩(wěn)定的PH值互相之間有相當(dāng)大的差異。因而兩種固相酶應(yīng)分別制備并需要復(fù)雜的反應(yīng)操作。
發(fā)明目的本發(fā)明涉及使用固相酶樹(shù)脂有效地生產(chǎn)D-α-氨基酸的技術(shù),該樹(shù)脂經(jīng)過(guò)將乙內(nèi)酰脲酶和脫氨甲?;敢悦傅墓泊鏍顟B(tài)(下文稱作“復(fù)合酶”)同時(shí)在一種固定化樹(shù)脂支持物上固定獲得。
在將5-取代的乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成D-α-氨基酸的這兩個(gè)酶促反應(yīng)中,一般來(lái)說(shuō),乙內(nèi)酰脲酶反應(yīng)的最適PH是PH8到9,且隨著PH值的增加,底物的可溶性增加。另外,乙內(nèi)酰脲環(huán)的消旋反應(yīng)在堿性范圍內(nèi)啟動(dòng)。因此,需要在PH范圍從7到10,優(yōu)選在堿性范圍內(nèi)進(jìn)行乙內(nèi)酰脲酶反應(yīng)。另一方面,一般來(lái)說(shuō),脫氨甲酰基酶反應(yīng)的最適PH是PH6.5至9.0,但隨著PH的升高所形成的氨對(duì)反應(yīng)的阻礙也顯著增加,因此,需要在PH大約為中性的條件下進(jìn)行脫氨甲?;磻?yīng)。
如果進(jìn)行這些反應(yīng)時(shí)可采用所謂的一步反應(yīng)(即這兩個(gè)酶促反應(yīng)可同時(shí)在一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行),與所謂的兩步反應(yīng)(其中,兩種不同的酶分別與底物反應(yīng))相比,可使反應(yīng)操作簡(jiǎn)單并能縮短總的反應(yīng)時(shí)間。另外,經(jīng)過(guò)將乙內(nèi)酰脲酶反應(yīng)(它是一種可逆反應(yīng))與脫氨甲?;阜磻?yīng)(它是一種不可逆反應(yīng))結(jié)合起來(lái),可提高乙內(nèi)酰脲的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率,以及使隨后的D-氨基酸純化簡(jiǎn)化。因此,可望顯著降低生產(chǎn)成本。然而,當(dāng)酶在不同的固定化支持物上分別固定并使用它們來(lái)混合時(shí),由于最適PH的差異使反應(yīng)性較差,而且固相酶的穩(wěn)定性存在問(wèn)題。
本發(fā)明人進(jìn)行深入細(xì)致的研究以生產(chǎn)一種復(fù)合固相酶制品,其中,兩種酶均在固定化支持物上同時(shí)固定。如果這兩種酶同時(shí)固定,兩個(gè)酶促反應(yīng)在樹(shù)脂的微空隙內(nèi)連續(xù)進(jìn)行。因而不需脫氨甲?;傅牡孜?D-N-氨甲?;?α-氨基酸)經(jīng)擴(kuò)散從固相Hase移動(dòng)到固相DCase,且在微空隙中PH的變化可達(dá)到最小。因此,預(yù)期酶各自的反應(yīng)性進(jìn)一步增加,而且相信會(huì)改善由于氨引起的產(chǎn)量障礙及重復(fù)使用的酶的穩(wěn)定性。
本發(fā)明概述本發(fā)明提供了經(jīng)一步反應(yīng)從相應(yīng)的DL-5-取代的乙內(nèi)酰脲有效地生產(chǎn)D-氨基酸的方法,此方法包含在大約中性的PH值下使用復(fù)合固相酶,所說(shuō)的復(fù)合固相酶經(jīng)過(guò)將其最適PH在堿性范圍內(nèi)的乙內(nèi)酰脲酶和其最適PH為大約中性的D-N-氨甲?;?α-氨基酸酰胺水解酶以共存狀態(tài)同時(shí)在陰離子交換樹(shù)脂固定化支持物上固定獲得(下文稱為復(fù)合酶)。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明至于本發(fā)明所用的乙內(nèi)酰脲酶,可用來(lái)自動(dòng)物、植物和微生物的酶。來(lái)自微生物的乙內(nèi)酰脲酶適于工業(yè)生產(chǎn)。至于這類微生物,JP-B62-30758所公開(kāi)的那些就是例子。細(xì)菌類包括無(wú)色桿菌屬,氣桿菌屬,氣單胞菌屬,土壤桿菌屬,產(chǎn)堿桿菌屬,節(jié)細(xì)菌屬,桿菌屬,短桿菌屬,棒狀桿菌屬,腸桿菌屬,歐文氏菌屬,埃希氏桿菌屬,克雷白氏桿菌屬,微桿菌屬,微球菌屬,精蛋白桿菌屬,變形桿菌屬,假單胞菌屬,八迭球菌屬,沙雷氏菌屬,黃單胞菌屬和類似物。放線菌類包括線菌屬,分支桿菌屬,奴卡氏菌屬,鏈霉菌屬,游動(dòng)放線菌屬和類似物。絲狀真菌包括曲霉屬,擬青霉菌屬,青霉屬和類似物。酵母包括假絲酵母屬,畢赤酵母屬,紅酵母屬,圓酵母屬和類似物。
在上述微生物中,具有相當(dāng)高的乙內(nèi)酰脲酶活性并在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出色的菌株例子包括陰溝氣桿菌IAM1221,發(fā)根病土壤桿菌IFO13259,不定形短桿菌IFO12145,腐爛棒狀桿菌IFO3306,黃色微桿菌ATCC10340,玫瑰色微球菌IFO3764,溝槽假單胞菌IFO12996,恥垢分枝桿菌ATCC607,珊瑚奴卡氏菌IFO3338,淺黃鏈霉菌IFO3241,桿菌屬SP,KNK108(FERMP-6056),桿菌屬sp.KNK245(FERM BP-4863)和類似物。
另外,可使用以人工微生物生產(chǎn)的酶,其中以基因重組技術(shù)賦予乙內(nèi)酰脲酶生產(chǎn)力,例如,大腸桿菌HB101PTH104(FERM BP-4864),或與JP-A53-136583所公開(kāi)的相比增加的或具有相似活性的二氫嘧啶酶。
至于本發(fā)明所用的脫氨甲酰霉,其來(lái)源不作具體限定,可使用那些來(lái)自動(dòng)物,植物和微生物的酶。然而,為了工業(yè)生產(chǎn),來(lái)源于微生物的酶是合適的。這種微生物的例子包括天然存在的微生物,例如在JP-B57-18793,JP-B63-20520和JP-B1-48758中公開(kāi)的土壤桿菌屬,假單胞菌屬,節(jié)細(xì)菌屬,產(chǎn)堿桿菌屬,無(wú)色桿菌屬,莫拉克斯氏菌屬,副球菌屬,氣桿菌屬,氣單胞菌屬,短桿菌屬,桿菌屬,產(chǎn)黃菌屬和沙雷氏菌屬,或在WO91/01696中描述的人工微生物,其中以基因重組技術(shù)賦予或增強(qiáng)脫氨甲酰基酶生產(chǎn)力。這類微生物有代表性的例子包括土壤桿菌屬SP.KNK712(FERM BP-1900),假單胞菌屬SP.KNK003A(FERM BP-3181),假單胞菌屬SP.KNK505(FERM BP-3182),大腸桿菌JM109PAD108(FERM BP-3184),大腸桿菌JM109pPD304(FERM BP-3183)和類似物。
當(dāng)使用負(fù)責(zé)脫氨甲?;笩峥剐缘陌被岜涣硪话被崛〈姆€(wěn)定脫氨甲酰基酶時(shí),可使用WO94/03613中公開(kāi)的下列轉(zhuǎn)化子。例如,該轉(zhuǎn)化子包括E.coli JM109pAD402(FERM BP-3912),E.
coli JM109pAD404(FERM BP-3913),E.coli JM109pAD406(FERM BP-3914),E.coli JM109pAD416(FERM BP-3915),E.coliJM109pAD428 E.coli JM109pAD429(FERM BP-4035),E.coliJM109pAD431,E.coli JM109pAD434,E.coli JM109pAD435,E.coliJM109pAD439,E.coli JM109pAD441,E.coli JM109pAD445,E.coliJM109pAD447,E.coli JM109pAD448,E.coli JM109pAD450,E.coliJM109pAD421,E.coli JM109pAD422,E.coli JM109pAD423,E.coliJM109pAD424,(FERM BP-4034),E.coliJM109pAD425,E.coliJM109pAD426,E.coli JM109pAD427,E.coli JM109pAD451,E.coliJM109pAD452,E.coli JM109pAD453,E.coli JM109pAD461,E.coliJM109pAD454,E.coli JM109pAD455,(FERM BP-4036),E.coliJM109pAD456,E.coli JM109pAD468,E.coli JM109pAD469,E.coliJM109pAD470,E.coli HB101pNT4553,(FERM BP-4368)或類似物。
當(dāng)使用這種穩(wěn)定酶時(shí),本發(fā)明的復(fù)合固相酶制品的重復(fù)使用可獲得較好效果。
本發(fā)明中所用的酶可經(jīng)過(guò)使用能產(chǎn)生兩種酶的微生物同時(shí)生產(chǎn)。作為選擇,可使用各自只能產(chǎn)生一種酶的微生物分別或同時(shí)生產(chǎn)兩種酶。至于能產(chǎn)生兩種酶的微生物,可使用從天然來(lái)源分離的微生物,例如在JP-B63-205200中公開(kāi)的土壤桿菌屬和類似物。另外,可使用經(jīng)過(guò)從天然來(lái)源分離的微生物中分離出兩種酶的基因并將它們導(dǎo)入宿主中制備的重組微生物,例如,在WO94/00577中公開(kāi)的微生物。作為選擇,可從相同或不同微生物中分離兩種酶的基因并以兩種基因的可表達(dá)形式插入相同的載體或插入具有不同復(fù)制方式的不同載體(例如pUC19和pACYC184)中。然后,可用上述相同載體或不同的載體轉(zhuǎn)化受體宿主(如大腸桿菌)以便在單個(gè)微生物中能生產(chǎn)兩種酶。在這些情況下,可根據(jù)特定的目的經(jīng)過(guò)選擇具有各種能力的啟動(dòng)子類型和具有不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒來(lái)改變各個(gè)酶生產(chǎn)的比率。然而,優(yōu)選調(diào)節(jié)比率使獲得幾乎相等量的酶蛋白。在使用分別產(chǎn)生不同酶的微生物的情況下,也可使用從天然來(lái)源分離的菌株或使用基因重組技術(shù)制備的重組微生物。在這種情況下,可經(jīng)過(guò)分別培養(yǎng)生產(chǎn)者微生物或培養(yǎng)以各種比率混合的培養(yǎng)物來(lái)進(jìn)行酶的生產(chǎn),優(yōu)選的比率是使能產(chǎn)生幾乎相等量的酶。
培養(yǎng)可以需氧方式進(jìn)行,例如,經(jīng)過(guò)使用錐瓶振動(dòng)培養(yǎng)或經(jīng)過(guò)通氣旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。至于在培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基,正常情況下可使用的培養(yǎng)基包含一般使用的天然營(yíng)養(yǎng)物,例如肉湯提取物和多肽胨及類似物。當(dāng)乙內(nèi)酰脲酶與脫氨甲?;阜謩e或同時(shí)生產(chǎn)時(shí),經(jīng)過(guò)加入一定量的錳離子進(jìn)行培養(yǎng)可獲得好效果,例如加入1到100mg/升的氯化錳,優(yōu)選大約20mg/升。
在本發(fā)明中,存在于固相酶制品中的酶可以純化的,部分純化的或粗制品的形式存在,或在某些情況下,可以微生物細(xì)胞本身的形式存在。至于酶在能表現(xiàn)出酶促活性的條件下,酶可以任何形式存在,且可與任何物質(zhì)共存。
在本發(fā)明的復(fù)合固相酶制品的制備或應(yīng)用中,為了重復(fù)使用可經(jīng)過(guò)加入抗氧化劑獲得較好的效果。至于這種抗氧化劑,可使用二硫蘇糖醇,2-疏基乙醇,L-半胱氨酸鹽酸,鹽酸半胱胺,二硫赤蘚糖醇,二硫蘇糖醇和二硫赤蘚糖醇的混合物,還原的谷胱甘肽和類似物。
根據(jù)固相酶的特定使用條件可改變所用的固相支持物。當(dāng)用粗制酶溶液(如無(wú)細(xì)胞提取物)或以硫酸銨沉淀法處理的部分純化的酶溶液或類似物進(jìn)行固定時(shí),可使用具有離子交換基團(tuán)或共價(jià)結(jié)合基團(tuán)的多聚體支持物。
至于具有離子交換基團(tuán)的多聚體支持物,可使用諸如Duouite(注冊(cè)商標(biāo))系列,或Amberlite IRA(注冊(cè)商標(biāo))系列(其交換基團(tuán)是一級(jí),二級(jí),三級(jí)和四級(jí)銨);或具有二乙醇類型官能團(tuán)的聚苯乙烯樹(shù)脂,例如可用Diaion EX。
至于具有共價(jià)結(jié)合基團(tuán)的支持物,可用具有醛作為結(jié)合基團(tuán)的取代的聚異丁烯酸酯多聚體,用聚乙烯亞胺/戊二醛復(fù)合物覆蓋的高密度礬土和類似物。
如固定完整的微生物細(xì)胞,例如活細(xì)胞或干細(xì)胞,可使用諸如聚丙烯酰胺,聚氨基甲酸乙酯或藻酸鈣的多聚體,或諸如礬土的多孔物質(zhì)。
本發(fā)明的復(fù)合固相酶制品按如下方法生產(chǎn)。將Hose和DCase活性被適當(dāng)調(diào)整的粗制復(fù)合酶溶液與支持物接觸以及吸附兩種酶,并用交聯(lián)劑處理使其穩(wěn)定。為了制備粗制復(fù)合酶的溶液,首先經(jīng)過(guò)培養(yǎng)微生物細(xì)胞生產(chǎn)各種酶。在這種情況下,當(dāng)使用能同時(shí)生產(chǎn)兩種酶的微生物時(shí),經(jīng)過(guò)收集細(xì)胞和用諸如聲處理,機(jī)械破碎(例如,勻漿器)或酶處理破碎細(xì)胞來(lái)制備無(wú)細(xì)胞提取物。當(dāng)使用不同微生物制備復(fù)合酶的溶液時(shí),其制備可經(jīng)過(guò)分別培養(yǎng)微生物,收集細(xì)胞制備各自的無(wú)細(xì)胞提取物并混合它們來(lái)完成?;蛘咂渲苽淇山?jīng)過(guò)將各自的生產(chǎn)者微生物一起培養(yǎng)并同時(shí)破碎細(xì)胞以制備兩種酶混合在一起的無(wú)細(xì)胞提取物來(lái)完成。當(dāng)兩種酶以不同的微生物生產(chǎn)時(shí),根據(jù)微生物的種類和培養(yǎng)方法的差別生產(chǎn)力有較大程度的差別。然而,一般來(lái)說(shuō),對(duì)于乙內(nèi)酰脲酶,正常生產(chǎn)者微生物以大約0.1到大約10單位/ml(本文所用的酶的一個(gè)單位定義為在PH8.7,40℃下,1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化底物5-(對(duì)羥苯丙基)乙內(nèi)酰脲成為D-N-氨甲?;?對(duì)羥苯丙甘氨酸所需的量)的水平生產(chǎn)乙內(nèi)酰脲酶,重組的人工生產(chǎn)者微生物以大約5到大約150單位/ml生產(chǎn)該酶。對(duì)于脫氨甲?;?,正常生產(chǎn)者微生物以大約0.01到大約2單位/ml(本文所用的酶的一個(gè)單位定義為在PH7.0,40℃下,1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化底物D-N-氨甲?;?對(duì)-羥苯丙甘氨酸成為D-對(duì)羥苯丙甘氨酸所需的量)生產(chǎn)脫氨甲?;福亟M的人工生產(chǎn)者微生物以大約0.1到大約20單位/ml生產(chǎn)該酶。在粗制復(fù)合酶溶液中調(diào)整Hase和DCase活性的比率以便從5-取代的乙內(nèi)酰脲產(chǎn)生D-α-氨基酸的反應(yīng)能最高效地進(jìn)行。如下文所述,在中性pH下進(jìn)行該反應(yīng),該pH接近DCase的最適pH,因而該條件與Hase表現(xiàn)出最大活性的條件不同。然后需要調(diào)整兩種酶的活性以便在反應(yīng)pH下表現(xiàn)出幾乎相等的活性。例如,在pH7.5進(jìn)行反應(yīng)的情況下,所需的復(fù)合固相酶制品可經(jīng)過(guò)使用酶溶液進(jìn)行固定化反應(yīng)來(lái)生產(chǎn),在酶溶液中蛋白質(zhì)的量和酶活性幾乎相等以使乙內(nèi)酰脲酶單位是DCase的大約5倍。固定后為了維持這一活性,需要在粗制復(fù)合酶的溶液中酶活性的比率(Hase∶DCase)應(yīng)在1到10∶1的范圍內(nèi)。因此,在微生物細(xì)胞破碎后和吸附前,將粗制復(fù)合酶活性調(diào)成這一水平。
另外,為了在支持物上吸附合適量的酶,優(yōu)選將粗制復(fù)合酶溶液中脫氨甲?;笣舛日{(diào)成10到300單位/ml。吸附的活性是加入活性的大約20%到大約90%且在兩種酶之間基本上看不到區(qū)別。
支持物在其交換基團(tuán)用諸如氯化鈉的水溶液活化和諸如在緩沖溶液中平衡后使用。優(yōu)選調(diào)整粗制復(fù)合酶溶液和支持物的比率使粗制酶溶液中蛋白質(zhì)的總量幾乎與支持物的最大吸附能力相同。如果必要,可加入1到10mm的抗氧化劑和/或0.5到20mm的錳離子。在4到30℃下,混合物優(yōu)選在15℃下攪拌混合物當(dāng)吸附的酶量達(dá)到給定量(一般8到48小時(shí),優(yōu)選在惰性氣體環(huán)境如氮?dú)庵羞M(jìn)行)后,經(jīng)過(guò)濾收集支持物。然后洗滌支持物并經(jīng)過(guò)用交聯(lián)劑處理使其固定化來(lái)穩(wěn)定支持物。至于交聯(lián)劑,可使用已知試劑,例如不超過(guò)1%,優(yōu)選0.1到0.2%的戊二醛。用蒸餾水和緩沖溶液(優(yōu)選上面所述的含0.1到20mm,一般為1到5mm的抗氧化劑)洗滌交聯(lián)的復(fù)合酶固相制品并在低溫(40℃)潮濕狀態(tài)下貯存于密封的容器中。一般來(lái)說(shuō),對(duì)于脫氨甲?;?,由此獲得的復(fù)合固相酶制品的活性為5到80單位/g支持物。對(duì)于乙內(nèi)酰脲酶,根據(jù)吸附條件其活性是脫氨甲?;富钚缘?到10倍。
使用本發(fā)明的復(fù)合固相酶制品從5-取代的乙內(nèi)酰脲生產(chǎn)D-α-氨基酸的方法將在下文描述。
經(jīng)過(guò)將底物5-取代的乙內(nèi)酰脲與復(fù)合固相酶制品反應(yīng)來(lái)進(jìn)行該反應(yīng),如果必要的話,有抗氧化劑和/或錳離子存在。正常情況下,優(yōu)選在0.1到20mm抗氧化劑和錳離子存在的條件下進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)下面反應(yīng)式進(jìn)行反應(yīng) 其中R代表苯基,以羥基取代的苯基,烷基,取代的烷基,芳烷基或噻吩基。
所用的底物5-取代的乙內(nèi)酰脲濃度是0.1到30%(W/V),優(yōu)選1到5%(W/V)。優(yōu)選所用的復(fù)合固相酶制品的量是使脫氨甲?;富钚詾榇蠹s10到大約20單位/g底物。反應(yīng)溫度根據(jù)特定的酶進(jìn)行變化,但一般為30到60℃。具有熱抗性的酶在較高溫度下使用。
反應(yīng)pH適當(dāng)?shù)剡x自6.5到8.0的范圍,該pH范圍對(duì)DCase而言幾乎是最適的。然而,它相當(dāng)遠(yuǎn)離Hase的最適pH,Hase的活性比在最適pH下的活性低幾倍。盡管如此,最終D-α-氨基酸的產(chǎn)量由最后一步的酶(DCase)控制,因此優(yōu)選根據(jù)DCase設(shè)定酶的量和反應(yīng)條件(即DCase的最適條件)并結(jié)合Hase活性與DCase活性的比例。一般來(lái)說(shuō),調(diào)整將要吸附于支持物上的酶的比率使表現(xiàn)出幾乎相等的活性,盡管這一比率根據(jù)特定的反應(yīng)條件而變化?!皫缀跸嗟鹊幕钚浴敝冈趐H7.5下測(cè)定的乙內(nèi)酰脲酶活性(以“單位(pH7.5)”表示)與上述脫氨甲酰基酶活性的比率為大約0.5到1.5∶1的情況。將反應(yīng)pH調(diào)到由此選定的pH范圍,一般調(diào)到pH7.5來(lái)進(jìn)行反應(yīng)。經(jīng)過(guò)這些操作,克服了Hase的不適條件并使反應(yīng)平衡向生產(chǎn)D-N-氨甲酰基氨基酸的方向傾斜。因此可比預(yù)期更有效地進(jìn)行反應(yīng)并能提高底物5-取代的乙內(nèi)酰脲的轉(zhuǎn)化。當(dāng)在接近乙內(nèi)酰脲酶最適pH的堿性pH范圍內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)時(shí),盡管D-N-氨甲酰基氨基酸的生產(chǎn)能成功地進(jìn)行,但脫氨甲?;富钚越档偷阶钸mpH活性的一半以下。另外,觀察到總產(chǎn)量減少且脫氨甲?;副旧淼姆€(wěn)定性降低,因?yàn)榉磻?yīng)產(chǎn)生的氨大幅度地抑制反應(yīng)。由于這些原因,當(dāng)復(fù)合固相酶制品具有的固定化比率使脫氨甲?;阜磻?yīng)輕微地決定速率并在接近脫氨甲?;缸钸m反應(yīng)條件和底物濃度的條件下使用時(shí),使用復(fù)合固相酶制品的反應(yīng)能有效地進(jìn)行。另外,其優(yōu)勢(shì)在于復(fù)合固相酶制品的總活性容易控制,因?yàn)镠ase的生產(chǎn)力高且DCase催化不可逆的反應(yīng)。
一般以過(guò)柱方法或通過(guò)將復(fù)合固相酶制品懸浮于反應(yīng)容器中進(jìn)行反應(yīng)。在后一種情況下,通常進(jìn)行批量反應(yīng)且反應(yīng)時(shí)間是每批大約6到大約48小時(shí)。經(jīng)過(guò)使用本發(fā)明的復(fù)合固相酶制品,可在一步反應(yīng)中以高產(chǎn)量從5-取代的乙內(nèi)酰脲生產(chǎn)相應(yīng)的D-氨基酸。下面實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地解釋本發(fā)明,但不能當(dāng)作是對(duì)其范圍的限制。
實(shí)施例1首先,為了制備乙內(nèi)酰脲酶的酶溶液,將桿菌屬sp.KNK108(FERM p-6056)接種到250ml種子培養(yǎng)基(肉膏1.0%,多肽胨1.0%,酵母浸出汁0.5%(pH7.0))中并在33℃培養(yǎng)大約25小時(shí),將該種子培養(yǎng)物接種到2.5升培養(yǎng)基(肉膏1.0%,多肽胨1.0%,酵母浸出汁0.5%,尿嘧啶0.1%,MnCl22O ppm(pH7.5))中并在33℃培養(yǎng)大約16小時(shí)。離心收集微生物細(xì)胞并懸浮于50ml20mmMnSO4水溶液中。調(diào)節(jié)pH至8.5后經(jīng)聲處理破碎細(xì)胞,去掉殘余物以獲得乙內(nèi)酰脲酶的粗制酶溶液(107單位/ml)。
另外,為了制備脫氨甲?;傅拿溉芤?,將大腸桿菌HB101pNT4553(FERM BP-4368)在20ml含50μg/ml氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)基(Bacto蛋白胨1.6%,Bacto酵母浸出汁1.0%,Nacl 0.5%)中37℃培養(yǎng)16小時(shí)。該培養(yǎng)物以1%的量接種到1.4升2YT培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)大約28小時(shí)。離心收集細(xì)胞并懸浮于140ml 5mm二硫蘇糖醇溶液中。將pH調(diào)到7.0后,經(jīng)聲處理破碎細(xì)胞,去掉殘余物獲得作為脫氨甲酰基酶粗制酶溶液的上清液(36單位/ml)。
實(shí)施例2使用實(shí)施例1獲得的粗制酶溶液進(jìn)行酶的固定化。首先用1MNacl和離子交換水洗滌作為固相支持物的Duolite A-568(Rohm和Haas),接著放入離子交換水中,將pH調(diào)到7.5。向8.4g該樹(shù)脂中加入20ml乙內(nèi)酰脲酶的粗制酶溶液和11.5ml脫氨甲酰基酶的粗制酶溶液,兩者的pH值已調(diào)到7.5,混合物在氮?dú)猸h(huán)境中15℃下攪拌大約20小時(shí)。用0.5mM MnSO4溶液洗滌該樹(shù)脂兩次后,將樹(shù)脂懸浮于5倍體積的離子交換水中。將懸液pH調(diào)到7.5后,逐步加入544μl 2.5%戊二醛并攪拌35分鐘。懸液用50mM Tris-HCl(pH7.5),5mM DTT和1mM MnSO4處理過(guò)夜,然后經(jīng)過(guò)濾收集復(fù)合固相酶制品(每1g樹(shù)脂乙內(nèi)酰脲酶活性為8.2個(gè)單位(pH7.5),脫氨甲?;富钚詾?.9個(gè)單位)。
然后,作為對(duì)照,制備分別固定兩種酶的樹(shù)脂。
將20ml乙內(nèi)酰脲酶的粗制酶溶液和60ml的脫氨甲?;复种泼溉芤悍謩e與4.2g和22.0g上述固定化支持物混合,按上面所述相同的操作進(jìn)行以獲得各個(gè)固相酶,其中每種酶分別固定(乙內(nèi)酰脲酶固相酶24個(gè)單位/g樹(shù)脂,2.7個(gè)單位/g樹(shù)脂(pH7.5),脫氨甲?;腹滔嗝?7個(gè)單位/g樹(shù)脂)。
實(shí)施例3經(jīng)過(guò)使用實(shí)施例2獲得的復(fù)合固相酶制品和分別含單個(gè)酶的對(duì)照固相酶,進(jìn)行從5-取代的乙內(nèi)酰脲產(chǎn)生相應(yīng)的D-α-氨基酸的反應(yīng)。
經(jīng)過(guò)向100ml 0.1M KPB(pH7.5),1mM MnSO4和5mM DTT的溶液中加入1g作為底物的5-(對(duì)羥苯丙)乙內(nèi)酰脲后,通入足夠的氮?dú)獠⒎磻?yīng)條件調(diào)到40℃和pH7.5。為了獲得兩種酶的相同酶活性,加入0.97g復(fù)合固相酶制品或3.0g乙內(nèi)酰脲酶固相酶和0.26g脫氨甲酰基酶固相酶。通入氮?dú)獠⒁?N H2SO4或6N NaOH將反應(yīng)pH控制在7.5進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)進(jìn)行29小時(shí)并定期取樣。以高效液相層析(Nippon Bunko,F(xiàn)inepack SIL C-18柱)測(cè)定每個(gè)取樣點(diǎn)產(chǎn)生的對(duì)羥苯丙甘氨酸的量。
結(jié)果如
圖1所示。
如圖1所見(jiàn),當(dāng)兩種酶同時(shí)固定在相同樹(shù)脂中時(shí)可更高效地進(jìn)行反應(yīng)。
實(shí)施例4以復(fù)合固相酶制品重復(fù)進(jìn)行反應(yīng)以研究酶活性的穩(wěn)定性。向100ml 1mM MnSO4和5mM DTT的溶液中加入2克5-(對(duì)羥苯丙)乙內(nèi)酰脲,將pH調(diào)至7.5。向混合物中加入實(shí)施例2獲得的8.9g復(fù)合固相酶制品,經(jīng)通入氮?dú)夂蛯H控制在7.5使反應(yīng)在40℃下進(jìn)行23小時(shí)。經(jīng)抽吸過(guò)濾反應(yīng)混合物后,根據(jù)上述相同的方式向復(fù)合固相酶中加入另一混合物并進(jìn)行反應(yīng)。重復(fù)操作五次,在每次反應(yīng)終點(diǎn)測(cè)定兩種酶的活性。
在第一次反應(yīng)中的相對(duì)活性如圖2所示。
在后五次反應(yīng)中很少觀察到活性下降。
實(shí)施例5為了制備乙內(nèi)酰脲酶的酶溶液,含桿菌屬SP.KNK245(FERMBP-4863)乙內(nèi)酰脲酶基因的大腸桿菌HB101pTH104(FERM BP-4864)在20ml 2YT培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)大約16小時(shí)。將該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1.2升含50μg/ml氨芐青霉素和400ppm MnCl2·4H2O的2YT培養(yǎng)基中并在37℃下培養(yǎng)26小時(shí)。離心收集細(xì)胞并懸浮于80ml1mM MnSO4水溶液中。用氨水將pH調(diào)到8.5后,經(jīng)聲處理破碎細(xì)胞,離心去掉殘余物。將上清液pH調(diào)到8.5后,在60℃下進(jìn)行熱處理20分鐘。離心去掉變性蛋白質(zhì)以獲得乙內(nèi)酰脲酶的粗制酶溶液(1,100單位/ml)。
經(jīng)過(guò)使用該粗制酶溶液和如實(shí)施例1所述根據(jù)相同方式制備的脫氨甲?;傅拇种泼溉芤?240個(gè)單位/ml),根據(jù)實(shí)施例2所述相同的方式制備復(fù)合固相酶制品。經(jīng)過(guò)使用30ml脫氨甲?;傅拇种泼溉芤汉?3ml乙內(nèi)酰脲酶的粗制酶溶液,根據(jù)與實(shí)施例2所述相同的方式將酶固定于29g樹(shù)脂上(在每1g樹(shù)脂中,脫氨甲?;?5單位,乙內(nèi)酰脲酶119單位,44單位(pH7.5))。
作為對(duì)照,使用分別固定有兩種酶的樹(shù)脂。按照實(shí)施例2所述制備脫氨甲?;傅墓滔嗝?43單位/g樹(shù)脂)。經(jīng)過(guò)將21.8g用于固定的樹(shù)脂與60ml粗制酶溶液混合(177單位/g樹(shù)脂,51單位/g(pH7.5))根據(jù)實(shí)施例2所述的方法制備乙內(nèi)酰脲酶的固相酶。
實(shí)施例6經(jīng)過(guò)使用實(shí)施例5獲得的5g復(fù)合固相酶制品,與在不同樹(shù)脂上分別固定酶所制備的固相酶一樣,5.6g乙內(nèi)酰脲酶固相酶和5.2g脫氨甲酰基酶固相酶的混合物(脫氨甲?;富钚?pH7.5)等于復(fù)合固相酶制品的活性,乙內(nèi)酰脲酶活性(pH8.7)是復(fù)合固相酶制品的2倍)在實(shí)施例5中獲得。根據(jù)實(shí)施例3所述的方法用3%的底物進(jìn)行反應(yīng)。
結(jié)果如圖3所示。
如圖3所示,盡管乙內(nèi)酰脲酶活性是單獨(dú)的固相酶活性的一半,復(fù)合固相酶制品的反應(yīng)活性與單獨(dú)的固相酶反應(yīng)活性相似。因此,發(fā)現(xiàn)以復(fù)合固相酶制品進(jìn)行的反應(yīng)更有效并且用于固定的昂貴樹(shù)脂量可大量減少。
實(shí)施例7經(jīng)過(guò)使用實(shí)施例5獲得的復(fù)合固相酶各5g,研究了反應(yīng)pH的效力。在7.0,7.25和7.5三個(gè)pH水平,用3%底物進(jìn)行了反應(yīng)。測(cè)量了轉(zhuǎn)化99%的底物所需的時(shí)間。時(shí)間分別是5.5,5.4和6.75小時(shí)。因此,發(fā)現(xiàn)pH7.0和pH7.25對(duì)反應(yīng)有優(yōu)勢(shì)。
如上文所述,根據(jù)本發(fā)明,經(jīng)過(guò)使用在同一樹(shù)脂上同時(shí)固定乙內(nèi)酰脲酶和脫氨甲?;干a(chǎn)的復(fù)合固相酶制品,在從5-取代的乙內(nèi)酰脲生產(chǎn)相應(yīng)的D-α-氨基酸的反應(yīng)中,可能進(jìn)行一步反應(yīng)比2步反應(yīng)操作更簡(jiǎn)單,且比用兩種酶分別在不同樹(shù)脂中固定獲得的2種固相酶的混合物進(jìn)行的反應(yīng)效率更高。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1描繪了使用本發(fā)明的復(fù)合固相酶制品和分別將乙內(nèi)酰脲酶和脫氨甲?;腹潭ㄓ诓煌瑯?shù)脂中制備的混合物在實(shí)施例3中從5-(對(duì)羥苯丙基)乙內(nèi)酰脲生產(chǎn)相應(yīng)的D-對(duì)羥苯丙基甘氨酸的反應(yīng)的時(shí)間過(guò)程。
圖2描繪了在實(shí)施例4中使用復(fù)合固相酶制品在重復(fù)的反應(yīng)中酶的穩(wěn)定性。
圖3描繪了實(shí)施例6中復(fù)合固相酶制品的活性與分別制備的固相酶制品混合物的活性(乙內(nèi)酰脲酶活性是復(fù)合固相酶制品的2倍)的比較。
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)過(guò)一步反應(yīng)從相應(yīng)DL-5-取代的乙內(nèi)酰脲生產(chǎn)D-氨基酸的方法,它包含在大約中性的pH下使用一種復(fù)合固相酶,所說(shuō)的復(fù)合固相酶經(jīng)過(guò)將最適pH在堿性范圍的乙內(nèi)酰脲酶(下文縮寫(xiě)成Hase)和最適pH大約為中性的D-N-氨甲酰基-α-氨基酸酰胺水解酶(下文縮寫(xiě)成DCase)在共存狀態(tài)下同時(shí)固定于固相支持物上來(lái)獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1生產(chǎn)D-氨基酸的方法,其中用于固定的復(fù)合酶是經(jīng)過(guò)分別生產(chǎn)Hase和DCase,然后將它們混合來(lái)制備的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2生產(chǎn)D-氨基酸的方法,其中所用的Hase是來(lái)自屬于桿菌屬的微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2生產(chǎn)D-氨基酸的方法,其中所用的Hase是來(lái)自桿菌屬SP.KNK108(FERM P-6056)或桿菌屬SP.KNK245(FERM BP-4863)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2生產(chǎn)D-氨基酸的方法,其中所用的Hase是來(lái)自重組大腸桿菌,特別是大腸桿菌HB101pTH104(FERMBP-4864)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的生產(chǎn)D-氨基酸的方法,其中所用的DCase來(lái)自土壤桿菌屬SP.KNK712(FERM BP-1900),假單孢菌屬SP.KNK003A(FERM BP-3181),假單孢菌屬SP.KNK505(FERM BP-3182),大腸桿菌JM109pAD108(FERM BP-3184),大腸桿菌JM109pPD304(FERM BP-3183)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的D-氨基酸的生產(chǎn)方法,其中所用的DCase來(lái)自重組微生物E.coli JM109pAD402(FERM BP-3912),E.coli JM109pAD404(FERM BP-3913),E.coli JM109pAD406(FERM BP-3914),E.coli JM109pAD416(FERM BP-3915),E.coli JM109pAD428 E.coli JM109pAD429(FERM BP-4035),E.coli JM109pAD431,E.coli JM109pAD434 E.coli JM109pAD435,E.col-iJM109pAD439,E.coli JM109pAD441,E.coli JM109pAD445,E.coliJM109pAD447,E.coli JM109pAD448,E.coli JM109pAD450,E.coli JM109pAD421,E.coli JM109pAD422,E.coliJM109pAD423,E.coliJM109pAD424,(FERM BP-4034),E.coliJM109pAD425,E.coli JM109pAD426,E.coli JM109pAD427,E.coli JM109pAD451,E.coliJM109pAD452,E.coli JM109pAD453,E.coli JM109pAD461,E.coliJM109pAD454,E.coliJM109pAD455,(FERM BP-4036),E.coliJM109pAD456,E.coli JM109pAD468,E.coli JM109pAD469,E.coli JM109pAD470,或E.coli HB101pNT4553(FERM BP-4368),其穩(wěn)定性經(jīng)過(guò)對(duì)來(lái)自土壤桿菌屬SP.KNK712(FERM BP-1900)的DCase進(jìn)行氨基酸取代來(lái)提高。
8.根據(jù)權(quán)利要求1生產(chǎn)D-氨基酸的方法,其中用于固定化的復(fù)合酶經(jīng)過(guò)同時(shí)生產(chǎn)Hase和DCase制備。
9.根據(jù)權(quán)利要求8生產(chǎn)D-氨基酸的方法,其中同時(shí)生產(chǎn)Hase和DCase的微生物是土壤桿菌SP.KNK712(FERM BP-1900),根瘤菌屬SP.KNK1415(FERM BP-4419)或假單孢菌屬SP.KNK003A(FERM BP-3181)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8生產(chǎn)D-氨基酸的方法,其中復(fù)合酶經(jīng)過(guò)培養(yǎng)含有將Hase基因和DCase基因連接于相同載體上而制備之質(zhì)粒的宿主而產(chǎn)生。
11.根據(jù)權(quán)利要求10生產(chǎn)D-氨基酸的方法,其中含有經(jīng)過(guò)將Hase基因和DCase基因連結(jié)于相同載體制備之質(zhì)粒的宿主是大腸桿菌HB101pPHD301(FERM BP-4866)或大腸桿菌JM109-pAHD101。
12.根據(jù)權(quán)利要求8生產(chǎn)D-氨基酸的方法,其中的復(fù)合酶經(jīng)過(guò)將Hase基因和DCase基因連結(jié)于具有不同復(fù)制方式的不同載體上,將這些載體導(dǎo)入相同的宿主并培養(yǎng)該宿主來(lái)生產(chǎn)。
13.根據(jù)權(quán)利要求8生產(chǎn)D-氨基酸的方法,其中復(fù)合酶經(jīng)過(guò)將產(chǎn)Hase的微生物和產(chǎn)DCase的微生物一起培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)。
14.一種復(fù)合固相酶制品,包含來(lái)自相同或不同微生物的乙內(nèi)酰脲酶和脫氨甲?;浮⒁环N抗氧化劑,錳離子和帶有所說(shuō)酶的支持物,支持物攜帶的乙內(nèi)酰脲酶和脫氨甲?;傅拿富钚栽诜磻?yīng)pH在6.5至8.0之間時(shí)幾乎相等。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種經(jīng)過(guò)一步反應(yīng)從相應(yīng)DL-5-取代的乙內(nèi)酰脲有效生產(chǎn)D-氨基酸的方法,它包含使用pH大約為中性的復(fù)合固相酶,所說(shuō)的復(fù)合固相酶經(jīng)過(guò)將具有最適pH在堿性范圍內(nèi)的乙內(nèi)酰脲酶和具有最適pH大約為中性的D-N-氨甲?;?α-氨基酸酰胺水解酶以共存狀態(tài)同時(shí)固定于一種固相支持物上來(lái)獲得。
文檔編號(hào)C12N1/15GK1129957SQ95190569
公開(kāi)日1996年8月28日 申請(qǐng)日期1995年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月24日
發(fā)明者難波弘憲, 山田勇喜雄, 矢島麗嘉, 高野昌行, 池中康裕, 高橋里美, 大橋武久 申請(qǐng)人:鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社