用于工業(yè)化生產(chǎn)手性非天然氨基酸的雙酶制備法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物化學(xué)領(lǐng)域，尤其設(shè)及氨基酸的生產(chǎn)方法，具體是指一種用于工業(yè) 化生產(chǎn)手性非天然氨基酸的雙酶制備法。
【背景技術(shù)】
[0002] 非天然氨基酸是眾多藥物尤其是近10年來新藥的核屯、中間體。眾所周知，早期 頭抱類藥物廣泛使用非天然氨基酸D-苯甘氨酸和D-對徑基苯甘氨酸作為核屯、中間體， 近20年來，越來越多的藥物廣泛使用非天然氨酸作為藥物的核屯、中間體，如左乙拉西坦使 用氨基下酸，培噪普利使用k正鄉(xiāng)氨酸，達(dá)泊西汀使用k3-苯丙氨酸，依那普利、貝 那普利、群多普利使用k高苯丙氨酸，正在Ξ期臨床的諾華的超級降壓藥物L(fēng)CZ696使用 L-2-(4-聯(lián)苯）基丙氨酸。
[0003] 非天然氨基酸的生產(chǎn)工藝主要有不對稱合成法、化學(xué)拆分法和生物酶催化法，其 中不對稱合成法由于手性催化劑和手性輔助試劑比較昂貴，目前尚不能夠廣泛用于工業(yè)化 生產(chǎn)；化學(xué)拆分法因?yàn)樵舷拇螅廴敬?，手性含量低，逐漸不符合目前清潔生產(chǎn)的要求； 生物酶催化法具有立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和、手性含量高、產(chǎn)品系列化、污染少等優(yōu)點(diǎn)， 是W后非天然氨基酸工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展方向。
[0004] 在酶法生產(chǎn)非天然氨基酸的工藝中，氨基酷化酶是主要使用的酶和工藝；目前已 經(jīng)商品化k氨基酷化酶和D-氨基酷化酶，但是目前該酶法理論轉(zhuǎn)化率只有50%，只能夠得 到一種手性異構(gòu)體，存在著成本高的問題；近年來研究發(fā)現(xiàn)，在生物體內(nèi)存在酷化消旋酶， 可W消旋心和〇-乙酷化氨基酸，因此有人將兩種酶結(jié)合起來使用生產(chǎn)非天然氨基酸，但是 眾多文獻(xiàn)均存在手續(xù)繁雜，不利于工廠生產(chǎn)，如何進(jìn)一步簡化工藝，提高收率，降低成本，依 然是該雙酶法工藝存在的問題，制備固定化菌體是一個發(fā)展方向。
[0005] 聚乙締醇是一個優(yōu)良的固定化細(xì)胞的材料，具有強(qiáng)度高、化學(xué)穩(wěn)定性好、價格低廉 的特點(diǎn)，但是單獨(dú)使用聚乙締醇作為固定化材料，有細(xì)胞毒性高、不易制備球形顆粒、凝固 速度慢的特征。明膠也為固定化細(xì)胞的常規(guī)原料，但是存在酶活性低的特征。
[0006] 固定化細(xì)胞與固定化酶不同，細(xì)胞存在細(xì)胞酶，酶在細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化底物和產(chǎn)物，均 需要通過細(xì)胞膜，因此存在細(xì)胞膜的通透性問題。固定化細(xì)胞比游離細(xì)胞通透性更差，如何 提高固定化細(xì)胞的通透性，也是一個研究方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供了一種能夠用于工業(yè)化生產(chǎn)手 性非天然氨基酸的雙酶制備法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的雙酶制備法具有如下構(gòu)成：
[0009] 該用于工業(yè)化生產(chǎn)手性非天然氨基酸的雙酶制備法，其主要特點(diǎn)是，所述的雙酶 制備法包括：
[0010] (1)用復(fù)合固定化材料同時固定化兩種基因工程菌菌體，其中所述的兩種基因工 程菌菌體為酷化消旋酶工程菌與k氨基酷化酶工程菌，或者酷化消旋酶工程菌與D-氨基 酷化酶工程菌；W滴落形式將所述的復(fù)合固定化材料滴入固定化液中，得到固定化細(xì)胞；
[0011] 似將所述的固定化細(xì)胞滲透交聯(lián)，提高所述的固定化細(xì)胞的比活力；
[0012] (3)在生物反應(yīng)器中將滲透交聯(lián)的固定化細(xì)胞進(jìn)行消旋和水解反應(yīng)，轉(zhuǎn)換乙酷 化-Dk氨基酸為手性D-氨基酸和手性k氨基酸。
[0013] 優(yōu)選地，所述的復(fù)合固定化材料為聚乙締醇和明膠的復(fù)配材料，聚乙締醇與明膠 的比例為20 :0.8~1.6。
[0014] 更優(yōu)選地，所述的固定化液為戊二醒與棚酸的復(fù)配材料，其中戊二醒為交聯(lián)劑，濃 度為5%，棚酸水溶液為固化劑，棚酸溶液抑為8. 0。
[0015] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的明膠加熱至75~85°C，后降溫至55~65°C使用。
[0016] 優(yōu)選地，所述的步驟（1)具體為：
[0017] 將所述的兩種基因工程菌菌體分別克隆至同一種大腸桿菌中，分別培養(yǎng)后得到有 效表達(dá)，離屯、得到濕菌體；W聚乙締醇與明膠的復(fù)配材料作為固定化材料共同固定酷化酶 菌體和消旋酶菌體；W滴落形式將所述的復(fù)合固定化材料滴入固定化液中，得到固定化細(xì) 胞。
[0018] 更優(yōu)選地，所述的有效表達(dá)為大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化后在抗性平板上篩選得 到的陽性菌株
[0019] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的液滴為2~3mm，用注射器抽取滴落。
[0020] 再進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的消旋和水解反應(yīng)的底物濃度為0. 1~0. 3mol。
[0021] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的生物反應(yīng)器包括流化床生物反應(yīng)器、固定床生物反應(yīng)器 或反應(yīng)蓋。
[0022] 最優(yōu)選地，每一步驟結(jié)束后對得到的固定化菌或固定化細(xì)胞進(jìn)行比活力測定。
[0023] 采用了該發(fā)明中的用于工業(yè)化生產(chǎn)手性非天然氨基酸的雙酶制備法，其技術(shù)效果 在于，一步法得到手性非天然氨基酸，其中生產(chǎn)材料安全易得，生產(chǎn)方法簡單，生產(chǎn)效率高， 操作簡便，適合大規(guī)模生產(chǎn)手性非天然氨基酸，易于推廣使用。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 為了能夠更清楚地描述本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)行進(jìn)一步的 描述。
[0025] 實(shí)施例1 :
[0026] k氨基酷化酶基因工程菌的構(gòu)建W及培養(yǎng)：
[0027] 目的基因細(xì)菌為嗜熱脂肪芽抱桿菌和受體菌化2UDE3)來自復(fù)旦大學(xué)， 陽T28aVector，PMD-18tVector，限制酶，T4DNA連接酶，Taq聚合酶為TaKaRa產(chǎn)品。
[0028] 嗜熱脂肪芽抱桿菌基因組DNA提取按照常規(guī)方法進(jìn)行，amaA基因PCT擴(kuò)增，Sense 鏈引入Ndel酶切位點(diǎn)，引物 5' -GCCATATGACAAAGGAAGAAATCAA-3'，Anti-Sense鏈引入EcoRI 酶切位點(diǎn)，5' -TTGAATTCTCAATCGTAAAGCGC-3'。常規(guī)PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收純化，克隆到 化d-18TVector，酶切鑒定測序，再用Ndel和EcoRI雙酶切amaA基因和載體陽T28a，回收 后16度連接轉(zhuǎn)化化21，培養(yǎng)，篩選陽性菌株，得到k氨基酷化酶基因工程菌化21 0E3)/ pET28a-acyl〇
[002引實(shí)施例2 :
[0030] D-氨基酷化酶基因工程菌的構(gòu)建：
[003。D-氨基酷化酶巧C. 3. 5. 1. 81，N-D-AAase)，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)Alcaligenes巧losoxidans的全序列（GenBank:D45918. 1)全合成該基因序列。設(shè)計含 有Bglll和化01位點(diǎn)的上下游引物，擴(kuò)增基因后插入祀T32a中，構(gòu)建表達(dá)載體，熱擊轉(zhuǎn)化 到化21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，抗性平板篩選，得到D-氨基酷化酶基因工程菌化21 0E3)/ pET32曰-曰曰曰se。
[003引實(shí)施例3 :
[0033] 構(gòu)建酷化消旋酶基因工程菌：
[0034] 根據(jù)已經(jīng)報道的AmycolatopsisazureaCCRC13413的酷化消旋酶基因 (GenBank:AY271627. 1)全合成該基因序列，兩端設(shè)計酶切位點(diǎn)WNdel和BamHI，亞克隆至 載體祀T24a-aar，獲得重組質(zhì)粒，回收后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌化21 0E3,培養(yǎng)檢測陽性菌，得到 酷化消旋酶基因工程菌化21 0E3) /祀T24a-aar。
[003引實(shí)施例4 :
[0036] 按照常規(guī)方法培養(yǎng)上述陽性基因工程菌，管式離屯、機(jī)20000RPM離屯、，得到濕菌 體。
[0037] 實(shí)施例5 :
[0038]取k氨基酷化酶菌體20g(菌體酶比活力120umol/g.min)，酷化消旋酶菌體 20g(菌體酶比活力210umol/g.min)，加入100G水中混合，保溫到40度均勻；取聚乙締醇20 克，明膠1克，加入水100克，混合加熱至80度溶解，降溫至60度；W上混合菌體和固定化 材料，迅速混合均勻，用注射器抽取然后再滴落到5%戊二醒的0. 02mol/Lp冊.0棚酸溶液 中，得到顆粒狀固定化細(xì)胞，過濾，加入5%多乙締多胺溶液中交聯(lián)2小時，過濾，得到顆粒 固定化細(xì)胞250克，經(jīng)過測定，固定化細(xì)胞的比活力為（菌體酶比活力6. 5umol/g.min)，用 于生物催化。
[0039] 在1L蒸饋水中加入乙酷化-Dk丙氨酸27克，配成0. 2M溶度溶液，用片堿調(diào)整 PH= 7. 5,加入上述混合濕菌體50克轉(zhuǎn)化，37度，15小時后測定，乙酷化-Dk丙氨酸小于 0. 001 %，幾乎全部轉(zhuǎn)換為k丙氨酸，經(jīng)過純化處理，得到k丙氨酸17克。WDk乙酷-亮 氨酸，Dk乙酷-鄉(xiāng)氨酸，Dk乙酷苯丙氨酸，Dk乙酷正亮氨酸為原料，分別得到k亮氨 酸，k鄉(xiāng)氨酸，k苯丙氨酸，k正亮氨酸。
[0040] 實(shí)施例6:
[0041]取D-氨基酷化酶菌體40g(菌體酶比活力65umol/g.min)，酷化消旋酶菌體 20g(菌體酶比活力210umol/g.min)，加入100G水中混合，保溫到40度均勻；取聚乙締醇20 克，明膠1克，加入水100克，混合加熱至80度溶解，降溫至60度；W上混合菌體和固定化 材料，迅速混合均勻，用注射器