專(zhuān)利名稱(chēng)：人參皂甙產(chǎn)生菌及人參皂甙生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物和應(yīng)用微生物發(fā)酵生產(chǎn)人參皂甙的方法。
人參是五加科植物人參(Panaxyginseng C.A.Meyer)的干燥根，原產(chǎn)中國(guó)東北，是我國(guó)民間最重要的一種補(bǔ)品。在三千年前《神農(nóng)本草經(jīng)》及明代《本草綱目》中已有收載，指出人參有補(bǔ)五臟、安精神、止驚悸、明目益智、補(bǔ)血，久服有輕身延年的功效。二千多年來(lái)中醫(yī)用作貴重補(bǔ)藥，治療虛弱病癥、用于休克急救、治療糖尿病等具有比較顯著的效果?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明人參對(duì)機(jī)體功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，可抑制和興奮中樞神精、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、對(duì)糖的代謝和核糖核酸、蛋白質(zhì)的合成有促進(jìn)作用。能促進(jìn)肝細(xì)胞和神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)，改善血象，增進(jìn)性功能及抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等作用。
人參的化學(xué)成分復(fù)雜，公認(rèn)的主要有效成分是人參皂甙，已確定的結(jié)構(gòu)至少30種以上。按其化學(xué)性質(zhì)可分為3類(lèi)齊墩果酸(oleanolic acid)類(lèi)如Ro，主要有抗炎作用、解毒作用、抗血栓作用；原人參二醇(Protopanaxadiol)類(lèi)如Rb1和Rb2，表現(xiàn)為中樞抑制、抗低溫、降低細(xì)胞內(nèi)鈣、抗氧化等作用；原人參三醇(Protopanaxatriol)類(lèi)如Rg1，表現(xiàn)為中樞興奮，易化學(xué)習(xí)記憶，促進(jìn)蛋白質(zhì)、DNA和RNA合成，增加海馬突觸數(shù)等作用。Rh2則對(duì)瘤細(xì)胞增殖有抑制作用[1]。日本學(xué)者Shibata、Yahara等人從人參分離出十幾種人參皂甙、測(cè)定其結(jié)構(gòu)為四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型，根據(jù)結(jié)構(gòu)特征分Rb、Rg、Ro三組[3-7]。八十年代發(fā)現(xiàn)葫蘆科的膠股藍(lán)含有Rb1、Rb3、Rd、Rf四種人參皂甙，被譽(yù)為南方人參，最近又發(fā)現(xiàn)棒錘瓜也含有人參皂甙。但人參或膠股藍(lán)、棒錘瓜均屬高等植物，需經(jīng)一年直至十幾年的栽培才能入藥，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低，而且受地理、氣候等各種栽培條件限制，數(shù)量有限，質(zhì)量差別也較大。其主要有效成份人參皂甙化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，至今尚未能合成成功，仍須從人參的根、莖、葉中提取，以滿足研究和醫(yī)療的需要[1]，價(jià)格昂貴。因此，如何用工業(yè)生產(chǎn)的方法獲得大量的人參皂甙和人參代用品是人們所企盼的。本發(fā)明將使這一愿望變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。
一、人參皂甙產(chǎn)生菌的分離與鑒定。
1988年發(fā)明人從福建永泰縣土壤中分離并提純獲得一絲狀真菌，營(yíng)養(yǎng)菌絲白色，具橫隔，分生孢子梗先端具典型的帚狀枝，孢子藍(lán)綠色。經(jīng)鑒定為叢梗孢目(Moniliales)、叢梗孢科(Moniliaceas)、青霉屬(Penicillium)，編號(hào)Z88(Penicillium sp)。該菌株菌絲生長(zhǎng)溫度5～32℃，可利用銨態(tài)氮、硝態(tài)氮，有機(jī)氮作為氮源，可利用葡萄糖、蔗糖、淀粉等作為碳源。經(jīng)多方研究后發(fā)現(xiàn)在一定培養(yǎng)條件下，Z88代謝物中含有人參皂甙。經(jīng)中國(guó)專(zhuān)利局檢索中心對(duì)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)查新結(jié)果，只有日本學(xué)者通過(guò)酶將人參皂甙Rb轉(zhuǎn)為人參皂甙Rd，至今國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有微生物產(chǎn)生人參皂甙的報(bào)導(dǎo)。該菌株已于1996年3月14日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)CGMCC NO 0257。
二、發(fā)酵方法可采用固體培養(yǎng)曲盤(pán)法或玻璃瓶固體培養(yǎng)；2、液體淺層靜止培養(yǎng)；3、液體深層通氣培養(yǎng)生產(chǎn)設(shè)備與生產(chǎn)工藝基本與抗菌素同；4、前期用液體深層培養(yǎng)，后期用淺層靜止培養(yǎng)或固體培養(yǎng)。四種發(fā)酵方式均可獲得含有人參皂甙的培養(yǎng)物。培養(yǎng)基可用馬鈴薯、懷山、大薯、小米、黃豆粉、玉米粉、蛋白胨、酵母膏、糖和麥皮、米糠等配制。pH值4.5～7.0，適宜pH5.5～7.0，培養(yǎng)溫度5～32℃，適宜溫度15～25℃。液體深層發(fā)酵通氣量1∶0.5～1，轉(zhuǎn)速50～300轉(zhuǎn)/分鐘。本方法區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)是不是用栽培人參或膠股藍(lán)等植物來(lái)獲得人參皂甙，而是通過(guò)培養(yǎng)微生物，由微生物來(lái)生成人參皂甙。
實(shí)例1培養(yǎng)基配方去皮馬鈴薯200～250g(或懷山、大薯均可)，糖20g，K2HPO40.7g、KH2PO4 0.7g，水1000ml。將馬鈴薯或懷山、大薯切片煮汁、過(guò)濾后加入上述其他成分溶化均勻。分裝于三角瓶或克氏瓶等容器，使平放后液層厚度1～2厘米。121℃高壓滅菌15～30分鐘。將Z88(CGMCC NO 0257)菌種接入，振蕩均勻后靜止培養(yǎng)，20℃條件下培養(yǎng)10天，5～15℃變溫條件下培養(yǎng)15～18天。以分生孢子成熟，并發(fā)出濃烈人參香味或青草味為結(jié)束培養(yǎng)的標(biāo)志。
實(shí)例2培養(yǎng)基馬鈴薯250g，加水煮汁1000ml(過(guò)濾去渣)，加入20g蔗糖和K2HPO4、KH2PO4各0.7g溶化后裝入三角瓶，裝量以旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)液體不濺濕瓶塞為度。20℃180rpm條件下培養(yǎng)3～4天，然后倒入淺盤(pán)進(jìn)行液體淺層靜止培養(yǎng)或拌入固體培養(yǎng)基進(jìn)行固體發(fā)酵(具體見(jiàn)實(shí)例3)。
實(shí)例3固體培養(yǎng)基①麥皮、米糠、谷殼各1/3拌勻，用20～25％馬鈴薯汁拌勻調(diào)濕(或懷山、大薯汁，均含蔗糖2％接固體菌種調(diào)至含水量60％，接液體菌種調(diào)至含水量50％)、調(diào)節(jié)pH至中性，高壓滅菌后接種。用液體菌種時(shí)用菌液調(diào)至含水量60％左右。發(fā)酵時(shí)注意品溫不要超過(guò)28℃，并注意通氣和適當(dāng)光照。培養(yǎng)6～12天分生孢子成熟，培養(yǎng)料發(fā)生濃烈的人參味和香草味后即可終止培養(yǎng)。
三、人參皂甙的提取工藝將Z88發(fā)酵液壓濾除去菌體，濾液用氨水調(diào)pH值至8，靜置12小時(shí)，壓濾，濾液40～60℃低溫減壓濃縮至原料液的1/10，加乙醇使含醇量達(dá)70～80％，混勻，靜置12～24小時(shí)。壓濾，回收乙醇至無(wú)醇味。以水孢和正丁醇萃取3次，合并萃取液，棄水層。正丁醇相減壓回收正丁醇，濃縮至浸膏狀，為減少雜質(zhì)及正丁醇?xì)埩袅浚偌?0％乙醇溶解、壓濾，濾液回收乙醇，濃縮至浸膏狀，噴霧干燥得人參總皂甙。固體發(fā)酵培養(yǎng)物需用100℃以下熱水浸泡提取，然后按上述方法處理。本方法區(qū)別于現(xiàn)有人參皂甙的提取方法是原料不是用五加科的人參根，而是用微生物培養(yǎng)物，這就發(fā)掘了豐富的用之不竭的人參皂甙新資源。并在提取工藝上加于改進(jìn)，將發(fā)酵液或浸提液調(diào)節(jié)PH值至8，提高了人參皂甙的得率。
四、Z88菌株代謝產(chǎn)物含人參皂甙的確證與含量測(cè)定確證過(guò)程以人參皂甙Rb1、Rg1標(biāo)準(zhǔn)樣品和人參根為參照，采用同一方法提取與鑒別。
(一)人參皂甙的提取1、人參根的人參皂甙提取[3、7、8]稱(chēng)取人參根(市售、東北產(chǎn))磨碎過(guò)篩(40目)人參粉15g，加甲醇300ml于索氏提取器加熱回流8小時(shí)換取溶劑一次，共提3次，合并提取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓蒸去甲醇至淺黃色浸膏狀。浸膏殘留物加50ml水溶解，溶解液移入分液漏斗，每次用30ml乙醚脫脂，共8次，棄醚層。水層用50ml飽和水正丁醇萃取8次，合并正丁醇提取液，減壓回收正丁醇至干，得淺黃色粉未為粗人參總皂甙，重0.585g(3.9％)。
2、Z88發(fā)酵液人參皂甙的提取Z88發(fā)酵液為棕色液體，振搖而產(chǎn)生蜂窩狀泡沫，具有濃厚人參味及香草味。發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾除去菌體及其他固形物，取濾液1000ml，低溫(40～60℃)減壓濃縮至50ml，移入分液漏斗，同人參根人參皂甙提取方法提取，得淺黃色粉末，重0.267g。
3、人參及Z88發(fā)酵液粗人參皂甙的精制人參根及Z88發(fā)酵液提取的粗皂甙含有雜質(zhì)，主要是糖、色素等，必須分離純化排除定性、定量的干擾。方法是取上述提取的粗皂甙分別加1～2ml甲醇溶解，將甲醇溶液緩慢逐滴滴入大量(20ml)丙酮(或丙酮∶乙醚，1∶1)溶液，劇烈攪拌，皂甙以白色絮狀沉淀析出，過(guò)濾或離心，80℃鼓風(fēng)干燥，置于干燥器(CaCl2)干燥2天后稱(chēng)重，得精制人參根總皂甙0.55g，Z88發(fā)酵液人參總皂甙0.229g。
(二)人參皂甙的鑒定1、顏色反應(yīng)取人參根及Z88發(fā)酵液總皂甙樣品少許，加冰醋酸1ml溶解，緩緩加入濃硫酸2ml，兩液界面由紅色變?yōu)榧t棕色，最后呈暗棕色。
2、比色測(cè)定人參皂甙(元)加香莢醛——高氯酸試劑，在冰醋酸溶液中加熱后顯紫色[7、9]取人參皂甙Rb1，Rg1標(biāo)樣及人參根、Z88發(fā)酵液提取精制的皂甙各1mg，用少量醇溶解，各吸100μl于試管中，加5％香莢醛——冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml混勻、密塞，置60℃水浴加熱15分鐘，取出冷卻至室溫，各處理均顯紫色，隨行試劑空白管顯黃色，原培養(yǎng)基(未接種)顯黃綠色。
比色測(cè)定結(jié)果Z88發(fā)酵液中檢出人參皂甙。
3、薄層層析取人參根及Z88發(fā)酵液精制的總皂甙各5mg加少量甲醇溶解，以硅膠G(青島海洋化工廠)薄層(涼干，105℃活化40分鐘)層離。以正丁醇——乙酸乙酯——水(4∶1∶5)展開(kāi)，以硫酸——水(1∶1)作顯色劑噴霧后涼干，105℃加熱15分鐘，各組皂甙呈不同程度紫色斑點(diǎn)。以碘蒸氣顯色(將點(diǎn)樣后硅膠板置碘氣缸中數(shù)秒鐘取出)，各組皂甙顯黃色斑點(diǎn)。二種顯色斑點(diǎn)分離結(jié)果基本一致。
4、紅外光譜、拉曼光譜測(cè)定為進(jìn)一步從結(jié)構(gòu)上確定Z88發(fā)酵液含人參皂甙，取Z88發(fā)酵液95-2、95-5、95-6和Z88(不同批次發(fā)酵液)中提取精制的皂甙試樣，送中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)所、結(jié)構(gòu)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室用NicolctMagna 750付立葉變換紅外光譜儀及910Raman付立葉變換拉曼光譜儀測(cè)定。由于人參皂甙無(wú)薩特勒標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜圖和標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜圖可查證。被測(cè)試樣均以化學(xué)對(duì)照品704-9204人參皂甙Rb1(GinsennosideRb1)及Rg1(Gensenoside Rg1)為標(biāo)準(zhǔn)參照物。溴化鉀壓卡法測(cè)試，試樣的紅外光譜表明人參皂甙四環(huán)三萜碳骨架均存在，尤其以95-2試樣幾與標(biāo)樣相同。95-2試樣的固態(tài)及水溶液的拉曼光譜亦證實(shí)試樣中四環(huán)三萜碳骨架的存在，且譜圖與標(biāo)樣很相似。
二種光譜測(cè)試結(jié)果Z88發(fā)酵液提取物檢出人參皂甙。
(三)、人參總皂甙量測(cè)定1、測(cè)定波長(zhǎng)的確定用移液管精確吸取人參皂甙Rb1標(biāo)準(zhǔn)樣甲醇溶液(2mg/2ml)100μl，加5％香莢醛-一冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，搖勻、密塞，于60℃水浴加熱15分鐘，顯紫色，取出冷卻至室溫，加入冰醋酸5ml稀釋?zhuān)瑩u勻，用722型光柵分光光度計(jì)于500-600nm波長(zhǎng)測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)為560nm，與文獻(xiàn)[6、7]報(bào)導(dǎo)一致。
同法測(cè)定Z88發(fā)酵液總皂甙的吸收?qǐng)D譜，最大吸收也在560um波長(zhǎng)處。
2、標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定精確稱(chēng)取人參皂甙Rb1標(biāo)樣5mg，加少量甲醇溶解，溶解液移入5ml容量瓶，再加甲醇至刻度。分別吸取0、50、100、150、200、250μl于磨口帶塞試管中。用熱風(fēng)在試管口吹去甲醇浴劑(勿使過(guò)熱)，各試管加入0.2ml5％香莢醛一冰醋酸溶液、高氯酸0.8ml混勻，密塞，置60℃水浴中加熱15分鐘，顯紫色，取出冷卻至室溫，各加冰醋酸5ml稀釋?zhuān)靹?，離心，取上清液于560nm波長(zhǎng)測(cè)得吸收度(OD值)見(jiàn)表1。以吸收度為縱座標(biāo)，濃度為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
表1 人參皂甙Rb1紫外光譜吸收度(OD值
3、人參根、Z88發(fā)酵液樣品人參總皂甙量測(cè)定取40目篩干燥人參根粉5g加甲醇100ml于索氏提取器回流8小時(shí)換取一次提取劑，共提取3次，合并提取液，減壓蒸干甲醇，殘?jiān)铀?0ml，每次5ml乙醚脫脂萃取共5次，棄醚層，水層用飽和水正丁醇5ml萃取共10次，減壓蒸干正丁醇，殘留物加20ml甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至30ml容量瓶?jī)?nèi)，再加甲醇至刻度，精確吸取100μl于磨口帶塞試管中，以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線。
量取Z88發(fā)酵液500ml，減壓濃縮至浸膏狀，加水30ml，每次5ml乙醚萃取脫脂共5次，棄醚層，水層用飽和水正丁醇5ml萃取共10次。減壓蒸干正丁醇，殘留物加20ml甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移干30ml容量瓶?jī)?nèi)，再加甲醇至刻度，精確吸取100μl于磨口帶塞試管中，以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線。
采用722型光柵分光光度計(jì)于560nm波長(zhǎng)，測(cè)定吸收度(OD值)，重復(fù)3次，其OD值人參根0.657、0.662、0.646，平均0.655，Z88發(fā)酵液0.691、0.700、0.699，平均0.697。
用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算總?cè)藚⒃磉傲浚Y(jié)果見(jiàn)表。
表2 人參、Z88發(fā)酵液總?cè)藚⒃磉皽y(cè)定結(jié)果
沖稀3倍比色，※※沖稀2倍比色。
以上測(cè)定結(jié)果，Z8 8發(fā)酵液1升所含人參總皂甙相當(dāng)于7.04g人參干燥根所含人參總皂甙。
本發(fā)明的主要技術(shù)特征是用微生物分離純化技術(shù)獲得一株具有產(chǎn)生人參皂甙功能的新菌株，并采用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)人參的主要有效成份——人參皂甙。以工業(yè)發(fā)酵取代傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)栽培，具有周期短、產(chǎn)量高、成本低、產(chǎn)品科技含量高的優(yōu)點(diǎn)，且不受土壤、氣候和地理?xiàng)l件的限制和影響，可以在任何地方進(jìn)行。
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權(quán)利要求
1.以青霉Z88(CGMCC NO 0257)為特征的菌株。
2.以權(quán)利要求1所述的菌株發(fā)酵生產(chǎn)含有人參皂甙的培養(yǎng)物的方法。
3.以權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)物提取人參皂甙的方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是采用①液體淺層靜止培養(yǎng)；②固體培養(yǎng)；③前期液體深層通氣培養(yǎng)，后期固體培養(yǎng)或液體淺層靜止培養(yǎng)；④液體深層通氣培養(yǎng)，四種發(fā)酵方式中的任何一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是采用以馬鈴薯、懷山、大薯等含甾體皂甙的植物和糖為組成份的培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其培養(yǎng)基pH值為4.5～7.0，適宜5.5～7.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是培養(yǎng)溫度5～32℃，適宜15～25℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是培養(yǎng)后期發(fā)出濃烈的人參味和青草味，并以此為終止培養(yǎng)的標(biāo)志。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是固體培養(yǎng)物用熱水浸提。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是發(fā)酵液或固體培養(yǎng)物浸提液調(diào)整pH值至8。
11.根據(jù)權(quán)利要求1～10中任一權(quán)利要求所述的菌株或方法獲得的培養(yǎng)物(包括發(fā)酵液)，浸提液、濾液、濃縮液和提取的人參皂甙半成品、粗制品、純品。
全文摘要
發(fā)明涉及一種微生物和人參皂甙生產(chǎn)方法，人參的主要有效成分人參皂甙至今未能合成和工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明從自然界中分離和提純了一株具有產(chǎn)生人參皂甙功能的新菌株，并采用微生物發(fā)酵方法獲得含有人參皂甙的培養(yǎng)物，從中提取人參皂甙。具有生產(chǎn)周期短、效率高、成本低、不受土壤氣候地理?xiàng)l件限制的優(yōu)點(diǎn)。其培養(yǎng)物和提取物可用于生產(chǎn)或配制各種保健品、藥品以及作為添加劑加入飲食品、飼料、化妝品等。
文檔編號(hào)C12P1/02GK1165856SQ9610747
公開(kāi)日1997年11月26日 申請(qǐng)日期1996年5月16日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月16日
發(fā)明者曾金鳳, 葉永在 申請(qǐng)人:曾金鳳, 葉永在