專利名稱：用于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的含有人參皂甙化合物k的促進(jìn)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的含有人參皂甙(ginsenoside)化合物K的促進(jìn)劑。更具體地，本發(fā)明提供了人參皂角苷(ginseng saponin)的主要代謝產(chǎn)物20-氧-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參萜二醇(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol)(稱為“化合物K”)的一種新的功效，即在人體細(xì)胞中提高透明質(zhì)酸合成酶(HAS)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)透明質(zhì)酸(HA)的產(chǎn)生，并且本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的含有化合物K的促進(jìn)劑。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸是一種非硫酸化的粘多糖，是由重復(fù)的葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺殘基構(gòu)成的線性多糖，分子量很大，在200,000-400,000之間。透明質(zhì)酸是胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)組分，并涉及水分保持、細(xì)胞外間隙的維護(hù)、細(xì)胞生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)的儲(chǔ)存和擴(kuò)散，以及細(xì)胞增殖、分化和遷移。
有報(bào)道稱，在哺乳動(dòng)物中50％或更多的透明質(zhì)酸存在于皮膚中，特別是存在于表皮的細(xì)胞外間隙和真皮的結(jié)締組織中，并且由角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞合成。另外，透明質(zhì)酸在人體皮膚中的含量隨著年齡的增加而減少，這導(dǎo)致皮膚失去彈性并且保水性降低(Biochem Biophys Acta 279，265-275，Carbohydr Res 159，127-136，Int J Dermatol 33，119-122)。
人的關(guān)節(jié)囊由外面的纖維層和里面的滑膜組成，其中含有透明質(zhì)酸和糖蛋白的滑液起關(guān)節(jié)潤(rùn)滑劑的作用。然而，有報(bào)道認(rèn)為，在骨關(guān)節(jié)炎(退化性關(guān)節(jié)炎)中，由于產(chǎn)生的透明質(zhì)酸減少和由蛋白水解酶引起的破壞的加速，因此關(guān)節(jié)中透明質(zhì)酸的含量逐漸降低了。因此，隨著關(guān)節(jié)中透明質(zhì)酸含量的減少，關(guān)節(jié)不能吸收或分散震動(dòng)，因此會(huì)加速軟骨損傷。因此，1997年，F(xiàn)DA提出注射透明質(zhì)酸作為緩解骨關(guān)節(jié)炎疼痛的措施，并沿用至今。然而，最終可能還是提高透明質(zhì)酸的生物合成更有效。
已報(bào)道多種生長(zhǎng)因子和反式視黃酸、N-甲基絲氨酸等可提高培養(yǎng)的表皮細(xì)胞中透明質(zhì)酸的生物合成(Biochem.J.258，919-922，Biochem.J.283，165-170，Biochem.J.307817-821，J.Biol.Chem.272，4787-4794，J InvestDermatol 92，326-332，Biol Pharm Bull 17，361-364，Skin Pharmacol Appl SkinPhysiol 12，276-283)。另外，也有報(bào)道稱將雌二醇及其衍生物施用到皮膚上可提高透明質(zhì)酸的生物合成(Steroids 16，1-3，J Invest Dermatol 87，668-673，Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 15，175-183)。然而，目前還不完全清楚透明質(zhì)酸代謝的詳細(xì)機(jī)制，僅知道透明質(zhì)酸是在質(zhì)膜的內(nèi)表面由透明質(zhì)酸合成酶合成的，并在合成的同時(shí)透過所述膜分泌到細(xì)胞外間隙(J.Biol.Chem.272，13997-14000)。
目前，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已鑒定了三種不同的HAS基因HAS1、HAS2和HAS3，它們高度同源。關(guān)于這些基因，有報(bào)道認(rèn)為當(dāng)培養(yǎng)表皮細(xì)胞系的培養(yǎng)基中含有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)時(shí)可提高HAS2基因的表達(dá)(J.Biol.Chem.276，20428-20435)。然而，到目前為止，對(duì)于細(xì)胞和組織中透明質(zhì)酸的分布以及涉及透明質(zhì)酸的多種因子和酶如調(diào)控透明質(zhì)酸活性的HAS或因子的研究還不夠。
因此，幾項(xiàng)連續(xù)的研究工作已經(jīng)注意到了透明質(zhì)酸的可能性，并且進(jìn)行了大量研究來尋找透明質(zhì)酸有效的產(chǎn)生和注射方法以及提高透明質(zhì)酸生物合成的方法。然而，還沒有獲得明顯的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
在這些情況下，本發(fā)明人進(jìn)行研究來尋找一種在人體中補(bǔ)充透明質(zhì)酸的有效方法。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，人參皂角苷的主要代謝產(chǎn)物化合物K(20-氧-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參萜二醇)能提高人體細(xì)胞中編碼透明質(zhì)酸合成酶的基因的表達(dá)并因此可以促進(jìn)人體內(nèi)透明質(zhì)酸的產(chǎn)生，所述人參皂角苷具有提高免疫、抑制腫瘤血管產(chǎn)生以及抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散的功效。也就是說，用化合物K治療可以促進(jìn)透明質(zhì)酸的產(chǎn)生，從而提高人體內(nèi)透明質(zhì)酸的含量。這個(gè)結(jié)果表明化合物K可應(yīng)用于多種利用透明質(zhì)酸功效的用途，如改善皮膚彈力和避免皮膚干燥或衰老的護(hù)膚作用以及治療或預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎的藥用作用。本發(fā)明就是根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)而完成的。
因此，本發(fā)明的目的是提供化合物K的一種新用途，即提高透明質(zhì)酸合成酶基因的表達(dá)并由此促進(jìn)透明質(zhì)酸的產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的并含有化合物K作為有效成分的促進(jìn)劑。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供化合物K可應(yīng)用于多種利用透明質(zhì)酸功效的用途的可能性，如改善皮膚彈力和避免皮膚干燥或衰老的護(hù)膚作用以及治療或預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎的藥用作用。
為實(shí)現(xiàn)這些目的，本發(fā)明提供化合物K的一種新的功效，其中已知該化合物具有提高免疫、抑制腫瘤血管產(chǎn)生以及抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散的功效。也就是說，本發(fā)明提供化合物K的一種新用途即提高透明質(zhì)酸合成酶基因的表達(dá)并由此促進(jìn)透明質(zhì)酸的產(chǎn)生。
下面是本發(fā)明的詳細(xì)描述。
化合物K，即由下列分子式1所代表的20-氧-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參萜二醇，是人參皂角苷通過人體腸道細(xì)菌分解的主要代謝產(chǎn)物(Hasegawa，H.，Sung，J.H.，Matsumiya.S.，Uchiyama.M.，(1996)PlantaMedica 62，453-457)。
分子式1
從人參中獲得的人參皂甙及其衍生物為達(dá)瑪烷系列的三萜化合物，具有如下結(jié)構(gòu)糖如葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖等通過醚鍵與原人參萜二醇或原人參萜三醇連接。迄今為止，已經(jīng)從人參(KOREA INSAM)中總共分離出29種人參皂甙。1964年，Shibata將人參皂角苷的成分命名為“人參皂甙”，所述人參皂甙是指在人參中含有的糖苷。根據(jù)在薄層層析(TLC)中分離的展開順序可將人參皂甙分為人參皂甙-Ro和人參皂甙-Ra、-Rb1、-Rb2、-Rc、-Re、-Rf、-Rg1、-Rg2、-Rg3和-Rh，所述人參皂甙-Ro是齊墩果烷皂角苷家系。已知根據(jù)連接于糖苷配基上的人參皂角苷的類型、數(shù)目或糖的位置，人參皂角苷可顯示出不同的藥用功效。已開展了許多關(guān)于人參中大量存在并容易分離的主要皂角苷的藥用功效方面的研究。然而，只開展了少量關(guān)于只在紅人參中存在的少量皂角苷或通過人腸道細(xì)菌分解的皂角苷代謝產(chǎn)物的藥用功效方面的研究。
在人參皂角苷中，化合物K，即20-氧-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參萜二醇，是由一個(gè)糖分子(葡萄糖)連接到原人參萜二醇上而組成的。已知化合物K具有抑制癌細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及加強(qiáng)抗癌試劑的抗癌活性的藥用功效。特別是，對(duì)皂角苷代謝產(chǎn)物的大量研究發(fā)現(xiàn)人參皂角苷的藥用功效是由通過人腸道細(xì)菌分解的代謝產(chǎn)物而不是由皂角苷本身產(chǎn)生的(Chem Pharm Bull 38(10)2859-2861，Bio.Pharm.Bull 25(6)743-747)。
本發(fā)明人證實(shí)在由化合物K處理的人體表皮和真皮細(xì)胞系即角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系HaCaT和成纖維細(xì)胞系HDF中，HAS2基因表達(dá)提高。也就是說，與沒有處理的相比，用化合物K處理24小時(shí)可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞和HDF細(xì)胞中的HAS2基因表達(dá)分別提高3倍和2.5倍。此外，在24小時(shí)培養(yǎng)和48小時(shí)培養(yǎng)期間，用1μM化合物K處理的HaCaT細(xì)胞的HAS2基因表達(dá)分別提高大約3倍和大約5倍。這些結(jié)果表明化合物K具有促進(jìn)人體細(xì)胞中HAS2基因表達(dá)的功效。同時(shí)，證實(shí)了通過化合物K的處理可以提高人體細(xì)胞培養(yǎng)中透明質(zhì)酸的含量。
另外，本發(fā)明人證實(shí)在由化合物K處理的無毛小鼠皮膚中透明質(zhì)酸的產(chǎn)量提高了。當(dāng)將化合物K加在膜片上并施用到無毛小鼠的背部皮膚上時(shí)，表皮和真皮中的透明質(zhì)酸產(chǎn)量提高大約3倍。這些結(jié)果顯示化合物K在生物體中有促進(jìn)HA產(chǎn)生的功效。
最后，本發(fā)明人證實(shí)了當(dāng)將含有化合物K的外用組合物施用到人體皮膚上時(shí)會(huì)改善皺紋、水合作用、彈性、光滑度和亮度。
在本發(fā)明中采用的化合物K可以是用常規(guī)方法獲得的天然化合物K或合成的化合物K，但不限于此?；衔颣可通過下述方法獲得將純化的人參皂角苷溶解在水性溶劑如蒸餾水或緩沖液中，或者溶解在水性溶劑與有機(jī)溶劑的混合物中，然后與從青霉菌(Penicillium)中分離的柚苷酶或從曲霉菌(Aspergillus)中分離的果膠酶中的至少一個(gè)反應(yīng)，但并不限制于該方法。
本發(fā)明顯示化合物K可提高HAS2基因表達(dá)并促進(jìn)透明質(zhì)酸產(chǎn)生。相應(yīng)地，化合物K可以作為一種有效組分加入到利用透明質(zhì)酸功效的護(hù)膚外用組合物中。例如，可以將其加入到用于改善皮膚彈力和避免皮膚干燥或衰老的護(hù)膚外用組合物中。另外，可以將其添加到通過給藥透明質(zhì)酸來治療或預(yù)防疾病如骨關(guān)節(jié)炎的藥物中。然而，化合物K的應(yīng)用并不限制于此。


圖1是HAS2基因的定量RT-PCR結(jié)果，用來鑒定用不同濃度化合物K處理后角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系HaCaT(圖1a)和成纖維細(xì)胞HDF(圖1b)中HAS2mRNA的表達(dá)；圖2是HAS1、HAS2和HAS3基因的定量RT-PCR結(jié)果，用來鑒定用不同濃度化合物K處理后HaCaT細(xì)胞中HAS mRNA的表達(dá)；圖3顯示化合物K對(duì)透明質(zhì)酸在培養(yǎng)的HaCaT和HDF細(xì)胞中的分布的影響。在用1μM化合物K處理后，用免疫細(xì)胞化學(xué)法(immunocytochemicalmethod)證實(shí)透明質(zhì)酸產(chǎn)量的增加，然后對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量；圖4顯示在由化合物K處理的無毛小鼠的背部皮膚中透明質(zhì)酸產(chǎn)量的增加，通過免疫組織化學(xué)染色法證實(shí)；圖5顯示用含化合物K的外用組合物處理時(shí)，人體皮膚形態(tài)的變化。
具體實(shí)施例方式
將通過下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，這不應(yīng)該被認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。另外，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)作出各種各樣的變更和變化，而不背離本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1化合物K的制備將10克人參提取物(紅人參、白人參以及人參根毛和人參葉)溶解在2升檸檬酸鹽緩沖液中(pH 4.0)。再加入10克柚苷酶(Sigma，St.Louis，MO)、10克果膠酶(Novozyme，Copenhagen，Denmark)，然后將得到的混合物置于38℃水浴中培養(yǎng)48小時(shí)。酶促水解完成后，將反應(yīng)混合物用2升醋酸乙酯進(jìn)行萃取，然后在真空條件下干燥，獲得2.8克殘余物質(zhì)。為了純化化合物K，對(duì)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行硅膠柱層析，先用氯仿-甲醇(9∶1)洗脫，然后再用氯仿-甲醇(6∶1)洗脫，獲得0.28克純的化合物K。
實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例1化合物K對(duì)人體表皮細(xì)胞系HaCaT中HAS2基因表達(dá)的效果<細(xì)胞培養(yǎng)>
自主無限增殖化人體角質(zhì)細(xì)胞系HaCaT由N.E.Fusenig博士(DeutschesKerbsforschungszentrum(DKFZ)，Heidelberg，Germany)提供，人體二倍體成纖維細(xì)胞系HDF由S.C.Park博士(Seoul National University，Seoul，Korea)提供。
將細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)中，其中該培養(yǎng)基中添加了10％胎牛血清(HyClone)、碳酸氫鈉(3.6克/升)以及抗生素鏈霉素(100微克/毫升)和青霉素(100單位/毫升)(LifeTechnologies，Inc.)，培養(yǎng)條件為37℃、含5％CO2和95％空氣的濕潤(rùn)氣體中。每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基。在達(dá)到最大的細(xì)胞密度時(shí)，細(xì)胞以1∶5的分裂比例重新培養(yǎng)。在用化合物K處理之前48小時(shí)，將細(xì)胞接種到組織培養(yǎng)瓶中，每75平方厘米含1×105個(gè)細(xì)胞，然后在含10％胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。接著，在無血清培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24小時(shí)，然后在添加了1-5μM化合物K的新鮮無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)3、6、12、24或48小時(shí)。作為對(duì)照，細(xì)胞在添加了0.01％賦形劑(vehicle)(二甲亞砜，DMSO)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在對(duì)照中，沒有觀察到DMSO對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響。
<RNA的制備>
將HaCaT細(xì)胞和HDF細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)(Life Technologies，Inc.)洗滌2次，并根據(jù)操作指南用TRIzol試劑(GibcoBRL Life Technologies，Grand Island，NY)分離全部的細(xì)胞RNA。用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。
<用定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法證實(shí)化合物K對(duì)HAS1、HAS2和HAS3mRNA合成的影響>
將定量好的全部RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后用HAS1、HAS2和HAS3特異性引物進(jìn)行RT-PCR。簡(jiǎn)要地說，在25微升反應(yīng)混合物中對(duì)4微克的全部RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，其中所述反應(yīng)混合物中含有2.5單位/微升Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1單位/微升核糖核酸酶(RNase)抑制劑、5mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3)、2.5μM寡聚(dT)(oligo(dT))引物和1mM脫氧核糖核苷酸(dNTP)。反應(yīng)混合物在42℃下溫和培養(yǎng)60分鐘來進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。然后，通過在85℃加熱5分鐘使反轉(zhuǎn)錄酶失活。
接著，用5微升得到的混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用Perkin-Elmer Cycler9600(Perkin-Elmer Applied Biosystems，F(xiàn)oster，CA)，在50微升反應(yīng)混合物中進(jìn)行每個(gè)PCR反應(yīng)，其中所述的反應(yīng)混合物含有0.04單位/微升AmpliTaqTMDNA聚合酶(Perkin Elmer，Shelton，Connecticut)、50mM Tris(pH 8.3)、0.25毫克/毫升BSA、3mM MgCl2、0.25mM dNTP以及0.25μM正向或反向PCR引物(表1)，PCR溫度形式包括在起始循環(huán)之前95℃變性5分鐘，然后95℃45秒、60℃45秒、72℃1分鐘循環(huán)25-35次。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并用溴化乙錠染色來顯現(xiàn)出來。結(jié)果顯示在圖1和圖2中。GAPDH是用于標(biāo)定擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)。
表1用于定量RT-PCR的HAS1、HAS2和HAS3特異性引物的序列

圖1是HAS2基因的定量RT-PCR結(jié)果，用于鑒定用不同濃度化合物K處理后角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系HaCaT(圖1a)和成纖維細(xì)胞HDF(圖1b)中HAS2mRNA的表達(dá)，并顯示出化合物K對(duì)HAS2mRNA水平的影響。在該實(shí)驗(yàn)中，在對(duì)照中檢測(cè)到少量的HAS2mRNA，但在由化合物K處理的HaCaT細(xì)胞和HDF細(xì)胞中HAS2mRNA分別提高了3倍和2.5倍。
圖2顯示化合物K對(duì)HaCaT細(xì)胞中HAS1、HAS2和HAS3轉(zhuǎn)錄的影響。HaCaT細(xì)胞在含0μM或1μM化合物K的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)或48小時(shí)，然后從中提取全部RNA。將全部RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并通過循環(huán)30次PCR進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果，用化合物K處理的HaCaT細(xì)胞的HAS2轉(zhuǎn)錄在24小時(shí)和48小時(shí)培養(yǎng)期間分別提高3倍和5倍。然而，化合物K對(duì)檢測(cè)到的少量的HAS1和HAS3mRNA的水平?jīng)]有影響。
實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例2化合物K對(duì)人體表皮細(xì)胞系和真皮細(xì)胞系中透明質(zhì)酸產(chǎn)生的影響將HaCaT和HDF細(xì)胞用PBS清洗，然后在室溫下用含有2％低聚甲醛(體積/體積)和0.5％戊二醛(體積/體積)的固定液(fixative)固定20分鐘。固定后，上述細(xì)胞用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)洗三次，每次2分鐘，然后在室溫下用含有1％牛血清清蛋白(重量/體積)的所述相同緩沖液封閉30分鐘，所述牛血清清蛋白含有0.1％Triton X-100(體積/體積)。用生物素化的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(bHABP)(Seikagaku，Tokyo，Japan)的特異性探針進(jìn)行透明質(zhì)酸染色。bHABP探針在3％牛血清清蛋白(重量/體積)中稀釋到5微克/毫升，然后加到固定的細(xì)胞中，并在4℃下培養(yǎng)過夜。清洗后，加入抗生物素蛋白-異硫氰酸熒光素(FITC)。圖像用熒光顯微鏡分析，并在圖3中顯示。
圖3顯示化合物K對(duì)透明質(zhì)酸在培養(yǎng)的HaCaT和HDF細(xì)胞中的分布的影響。在用1μM化合物K處理(圖3b，圖3d)或不用化合物K處理(圖3a，圖3c)時(shí)培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞(圖3a，圖3b)和HDF細(xì)胞(圖3c，圖3d)。
實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例3化合物K對(duì)無毛小鼠皮膚中透明質(zhì)酸產(chǎn)量的影響<無毛小鼠及其處理>
從Biogenomics(Seoul，Korea)購(gòu)買30周大的雄性白化Hoshr-1小鼠，對(duì)常規(guī)的嚙齒類飼料和水沒有限制。在控制條件(24±2℃和55±10％濕度)下，適應(yīng)1周后，將200毫升在賦形劑(1，3-BG∶乙醇＝7∶3)中的1％(w/v)化合物K溶液施用于小鼠背部，2天施用2次。在最后給藥后24小時(shí)收集每個(gè)皮膚樣品。
<在由化合物K處理的皮膚上用透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色>
用bHABP(Seikagaku)進(jìn)行透明質(zhì)酸染色。每個(gè)皮膚樣品用含2％低聚甲醛和0.5％戊二醛的PBS固定，并包埋、切片。去除石蠟之后，將切片在含0.3％H2O2的甲醇中室溫培養(yǎng)30分鐘，用PBS清洗，然后在1％牛血清清蛋白中封閉。接著，將切片在含5毫克/毫升bHABP的PBS中于4℃培養(yǎng)，清洗后，用以1/300稀釋于PBS中的鏈霉親和素-過氧化物酶室溫培養(yǎng)30分鐘。清洗后，每個(gè)載玻片用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)四鹽酸鹽在室溫下處理5分鐘。用蒸餾水清洗后，用Mayer蘇木精(Mayer’s hematoxylin)進(jìn)行染色。
<對(duì)免疫組織化學(xué)染色方法獲得的圖像和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析>
用ImagePro-Plus(Media Cybemetics，Silver Spring，MD)通過數(shù)字圖像分析對(duì)染過色的載玻片進(jìn)行定量表征。使用安裝了縮微圖象攝影機(jī)(MicroImage Video Camera)(Boyertown，PA)的Olympus BH-2顯微鏡來采集圖像。從幾個(gè)載玻片的10個(gè)隨機(jī)圖像系列收集參數(shù)，如總面積、總?cè)旧娣e和染色強(qiáng)度，由此獲得用于統(tǒng)計(jì)比較的平均值。用下列方程式1來確定染色數(shù)值。
方程式1染色強(qiáng)度X(總?cè)旧娣e/總面積)用SigmaStat(SPSS Inc.，Chicago，IL)進(jìn)行事后Duncan檢驗(yàn)(post-hogDuncan test)的單向方差分析(one-way ANOVA)。數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示。顯著性為p＜0.05。
圖4顯示透明質(zhì)酸大量沉積在表皮和真皮中，表明透明質(zhì)酸在由化合物K處理的無毛小鼠皮膚中大量增加。如圖4a和圖4b中所示，增加的透明質(zhì)酸主要在用化合物K處理的細(xì)胞間真皮乳突層以及小鼠皮膚的活表皮中。圖4c是定量圖像分析的結(jié)果，顯示與未被處理的皮膚相比，化合物K處理的小鼠皮膚的表皮和真皮中HA的量分別提高3倍。(p＜0.05)。
上述結(jié)果證實(shí)用化合物K處理皮膚細(xì)胞可提高透明質(zhì)酸合成酶HAS2基因的表達(dá)，從而促進(jìn)皮膚表皮和真皮中透明質(zhì)酸的產(chǎn)生。
實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例4護(hù)膚功效的評(píng)價(jià)<外敷>
為評(píng)價(jià)含化合物K的美容組合物的功效，對(duì)有面部皺紋和細(xì)小皺紋(finewrinkle)的49位年齡在31到37歲的健康韓國(guó)女性進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)。根據(jù)皮膚類型將她們分為三組正常皮膚、干性皮膚和混合型皮膚，并對(duì)她們施用含0.03％化合物K或不含化合物K的兩種油-水乳劑。在實(shí)驗(yàn)前，用globalphotodamage score對(duì)每個(gè)志愿者進(jìn)行面部皺紋和細(xì)小皺紋的評(píng)價(jià)。獲得使用前和使用后4周、8周和12周的數(shù)值。每個(gè)志愿者每天在家在面部皮膚上施用測(cè)試樣品兩次(早上和晚上)，特別是在眼部周圍的皺紋上。
<效果評(píng)價(jià)>
由志愿者和皮膚專業(yè)檢查員對(duì)護(hù)膚功效如面部皺紋、細(xì)小皺紋、水合、彈性、光滑度、粗糙度和亮度進(jìn)行評(píng)價(jià)。用Camscope(DCS-105型)通過光度測(cè)定法以及用Skin-Visiometer SV600(Courage&Khazaka，Germany)通過硅復(fù)制品的圖像分析來確定使用外用樣品前后的差別和改善情況。
圖5顯示由皮膚專業(yè)檢查員使用global photodamage score的評(píng)價(jià)結(jié)果。將使用前測(cè)量的起始數(shù)值和使用含或不含化合物K的乳劑12周后測(cè)量的數(shù)值進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)化合物K使得面部皺紋和細(xì)小皺紋在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少(圖5a)。在臨床實(shí)驗(yàn)中，76％的志愿者使用8周后和92％的志愿者使用12周后給出了正面和肯定的評(píng)價(jià)(圖5b)。
在皮膚復(fù)形分析中，發(fā)現(xiàn)在使用8周后整體皺紋在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地減少。92％的志愿者回答說皮膚光滑度有改善；68％的志愿者回答說皮膚亮度有改善；68％回答說皮膚彈性有改善；94％回答說皮膚粗糙度有改善。88％的志愿者回答說皮膚的保濕能力提高了。
工業(yè)適用性如上所述，人參皂角苷的主要代謝產(chǎn)物化合物K能提高編碼透明質(zhì)酸合成酶2的基因的表達(dá)，由此激活生物體中透明質(zhì)酸的產(chǎn)生。因此，化合物K能用于有效避免皮膚彈性降低、水分保持降低和皮膚衰老。另外，它可利用透明質(zhì)酸的治療價(jià)值來有效地預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎。
序列表<110>株式會(huì)社太平洋<120>用于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的含有人參皂甙化合物K的促進(jìn)劑<130>15075YOL<150>KR10-2004-0084036<151>2002-12-26<160>6<170>PatentIn 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增HAS1基因的PCR擴(kuò)增引物<400>1accatcgcct tcgccctgct catcc 25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增HAS1基因的PCR擴(kuò)增引物<400>2cccgctccac attgaaggct accca 25<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于擴(kuò)增HAS2基因的PCR擴(kuò)增引物<400>3tttctttatg tgactcatct gtctcaccgg 30<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增HAS2基因的PCR擴(kuò)增引物<400>4attgttggct accagtttat ccaaaggg 28<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增HAS3基因的PCR擴(kuò)增引物<400>5cagaaggctg gacatataga ggaggg 26<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增HAS3基因的PCR擴(kuò)增引物<400>6attgttggct accagtttat ccaaacg 2權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的促進(jìn)劑，該促進(jìn)劑含有由分子式1所表示的化合物K(20-氧-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參萜二醇)作為有效成分分子式1
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)劑，其中，所述化合物K通過提高透明質(zhì)酸合成酶基因的表達(dá)來促進(jìn)透明質(zhì)酸的產(chǎn)生。
3.一種抗骨關(guān)節(jié)炎試劑，其中，該試劑含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的促進(jìn)劑。
4.一種抗衰老試劑，其中，該試劑含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的促進(jìn)劑。
全文摘要
提供一種用于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的含有人參皂甙化合物K的促進(jìn)劑，更具體地，提供人參皂角苷的主要代謝產(chǎn)物20－氧－β－D－吡喃葡萄糖基－20(S)－原人參萜二醇(化合物K)的一種新的功效，即可提高人體細(xì)胞中透明質(zhì)酸合成酶基因的表達(dá)從而促進(jìn)透明質(zhì)酸的產(chǎn)生，還提供含有用于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的促進(jìn)劑作為有效成分的抗衰老試劑。
文檔編號(hào)A61K31/704GK1717414SQ03825714
公開日2006年1月4日 申請(qǐng)日期2003年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月26日
發(fā)明者金修晶, 姜炳永, 曹始泳, 張希景, 成大石, 廉明勛, 禹光植, 金德姬, 金漢坤, 沈榮哲, 姜鶴熙, 李容成 申請(qǐng)人:株式會(huì)社太平洋