專利名稱：枯草桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基的建立及其發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物工程領(lǐng)域，是一種適合枯草桿菌生長(zhǎng)及生產(chǎn)基因工程產(chǎn)物用培養(yǎng)基的制備方法及其發(fā)酵方法。
目前基因工程的受體菌常用的有大腸桿菌，枯草桿菌，酵母菌等。大腸桿菌由于會(huì)產(chǎn)生一些不溶性蛋白，體內(nèi)不具備某些必要的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯后的修飾，而受到限制。酵母菌由于基因表達(dá)水平較低，甚至對(duì)某些蛋白會(huì)產(chǎn)生不適應(yīng)的糖基化，這些都對(duì)基因產(chǎn)品生產(chǎn)不利。而枯草桿菌能在廉價(jià)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，基因表達(dá)產(chǎn)物分泌于體外，它對(duì)外來基因具有充分表達(dá)的系統(tǒng)，而沒有限制，生長(zhǎng)速度快，對(duì)人、動(dòng)物、植物、環(huán)境安全可靠，而受到重視.另外，該菌具有較強(qiáng)的蛋白水解酶而水解基因表達(dá)產(chǎn)物，所以，不少研究者應(yīng)用化學(xué)、物理方法誘變，或者用其他手段使枯草桿菌的蛋白酶基因缺失，從而降低蛋白酶活性，保證基因表達(dá)產(chǎn)物不被水解。目前常用的枯草桿菌培養(yǎng)基色素深，直接影響產(chǎn)品的分離純化，因而也影響產(chǎn)量，況且不同的枯草桿菌有不同的最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基，而生產(chǎn)不同的基因產(chǎn)物又往往使用不同的培養(yǎng)基，即使使用最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基，但未必是基因產(chǎn)物生產(chǎn)最佳培養(yǎng)基，表達(dá)量未必最高。因此篩選一個(gè)既適合菌體生長(zhǎng)又有利于表達(dá)、分泌基因產(chǎn)物的生產(chǎn)用培養(yǎng)基，在其他條件相同的情況下，培養(yǎng)基的選用顯得十分重要。所以在國(guó)際工業(yè)界、發(fā)酵行業(yè)、生產(chǎn)企業(yè)，培養(yǎng)基配方及以此培養(yǎng)基生產(chǎn)目的產(chǎn)物的工藝路線成為該領(lǐng)域追逐的目標(biāo)。
本發(fā)明的目的是篩選一種適合枯草桿菌生長(zhǎng)，并充分表達(dá)基因工程產(chǎn)物的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。
本發(fā)明的一種適合枯草桿菌生長(zhǎng)的半合成培養(yǎng)基，其制備方法是無機(jī)鹽及磷酸緩沖液，無機(jī)鹽和磷酸緩沖液的成份主要是(g/L)Na2HPO44.0～7.0 Na2SO40.05～0.20KH2PO44.0～7.0 Mgcl20.02～0.20NH4cl0.5～2.0 MnCl20.001～0.008FeCl20.002～0.008有機(jī)組成是(g/L) 葡萄糖1～10酵 母2～10蛋白胨2～10其余是水。
該培養(yǎng)基成份含有枯草桿菌生長(zhǎng)的必要元素和有機(jī)含量，經(jīng)摸索其成份和含量均比較合理，降低了培養(yǎng)基色素，再經(jīng)下述滅菌處理后，能有效地作為枯草桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基制備時(shí)在無機(jī)鹽和磷酸緩沖液中加入酵母、蛋白胨后調(diào)節(jié)pH7.0～8.0，在0.04～0.05Mpa壓力下滅菌15～30分鐘后，再加入滅菌后的葡萄糖作為培養(yǎng)基使用。
本發(fā)明培養(yǎng)枯草桿菌的發(fā)酵方法如下將枯草桿菌在LB培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，然后挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)二次，其條件是溫度為32～40℃，轉(zhuǎn)速為160～240r/分下培養(yǎng)10～18小時(shí)，然后以接種量5～10％進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵條件為溫度30～38℃，轉(zhuǎn)速400～600轉(zhuǎn)/分，空氣流量1∶0.4～1∶1，未接種時(shí)溶氧90～98％；接種后溶氧量10～40％，pH為7.0～8.0，pH不宜太低，太低了菌不易生長(zhǎng).接種后在上述條件下維持0.5～1.5小時(shí)，然后升溫35～40℃，在上述同樣條件下維持3.0～4.0小時(shí)后添加補(bǔ)料液，補(bǔ)料添加方法是將有機(jī)物組分與濃縮的無機(jī)鹽及磷酸緩沖液等體積混合，濃縮的目的是使發(fā)酵液體積不至于太大。添加量為發(fā)酵液體積的1～10％，繼續(xù)發(fā)酵至5～7小時(shí)后，與前述同樣條件再次添加補(bǔ)料液，添加量同前。跟蹤基因產(chǎn)物達(dá)最高時(shí)結(jié)束發(fā)酵。
補(bǔ)料的組分其無機(jī)鹽及磷酸緩沖液與發(fā)酵培養(yǎng)基相同，而有機(jī)組成為(g/L) 葡萄糖4～7酵 母2～5蛋白胨200～400有機(jī)成分濃度較大，是為減少發(fā)酵液體積，補(bǔ)料的添加速度也很重要，一般控制在2～8mL/分，補(bǔ)料添加方法是將有機(jī)物組分與濃縮的無機(jī)鹽及磷酸緩沖液等體積混合，如以一升發(fā)酵液體積計(jì)算，8ml 30％的葡萄糖和8ml濃縮的無機(jī)鹽及磷酸緩沖液培養(yǎng)基，分別滅菌后混合即可。補(bǔ)料量通常為發(fā)酵液體積的1～10％，若溶氧量突然偏離設(shè)定值，可調(diào)節(jié)補(bǔ)料速度，此點(diǎn)在發(fā)酵后期尤其重要，不然溶氧不足會(huì)出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象，影響發(fā)酵產(chǎn)量。
本發(fā)明建立的培養(yǎng)基和發(fā)酵控制模式，適合于基因在枯草桿菌中高效穩(wěn)定地表達(dá)，用本發(fā)明方法發(fā)酵菌體，每毫升菌體濃度達(dá)OD600≈15～24，以發(fā)酵生產(chǎn)的控制條件來控制蛋白酶的分泌，使基因表達(dá)產(chǎn)物不被水解，大大地提高了基因表達(dá)量。本發(fā)明用于發(fā)酵基因工程產(chǎn)物的發(fā)酵液色素低，有利于分離提純酶制品，不僅提高了產(chǎn)品質(zhì)量，而且提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量，從而大大降低成本。
實(shí)施例(以溶葡球菌酶為例)本發(fā)明用于溶葡球菌酶發(fā)酵方法如下將枯草桿菌(BR151)轉(zhuǎn)化子在LB培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，然后挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)二次，培養(yǎng)條件溫度為35℃，轉(zhuǎn)速為160r/分下培養(yǎng)16小時(shí)，再以接種量4％擴(kuò)大培養(yǎng)于發(fā)酵培養(yǎng)液中。發(fā)酵培養(yǎng)液中無機(jī)鹽和磷酸緩沖液的成份主要是(g/L)Na2HPO44.0 Na2SO40.05KH2PO44.0 Mgcl20.02NH4cl1.0 MnCl20.001FeCl20.002其中有機(jī)組成是(g/L) 葡萄糖3酵母3蛋白胨2其余是水。在無機(jī)鹽和磷酸緩沖液中加入酵母、蛋白胨調(diào)pH7.0后，在0.04Mpa壓力下滅菌20分鐘，再加入滅菌的3g/L葡萄糖作為培養(yǎng)基。發(fā)酵條件為溫度32℃，轉(zhuǎn)速450轉(zhuǎn)/分，空氣流量1∶0.6，溶氧30％，接種后在上述條件下維持1.5小時(shí)，然后升溫35℃，上述同樣條件下維持2小時(shí)后添加補(bǔ)料液，補(bǔ)料添加方法是將有機(jī)物組分與濃縮的無機(jī)鹽及磷酸緩沖液等體積混合，添加量為發(fā)酵體積的2％，繼續(xù)發(fā)酵6小時(shí)后，與前述同樣條件下再次添加補(bǔ)料液，添加量同前，并隨時(shí)跟蹤酶活性，酶活性達(dá)最高并有下降趨勢(shì)時(shí)結(jié)束發(fā)酵。
用本發(fā)明方法發(fā)酵溶葡球菌酶，每毫升菌體濃度達(dá)OD600≈20，溶葡球菌酶產(chǎn)量約500mg/L。
權(quán)利要求
1.一種適合枯草桿菌生長(zhǎng)的半合成培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成份是無機(jī)鹽及磷酸緩沖液，其組成是(g/L)Na2HPO44.0～7.0 Na2SO40.05～0.20KH2PO44.0～7.0Mgcl20.02～0.20NH4cl0.5～2.0 MnCl20.001～0.008FeCl20.002～0.008有機(jī)組成是(g/L) 葡萄糖1～10酵 母2～10蛋白胨2～10其余是水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合枯草桿菌生長(zhǎng)的半合成培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于無機(jī)鹽磷酸緩沖液中加入酵母、蛋白胨后，調(diào)節(jié)pH＝7.0～8.0，并須在0.04～0.05Mpa下滅菌15～30分鐘，加入滅菌后的葡萄糖作為培養(yǎng)基使用。
3.一種用枯草桿菌工程菌的發(fā)酵方法，特征在于(1)將枯草桿菌在LB培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，然后挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)二次，其條件是培養(yǎng)時(shí)間10～18小時(shí)，溫度32～40℃，轉(zhuǎn)速160～240r/分，最后全部接入發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)發(fā)酵過程是接種后維持30～38℃，0.5～1.5小時(shí)，然后升溫35～40℃，維持3.0～4.0小時(shí)后添加補(bǔ)料液，發(fā)酵至5～7小時(shí)后，與前述同樣條件再次添加補(bǔ)料液，直至基因產(chǎn)物量最高時(shí)結(jié)束發(fā)酵；(3)發(fā)酵過程中其它控制條件轉(zhuǎn)速400～600轉(zhuǎn)/分，空氣流量1∶0.4～1∶1，pH＝7.0～8.0，來接種時(shí)溶氧90～98％；接種后最低溶解氧控制在10～40％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草桿菌的發(fā)酵方法，其特征在于補(bǔ)料分批培養(yǎng)中加入濃縮的上述無機(jī)鹽及磷酸緩沖液和下述有機(jī)成份(g/L)蛋白胨4～7酵 母2～5葡萄糖200～400
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草桿菌的發(fā)酵方法，其特征在于補(bǔ)料培養(yǎng)基添加方法是有機(jī)成分與濃縮的無機(jī)鹽及磷酸緩沖液等體積混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草桿菌的發(fā)酵方法，其特征在于補(bǔ)料液的添加速度是2～8ml/分。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草桿菌的發(fā)酵方法，其特征在于補(bǔ)料添加量為發(fā)酵液體積的1～10％。
全文摘要
本發(fā)明是一種適合用枯草桿菌生產(chǎn)基因工程產(chǎn)物的半合成培養(yǎng)基的建立及其發(fā)酵方法。現(xiàn)有技術(shù)中由于有些受體菌表達(dá)水平低，或者會(huì)水解基因表達(dá)產(chǎn)物，致使產(chǎn)率低，價(jià)格高。也會(huì)由于培養(yǎng)基成分復(fù)雜，色素深，影響產(chǎn)品的質(zhì)量。本發(fā)明篩選了一種適合枯草桿菌生長(zhǎng)并高效生產(chǎn)基因工程產(chǎn)物的半合成培養(yǎng)基，應(yīng)用本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)控制模式，有效地控制了產(chǎn)物被水解，提高了產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1167826SQ9710620
公開日1997年12月17日 申請(qǐng)日期1997年1月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月2日
發(fā)明者張培德, 周潤(rùn)琦, 陳石根, 李致勛 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)