一種提高脫落酸固體發(fā)酵產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高脫落酸固體發(fā)酵產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]脫落酸是植物五大激素之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起多方面作用:如調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)閉，抑制種子發(fā)芽，控制胚胎和種子發(fā)育成熟，涉及抗逆作用如脫水，干旱，鹽脅迫，低溫，病蟲(chóng)害和機(jī)械創(chuàng)傷等環(huán)境因子應(yīng)答。在農(nóng)業(yè)中，可用于提高作物的抗旱、抗寒、抗鹽能力，在其應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)有大量專利報(bào)道，如專利CN104671979A公開(kāi)了一種含脫落酸的拌種劑，可提高東農(nóng)冬麥I號(hào)抗寒能力；專利CN101199284公開(kāi)了一種含脫落酸的仁用杏樹(shù)花果防凍劑；專利CN1229015C公開(kāi)了一種含脫落酸的花期延長(zhǎng)劑等。
[0003]脫落酸的生產(chǎn)方法主要可以分為三類:(I)從植物中提取；(2)化學(xué)合成；(3)微生物發(fā)酵法。其中植物中提取的方法因植物中含量極低，難以大量獲得，成本過(guò)高而無(wú)應(yīng)用價(jià)值。人工合成脫落酸為多種光學(xué)異構(gòu)體的混合物，拆分困難，活性遠(yuǎn)小于天然型的脫落酸，售價(jià)昂貴，限制了其應(yīng)用。而微生物發(fā)酵法是近年來(lái)興起的天然脫落酸生產(chǎn)方法，已經(jīng)在工業(yè)上推廣應(yīng)用。
[0004]微生物發(fā)酵法生產(chǎn)脫落酸，主要使用的是真菌，如灰葡萄孢霉菌(漢cinerea),因?yàn)樵摼l(fā)酵產(chǎn)量比其他微生物高，這在文獻(xiàn)中已經(jīng)有較詳細(xì)的報(bào)道(陸麗珍等，氨基酸和生物資源2011，33 (2):23~26)。為提高其發(fā)酵產(chǎn)量，人們主要對(duì)其發(fā)酵液成分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、添加前體等進(jìn)行了研究。例如:日本專利JP 5836393報(bào)道了在C rosicWa液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加鳥(niǎo)嘌呤，可使發(fā)酵產(chǎn)量提高；但由于鳥(niǎo)嘌呤價(jià)格較昂貴，在生產(chǎn)過(guò)程中成本較高。日本專利JP 0260590報(bào)道了在漢cherea液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加柑橘干果皮提取物，可提高發(fā)酵產(chǎn)量，但由于柑橘果皮中含有抑制真菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，且其含量受到柑橘種類、產(chǎn)地等因素的影響，在發(fā)酵中較難控制其添加量。
[0005]國(guó)內(nèi)專利CN1182798A公開(kāi)了一種采用三級(jí)發(fā)酵方法，在第三級(jí)發(fā)酵中采用連續(xù)流加補(bǔ)料出料以及菌種固定化，并添加關(guān)鍵底物如咪唑、嗎啉、吡啶及其衍生物、乙酰胺、乙酸胺、甲羥戊酸等中的任一種，使脫落酸的產(chǎn)量可達(dá)到1.2克/升發(fā)酵液。專利CN101041837A公開(kāi)了一種通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中流加肌醇解除葡萄糖阻遏的工藝來(lái)提高脫落酸的產(chǎn)量。
[0006]專利CN 102399827 A則通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中流加乙酰輔酶A作為菌株合成脫落酸的前體物質(zhì)，同時(shí)，添加生物表面活性劑吐溫-20改善發(fā)酵液溶氧狀況來(lái)制備天然脫落酸的方法，可以提高脫落酸的發(fā)酵產(chǎn)量。
[0007]但現(xiàn)有主要集中在液體發(fā)酵領(lǐng)域，對(duì)固體發(fā)酵報(bào)道較少。相比于液體發(fā)酵，固體發(fā)酵具有耗水量少、能耗低、可充分利用農(nóng)業(yè)廢棄物(如麩皮、秸桿)等優(yōu)點(diǎn)；此外，固體發(fā)酵產(chǎn)物直接使用有機(jī)溶劑浸提其中的脫落酸，經(jīng)后續(xù)工藝減壓濃縮后回收有機(jī)溶劑，幾乎無(wú)廢水排放，廢渣則可用作含氮肥料或制沼氣，減少對(duì)環(huán)境的污染。本專利報(bào)道了一種添加檸檬酸或檸檬酸鹽提高固體發(fā)酵產(chǎn)量的方法，可使發(fā)酵產(chǎn)量大幅度提高，降低生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明公開(kāi)了一種提高脫落酸固體發(fā)酵產(chǎn)量的方法，包括斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)及固體發(fā)酵工藝，在發(fā)酵過(guò)程中添加檸檬酸及其鹽類的一種或者兩種以上的組合，從而提高灰葡萄孢霉菌固體發(fā)酵產(chǎn)天然脫落酸的產(chǎn)量。與現(xiàn)有液體發(fā)酵技術(shù)相比，本發(fā)明所用固體發(fā)酵工藝可減少水資源的損耗，并可以促進(jìn)農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物如秸桿的再利用。另外，本發(fā)明中所用的發(fā)酵促進(jìn)劑價(jià)格低廉，可顯著提高脫落酸固體發(fā)酵產(chǎn)量，與原始工藝相比發(fā)酵產(chǎn)量提高40.19^115.8%，脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)3.lg/kg以上，工藝簡(jiǎn)單，便于工業(yè)應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的在于提高脫落酸固體發(fā)酵產(chǎn)量，促進(jìn)其固體發(fā)酵工藝的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案進(jìn)一步解決技術(shù)問(wèn)題，整個(gè)技術(shù)方案包括以下步驟: 第一步，將灰葡萄孢霉菌進(jìn)行斜面培養(yǎng)5-7天，培養(yǎng)溫度24_30°C ;
第二步，經(jīng)斜面培養(yǎng)的灰葡萄孢霉菌進(jìn)行種子培養(yǎng)48-96小時(shí)，培養(yǎng)溫度24-30°C ;第三步，經(jīng)種子培養(yǎng)的灰葡萄孢霉菌進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)7-11天，培養(yǎng)溫度24-30°C，培養(yǎng)時(shí)每千克培養(yǎng)基質(zhì)中添加0.001-50g朽1檬酸鹽，攪勾后靜置培養(yǎng)；
第四步，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)有機(jī)溶劑提取，純化后得到高產(chǎn)量的脫落酸。
[0011]上述方法中在發(fā)酵工藝中使用的菌種為灰葡萄孢霉菌As 3.4584，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。
[0012]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案進(jìn)一步解決技術(shù)問(wèn)題，所述第一步中，斜面培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基。
[0013]所述第二步中，種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，滅菌后在溶化狀態(tài)下取20ml置于平皿中，冷卻備用。在無(wú)菌條件下將約IcmXlcm斜面菌苔接種于種子平皿中，靜置培養(yǎng)。
[0014]所述第三步中，固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為，每千克培養(yǎng)基含麩皮10_150g，稻桿粉10-150g，小米 lO-lOOg，葡萄糖 5-50g，酵母粉 5-50g，蛋白胨 5_50g，CaC03 10-100g，檸檬酸或檸檬酸鹽0.001-50g，余量為水。所述檸檬酸鹽為檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸銨、檸檬酸鈣、檸檬酸鐵、檸檬酸鎂、檸檬酸鋅、檸檬酸銅中的至少一種，檸檬酸鹽單獨(dú)在121°C滅菌25min，在發(fā)酵過(guò)程中一次或分次添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0015]將生長(zhǎng)有灰葡萄孢霉菌的種子培養(yǎng)基以1%-10%的接種量接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪勻后靜置培養(yǎng)。
[0016]所述第四步中，發(fā)酵后的產(chǎn)物用乙醇浸泡，提取其中的脫落酸，過(guò)濾后收集提取液，濃縮至粘稠狀液體，用熱的乙酸乙酯溶解，冷卻后結(jié)晶可得到脫落酸產(chǎn)品。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1
菌種活化用培養(yǎng)基為土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):稱取新鮮土豆200 g，洗凈后去皮切成小塊并煮沸30 min，四層-八層紗布過(guò)濾，后加入葡萄糖20g和瓊脂20 g，加熱充分溶解后補(bǔ)水至1L，灌裝試管，121°C滅菌20 min，將試管傾斜放置，冷卻后制成斜面。將凍干保存的灰葡萄孢霉菌挑取到斜面上活化，26°C培養(yǎng)培養(yǎng)5天。
[0018]用無(wú)菌刮刀挑取活化后的菌苔約IcmX lcm，鋪于種子PDA平皿中央，置于26°C下靜置培養(yǎng)3天，至菌絲鋪滿整個(gè)平皿。
[0019]固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:每千克培養(yǎng)基含麩皮50g，稻桿粉100g，小米50g，葡萄糖20g，酵母粉20g，蛋白胨10g，CaCO3 30g，余量為水，攪拌均勻后于121°C滅菌25min。將配置的發(fā)酵培養(yǎng)基分成兩組，一組加10ml/kg的無(wú)菌水，作為空白對(duì)照；另一組將檸檬酸鈉溶解配置成0.2g/ml溶液，121°C滅菌20 min，每kg培養(yǎng)基加10ml。然后每kg固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種20g種子培養(yǎng)物，無(wú)菌條件下攪拌均勻，置于滅菌托盤(pán)中，蓋上八層紗布，在27°C下靜置培養(yǎng)8天。測(cè)得檸檬酸鈉組脫落酸產(chǎn)量為1.97g/kg，而不加發(fā)酵促進(jìn)劑的對(duì)照組產(chǎn)量為1.21 g/kg，比對(duì)照產(chǎn)量提高了 62.8%。
[0020]實(shí)施例2
菌種活化及種子培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:每千克培養(yǎng)基含麩皮100g，稻桿粉50g，小米100g，葡萄糖10g，酵母粉10g，蛋白胨10g, CaCO3 20g，余量為水，攪拌均勻后于121°C滅菌25min。將配置的發(fā)酵培養(yǎng)基分成兩組，一組分別于0h、12h、24h、48h加2.5ml/kg的無(wú)菌水，作為空白對(duì)照；另一組將梓檬酸錢(qián)溶解配置成lmg/ml溶液，0.22Mm濾膜過(guò)濾除菌，分別于0h、12h、24h、48h分4次，各加2.5ml/kg至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中。然后每kg固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種30g種子培養(yǎng)物，無(wú)菌條件下攪拌均勻，置于滅菌托盤(pán)中，蓋上八層紗布，在27°C下靜置培養(yǎng)8天。測(cè)得檸檬酸銨組脫落酸產(chǎn)量為3.10g/kg，而不加發(fā)酵促進(jìn)劑的對(duì)照組產(chǎn)量為1.39 g/kg,比對(duì)照產(chǎn)量提高了 115.8%。
[0021]實(shí)施例3
菌種活化及種子培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。每千克培養(yǎng)基含麩皮10g，稻桿粉90g，小米20g，葡萄糖20g，酵母粉40g，蛋白胨50g，CaCO3 10g,余量為水，攪拌均勻后于121°C滅菌25min。將配置的發(fā)酵培養(yǎng)基分成兩組，一組加10ml的無(wú)菌水，作為空白對(duì)照；另一組將檸檬酸鎂溶解配置成0.5g/ml溶液，121°C滅菌20 min，加10ml至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中。然后每kg固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種1g種子培養(yǎng)物，無(wú)菌條件下攪拌均勻，置于滅菌托盤(pán)中，蓋上八層紗布，在27°C下靜置培養(yǎng)8天。測(cè)得檸檬酸銨組脫落酸產(chǎn)量為2.61g/kg，而不加發(fā)酵促進(jìn)劑的對(duì)照組產(chǎn)量為1.25g/kg，比對(duì)照產(chǎn)量提高了 108.8%。
[0022]除上述實(shí)施外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提高脫落酸固體發(fā)酵產(chǎn)量的方法，包括以下步驟: 第一步，將灰葡萄孢霉菌進(jìn)行斜面培養(yǎng)5-7天，培養(yǎng)溫度24-30°C ; 第二步，經(jīng)斜面培養(yǎng)的灰葡萄孢霉菌進(jìn)行種子培養(yǎng)48-96小時(shí)，培養(yǎng)溫度24-30°C ; 第三步，經(jīng)種子培養(yǎng)的灰葡萄孢霉菌進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)7-11天，培養(yǎng)溫度24-30°C，培養(yǎng)時(shí)每千克培養(yǎng)基質(zhì)中添加0.001-50g朽1檬酸鹽，攪勾后靜置培養(yǎng)； 第四步，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)有機(jī)溶劑提取，純化后得到高產(chǎn)量的脫落酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述第一步中，斜面培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述第二步中，種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，置于平皿中靜置培養(yǎng)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述第三步中，固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為，每千克培養(yǎng)基含麩皮10_150g，秸桿粉10-150g，小米10-100g，葡萄糖5-50g，酵母粉5-50g，蛋白胨5-50g，CaC03 1 0-100g，檸檬酸或檸檬酸鹽0.001_50g，余量為水。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述檸檬酸鹽為檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸銨、檸檬酸鈣、檸檬酸鐵、檸檬酸鎂、檸檬酸鋅、檸檬酸銅中的至少一種，朽1檬酸鹽單獨(dú)在121°C滅菌25min，在發(fā)酵過(guò)程中一次或分次添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提高脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述檸檬酸鹽的添加量為 0.001-50g/kgo7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:將生長(zhǎng)有灰葡萄孢霉菌的種子培養(yǎng)基以1%-10%的接種量接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪勻后靜置培養(yǎng)。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高脫落酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:發(fā)酵后的產(chǎn)物用乙醇浸泡，提取其中的脫落酸，過(guò)濾后收集提取液，濃縮至粘稠狀液體，用熱的乙酸乙酯溶解，冷卻后結(jié)晶可得到脫落酸產(chǎn)品。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提高脫落酸固體發(fā)酵產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明的方法包括斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)及固體發(fā)酵等步驟，其特點(diǎn)是在固體發(fā)酵過(guò)程中添加檸檬酸鹽，可大幅度提高脫落酸的產(chǎn)量。本方法中所用發(fā)酵促進(jìn)劑成本低，工藝簡(jiǎn)單，便于工業(yè)應(yīng)用。
【IPC分類】C12R1/645, C12P7/42
【公開(kāi)號(hào)】CN105349582
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510966045
【發(fā)明人】鄭珩, 勞興珍, 余永柱
【申請(qǐng)人】南京廣方生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2015年12月22日