一種提高利福霉素sv發(fā)酵合成效率的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高利福霉素SV發(fā)酵合成效率的方法。本發(fā)明屬于生物制藥發(fā)酵工程領域，特別是涉及一種通過調(diào)控微生物碳氮代謝流向、增強利福霉素SV前體(3-氨基-5-羥基苯甲酸)合成，促進前體均勻性供給，提高利福霉素SV合成效率的方法。
【背景技術】
[0002]做為結核病治療的大宗抗生素原料藥，提高利福霉素發(fā)酵合成效率一直備受生產(chǎn)企業(yè)和研究單位關注。目前，國內(nèi)外對提高利福霉素發(fā)酵效價的研究較多，包括:生產(chǎn)菌種的分子生物學信息特征、發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化等方面，如對比文獻1:在1L罐水平添加豆油和丙氨酸可提高利福霉素SV效價12.3% (食品與發(fā)酵工業(yè)，商純良，2011，37 (5):56-60);對比文獻2:在50噸大罐水平添加豆油和乙二酸可使利福霉素SV發(fā)酵十億提高5.4% (發(fā)明專利ZL201210176175.9);對比文獻3:添加丙氨酸、豆油和磷霉素鈉/磷霉素氨丁三醇可使利福霉素SV效價平均提高17.0% (發(fā)明專利申請?zhí)?01210176177.8)。但是，對比文獻I只涉及豆油和丙氨酸存在交互作用，在確定的優(yōu)化濃度下，利福霉素SV效價提高12.3%,并對生產(chǎn)菌種的糖酵解途徑碳代謝、有機酸合成效率以及效價合成的影響進行了初步的分析，并沒有涉及芳香族氨基酸(色氨酸)合成效率對利福霉素SV的氮環(huán)前體(3-氨基-5-羥基苯甲酸)合成的影響；對比文獻2涉及豆油和乙二酸的雙重作用調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)中的關鍵步驟一琥珀酸脫氫酶催化的反應的活性，通過促進利福霉素SV前體一甲基丙二酰CoA的合成代謝效率來提高利福霉素SV的合成效率，也沒有涉及芳香族氨基酸(色氨酸)合成效率對利福霉素SV的氮環(huán)前體(3-氨基-5-羥基苯甲酸)合成的影響；對比文獻3中并沒有提到磷霉素鈉/磷霉素氨丁三醇起到的作用，應用該方法帶來的增產(chǎn)效果也無法斷定是磷霉素鈉/磷霉素氨丁三醇的作用結果，對比現(xiàn)有技術(對比文獻I)僅知道:豆油和丙氨酸具有調(diào)節(jié)利福霉素SV發(fā)酵的作用，即關于磷霉素鈉/磷霉素氨丁三醇調(diào)節(jié)利福霉素SV發(fā)酵的
【發(fā)明內(nèi)容】
沒有充分的證明、公開不充分，而且該文獻也沒有涉及芳香族氨基酸(色氨酸)合成效率對利福霉素SV的氮環(huán)(前體3-氨基-5-羥基苯甲酸)合成的影響。
[0003]芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)生物合成的限速酶之一是5-烯醇丙酮酰莽草酸合成酶(底物是磷酸烯醇式丙酮酸和3-磷酸-莽草酸)，而色氨酸會顯著抑制利福霉素SV的核心氮環(huán)前體3-氨基-5-羥基苯甲酸的合成效率。因此，通過抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸合成酶的活性，可以降低芳香族氨基酸在發(fā)酵中后期的合成與積累，特別是降低色氨酸對利福霉素SV前體3-氨基-5-羥基苯甲酸合成的抑制作用。與5-烯醇丙酮酰莽草酸合成酶的底物(如磷酸烯醇式丙酮酸)分子結構相似的小分子可能具有對該酶的抑制功能。
[0004]磷霉素鈉是臨床使用的抗生素，主要通過抑制敏感致病菌細胞壁的合成來治療呼吸道感染、皮膚軟組織感染、腸道感染等的治療，成人靜脈滴注劑量為:一日4?12g。磷霉素分子結構與磷酸烯醇式丙酮酸分子結構類似，但是，沒有關于磷霉素鈉作為代謝調(diào)控因子作用于地中海擬無枝酸菌的新功能的報道，即:通過抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸合成酶活性來降低芳香族氨基酸合成效率、提高利福霉素SV氮環(huán)前體3-氨基-5-羥基苯甲酸前體合成效率、促進利福霉素SV發(fā)酵產(chǎn)量的新功能的報道。
[0005]利福霉素SV分子氮環(huán)的氮原子來源于谷氨酰胺(Gin)，在谷氨酰胺合成酶(GS)催化下，將谷氨酸(Glu)轉化為谷氨酰胺。另外，谷氨酰胺在谷氨酸合成酶(G0GAT)催化下還可以轉化為谷氨酸。發(fā)酵過程中胞外谷氨酸濃度越高反映出消耗的谷氨酰胺越多，即沒有用于氮環(huán)前體3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)合成而是流入Glu旁路代謝的Gin也就越多，而這對于AHBA前體合成和利福霉素SV合成是不利的。因此，提高發(fā)酵過程中的Gin有效供給、減少由Gin向Glu的代謝流可能會有效提高利福霉素SV的合成效率。G0GAT的催化產(chǎn)物是Glu，該酶活性存在受到其產(chǎn)物抑制的反饋作用。因此，Glu作為代謝調(diào)控因子，在適當?shù)陌l(fā)酵周期添加到發(fā)酵液可能會對AHBA的合成產(chǎn)生積極作用。
[0006]通常谷氨酸鈉是作為鮮味劑在食品行業(yè)被廣泛使用，沒有關于谷氨酸鈉作為代謝調(diào)控因子作用于地中海擬無枝酸菌的新功能的報道，即:通過作用于G0GAT的催化反應減少Gin的旁路消耗，促進Gin流向氮環(huán)前體3-氨基-5-羥基苯甲酸的合成途徑、促進利福霉素SV發(fā)酵產(chǎn)量的新功能的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種提高利福霉素SV發(fā)酵合成效率的新方法，其實質(zhì)性是不將磷霉素鈉作為常規(guī)意義上的抗生素來抑制細菌細胞壁的合成以及不將谷氨酸鈉是作為鮮味劑來使用，而是將磷霉素鈉和谷氨酸鈉作為代謝調(diào)控因子來促進利福霉素SV氮環(huán)前體3-氨基-5-羥基苯甲酸前體合成效率、促進利福霉素SV的發(fā)酵產(chǎn)量。
[0008]將終濃度為5_20mg/L的磷霉素鈉和終濃度為3-lOg/L的谷氨酸鈉無菌補入發(fā)酵培養(yǎng)40-60h的地中海擬無枝酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)物中，培養(yǎng)結束時利福霉素SV效價平均提高13.
[0009]所述發(fā)明具有材料易購、操作步驟簡單、可控性高、適用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的特點。
[0010]本發(fā)明提出的一種提高利福霉素SV發(fā)酵合成效率的方法，包括以下步驟:
[0011](1)培養(yǎng)基的制備
[0012]①種子培養(yǎng)基
[0013]葡萄糖1.5%，黃豆餅粉1.0%，蛋白胨1.0%，硝酸鉀0.05%，碳酸鈣0.2%，可溶性淀粉1.5%，pH 7.0。經(jīng)0.1MPa蒸氣滅菌30min備用；
[0014]②發(fā)酵培養(yǎng)基
[0015]葡萄糖6-10%，魚粉 0.3-0.55%，黃豆餅粉 0.5-0.65%，蛋白胨 0.4-0.7%，硝酸鉀0.6-0.8% ,碳酸I丐0.5% ,磷酸二氫鉀0.02%，pH自然。經(jīng)0.1MPa蒸氣滅菌20min備用;
[0016](2)菌種活化
[0017]取保藏的地中海擬無枝酸菌(A.mediterranei)菌種接入種子培養(yǎng)基，在搖床上培養(yǎng)48h，培養(yǎng)條件為28°C、220r/min ；
[0018](3)菌種擴大培養(yǎng)與合瓶種子細胞的收集
[0019]將上述菌種接到發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中，裝液量為50-100mL/250mL三角瓶，接種量為3% -5%，于27°C -28°CU50-200r/min振蕩培養(yǎng)46_50h，后無菌操作將搖瓶種子培養(yǎng)基合瓶；
[0020](4) 二級種子培養(yǎng)與三級發(fā)酵
[0021]將合瓶種子火焰保護接入二級種子罐，培養(yǎng)溫度28°C，轉速為160-200r/min，空氣流量控制為0.8vvm，罐壓控制為0.03-0.04MPa，培養(yǎng)48h后移種至三級發(fā)酵罐；
[0022](5)三級發(fā)酵罐控制
[0023]培養(yǎng)溫度28 °C，轉速 0-48h 為 200r/min，48_72h 為 220r/min，72_96h 為 230r/min，96h 至放耀為 240r/min。空氣流量控制:0_48h 為 0.4vvm，48_72h 為 0.6vvm，72_96h為 0.8vvm, 96h 至放罐為 lvvm0 罐壓控制:0_48h 為 0.02MPa，48_72h 為 0.03MPa，72_96h 為0.04MPa，96h 至放罐為 0.05MPa ；
[0024](6)三級發(fā)酵培養(yǎng)周期為40_60h時，無菌補入終濃度為5_20mg/L的磷霉素鈉和3-10g/L的谷氨酸鈉，其它控制工藝不變。
[0025]有益效果
[0026]按技術方案進行操作，只添加了兩種代謝調(diào)控物質(zhì)，發(fā)酵中后期促進了谷氨酰胺的積累、抑制了色氨酸的生成，更有效促進了利福霉素SV前體(3-氨基-5-羥基苯甲酸，AHBA)的