專(zhuān)利名稱(chēng)：糖核苷酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種糖鏈(低聚糖等)合成用重要基質(zhì)的糖核苷酸的制造方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著有關(guān)糖鏈研究的急速發(fā)展，有關(guān)糖鏈的功能已經(jīng)明確，且其作為具有生理活性的低聚糖的藥物或作為功能性材料用途的開(kāi)發(fā)也引人注目。然而，目前市售的低聚糖不僅其種類(lèi)僅限于有限的幾種，且其價(jià)格極高。另外，這些低聚糖只以試劑的水平制造，大批量的制造方法尚不能說(shuō)已確立。
以往，低聚糖的制造是采用從天然物中提取的抽提法、化學(xué)合成法或酶合成法，也有并合使用所述二種方法而進(jìn)行的，其中，酶合成法可以認(rèn)為是最適于大批量制造低聚糖的方法。即，可以認(rèn)為基于下述二點(diǎn)，(1)酶合成法無(wú)需化學(xué)合成法所常見(jiàn)的保護(hù)、脫保護(hù)等繁雜的過(guò)程，即可迅速地合成得到目的物的低聚糖，(2)基于酶的基質(zhì)特異性，可以合成制得其結(jié)構(gòu)特異性極高的低聚糖等，酶合成法是比較其它方法更為有利的方法。另外，由于近年來(lái)重組DNA技術(shù)的發(fā)展，人們可以大量且廉價(jià)地制得各種合成酶，其結(jié)果，更加提高了酶合成法的優(yōu)越性。
作為由酶合成法合成低聚糖的方法，可以考慮采用利用低聚糖的水解酶的逆反應(yīng)方法及利用糖基轉(zhuǎn)移酶的方法這二種方法。盡管前一種方法的優(yōu)點(diǎn)是，可以使用其單價(jià)較低的單糖作為基質(zhì)，但是，其反應(yīng)自身是利用了分解反應(yīng)的逆反應(yīng)，在對(duì)于提高低聚糖的合成收率及用于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜的低聚糖的合成應(yīng)用上，未必可認(rèn)為是最好的方法。
另一方面，后一種方法是使用糖基轉(zhuǎn)移酶的合成方法?？梢哉J(rèn)為，在對(duì)于提高低聚糖的合成收率及用于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜的低聚糖合成的應(yīng)用上，該方法較前一種方法更為有利。而且，由于近年來(lái)重組DNA技術(shù)的發(fā)展，各種糖基轉(zhuǎn)移酶的批量化生產(chǎn)也加快了該技術(shù)的實(shí)現(xiàn)。
然而，在使用糖基轉(zhuǎn)移酶的合成方法中，作為所使用的供糖體的糖核苷酸，除了一部分之外，其價(jià)格依然較高。所以，現(xiàn)狀是，目前的供給量只能維持在試劑的水平。雖然，作為含于許多生理活性糖鏈的芯部分的N-乙酰葡糖胺供體的尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDPAG)，也有使用耐滲透壓酵母制造的方法的報(bào)導(dǎo)(特開(kāi)平8-23993號(hào)公報(bào))，但要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，尚有待研究。
發(fā)明揭示本發(fā)明者們就櫪倉(cāng)等人報(bào)導(dǎo)的、使用以尿苷酸和葡糖胺作為基質(zhì)的酵母的UDPAG的制造方法(特公昭49-8278號(hào)公報(bào)櫪倉(cāng)法)進(jìn)行了研究，結(jié)果確認(rèn)根據(jù)櫪倉(cāng)法，盡管在小規(guī)模上可以高收率地制得UDPAG，但是，如果將反應(yīng)工藝水平提高(例如，提高至數(shù)十ml以上的反應(yīng)規(guī)模時(shí))，則其合成效率顯著低下。
于是，本發(fā)明者們?yōu)殚_(kāi)發(fā)一種即使在擴(kuò)大工藝規(guī)模的場(chǎng)合也可以不降低收率、實(shí)用的糖核苷酸的制造方法，進(jìn)行了刻意的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(1)使用酵母的UDPAG合成反應(yīng)大致可分為有關(guān)使用呼吸酶的三磷酸腺苷的生成及與其偶合的尿苷三磷酸(UTP)的生成積蓄的反應(yīng)和有關(guān)葡糖胺的磷酸化及乙酰化等的UDPAG的糖部分合成的反應(yīng)這二個(gè)反應(yīng)；(2)根據(jù)櫪倉(cāng)法，在UTP合成反應(yīng)和糖部分的合成反應(yīng)的開(kāi)始階段中，存在著時(shí)間滯后，反應(yīng)工藝規(guī)模越是大，該時(shí)間滯后也越增大，其結(jié)果，降低了UDPAG的合成收率；(3)考慮到酵母的最佳作用溫度，在約為20℃以下的溫度條件下(該條件完全是出乎人們意料之外)進(jìn)行反應(yīng)，則可在UTP的合成反應(yīng)與糖部分的合成反應(yīng)之間取得平衡，即使增大反應(yīng)規(guī)模，也可有效地合成UDPAG；及(4)不光是UDPAG，也可適用于制造其它的糖核苷酸，從而，完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及一種糖核苷酸的制造方法。該方法系使用酵母，從核苷酸和糖衍生物制造糖核苷酸的方法，其特征在于，在約20℃以下的反應(yīng)條件下進(jìn)行所述的反應(yīng)。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1所示為反應(yīng)溫度對(duì)UDPAG生成量的影響。
圖2所示為在80ml的反應(yīng)規(guī)模時(shí)的UDPAG生成量的經(jīng)時(shí)變化。
圖3所示為在1000立升的反應(yīng)規(guī)模時(shí)的UDPAG生成量的經(jīng)時(shí)變化。
圖4所示為反應(yīng)溫度對(duì)尿苷二磷酸葡糖(UDPG)生成量的影響。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式作為本發(fā)明的制造對(duì)象的糖核苷酸只要是已知的糖核苷酸即可，并無(wú)特別的限制。具體地，可以例舉出，如UDPG、UDPAG、UDP半乳糖、UDP葡糖醛酸等的UDP糖，如鳥(niǎo)苷二磷酸甘露糖、(GDP甘露糖)，GDP巖藻糖、GDP葡糖等的GDP糖，如二磷酸腺苷葡糖(ADP葡糖)等的ADP葡糖，如胸苷二磷酸葡糖(dTDP葡糖)、dTDP半乳糖等的dTDP糖，如胞苷二磷酸葡糖(CDP葡糖)等的CDP糖等。又，作為該糖核苷酸中的糖部分，也可以是除了單糖以外的脫氧糖、氨基糖、糖醛酸、糖醇。
本發(fā)明的方法是利用酵母，從核苷酸及糖衍生物制得目的物糖核苷酸。
作為本發(fā)明中所使用的酵母，只要是可用于以往的對(duì)UDPAG等的糖核苷酸的制造，例如，櫪倉(cāng)法中所用的酵母即可使用，并無(wú)特別的限制。具體地，可以使用屬于如酵母(Saccharomyces)屬，東北接合酵母(Zygosaccharomyces)屬，假絲酵母(Candida)屬，球擬酵母(Torulopsis)屬，漢遜酵母(Hansenula)屬，Debaryomyces屬等屬的酵母。這些酵母可以是生酵母或干燥酵母中的任何一種，但從提高反應(yīng)收率的觀點(diǎn)來(lái)說(shuō)，以使用干燥酵母為宜。
反應(yīng)中所使用的核苷酸及糖衍生物可以作適當(dāng)?shù)倪x擇，以對(duì)應(yīng)于目的物糖核苷酸。具體地，如所欲制造的糖核苷酸為UDP糖時(shí)，作為核苷酸可以是尿苷一磷酸(UMP)；作為糖衍生物，可相應(yīng)于糖核苷酸從葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、葡糖醛酸等中作適當(dāng)?shù)倪x擇。同樣，如所欲制造的糖核苷酸為GDP糖時(shí)，作為核苷酸可以是鳥(niǎo)苷一磷酸(GMP)；作為糖衍生物，可相應(yīng)于糖核苷酸從甘露糖、巖藻糖、葡萄糖等中作適當(dāng)?shù)倪x擇。如所欲制造的糖核苷酸為ADP糖、dTDP糖或CDP糖時(shí)，作為核苷酸可以是一磷酸腺苷(AMP)、胸苷一磷酸(dTMP)，或胞苷一磷酸(CMP)；作為糖衍生物，可相應(yīng)于目的物糖核苷酸從葡萄糖、半乳糖等中作適當(dāng)?shù)倪x擇。
反應(yīng)中所使用的核苷酸及糖衍生物有市售，使用市售品即可。其使用濃度分別適當(dāng)?shù)卦O(shè)定于約1～約50mM、優(yōu)選地，分別設(shè)定于約10～約30mM的范圍。
除了市售核苷酸及糖衍生物之外，也可以更好地對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)添加無(wú)機(jī)磷酸和能量源，由此實(shí)施本發(fā)明。
作為所用的無(wú)機(jī)磷酸，可以直接使用磷酸鉀，較好的是使用磷酸鉀的磷酸緩沖液形式。其使用濃度可分別適當(dāng)?shù)卦O(shè)定于例如約10～約500mM、優(yōu)選地，分別設(shè)定于約100～約300mM的范圍。又，磷酸緩沖液的pH也宜設(shè)定于約6～8的范圍。
作為能量源可以使用葡萄糖、果糖等的糖類(lèi)，如醋酸、檸檬酸等的有機(jī)酸。另外，在使用糖類(lèi)作為能量源時(shí)，也可將該能量源與上述糖衍生物并用。
向磷酸緩沖液中添加酵母、核苷酸及糖衍生物，再視需要，添加能量源，在約20℃以下、較好的是在約5～約20℃的溫度下，更好的是，在約10～約20℃的溫度下，進(jìn)行上述反應(yīng)約2～約50小時(shí)，必要時(shí)，充分加以攪拌。
如此所得的糖核苷酸可由糖核苷酸的通常的分離純化手段(離子交換色譜層析法、吸附色譜法、鹽析等)進(jìn)行分離純化。
實(shí)施例以下，舉實(shí)施例具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。另外，在實(shí)施例中，反應(yīng)液中的糖核苷酸的定量由HPLC法進(jìn)行。即，其分離使用YMC公司制的ODS-AQ312柱，其洗出液使用0.5M的磷酸一鉀溶液。
實(shí)施例1UDPAG的合成(1)在100ml容積的燒瓶中配制由5’-UMP20mM、葡糖胺20mM、葡萄糖100mM、磷酸緩沖液(pH8.0)200mM、MgCl210mM組成的反應(yīng)液80ml，反應(yīng)液懸浮24g的干燥面包酵母(東方酵母工業(yè)株式會(huì)社)。然后，將反應(yīng)溫度設(shè)定于5℃、10℃、15℃、20℃及25℃，邊攪拌，邊進(jìn)行反應(yīng)50小時(shí)，測(cè)得UDPAG的最大生成量。又，UDPAG的生成量系將離心分離反應(yīng)液所得的上清液用高壓液相色譜分析法(HPLC)，進(jìn)行分析而求得。
測(cè)得結(jié)果示于圖1。從圖1中可以明白，在20℃以下、較好的是在5℃～20℃的溫度條件下，生成13mM以上的UDPAG是可能的，可以明顯看到反應(yīng)溫度對(duì)UDPAG生成量產(chǎn)生的影響在意料之外。另外，可以確認(rèn)到15℃，48小時(shí)之后，生成14.5mM的UDPAG。
實(shí)施例2UDPAG的合成(2)在100ml容積的燒瓶中配制由5’-UMP20mM、葡糖胺20mM、葡萄糖100mM、磷酸緩沖液(pH8.0)200mM、MgCl210mM組成的反應(yīng)液80ml，向此反應(yīng)液中懸浮24g的干燥面包酵母(東方酵母工業(yè)株式會(huì)社)。在28℃(櫪倉(cāng)法中所采用的反應(yīng)溫度)或15℃(本發(fā)明的方法)下攪拌，使之反應(yīng)，測(cè)得UDPAG的經(jīng)時(shí)生成量。又，UDPAG的生成量系將離心分離反應(yīng)液所得的上清液用高壓液相色譜分析法(HPLC)，進(jìn)行分析而求得。
測(cè)得結(jié)果示于圖2。從圖2，可以明顯觀察到反應(yīng)溫度在28℃時(shí)的最大生成量為反應(yīng)開(kāi)始8小時(shí)后的9.5mM，其后，UDPAG急劇減少。相比之下，反應(yīng)溫度在15℃時(shí)，顯示了反應(yīng)開(kāi)始20小時(shí)后的最大生成量15mM，24小時(shí)之后，UDPAG的減少也極小。
實(shí)施例3UDPAG的合成(3)在2000立升容積的反應(yīng)罐中配制如同實(shí)施例1的組成的反應(yīng)液1000L(立升)，反應(yīng)液懸浮300Kg的干燥面包酵母。在28℃(櫪倉(cāng)法)或15℃(本發(fā)明的方法)下攪拌使之反應(yīng)，制造UDPAG。
其結(jié)果示于圖3。從圖3可以明白地看甘醇，在28℃要合成3mM的UDPAG已是相當(dāng)費(fèi)力。相比之下，僅將反應(yīng)溫度下降至15℃，即可合成約12mM的UDPAG。該生成量雖然多少少于上述實(shí)施例1中的80ml的規(guī)模，但考慮到制造規(guī)模之大，顯見(jiàn)其減少的程度已被控制得很低，本發(fā)明的方法是實(shí)用的方法。
另外，可以確認(rèn)，在將上述方法用于規(guī)模更大的數(shù)千立升的制造規(guī)模時(shí)，可以以Kg數(shù)量級(jí)制造糖核苷酸。
實(shí)施例4UDPG的合成在由UMP 40mM、葡萄糖400mM、磷酸鈉(pH8.0)200mM、MgCl210mM組成的反應(yīng)液5ml中懸浮0.5g的干燥面包酵母(東方酵母工業(yè)株式會(huì)社)。在20℃、23℃及28℃下攪拌，使之反應(yīng)，測(cè)得UDPG的經(jīng)時(shí)生成量。
測(cè)得結(jié)果示于圖4。從圖4顯然可見(jiàn)，反應(yīng)溫度越高，UDPG的合成速度越快。但是，其最終收率在20℃時(shí)為最高，生成UDPG約8mM。
實(shí)施例5GDP甘露糖的合成在100ml容積的燒杯中配制由GMP 40mM、葡萄糖200mM、磷酸鉀(pH8.0)200mM、MgCl210mM組成的反應(yīng)液20ml。向該反應(yīng)液懸浮2g的干燥面包酵母(東方酵母工業(yè)株式會(huì)社)。在20℃下攪拌反應(yīng)7小時(shí)。反應(yīng)完畢后，在100℃下處理反應(yīng)液5分鐘、離心分離(2,000xg，10分鐘)去除酵母菌體。用HPLC法分析回收的上清液部分，確認(rèn)生成11.2mM的GDP甘露糖。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明系一種可應(yīng)用于糖核苷酸的大量制造的、極為實(shí)用的方法，本發(fā)明藉由將反應(yīng)溫度控制在約20℃以下這一極為簡(jiǎn)單的方法，即可在放大的規(guī)模的場(chǎng)合下抑止糖核苷酸合成率的降低。
權(quán)利要求
1.一種糖核苷酸的制造方法，該方法系使用酵母，從核苷酸和糖衍生物制造糖核苷酸的方法，其特征在于，在約20℃以下的反應(yīng)條件下進(jìn)行上述反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于，在約5～20℃以下的溫度條件下進(jìn)行所述反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于，在約10～20℃以下的溫度條件下進(jìn)行所述反應(yīng)。
4.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于，在有無(wú)機(jī)磷酸存在的條件下進(jìn)行所述反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述的糖核苷酸選自UDP糖、GDP糖、ADP糖、dTDP糖及CDP糖。
6.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述的糖核苷酸選自由下述①～⑤組成的A組(A組)①UDP糖UDP-N-乙酰葡糖胺、UDP葡萄糖、UDP半乳糖及UDP葡糖醛酸；②GDP糖GDP甘露糖，GDP巖藻糖及GDP葡萄糖；③ADP糖ADP葡萄糖；④dTDP糖dTDP葡萄糖及dTDP半乳糖；⑤CDP糖CDP葡萄糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種糖核苷酸的制造方法,該方法系使用酵母,從核苷酸和糖衍生物制造糖核苷酸的方法,其特征在于,在約20℃以下的反應(yīng)條件下進(jìn)行上述反應(yīng)。本發(fā)明藉由將反應(yīng)溫度控制在約20℃以下這一極為簡(jiǎn)單的方法,即可在放大的規(guī)模的場(chǎng)合下抑止糖核苷酸合成率的降低,為一種可應(yīng)用于糖核苷酸的大量制造的、極為實(shí)用的方法。
文檔編號(hào)C12P19/30GK1197484SQ9719089
公開(kāi)日1998年10月28日 申請(qǐng)日期1997年7月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月15日
發(fā)明者石毛和也, 竹之內(nèi)健治 申請(qǐng)人:山佐醬油株式會(huì)社