專利名稱：經(jīng)修飾具有改變了的鈣離子吉合性質(zhì)的α－淀粉酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有改變了的鈣離子結(jié)合性質(zhì)的α-淀粉酶。特別地，本發(fā)明涉及帶有如點突變的修飾的新型α-淀粉酶，其中的修飾意在改變分子中一先前未知的鈣離子結(jié)合位點處的鈣離子結(jié)合。通過改變此附加位點的鈣離子結(jié)合性質(zhì)，可以增加修飾過的α-淀粉酶的穩(wěn)定性。
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC.3.2.1.1)在淀粉中主要以隨機方式水解內(nèi)部α-1,4-糖苷鍵以產(chǎn)生小分子量的麥芽糖糊精。α-淀粉酶具有可觀的商業(yè)價值，應(yīng)用于淀粉加工的初始階段(液化)；酒精生產(chǎn)；洗滌基質(zhì)中的清洗劑以及紡織工業(yè)中的淀粉脫漿。α-淀粉酶由許多不同的微生物包括芽孢桿菌(Bacillus)和曲霉(Asper gillus)產(chǎn)生，其中最有商業(yè)價值的淀粉酶產(chǎn)自如地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliq uefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的細菌來源。近年來，優(yōu)選的用于商業(yè)的酶是那些來自地衣芽孢桿菌的酶，因為它們的熱穩(wěn)定性和至少在中性和溫和堿性pH下的性能。
在美國專利No.5,322,778中通過將一種如亞硫酸氫鹽、抗壞血酸或其鹽、erythorbic酸的抗氧化劑或是如丁基化羥苯甲醚、丁基化羥甲苯或α-維生素E的酚類抗氧化劑加入到液化漿液中在pH4.0和6.0之間實現(xiàn)液化。根據(jù)此專利，亞硫酸氫鈉必須以高于5mM的濃度加入。
在美國專利No.5,180,669中，通過將超過緩沖溶液所需的量的碳酸根離子加入到磨碎的淀粉漿液中在pH5.0到6.0之間實現(xiàn)液化。因為碳酸根離子的加入引起pH值的增加，一般通過加入一種氫離子，例如象鹽酸或硫酸的一種無機酸中和漿液。
在PCT申請No.WO95/10603中，公開了具有改進的洗衣或洗碟性能的包含地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中不是在M197位點的單一突變的一種突變的α-淀粉酶變體。
在PCT申請No.WO94/02597中，描述了一種具有改進的氧化穩(wěn)定性的突變α-淀粉酶，其中的一個或多個甲硫氨酸用除了半脫氨酸或甲硫氨酸之外的任意氨基酸替換。
在PCT申請No.WO94/18314中，描述了一種具有改進的氧化穩(wěn)定性的突變α-淀粉酶，其中的一個或多個甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸、組氨酸或酪氨酸殘基用一種不能氧化的氨基酸取代。
在PCT申請No.WO91/00353中，野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中與液化相關(guān)的性能特點和問題均通過基因工程處理該α-淀粉酶來解決，其中包括特異性替換Ala-111-Thr,His-133-Tyr和/或Thr-149-Ile。
已有許多不同的研究人員利用重組DNA技術(shù)進行了探查哪個殘基對于淀粉酶的催化活力是重要的和/或探查修飾不同淀粉酶和糖基化酶中的活性位點的特定氨基酸的效果的研究(Vihinen等人，生物化學(xué)雜志(J.Biochem.)vol.107,267-272(1990))；Holm等人，蛋白質(zhì)工程(ProteinEngineering),Vol.3,181-191(1990)；Takase等人，生物化學(xué)及生物物理學(xué)通報(Biochemica et Biophysica Acta)Vol.1120,281-288(1992)；Matsui等人，F(xiàn)ebs.Letters,Vol.310,216-218(1992)；Matsui等人，生物化學(xué)(Biochemistry)Vol.33,451-458(1992)；Sogaard，等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)vol.268,22480-22484(1993)；Sogaard等人，碳水化合物(Carbohydrate Polymers)Vol.21,137-146(1993)；Svensson，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)Vol.25,141-157(1994)；Svensson等人，生物技術(shù)雜志(J.Biotech.)Vol 29,1-37(1993))。研究人員也已研究了哪個殘基對于熱穩(wěn)定性重要(Suzuki，等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)Vol.264,18933-18938(1989)；Watannabe等人，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)vol.226,277-283(1994))；并且已有一研究組使用這種方法在地衣芽孢桿菌淀粉酶中在不同的組氨酸殘基處引入突變，其基本原理是已知與其它相似的芽孢桿菌淀粉酶相比具有相對熱穩(wěn)定性的地衣芽孢桿菌淀粉酶含有的組氨酸較多，因此提示組氨酸的取代可能影響此酶的熱穩(wěn)定性。這一工作導(dǎo)致了在133位組氨酸殘基和209位丙氨酸殘基的穩(wěn)定化突變的確認(Declerck等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)vol.265,15481-15488(1990)；FR2,665,178-A1；Joyet等人，生化技術(shù)(Bio/Technology),vol10,1579-1583(1992))。
來自不同生物的α-淀粉酶除了一級結(jié)構(gòu)上可觀的差異之外均有相似的三維結(jié)構(gòu)。

圖1顯示地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)。雖然在不同的α-淀粉酶之間會有一些種類內(nèi)部的變化，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的主要結(jié)構(gòu)部件一般認為是α-淀粉酶結(jié)構(gòu)的代表(見Brayer等人，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Sci.)Vol.4,1730-1742(1995)；Larson等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)Vol.235,1560-1584(1994)；Qian等人，分子生物學(xué)雜志，Vol.231,785-799(1993))。例如，定點突變已確認對催化有重要作用(Svensson，植物分子生物學(xué)，vol.25,141(1984))的三個不變的羧酸和兩個不變的組氨酸(地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中的D231、E261、D328和H104和H327)，且已提出了一種普遍性機理(Mazur等人，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)vol.204,297(1994))。已表征了認為參與鈣和氯結(jié)合的殘基且發(fā)現(xiàn)在不同的酶中這些殘基高度保守(見如Kadziola等人，分子生物學(xué)雜志，vol.239,104(1994)；Qian等人，出處同前，Larson等人，出處同前；Brayer等人，出處同前；Machius等人，分子生物學(xué)，vol.246,545-559(1995)和Boel等人，生物化學(xué)，vol.29,6244(1990))。
此外，在幾乎所有目前已測序的內(nèi)切淀粉酶(范圍包括植物、哺乳動物和細菌)之間已發(fā)現(xiàn)同源物(Nakajima等人，應(yīng)用微生物生物技術(shù)(Appl.Microbiol.Biotechnol.),vol 23,355-360(1986)；Rogers,生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊，vol.128,470-476(1985)；Janecek，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.),vol 224,519-524(19941))。在某些芽孢桿菌淀粉酶中有4個區(qū)域有特別高的同源性，如圖5所示，其中下劃線的區(qū)域稱為高度同源區(qū)。也已采用序列對比以標明芽孢桿菌內(nèi)切淀粉酶之間的關(guān)系(Feng等人，分子進化雜志(J.Molec.Evol.)vol.35,351-360(1987))。嗜熱脂肪芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌淀粉酶之間相關(guān)序列同源性約為66％，地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌淀粉酶之間約為81％，如Holm等人，蛋白質(zhì)工程，vol.3,No.3,181-191(1990)所測定。雖然序列同源性重要，一般認為結(jié)構(gòu)同源性在比較淀粉酶或其它酶時也很重要。
來源于不同生物的不同α-淀粉酶(及相關(guān)淀粉分解酶如環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶和α-葡糖苷酶)之間的三維結(jié)構(gòu)相似(除了它們一級結(jié)構(gòu)的差異之外)，發(fā)現(xiàn)其共同存在一種α/β-桶形成的中央部分(結(jié)構(gòu)域A)、作為分離的結(jié)構(gòu)域C的希臘紋樣排列(Greek key motif)和至少一個附加的結(jié)構(gòu)域，即結(jié)構(gòu)域B(Machius等人，出處同前)。認為底物的結(jié)合點位于α/β-桶和結(jié)構(gòu)域B之間，包含依種類不同而具有不同長度的β-鏈(Machius，出處同前)。也同樣共有的是對鈣的需求，認為它維持結(jié)構(gòu)的完整性。Machius公開了一個鈣離子結(jié)合位點，它涉及對應(yīng)于由源自地衣芽孢桿菌的耗盡了鈣的α-淀粉酶的晶體結(jié)構(gòu)中的N104、D200和H235的殘基。除了地衣芽孢桿菌的結(jié)構(gòu)之外，已測定了黑曲霉(Aspergillus niger)(Brady等人，Acta.Crystailog.B,vol47,527(1991))、豬胰腺(Qian等人，分子生物學(xué)雜志，vol231,758(1993)；Larson等人，分子生物學(xué)雜志，vol235,1560(1994))和人胰腺(Brayer等人，Prot.Sci.vol.4,1730(1995))中的淀粉酶的結(jié)構(gòu)。
除了先有技術(shù)取得的進展之外，還需要具有改變了的性能(包括活性和穩(wěn)定性)的以便在淀粉液化、洗衣用和洗碟用洗滌劑、焙烤、紡織品脫漿和其它的淀粉酶標準用途中使用的α-淀粉酶。因為在許多條件下由于穩(wěn)定性和/或活性的問題商業(yè)性可得的淀粉酶不可使用，因而在這些條件下需要一種具有改變了的優(yōu)選的為增加了的性能曲線的淀粉酶。例如與洗滌劑相關(guān)聯(lián)的高堿性和氧化(漂白)性水平或是在淀粉液化過程中存在的極端條件均可造成α-淀粉酶的不穩(wěn)定及失活。因此，期望獲得諸如熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性或鈣離子穩(wěn)定性的改變了的性能特征的，同時與野生型或前體酶相比也有改變了的、維持原狀的或增加了的酶活性的淀粉酶。類似地，已知許多α-淀粉酶需要鈣離子的添加以維持穩(wěn)定。在一些應(yīng)用中由于這會增加加工成本因而是不期望的。
本發(fā)明的目的在于提供一種具有改變了的性能特點如改變了的pH穩(wěn)定性、堿性穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性或酶活性的α-淀粉酶。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種具有改變了的鈣離子結(jié)合性質(zhì)(例如維持活性所需加入的鈣減少)的α-淀粉酶。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種由于增加了低pH穩(wěn)定性或活性而具有改善的性能的(特別是在淀粉液化的過程中)α-淀粉酶。
本發(fā)明還有一個目的在于提供一種在高溫或高pH環(huán)境中或是在氧化劑或漂白劑存在時具有改善的性能的α-淀粉酶。
本發(fā)明還有一個目的在于提供一種由于其改變了的穩(wěn)定性或活性而在紡織品脫漿或烘烤中具有改善的性能的α-淀粉酶。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種包含一個結(jié)構(gòu)域A，一個結(jié)構(gòu)域C和一個鈣離子結(jié)合位點的α-淀粉酶，其中的鈣離子結(jié)合位點與結(jié)構(gòu)域A和結(jié)構(gòu)域C相關(guān)且包含位于結(jié)構(gòu)域A和/或C中的配體殘基，其中α-淀粉酶經(jīng)過修飾以改變鈣離子結(jié)合位點的特性，從而改變了該α-淀粉酶的性能。
在一優(yōu)選的實施方案中，修飾包括一種基因工程修飾，其導(dǎo)致在等價于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶氨基酸殘基290-309,339-347,402-411,426-436或472-477中的一個或多個殘基處的替換、刪除或添加。在一特別優(yōu)選的實施方案中，基因工程修飾包括在等價于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶G301,M304,H405,H406和/或K436中的一個或多個殘基處的替換、刪除或添加。
在一產(chǎn)品實施方案中，本發(fā)明包含一種編碼本發(fā)明的α-淀粉酶的DNA。在另一組合物實施方案中，本發(fā)明包含一種整合有編碼根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的DNA的表達載體，以及已用這種DNA和/或表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。在一個方法實施方案中，包含在一宿主細胞中表達一種編碼本發(fā)明的α-淀粉酶的DNA或是一種整合有這種DNA的表達載體。
在另一產(chǎn)品實施方案中，本發(fā)明包含一種摻入根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的洗衣或洗碟用洗滌組合物。在另一產(chǎn)品實施方案中，本發(fā)明包含一種摻入根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的紡織品脫漿組合物。在又一產(chǎn)品實施方案中，本發(fā)明包含一種摻入根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的淀粉液化組合物。在又一個產(chǎn)品實施方案中，本發(fā)明包含了一種含有根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的烘烤助料。
在一本發(fā)明的方法實施方案中，提供了一種使用摻入根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的洗碟洗滌劑組合物洗滌衣物或清洗碟子的方法。在另一本發(fā)明的方法實施方案中，提供了使用一種摻入根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的組合物使紡織品脫漿的方法。在另一本發(fā)明的方法實施方案中，提供了一種使用摻入根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的淀粉液化組合物液化淀粉的方法。在另一本發(fā)明的方法實施方案中，提供了一種烘烤方法，其包含加入一種摻入根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的組合物。
根據(jù)本發(fā)明的修飾過的α-淀粉酶將具有一些與現(xiàn)有α-淀粉酶相比重要的優(yōu)點。例如已在一些變體中發(fā)現(xiàn)在常用淀粉液化方法中典型的低pH和高溫條件下具有增加的活性的優(yōu)點。在一些具有增加的高pH和氧化穩(wěn)定性的變體中發(fā)現(xiàn)有便于其在洗滌劑中使用的另一優(yōu)點。通過在無或低鈣離子濃度中具有改善的穩(wěn)定性的變體提供了另一優(yōu)點。本發(fā)明的目的和伴隨的優(yōu)點將通過下面詳細的描述和實施例進一步闡明。
圖1顯示地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)，標明了主鏈折疊與結(jié)構(gòu)域A和結(jié)構(gòu)域B相關(guān)聯(lián)的鈣離子結(jié)合位點(CalA)的位置以及與結(jié)構(gòu)域A和結(jié)構(gòu)域C相關(guān)聯(lián)的另一鈣離子結(jié)合位點(CalB)的位置。
圖2顯示最終2fo-fc差異圖的立體視圖以及在與來自地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)域A和結(jié)構(gòu)域C相關(guān)的鈣離子結(jié)合位點的Sm異常傅里葉差異。
圖3A-C顯示來自地衣芽孢桿菌(NCIB8061)的α-淀粉酶的基因的DNA序列以及如Gray等人，細菌學(xué)雜志(J.Bacteriology)vol166,635-643(1986)中所述的翻譯產(chǎn)物的推測的氨基酸序列。
圖4顯示了來自地衣芽孢桿菌的成熟的α-淀粉酶的氨基酸序列。
圖5A-B顯示三種芽孢桿菌α-淀粉酶的一級結(jié)構(gòu)的一個片段。地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(Am-Lich)如Gray等人，細菌學(xué)雜志，vol.166,635-643,(1986)所述；解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(Am-Amylo)如Takkinen等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)vol.258,1007-1013(1983)所述；嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(Am-Stearo)如Ihara等人生物化學(xué)雜志(J.Biochem.)vol.98,95-103(1985)所述。
“α-淀粉酶”指一種切割或水解如在淀粉、支鏈淀粉或直鏈淀粉聚合物中的α-(1-4)糖苷鍵的酶活性。此處所用的α-淀粉酶包括天然產(chǎn)生的α-淀粉酶以及重組α-淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶可以衍生自一種前體淀粉酶。該前體淀粉酶可以通過任何能夠產(chǎn)生α-淀粉酶的來源生產(chǎn)。α-淀粉酶的合適來源是原核或真核生物，包括真菌、細菌、植物或動物。優(yōu)選地，前體α-淀粉酶由芽孢桿菌或真菌產(chǎn)生，如衍生自曲霉的真菌(即米曲霉(A.oryzae)和黑曲霉)。更優(yōu)選地，前體由地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)生；更優(yōu)選地，前體α-淀粉酶源自地衣芽孢桿菌。
一種“修飾過的”α-淀粉酶是一種經(jīng)遺傳或化學(xué)性修飾以改變其生物化學(xué)、結(jié)構(gòu)或物理化學(xué)性質(zhì)的α-淀粉酶。α-淀粉酶中的“遺傳性修飾”指編碼天然產(chǎn)生的或前體α-淀粉酶的DNA序列經(jīng)過修飾以產(chǎn)生一種突變的DNA序列，此序列編碼與天然產(chǎn)生的α-淀粉酶或前體α-淀粉酶相比的α-淀粉酶序列中一個或多個氨基酸的替換、插入或刪除。
“表達載體”指包含一種能影響該DNA在合適的宿主中表達的DNA序列的DNA構(gòu)建體，此DNA序列一般被可操縱地與合適的控制序列連接。這樣的控制序列可以包括一種影響轉(zhuǎn)錄的啟動子，一種控制這種轉(zhuǎn)錄的選擇性操縱子序列、一種編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點的序列以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。一種優(yōu)選的啟動子是枯草芽孢桿菌aprE啟動子。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆?；蛞庠谟绊懟蚪M插入(即整合)的DNA。一旦轉(zhuǎn)化入合適的宿主，此載體可不依賴宿主基因組的復(fù)制并發(fā)揮功能，或在有些情況下可以整合到基因組之中。質(zhì)粒和載體有時候互相換用，因為質(zhì)粒是目前最為常用的載體的形式。然而，本發(fā)明意在包括其它形式的有等效功能的表達載體，這些載體為本領(lǐng)域已知或逐漸為本領(lǐng)域知曉，特別包括噬菌體顯示。
“宿主菌”或“宿主細胞”指一種對如含有編碼根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的DNA的表達載體合適的宿主。用于本發(fā)明的宿主細胞一般地為原核或真核宿主，包括在其中能實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的表達的任何可轉(zhuǎn)化的微生物。特別地，與產(chǎn)生α-淀粉酶的種屬相同的種或?qū)俚乃拗骶耆缪挎邨U菌菌株是適宜的。優(yōu)選地，使用一種α-淀粉酶陰性芽孢桿菌菌株(基因缺失)和/或一種α-淀粉酶和蛋白酶缺失的芽孢桿菌(如ΔamyE,Δapr,Δnpr)。使用由重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞。這種轉(zhuǎn)化的宿主細胞或是能復(fù)制編碼α-淀粉酶和其變體(突變體)的載體，或是能表達期望的α-淀粉酶。
“液化作用”或“液化”指一種將淀粉轉(zhuǎn)變成短鏈和低粘度糊精的過程。一般地，此過程包括淀粉凝膠化的同時或之后加入α-淀粉酶。
“鈣離子結(jié)合位點”指α-淀粉酶中適于且在游離鈣離子存在時對結(jié)合鈣離子有作用的一個區(qū)域。一般認為在許多條件下鈣離子對維持α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)完整性是必需，且已證實在不同的酶中參與鈣離子結(jié)合的氨基酸殘基是高度保守的(Machius等人，分子生物學(xué)雜志，vol246,545-559(1995))。根據(jù)本發(fā)明，與野生型或前體α-淀粉酶相比改變了鈣離子結(jié)合位點的特性從而改變了α-淀粉酶的性能。鈣離子結(jié)合位點的改變可以包括降低或增加該位點與鈣離子結(jié)合的親和力。通過改變其性能意在指該酶在不同應(yīng)用中的穩(wěn)定性(如氧化或熱穩(wěn)定性)或是活性(如α-淀粉酶水解淀粉底物的速度或效率)。
“配體殘基”或“鈣離子配體”指在α-淀粉酶中的一個或多個氨基酸殘基，其在鈣離子結(jié)合位點之中形成一個與鈣離子結(jié)合的配體。就由本申請人，發(fā)現(xiàn)的α-淀粉酶之中的鈣離子結(jié)合位點而言，已確認了認為起鈣離子配體作用的5個氨基酸配體。鈣離子配體殘基包含與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中G300,Y302,H406,D407和D430等效的氨基酸殘基。特別地，就這些確定的鈣離子配體而言，認為G300,Y302和H406的羰基氧以及D407和D430側(cè)鏈參與了鈣離子結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，提供了包含結(jié)構(gòu)域A，結(jié)構(gòu)域C和一個鈣離子結(jié)合位點的一種α-淀粉酶，其中的鈣離子結(jié)合位點與結(jié)構(gòu)域A和結(jié)構(gòu)域C相關(guān)且包含結(jié)構(gòu)域A和/或結(jié)構(gòu)域C中的配體殘基，其中的α-淀粉酶經(jīng)修飾以改變鈣離子結(jié)合位點的特性從而改變該α-淀粉酶的性能。
本發(fā)明也提供了編碼含有本發(fā)明提供的α-淀粉酶的至少一部分的氨基酸序列的一種核酸分子(DNA)，整合有這種DNA包括載體和噬菌體的表達體系，用這種DNA轉(zhuǎn)化的宿主細胞以及與編碼該氨基酸序列的DNA分子相對應(yīng)的DNA的反義鏈。類似地，本發(fā)明包括一種通過表達在已轉(zhuǎn)化入宿主細胞中的整合到一種表達體系上的DNA來生產(chǎn)一種α-淀粉酶的方法。
可以通過將其與合適的表達載體中的表達控制序列相連且按照周知的技術(shù)用此表達載體轉(zhuǎn)化一合適的宿主以表達該DNA序列。大量不同的宿主表面體系的組合均可用于表達本發(fā)明的DNA序列。有用的表達載全體，例如，包括染色體、非染色體的片段和合成的DNA序列，如不同的已知用于此目的的質(zhì)粒和噬菌體。此外，大量不同的表達控制序列中的任一種一般地均可用于這些載體。例如，申請人已發(fā)現(xiàn)用于芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子的優(yōu)選的表達控制序列是衍生自枯草芽孢桿菌的aprE信號肽。此外，噬菌體顯示系統(tǒng)也適用于本發(fā)明。
許多宿主細胞也可用于表達本發(fā)明的DNA序列且也在此加以考慮。這些宿主可以包括周知的真核和原核宿主，如大腸桿菌、假單孢菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬(Streptomyces)、不同的如木霉屬(Trichoderma)或曲霉屬的真菌的菌株，酵母和動物細胞。優(yōu)選地，宿主將本發(fā)明的α-淀粉酶表達到胞外以利于純化和下游加工。本發(fā)明突變的α-淀粉酶的表達和純化可以通過本領(lǐng)域已知的進行此類操作的方法進行。
根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶包含一種衍生自一種前體α-淀粉酶的氨基酸序列的氨基酸序列。此前體α-淀粉酶包括天然產(chǎn)生的α-淀粉酶和重組α-淀粉酶。α-淀粉酶突變體的氨基酸序列通過前體氨基酸序列的一種或多種氨基酸的替換、刪除或插入而衍生自前體α-淀粉酶氨基酸序列。這種修飾一般地是對編碼前體α-淀粉酶的氨基酸序列的前體DNA序列而不是對前α-淀粉酶本身的操作。修飾α-淀粉酶基因(即通過定點寡核苷酸突變)和轉(zhuǎn)化、表達和分泌遵照突變的基因所產(chǎn)生的酶產(chǎn)物的方法已由先有技術(shù)所述，包括PCT公開文本No.WO95/10603(NovoNordisk),PCT公開文本No.WO94/02597(Novo Nordisk),PCT公開文本No.WO94/18314(Genencor International，公司)和PCT公開文本No.WO91/00353(Gist Brocades)，此處引入這些公開作為參考。另外適合于前體DNA序列操作的方法包括此處公開的以及共同擁有的美國專利No.4,760,025和5,185,258，此處引用作為參考。
主要的結(jié)構(gòu)元件，包括此處公開的新發(fā)現(xiàn)的CalB位點和為了改變α-淀粉酶的性能而進行的改變在下面以適用于大多數(shù)α-淀粉酶的一般性詞語進行描述。如圖1所示，明確了三個主要的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域A、B和C以及兩個鈣離子結(jié)合位點CalA和CalB。結(jié)構(gòu)域A包含此分子的中央部分且已確認為一個α/β或TIM桶形。此α/β桶由一系列平行的以α-螺旋內(nèi)部相連的β-鏈構(gòu)成。在酶的羧基端，結(jié)構(gòu)域A的一側(cè)為一個由反平行β-桶(稱為“希臘紋樣”)組成的區(qū)域(參見如Richardson等人，高等蛋白質(zhì)化學(xué)(Advan.Protein Chem.),vol.34,167-339(1981)；Braden等人，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)論(Introduction to Protein Structure),Garland出版公司，紐約(1991))。此結(jié)構(gòu)域已確認為結(jié)構(gòu)域C。在結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域C相對的一側(cè)(N-端)是一個附加的結(jié)構(gòu)域，其包含一些隨種類不同而長度不同的β-鏈，稱為結(jié)構(gòu)域B。已發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域B在不同種類的α-淀粉酶之間高度可變且經(jīng)常包含延伸的環(huán)。認為底物結(jié)合位點位于結(jié)構(gòu)域A和結(jié)構(gòu)域B之間的裂隙中，且活性位點也與此區(qū)域的分子有關(guān)。CalA結(jié)合位點位于分隔結(jié)構(gòu)域A和結(jié)構(gòu)域B的裂隙中，認為其可穩(wěn)定此區(qū)域。此處公開的CalB結(jié)合位點位于結(jié)構(gòu)域A和結(jié)構(gòu)域C交界的區(qū)域。
由申請者發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌α-淀粉酶中的CalB結(jié)合位點使得申請者可開發(fā)一種具有改變了的性能的突變α-淀粉酶，且具有特別改變了的穩(wěn)定性。例如可將用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一般原則應(yīng)用于CalB位點周圍的區(qū)域。此外，特別為提高在CalB位點的鈣離子結(jié)合設(shè)計的方案也可以采用以增加該酶的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，這種修飾在結(jié)合到CalB結(jié)合位點的鈣離子中央的15A之內(nèi)，更優(yōu)選地在結(jié)合到CalB位點的鈣離子中央的10之內(nèi)。
此處還確定了用于刪除或替換的α-淀粉酶中的殘基。因此，此處討論的特別的殘基是指參照示于圖4中分配給成熟地衣芽孢桿菌α-淀粉酶序列的號碼的一種氨基酸的位置號碼。然而，本發(fā)明不局限于特定的成熟地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的突變，而可延伸到非地衣芽孢桿菌前體α-淀粉酶，這些酶中含有與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的特定殘基等價位置的氨基酸。一種前體α-淀粉酶的殘基等價于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的殘基，只要其與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中特定的殘基或部分同源(即相應(yīng)于或是初級或是四級結(jié)構(gòu)的位置)或類似(即有相同或相似的結(jié)合、反應(yīng)或者化學(xué)性或功能性相互作用的功能)。
為了構(gòu)建一級結(jié)構(gòu)的同源物，直接將前體α-淀粉酶的氨基酸序列與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶一級序列特別是與在所有α-淀粉酶中恒定的一系列殘基(其序列已知)相比較(見如圖7)。也可以通過已報道的豬胰腺α-淀粉酶(Buisson等人，EMBO J.vol6,3909-3916(1987)；Qian等人，生物化學(xué)(Biochemistry),vol.33,6284-6294(1994)；Larson等人，分子生物學(xué)雜志，vol335,1560-1584(1994))；來源于米曲霉的Taka-淀粉酶A(Matsuura等人，生物化學(xué)(J.Biochem)(東京)，vol95,697-702(1984))和來自黑曲霉的帶有前兩個結(jié)構(gòu)相似的一種酸性α-淀粉酶(Boel等人，生物化學(xué)(Biochemistry),vol,29,6244-6249(1990))以及大麥α-淀粉酶(Vallee等人，分子生物學(xué)雜志，vol.236,368-371(1994)；Kadziola，分子生物學(xué)雜志，vol.239,104-121(1994))的晶體結(jié)構(gòu)的四級結(jié)構(gòu)分析確定等價殘基。雖然有一些初步的研究已公開(Suzuki等人，生物化學(xué)雜志(J.Biochem.),vol.108,379-381(1990)；Lee等人，生物化學(xué)和生物物理學(xué)文獻(Arch.Biochem.Biophys.)vol291,255-257(1991)；Chang等人，分子生物學(xué),vol229,235-238(1993)；Mizuno等人，分子生物學(xué)，vol.234,1282-1283(1993))，但僅有關(guān)于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的公開的結(jié)構(gòu)(Machius等人，分子生物學(xué)，vol.246,545-549(1995))。然而，一些研究人員已預(yù)測了在葡聚糖酶(MacGregor等人，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)vol.259,145-152(1989))和α-淀粉酶內(nèi)部以及其他淀粉代謝酶(Jaspersen，蛋白質(zhì)化學(xué)雜志(J.Prot.Chem.)vol.12,791-805(1993)；MacGregor,Starke,vol.45,232-237(1993))之間共同的超二級結(jié)構(gòu)；以及與α-淀粉酶有相似的超二級結(jié)構(gòu)的酶之間的序列相似性(Janecek,FEBS Letters,vol.316,23-26(1993)；Janecek等人，蛋白質(zhì)化學(xué)雜志，vol.12,509-514,(1993))。一種嗜熱脂肪芽孢桿菌酶的結(jié)構(gòu)已按Taka-淀粉酶A制成模型(Holm等人，蛋白質(zhì)工程，Vol.3,181-191(1990))。圖7中所示的4個高度保守區(qū)域包含許多認為屬于活性位點的殘基(Matsuura，等人，生物化學(xué)雜志(J.Biochem.)(東京)，vol.95,697-702(1984)；Buisson等人，EMBO J.,vol.6,3909-3916(1987)；Vihinen等人，生物化學(xué)雜志(J.Biochem.)vol.107,267-272(1990))，其包括按地衣芽孢桿菌編號體系中的His105；Arg+229；ASP+231；His+235；Glu+261和Asp+328。
含有CalB結(jié)合位點的α-淀粉酶多肽鏈片段包括殘基290-309,339-347,402-411,426-436和472-477。這些多肽片段含有CalB結(jié)合位點。相應(yīng)地，可以預(yù)期在這些區(qū)域中的區(qū)域特異性隨機突變將產(chǎn)生通過在這些位點鈣離子親合力的調(diào)整而調(diào)整α-淀粉酶穩(wěn)定性的變體。
下面提供了另外的更特別的方案(1)增加未折疊主鏈的熵可以增加酶的穩(wěn)定性。例如，將脯氨酸殘基在α-螺旋和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的N-端轉(zhuǎn)角的2位上引入可以通過增加未折疊鏈的熵而明顯穩(wěn)定此蛋白質(zhì)(見如Watanabe等人，歐洲生物化學(xué)雜志，vol.226,277-283(1994))。類似地，甘氨酸殘基沒有β-碳原子，因而比其它殘基具有明顯較大的骨架構(gòu)象自由度。這可造成導(dǎo)致弱穩(wěn)定性的高柔性。在等價于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中G299,G410,G433,G474,G475的一個或多個甘氨酸殘基的替換，優(yōu)選地用丙氨酸，可以降低柔性而增加穩(wěn)定性。此外，通過縮短延伸環(huán)也可以增加穩(wěn)定性。已觀察到高溫嗜熱產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與其中溫對應(yīng)物相比延伸環(huán)較短(見如Russel等人，生物技術(shù)現(xiàn)代觀點(Current Opinions in Biotechnolog)vol.6,370-374(1995))。二硫鍵的引入對穩(wěn)定彼此間獨特的四級結(jié)構(gòu)也有效。在G301處的修飾通過限制或增加甘氨酸的構(gòu)象變化將改變290-309片段的穩(wěn)定性。特別地，考慮在此殘基天冬氨酸或脯氨酸的替換。在G474的修飾通過用其它殘基替換可以因引入一個Cβ而增加穩(wěn)定性，因此降低其構(gòu)象自由度。
(2)通過增加側(cè)鏈疏水性減少內(nèi)部的空腔可以改變一種酶的穩(wěn)定性。減少內(nèi)部空腔的數(shù)量和體積可通過最大化疏水相互作用和降低填充缺陷從而增加酶的穩(wěn)定性(見如Mattews,Ann.Rew.biochem.vol.62,139-160(1993)；Burley等人，科學(xué)，vol.229,23-29(1985)；Zuber,Biophys.Chem.,vol29,171-179(1988)；Kellis等人，自然，vol.333,784-786(1988))。已知來自嗜熱性蛋白的多亞基蛋白經(jīng)常比其嗜溫性對應(yīng)物中有較大表面互補性的疏水性亞單位界面(Russel.等人，出處同前)。申請者認為此原則可應(yīng)用到單亞基蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域表面。特異性替換可以通過增加疏水性以增加穩(wěn)定性，包括賴氨酸換成精氨酸、絲氨酸換成丙氨酸以及蘇氨酸換成丙氨酸(Russel，等人，出處同前)。通過替換成丙氨酸或脯氨酸在G301處的修飾可以增加側(cè)鏈的尺寸，從而導(dǎo)致空腔減少，填充性更好且增加疏水性。此外，在CalB結(jié)合區(qū)域中結(jié)構(gòu)域A和結(jié)構(gòu)域C之間的交界處的空腔是以Y302,M304,L307,F343,L427和I428為邊界的。減少空腔尺寸、增加疏水性和提高結(jié)構(gòu)域A-結(jié)構(gòu)域C交界處的互補性的替換可以提高酶的穩(wěn)定性。特別地，用選自苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸和異亮氨酸中的不同的殘基對在這些位點的特異性殘基加以修飾可以改善性能?？赡苡杏玫牧硗獾奶鎿Q是在V409和F403，優(yōu)選地替換在V409包含異亮氨酸或亮氨酸，以及在F403包含酪氨酸或色氨酸。
(3)平衡剛性二級結(jié)構(gòu)(即α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角)中的電荷可以提高穩(wěn)定性。例如，用天冬氨酸上的負電荷中和螺旋N-端的部分正電荷可以穩(wěn)定此結(jié)構(gòu)(見如，Eriksson等人，科學(xué)，vol.255,178-183(1992))。相似地，用正電荷中和螺旋C-端上的負電荷可以增加穩(wěn)定性。移去與β-轉(zhuǎn)角中肽的N-端相互作用的正電荷可以有效賦予四級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。用非正電荷的殘基替換H405可從與405-408轉(zhuǎn)角中的D407酰胺氮相互作用中除去不利的正電荷。
(4)引入鹽橋和氫鍵以穩(wěn)定四級結(jié)構(gòu)是有效的。例如，離子對相互作用，如天冬氨酸或谷氨酸與賴氨酸、精氨酸或組氨酸之間，可以引起強穩(wěn)定效果且可以用于貼附不同的四級結(jié)構(gòu)元件從而導(dǎo)致熱穩(wěn)定性的提高。此外，荷電殘基/非荷電殘基氫鍵的數(shù)目以及氫鍵數(shù)目的增加一般地可提高熱穩(wěn)定性(見如Tanner等人，生物化學(xué)(Biochemistry),vol.35,2597-2609)。用天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺替換H405可以引入與骨架酰胺D407之間的氫鍵，因而穩(wěn)定了405-408轉(zhuǎn)角。用精氨酸替換K436可以改善與D404的鹽橋且引入一種H鍵到I408的骨架羰基。
(5)避免不耐熱的殘基一般可以增加熱穩(wěn)定性。例如，高溫下天冬酰胺和谷氨酰胺易于脫酰胺而半胱氨酸易于被氧化。在敏感位置減少這些殘基的數(shù)目可以導(dǎo)致熱穩(wěn)定性提高(Russel等人，出處同前)。由除了谷氨酰胺或半胱氨酸之外的任一氨基酸替換或刪除Q291,Q298,N309,Q340或N473可以通過避免了不耐熱的殘基而增加穩(wěn)定性。
(6)從蛋白質(zhì)上引入第六個配基到鈣離子可以提高結(jié)合的鈣離子的穩(wěn)定性，因而穩(wěn)定此酶。用天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺替換H406可以增加鈣離子的親和力。
(7)CalB中現(xiàn)有的鈣離子配基的穩(wěn)定也可以增加結(jié)合的鈣離子的穩(wěn)定性，因而穩(wěn)定此酶。例如，M304可以用苯丙氨酸或酪氨酸替換以引入芳香側(cè)鏈/天冬氨酸側(cè)鏈穩(wěn)定性，其中羧化的氧可以與芐基環(huán)相關(guān)的部分正電荷有利的相互作用，從而增加D407和D430的穩(wěn)定性。用苯丙氨酸或酪氨酸替換H405在D407附近引入一個疏水基因，可以通過D407側(cè)鏈的C-b和C-g原子的有利的范德華相互作用的形成而增加D407的穩(wěn)定性。用苯丙氨酸在G300的替換可以除去與Q291的側(cè)鏈H鍵。
(8)增加任何一個鈣離子配體的負電性可以增強鈣離子結(jié)合。例如，用苯丙氨酸或酪氨酸替換M304可以通過改善對溶劑的屏蔽而增加D407和D430的負電性，從而改善鈣離子結(jié)合。
(9)從鈣離子附近除去可以干擾鈣離子結(jié)合的正電荷可以類似地改善鈣離子結(jié)合位點的穩(wěn)定性。例如，替換緊鄰結(jié)合的鈣離子的H405或H406，這些殘基可帶有可能與帶正電的鈣離子產(chǎn)生不利的電荷-電荷相互作用的正電荷且可以與帶負電荷的鈣離子配體有競爭性電荷-電荷相互作用。因此，使用一個合適的非正電荷殘基的替換可以增加鈣離子親和力和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。
(10)通過在其附近引入負電荷的殘基的CalB結(jié)合位點的穩(wěn)定也可以改進在此位點的鈣離子的結(jié)合(見例如，Pantoliano等人，生物化學(xué)(Biochemisry)vol.27,8311-8317(1988)；Bryan,《蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性B部體外降解途徑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定的策略》(Stability of Protein Pharmaceuticals Part B:In vitro Pathwaysfor Degradation and Strategies for Protein Stabilization)(Ahern和Manning編)，147-181(1992)；Fagain,Biochim.Biophys.Acta,vol.1252,1-14(1995))。例如，用帶負電荷的天冬氨酸或谷氨酸替換Q291,Q298,N309,Q304,H405,H406,N473和/或G474可以增加鈣離子區(qū)的凈負電荷且可增加鈣離子的親和力，從而增加酶的穩(wěn)定性。
根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶可以呈現(xiàn)改變了的性能，只要這些期望的和出乎意料的效果在通常使用α-淀粉酶的不同應(yīng)用中是有用的。例如，根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶呈現(xiàn)出在低pH下改變了的性能特點，包括改善了的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和/或氧化穩(wěn)定性，它就可用于低pH的淀粉液化。增強的熱穩(wěn)定性可用于延長摻入此酶的產(chǎn)品的保質(zhì)期。增強的氧化穩(wěn)定性或改善了的性能在清潔產(chǎn)品中特別需要，且可用于延長含有漂白劑、過硼酸鹽、過碳酸鹽或用于這些清潔產(chǎn)品的過酸的α-淀粉酶的保質(zhì)期。相反，低熱穩(wěn)定性或氧化穩(wěn)定性可以用于需要淀粉水解活性迅速高效失活的工業(yè)過程中。此外，對鈣離子的低需要或強親和力在洗滌劑中通?？梢姷亩鄡r螯合組分存在時有利，如增加清潔作用的物質(zhì)(助洗劑)。
本發(fā)明的α-淀粉酶特別用于淀粉加工和特別是淀粉液化中。在商業(yè)化期望的液化過程的特征性條件包括低pH，高溫和可能的氧化條件，這就要求α-淀粉酶呈現(xiàn)改善的低pH性能、改善的熱穩(wěn)定性和改善的氧化穩(wěn)定性。相應(yīng)地，根據(jù)本發(fā)明的在液化過程中特別有用的α-淀粉酶在低于約pH6，優(yōu)選地低于約pH5.5，更優(yōu)選地在約pH5.0和5.5之間呈現(xiàn)改善的性能，此外，根據(jù)本發(fā)明的在溫度約80-120℃之間，優(yōu)選地在約100-110℃之間呈現(xiàn)增加的熱穩(wěn)定性以及在有氧化劑存在下增加的穩(wěn)定性的α-淀粉酶特別有用。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的用于液化的α-淀粉酶還包含在M15,V128,H133,W138,N188,A209和/或M197的一個或多個位置的缺失或替換。
在另一本發(fā)明的實施方案中，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的液體、凝膠或顆粒形式的洗滌劑組合物。這些洗滌劑組合物將會從根據(jù)本發(fā)明的一種α-淀粉酶的添加中受益，這些α-淀粉酶具有增加的熱穩(wěn)定性可延長保質(zhì)期或增加氧化穩(wěn)定性，因而此α-淀粉酶對洗滌劑中常常存在的漂白劑或過酸化合物有增強的抗性。因此，根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶可以被有利的制成具有pH約6.5到12.0之間的粉末、液體或凝膠型洗滌劑。本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案還包括在M15,V128,H133,W138,N188,A209和/或M197的一個或多個位置的缺失或替換。含有根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的洗滌劑組合物可以進一步包含如內(nèi)切糖苷酶、纖維素酶、蛋白酶、脂酶或其它淀粉酶的其它酶，例如，為本領(lǐng)域周知的源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的淀粉酶。
本發(fā)明的實施方案包括根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶與蛋白酶的結(jié)合物，優(yōu)選地包括氧化穩(wěn)定的蛋白酶，如在US.Re34,606中描述過的酶(此處引用作為參考)以及商業(yè)性可得的酶如DURAZYM(NovoNordisk),MAXAPEM(Gist brocades)和PURAFECTOxP(Genencor International公司)。制造這些蛋白酶突變體(氧化穩(wěn)定性蛋白酶)特別是具有在等價于解淀粉地衣芽孢桿菌中M222位置的甲硫氨酸替換的突變體的方法見U.S,Re34,606中所述。
以下以實施例方式給出且不構(gòu)成對權(quán)利要求范圍的限制。此處所用的縮寫，特別是關(guān)于氨基酸的三字母或單字母概念如Dale,J.W.細菌分子遺傳學(xué)(Molecular Genetics of Bacteria)John Wiley&Sons(1989)附錄B中所述。實驗部分實施例地衣芽胞桿菌α-淀粉酶晶體的制備晶體生長在10μl的懸滴中進行，其中含有1.6-1.8M Li2SO4,1mMCaCl2,50mM NaCl,用200mM bistrispropane緩沖在pH6.5。晶體在7-14天生長成長條棱柱狀，最大線度約1.5mm，其空間群為P212121,晶胞參數(shù)為a=118.3,b=119.0,c=84.9。假定不對稱單位中含2個分子,則Matthews值(見Matthews，分子生物學(xué)，vol.33,409(1968))為3.01，處于正常范圍之內(nèi)。數(shù)據(jù)收集使用RAXISⅡ成象板系統(tǒng)，固定于RU-200B轉(zhuǎn)靶X光源產(chǎn)生的石墨單色化的CuKα輻射。使用Molecular Structures公司(The Woodlands,Texas)為此系統(tǒng)配備的軟件進行數(shù)據(jù)處理并還原為振幅。相角信息的確定采用多對同晶置換法(MIR)輔以反常散射數(shù)據(jù)(MIRAS)，及隨后的密度修正方法。重原子衍生物用傳統(tǒng)浸泡法制備，SmCl3衍生物除外，它是用共晶法制備的。采用差值帕特森法(Pattersons)和交差相位差值付里葉法確定重原子位置。SmCl3衍生物提供了極好的反常散射數(shù)據(jù)，被用來確定正確的手性，以及給所有重原子確定共同的原點。使用Xheavy程序(Zhang等人，Acta Crystallog.A,vol.46,377(1990))修正重原子位置并計算了MIRAS相角。相角進一步采用溶劑過濾法進行改善，使用的程序為SQUASH(McRee,J.,Mol.Graph.,vol.10,44(1992))，由此獲得了3分辨率的電子密度圖，其上兩個分子的大部分二級結(jié)構(gòu)元素都能被識別。用Xfit程序(Zhang，出處同前)進行了模型建造、實空間修正和對稱性平均。兩個分子中，α/β桶形結(jié)構(gòu)域中的β折疊和α螺旋的Cα位置，和所有β結(jié)構(gòu)域的C末端的Cα位置都被識別出。將曲霉屬α-淀粉酶(PDB代號6TAA)(Swift等人，Acta Crystallog.B,vol.47,535(1991))中的TIM桶模型近似地覆蓋于不對稱單位中兩個分子的Cα軌跡上，然后用整個未修改的結(jié)構(gòu)域的實空間修正來精確定位。這樣就可以精確測定局部對稱性算符，后者被用于電子密度圖的非晶體學(xué)對稱性平均。由此得到了顯著改善的電子密謀圖，但結(jié)構(gòu)域B仍不好。此時，僅有一個分子被建造于經(jīng)對稱性平均的圖中，另一個分子用局部對稱算符產(chǎn)生出來。Cα位置被識別出，主鏈用迭合五聚體的方法構(gòu)建出，五聚體取自一個經(jīng)很好修正的結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(Zhang，出處同前；Jones等人，EMBO,vol.5,819(1986))。在結(jié)構(gòu)域B，電子密度圖的大部分都不可解釋，僅殘基105-116和133-169能被建造出。對那些沒有明顯側(cè)鏈密度的殘基，以丙氨酸模型代替。使用Xplor程序(Brunger等人，ActaCrystallog.A,vol.45,50(1989))對這一初始模型用模擬退火慢降溫過程(初始溫度=3000K)，隨后用傳統(tǒng)最小二乘法進行修正，使用15-3.0之間的數(shù)據(jù)(F＞=3σF)，施加非晶體學(xué)對稱性約束。模型收斂于R因子0.28。用sigmaA法(Read,Acta Crystallog.A,Vol.42,140(1986))結(jié)合MIRAS和模型的相角，計算了2.2的電子密度圖。缺失的殘基被建造出來，同時對結(jié)構(gòu)的其余部分進行了相當(dāng)大的手工調(diào)整，然后用模擬退火(初始溫度=1000K)進行修正，使用8.0-2.2A之間的數(shù)據(jù)(F＞=3σF)。模型收斂于R因子0.245。隨后進行的限制性各向同性B因子修正給出R因子0.225。采用計算的相角計算了sigmaA加權(quán)的2fo-fc和fo-fc電子密度圖，并被用于鑒別錯誤，以及定位鈣離子。獲得1.9的母體數(shù)據(jù)后，fo-fc和2fo-fc差值電子密度圖被用于定位殘留的錯誤和識別有序水分子，繼之以Powell能量最小化和立體化學(xué)約束的B因子修正。
目前模型的R因子為0.19(15-1.9,F＞=3σF)，包含7914個非氫原子且包括630個水氧原子和3個鈣原子。它的幾何學(xué)質(zhì)量很好，與理想鍵長鍵角的r.m.s偏差分別為0.012和1.35°。φ和ψ角的Ramachandron圖顯示殘基150是唯一的顯著偏離允許區(qū)的非甘氨酸殘基。
地衣芽胞桿菌α-淀粉酶包含483個殘基。在目前的模型中N端的頭3個殘基和C端的殘基缺失，缺失的殘基還有分子1的殘基181-195，分子2的殘基181-193。這一例子導(dǎo)出的數(shù)據(jù)列于表1。
權(quán)利要求
1．一種包含結(jié)構(gòu)域A，結(jié)構(gòu)域C和鈣離子結(jié)合位點的α-淀粉酶，其中該鈣離子結(jié)合位點與所述結(jié)構(gòu)域A和所述結(jié)構(gòu)域C相關(guān)，其包含位于所述結(jié)構(gòu)域A和/或結(jié)構(gòu)域C中的配體殘基，其中所述的α-淀粉酶被修飾以改變該鈣離子結(jié)合位點的特性從而改變所述α-淀粉酶的性質(zhì)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的α-淀粉酶，其中所述的對該α-淀粉酶的修飾包括在該α-淀粉酶中替換、添加或刪除一種或多種氨基酸殘基的基因工程修飾。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的α-淀粉酶，其中所述的α-淀粉酶由芽孢桿菌或其衍生菌產(chǎn)生。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的α-淀粉酶，其中所述的α-淀粉酶由地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌或其衍生菌產(chǎn)生。
5．根據(jù)權(quán)利要求2的α-淀粉酶，其中所述的基因工程修飾包括在等價于地衣芽孢桿菌中290-309,339-347,402-411,426-436和/或472-477的位置上替換、添加或刪除一種氨基酸殘基。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的α-淀粉酶，其中所述的基因工程修飾包括在地衣芽孢桿菌中Q291,Q298,G299,G301,Y302,M304,L307,N309,Q340,F343,F403,H405,H406,D407,V409,G410、L427,I428,D430,G433,K436,N473,G474和G475中的一處或多處替換。
7．一種含有根據(jù)權(quán)利要求1的α-淀粉酶的洗滌劑。
8．一種含有根據(jù)權(quán)利要求1的α-淀粉酶的淀粉液化組合物。
9．根據(jù)權(quán)利要求1的α-淀粉酶，其中所述的α-淀粉酶還包含在等價于地衣芽孢桿菌中M15,V128,H133,W138,N188,A209和/或M197的一個或多個殘基的替換或刪除。
10．一種液化淀粉的方法，其包括以下步驟將根據(jù)權(quán)利要求1的一種α-淀粉酶加入到淀粉的水溶液中，在合適的條件下孵育合適的時間以液化該淀粉水溶液。
11．一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1的α-淀粉酶的DNA。
12．一種表達載體，其中權(quán)利要求11的DNA被可操縱地連接到可以用于表達該DNA的表達控制序列上。
13．一種用權(quán)利要求12的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
14．一種在宿主細胞中表達和/或分泌權(quán)利要求11的DNA的方法。
全文摘要
公開了新型α－淀粉酶,其中一種新的鈣離子結(jié)合位點通過化學(xué)或遺傳性改造與鈣離子結(jié)合位點相關(guān)的殘基加以修飾。此新型α－淀粉酶具有改變了的性能特征,如低pH下的淀粉水解能力、穩(wěn)定性和活性曲線。
文檔編號C12N9/26GK1222938SQ97194690
公開日1999年7月14日 申請日期1997年5月6日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月6日
發(fā)明者R·R·鮑特, A·沙瓦 申請人:金克克國際有限公司