專利名稱：鈣離子阻斷化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的鈣離子阻斷化合物(calcilytic compound)，含有該化合物的組合物及其作為鈣受體拮抗劑的應(yīng)用。
在哺乳動物中，細(xì)胞外Ca2+處于嚴(yán)格的體內(nèi)平衡控制下，調(diào)節(jié)著諸如凝血、中樞和肌肉的興奮性、適當(dāng)?shù)墓切纬傻榷喾N過程。細(xì)胞外Ca2+抑制了甲狀旁腺細(xì)胞分泌甲狀旁腺激素(“PTH”)，抑制了碎骨細(xì)胞的吸收，并且刺激了C-細(xì)胞分泌降鈣素。鈣受體蛋白能夠使得某些特異性細(xì)胞來響應(yīng)細(xì)胞外Ca2+濃度的改變。
PTH是血液和細(xì)胞外液中調(diào)節(jié)體內(nèi)Ca2+平衡的主要內(nèi)分泌因子。PTH，通過作用于骨和腎細(xì)胞，增加了血液中Ca2+的水平。這種細(xì)胞外Ca2+的增加會起負(fù)的反饋信號的作用，抑制PTH的分泌。細(xì)胞外Ca2+和PTH分泌之間的這種成反比的關(guān)系形成了一個(gè)重要的維持體內(nèi)Ca2+平衡的機(jī)理。
細(xì)胞外Ca2+直接作用于甲狀旁腺細(xì)胞來調(diào)節(jié)PTH的分泌。檢測細(xì)胞外Ca2+的變化的甲狀旁腺細(xì)胞表面蛋白的存在已經(jīng)得到確認(rèn)。見Brown等，Nature 366574，1993。在甲狀旁腺細(xì)胞中，這種蛋白即鈣受體起細(xì)胞外Ca2+受體的作用，能檢測到細(xì)胞外Ca2+離子濃度的改變，引發(fā)細(xì)胞的響應(yīng)功能，即PTH的分泌。
細(xì)胞外Ca2+影響多種細(xì)胞功能，綜述在Nemeth等的Cell Calcium 11319，1990文獻(xiàn)中。例如，細(xì)胞外Ca2+在濾泡旁(C-細(xì)胞)和甲狀旁腺細(xì)胞中起重要作用。參見Nemeth的Cell Calcium 11323，1990。已經(jīng)研究了細(xì)胞外Ca2+對碎骨細(xì)胞的作用。參見Zaidi的Bioscience Reports 10493，1990。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種化合物可模仿出細(xì)胞外Ca2+對鈣受體分子的效果。鈣離子阻斷化合物是能夠抑制鈣受體活性，導(dǎo)致由細(xì)胞外Ca2+引起的一個(gè)或多個(gè)鈣受體活性降低的化合物。鈣離子阻斷化合物在鈣受體調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展、設(shè)計(jì)、修飾和/或構(gòu)造中用作先導(dǎo)(lead)分子，其對Ca2+受體表現(xiàn)出活性。鈣離子阻斷化合物可用于治療多種疾病，這些疾病的特征為一種或多種成分的量異常，這些成分例如為多肽，如激素，酶或生長因子，它們的表達(dá)和/或分泌受在一個(gè)或多個(gè)Ca2+受體上的活性的調(diào)節(jié)或影響。鈣離子阻斷化合物的目標(biāo)疾病或失調(diào)包括骨和礦物質(zhì)的體內(nèi)平衡異常(abnormall bone and mineral homeostasis)。
鈣體內(nèi)平衡異常的特征為具有一個(gè)或多個(gè)下列活性血清中鈣的異常增加或減少；排泄尿中鈣的異常增加或減少；骨鈣水平(例如，按照骨礦物質(zhì)密度測量得到的)的異常增加或減少；飲食中鈣的異常吸收；影響血清中鈣量的信使如PTH和降血鈣素的產(chǎn)生和/或釋放的異常增加或減少；由影響血清中鈣量的信使引起的響應(yīng)中的異常改變。
因此，鈣受體拮抗劑提供了一種獨(dú)特的對與骨或礦物質(zhì)體內(nèi)平衡異常有關(guān)的疾病或失調(diào)的藥物治療方法，所述疾病或失調(diào)例如甲狀旁腺功能減退、骨肉瘤、牙周病、骨折康復(fù)、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Paget氏疾病，惡性腫瘤和骨折康復(fù)所致的體液性血鈣過多以及骨質(zhì)疏松。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括下文通式(I)表示的新的鈣受體拮抗劑，以及其作為鈣受體拮抗劑在治療與骨或礦物質(zhì)體內(nèi)平衡異常有關(guān)的疾病中的應(yīng)用，所述疾病包括但不限于甲狀旁腺功能減退、骨肉瘤、牙周病、骨折康復(fù)、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Paget氏疾病，惡性腫瘤和骨折康復(fù)所致的體液性血鈣過多以及骨質(zhì)疏松。
本發(fā)明還提供一種拮抗哺乳動物(包括人)體內(nèi)鈣受體的方法，其包括給有所需要的動物服用有效量的下文所述的通式(I)化合物。
本發(fā)明還提供一種增加哺乳動物(包括人)體內(nèi)血清中甲狀旁腺量的方法，其包括給有所需要的動物服用有效量的下文所述的通式(I)化合物。
發(fā)明詳述本發(fā)明的化合物選自下述通式(I)
其中A是芳基或稠合的芳基、二氫或四氫稠合的芳基、雜芳基或稠合的雜芳基、二氫或四氫稠合的雜芳基，它們是未取代的或被選自O(shè)H、鹵素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C3-6環(huán)烷基、CF3、OCF3、CN和NO2的基團(tuán)取代的；D是C或N，在環(huán)中具有1-2-N，條件是當(dāng)D為N時(shí)，X1-X5不存在；X1和X5獨(dú)立地選自氫、鹵素、CN和NO2，條件是或者X1或者X5是氫；另外條件還有當(dāng)D為N時(shí)，X1和X5不存在；X2、X3和X4選自氫、鹵素、O-C1-4烷基和J-K，其中J是共價(jià)鍵、亞烷基、O-亞烷基或亞烯基；和K選自CO2R5、CONR4R4’、OH、NR4R4’和CN，條件是當(dāng)D是N時(shí)，X2、X3和X4不存在；R4和R4’獨(dú)立地是氫、烷基、芳基或雜芳基；R5是氫、烷基、烷基-(O-烷基)m-O-烷基、芳基或雜芳基；n是0-4的整數(shù)；和，m是1-3的整數(shù)。
本文中所述“烷基”指的是任選取代的由碳-碳單鍵連接形成的并且含有1-20個(gè)碳原子的烴基。烷烴可以是飽和的或不飽和的直鏈、支鏈或環(huán)狀。優(yōu)選的，任選取代的烷基上的取代基選自芳基、CO2R、CO2NHR、OH、OR、CO、NH2、鹵素、CF3、OCF3和NO2，其中R是H、C1-4烷基、C3-6環(huán)烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、雜環(huán)烷基或芳基。另外的取代基選自F、Cl、Br、I、N、S和O。優(yōu)選取代基不多于3個(gè)。更優(yōu)選，烷基具有1-12個(gè)碳原子并且是未取代的。優(yōu)選烷基是直鏈烷基。
本文中所述“環(huán)烷基”指的是任選取代的3-7元碳環(huán)，除非另外說明，其中的取代基選自F、Cl、Br、I、N(R4)2、SR4和OR4。
本文中所述“芳基”指的是任選取代的具有至少一個(gè)共軛π電子體系的環(huán)的芳族基團(tuán)，該芳族基團(tuán)最多包含兩個(gè)共扼或稠合的環(huán)系。芳基包括碳環(huán)芳基和雙芳基基團(tuán)，均可被任選取代。優(yōu)選的芳基包括苯基和萘基。更優(yōu)選的芳基包括苯基。優(yōu)選的取代基選自鹵素、C1-4烷基、OCF3、CF3、OMe、CN、OSO2R和NO2，其中R是C1-4烷基或C3-6環(huán)烷基。
本文中所述的“雜芳基”指的是含有1、2或3個(gè)諸如N、S或O雜原子的芳環(huán)。
本文中所述的“烯基”指的是任選取代的包含至少一個(gè)碳-碳雙鍵并且含有多至5個(gè)碳原子的烴基。烯烴鏈可以是直鏈、支鏈或環(huán)狀。任意的取代基選自鹵素、C1-4烷基、OCF3、CF3、OMe、CN、OSO2R和NO2，其中R是C1-4烷基或C3-6環(huán)烷基。
本文中所述的“炔基”指的是任選取代的包含至少一個(gè)碳-碳三鍵并且含有多至5個(gè)碳原子的烴基。炔烴鏈可以是直鏈、支鏈或環(huán)狀。任意的取代基選自鹵素、C1-4烷基、OCF3、CF3、OMe、CN、OSO2R和NO2，其中R是C1-4烷基或C3-6環(huán)烷基。
本發(fā)明的化合物可以包括一個(gè)或多個(gè)不對稱碳原子，也可以消旋或立體活性形式存在。所有這些化合物及其非對映異構(gòu)體均在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的優(yōu)選化合物包括3-{6-氰基-5-[(R)-2-羥基-3-(2-茚滿(indan)-2-基-1，1-二甲基-乙基氨基)-丙氧基]-吡啶-2-基}-丙酸乙酯；3-{6-氰基-5-[(R)-2-羥基-3-(2-茚滿-2-基-1，1-二甲基-乙基氨基)-丙氧基]-吡啶-2-基}-丙酸；3-(6-氰基-5-{(R)-2-羥基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-乙基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸乙酯；3-(6-氰基-5-{(R)-2-羥基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-乙基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸；3-(6-氰基-5-{(R)-2-羥基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-丁基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸乙酯；和
3-(6-氰基-5-{(R)-2-羥基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-丁基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸。
藥學(xué)上可接受的鹽是在其服用時(shí)數(shù)量和濃度下沒有毒性的鹽。
藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽，如硫酸鹽、鹽酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、磷酸鹽、氨基磺酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、環(huán)己基氨基磺酸鹽和奎尼酸鹽。優(yōu)選的鹽是鹽酸鹽。藥學(xué)上可接受的鹽可以通過如鹽酸、馬來酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、環(huán)己基氨基磺酸和奎尼酸獲得。
藥學(xué)上可接受的鹽也包括當(dāng)存在酸性官能團(tuán)如羧酸或羥基時(shí)，與諸如芐星(benzathine)、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、甲葡胺(meglumine)、普魯卡因、鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉、銨、烷基胺和鋅形成的堿加成鹽。
本發(fā)明提供的通式(I)化合物可以采用標(biāo)準(zhǔn)的工藝來制備。制備優(yōu)選化合物的方法可以按照下述內(nèi)容進(jìn)行。接下來的實(shí)施例舉例說明了具體化合物的合成方法。根據(jù)本文所描述的方案，將其作為模型，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地生產(chǎn)出本發(fā)明所述的其他化合物。
本文中所用的試劑和溶劑都是購得的，起始材料可以通過標(biāo)準(zhǔn)工藝和步驟合成得到。
流程

圖1
流程圖2 一般制備方法按照流程圖1，根據(jù)該一般的步驟，可以合成許多本發(fā)明的化合物雜芳基酚的丙酮溶液用適當(dāng)?shù)膲A如碳酸鉀處理，加熱15分鐘。加入R-縮水甘油基-O-SON(R-glycidyl nosylate)，持續(xù)反應(yīng)過夜，得到相應(yīng)的縮水甘油基醚(流程圖1)。取代的縮水甘油基醚和過量的胺(例如1，1-二甲基-2-(4-甲氧苯基)乙胺)在無水乙醇、乙腈、THF、二氧六環(huán)(dioxane)、甲苯或其他類似溶劑中形成的溶液，在LiClO4等合適的催化劑的存在下，攪拌、回流過夜。產(chǎn)品通過色譜純化。鹽酸鹽可以通過向相應(yīng)的堿中加入氯化氫氣體或氯化氫的4M的二氧六環(huán)溶液來制得，或也可以采用其他標(biāo)準(zhǔn)方式制得。流程圖2說明了雜芳基酚的典型制法。2-溴-吡啶-3-酚與異丁烯的二氯甲烷溶液在硫酸的作用下反應(yīng)得到相應(yīng)的叔丁醚，將其和氰化鋅Zn(CN)2在鈀催化劑下作用得到3-叔丁氧基-吡啶-2-腈。進(jìn)行選擇性溴化得到6-溴-3-叔丁氧基-吡啶-2-腈。用丙烯酸乙酯進(jìn)行進(jìn)行Heck偶合，然后進(jìn)行選擇性還原，得到3-(5-叔丁氧基-6-氰基-吡啶-2-基)-丙酸乙酯，接著用TFA脫保護(hù)得到3-(5-羥基-6-氰基-吡啶-2-基)-丙酸乙酯。
為了將通式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于人和其他哺乳動物，采用標(biāo)準(zhǔn)的制藥操作，按照一般的方法將其配制成藥物組合物。
鈣離子阻斷化合物可以通過不同的途徑給藥，包括靜脈、腹膜、皮下、肌內(nèi)、口服、局部(經(jīng)皮)或粘膜給藥。對于全身給藥，優(yōu)選口服方式。對于口服給藥，化合物例如能夠配制成常規(guī)的口服劑型如膠囊、片劑和液體制劑形式如糖漿、酊劑和滴劑等。
可選的，注射劑(非腸胃給藥)可以用于例如肌內(nèi)、靜脈、腹膜和皮下。作為注射劑，本發(fā)明的化合物配制成溶液，優(yōu)選配制在生理上相容的緩沖劑或溶液如生理鹽水、Hank溶液或Ringer溶液中。另外，化合物也可以配制成固體形式，使用前重新溶解或懸浮后，然后立即使用。凍干劑(lyophilizedform)也可以應(yīng)用。
全身服用(systemic administration)也可以通過經(jīng)皮或粘膜方式給藥。對于經(jīng)皮或粘膜給藥，在制劑中加入適宜將藥物透過要穿透的屏障的滲透劑。這種滲透劑是本領(lǐng)域已知的，例如包括；用于粘膜給藥的膽汁酸鹽和梭鏈孢酸(fusidic acid)衍生物。另外，凈化劑也可用來促進(jìn)滲透。粘膜給藥可以通過諸如鼻噴霧器、直腸栓劑或陰道栓劑等方式。
對于局部給藥，本發(fā)明的化合物可以配制成本領(lǐng)域常用的藥膏(ointment)、軟膏(salve)、凝膠(gel)或乳膏(cream)等劑型。
各種鈣離子阻斷化合物的用量可以通過標(biāo)準(zhǔn)步驟，考慮到如化合物的IC50、EC50、化合物的生物半衰期、病人的年齡、身高和體重以及病人所患病癥的因素來確定，這些因素以及其他要考慮的因素的重要性對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是已知的。
服用劑量也依賴于服用方式和生物利用度。例如，對于口服生物利用度低的化合物，服用時(shí)所用的劑量將相應(yīng)的增加。
組合物優(yōu)選是單位劑量形式。對于口服方式，可以采用片劑或膠囊，對于鼻用方式，可采用可計(jì)量的氣霧劑劑型，對于經(jīng)皮給藥，可以采用局部用制劑或貼片，對于粘膜給藥方式，可以采用口腔貼片。對于每一種情況，制劑都要使得患者能夠服用一個(gè)劑型。
對于口服給藥，每個(gè)劑量單位適宜包含0.01-500mg/Kg，優(yōu)選0.1-50mg/Kg的通式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，按游離堿計(jì)算。對于腸胃外給藥、鼻內(nèi)給藥、口服吸入給藥、粘膜給藥或經(jīng)皮給藥途徑，每日劑量適宜包含0.01-100mg/Kg的通式(I)化合物。局部用制劑適宜包含0.01-5.0％的通式(I)化合物?；钚猿煞挚梢悦刻旖o服例如1-6次，優(yōu)選一天一次，要足以產(chǎn)生所需的活性，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是清楚的。
本文中所述的“治療”疾病包括但不限于防止、延緩和預(yù)防疾病。
可被治療或預(yù)防的疾病和失調(diào)，基于受侵襲的細(xì)胞，包括與骨和礦物質(zhì)有關(guān)的疾病或失調(diào)；甲狀旁腺機(jī)能減退；中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如發(fā)作()、發(fā)作綜合征(stroke)、頭部創(chuàng)傷、脊髓損傷、缺氧引起的神經(jīng)細(xì)胞受損如心動停止或新生兒呼吸窘迫(neonatal distresss)時(shí)發(fā)生的那些情況、癲癇、神經(jīng)退化疾病如阿爾茨海姆疾病、亨廷頓病和帕金森氏癥、癡呆、肌肉緊張、抑郁、焦慮、恐慌(panic disorder)、強(qiáng)迫觀念和行為的疾病，外傷后緊張性刺激(post-traumatic stresss disorder)，精神分裂癥、抗精神病藥的惡性綜合征和Tourette綜合征；涉及過量水由腎吸收的疾病如ADH分泌失調(diào)綜合癥(SIADH)、(肝)硬化、充血性心力衰竭和腎(變)?。桓哐獕?；預(yù)防和/或減少來自陽離子抗生素(例如氨基糖苷類抗生素)的腎臟毒性；消化道能動性失調(diào)(gut motility disorders)如腹瀉和結(jié)腸痙攣(spastic colon)；GI潰瘍；具有過量鈣吸收的GI疾病例如肉狀瘤病(sarcoidosis)；自身免疫系統(tǒng)疾病和器官移植的排斥反應(yīng)；鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma)；以及胰腺炎(pancreastitis)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物被用于增加血清中甲狀旁腺激素(“PTH”)水平。增加血清中PTH水平有助于治療諸如甲狀旁腺功能失調(diào)(hypoparathyroidism)、骨肉瘤(osteosarcoma)、牙周病(periodontaldisease)、骨折愈合、骨關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)復(fù)位(joint replacement)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Paget氏疾病、體液性血鈣過多(humoral hypercalcemia)、惡性腫瘤(malignancy)和骨質(zhì)疏松等疾病。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物與抗吸收劑(anti-resorptive agent)聯(lián)合應(yīng)用。這種藥劑包括但不限于雌激素、1，25-二羥基維生素D3、降血鈣素(calcitonin)、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selectiveestrogen recaptor modulators)、血漿糖蛋白(vitronectin)受體拮抗劑、V-H+-ATP酶抑制劑、src SH2拮抗劑、二膦酸類(bisphosphonates)和組織蛋白酶(cathepsin)K抑制劑。
本發(fā)明的另一方面還公開了一種治療患者的方法，該方法包括給患者服用足以增加血清中PTH水平量的本發(fā)明化合物。優(yōu)選，該方法是給患者服用有效量的化合物，以有效增加血清中PTH水平的持久性和/或數(shù)量，從而產(chǎn)生治療效果。
在各種實(shí)施方案中，給患者服用的本發(fā)明化合物可以使血清中PTH水平持續(xù)增加高至1小時(shí)，約1-約24小時(shí)，約1-約12小時(shí)，約1-約6小時(shí)，約1-約5小時(shí)，約1-約4小時(shí)，約2-約5小時(shí)，約2-約4小時(shí)，或者約3-約6小時(shí)。
在本發(fā)明可供選擇的實(shí)施方案中，給患者服用的本發(fā)明化合物可以使血清中PTH水平增加持續(xù)約24小時(shí)以上，條件是本發(fā)明的化合物和抗再吸受劑聯(lián)合給藥。
在另外的不同的實(shí)施方案中，給患者服用的本發(fā)明化合物使血清中PTH水平比病人的血清中PTH最高值增加高至2倍，2-5倍，5-10倍，以及至少10倍。血清中PTH最高值是在病人沒有進(jìn)行治療的時(shí)候測定的。
通式(I)化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性物質(zhì)在口服服用時(shí)，可以制成糖漿、片劑、膠囊和錠劑等劑型。糖漿劑通常是化合物或鹽在液體載體中的懸浮液或溶液，其中的液態(tài)載體例如乙醇，花生油，橄欖油，甘油或水，其中還含有矯味劑或著色劑。當(dāng)組合物是片劑形式時(shí)，通常用于制備固體劑型的藥物載體都可以應(yīng)用。這些載體的實(shí)例包括硬脂酸鎂，高嶺土(terra alba)，滑石，明膠，阿拉伯膠，硬脂酸，淀粉，乳糖和蔗糖。當(dāng)組合物是膠囊形式時(shí)，任何常規(guī)的包封材料都是可用的，例如在硬明膠殼時(shí)使用上述載體。當(dāng)組合物是軟明膠殼膠囊形式時(shí)，常規(guī)的用于制備分散體或懸浮液的任何藥用載體都是可用的，例如含水(樹)膠，纖維素，硅酸鹽或油，將它們加入到軟明膠膠囊殼中。
典型的非腸胃給藥的組合物的組成為化合物或其鹽在一種滅菌的含水或不含水的載體中的溶液或懸浮液，其任選地含有腸胃外可接受的油，例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂(lecithin)、花生油(arachis oil)或芝麻油。
典型的用于吸入的組合物是溶液、懸浮液或乳液的形式，它們可以通過干粉形式給藥，或者采用諸如二氯二氟甲烷或三氯氟代甲烷的常規(guī)推進(jìn)劑的氣霧劑形式給藥。
典型的栓劑含有在以這種形式給藥時(shí)作為活性物質(zhì)的通式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及粘合劑和/或潤滑劑，例如聚二醇類，明膠，可可脂或其他低熔點(diǎn)的植物蠟或脂肪或它們的合成的類似物。
典型的真皮(dermal)和經(jīng)皮劑型含有常規(guī)的水或非水載體，例如乳膏、藥膏、洗液或糊劑形式，它們是藥用的膏藥、貼劑或膜劑形式。
優(yōu)選，本發(fā)明的組合物為單位劑量形式，例如片劑、膠囊或可計(jì)量氣霧劑形式，這樣病人可以服用單一的劑量。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行給藥時(shí)，本發(fā)明的化合物沒有不可接受的毒性作用。
通式(I)化合物的生物活性可以通過下列試驗(yàn)證明(I)鈣受體拮抗劑試驗(yàn)鈣離子阻斷化合物的活性可以通過測定待測化合物阻斷穩(wěn)定表達(dá)人鈣受體的HEK 293 4.0-7細(xì)胞中的由細(xì)胞外Ca2+引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加所致的IC50來進(jìn)行確定。HEK 293 4.0-7細(xì)胞可以通過Rogers等人在J.Bone Miner.Res.10 Suppl.1S483，1995(在此引入作為參考文獻(xiàn))中記載的方法構(gòu)建。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加可以由細(xì)胞外Ca2+的濃度從1到1.75mM的增加而引起。細(xì)胞內(nèi)Ca2+可以采用熒光-3(fluo-3)，一種熒光性鈣指示劑來測定。
方法如下1.在T-150燒瓶中，將細(xì)胞在5％二氧化碳95％空氣中，37℃下，采用選擇培養(yǎng)基(DMEM中補(bǔ)充10％胎牛血清和200ug/ml的潮霉素B)培養(yǎng)，融合生長到高達(dá)90％。
2.保持溫度在37℃，緩慢倒出培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞單層兩次。第二次洗后，加入6mL的0.02％EDTA的PBS溶液，在37℃培養(yǎng)4分鐘。培養(yǎng)以后，通過緩慢攪拌來分散細(xì)胞。
3.集中2或3個(gè)燒瓶中的細(xì)胞，球化(pellet)(100xg)，將細(xì)胞球(cellularpellet)再次懸浮在10-15mL的SPF-PCB+中，通過離心分離再次球化。洗滌兩次。
無硫酸或磷酸的甲狀旁腺細(xì)胞緩沖劑(SPF-PCB)含有20mM為pH7.4的Na-Hepes、126mL的氯化鈉、5mM氯化鉀和1mM氯化鎂。SPF-PCB在4℃制備和儲存。使用的當(dāng)天，補(bǔ)充加入1mg/mL的D-葡萄糖和1mM氯化鈣，然后分成兩部分。一部分中加入5mg/mL(SPF-PCB+)的牛血清蛋白(BSA；部分V，ICN)。該緩沖液被用來洗滌、載荷和保持細(xì)胞。沒有BSA的部分用來稀釋試管中的用于熒光檢測的細(xì)胞。
4.用10mL含有2.2uM的熒光-3(分子化探針)的SPF-PCB+將細(xì)胞球重新懸浮，在室溫下培養(yǎng)35分鐘。
5.培養(yǎng)后，通過離心分離將細(xì)胞球化。得到的細(xì)胞球用SPF-PCB+洗滌。洗畢，用SPF-PCB+將細(xì)胞球再次懸浮，密度為1-2×106細(xì)胞/mL。
6.為了記錄熒光信號，用1.2mL含有1mM氯化鈣和1mg/mL的D-葡萄糖的SPF緩沖液稀釋300uL的細(xì)胞懸浮液。熒光的測量是在37℃恒速攪拌下用分光熒光計(jì)(spectrofluorimeter)測得。激發(fā)和發(fā)射波長分別在485和535nm測得。為了校正熒光信號，加入洋地黃皂苷(digitonin)(在乙醇中濃度為5mg/mL)得到Fmax，通過加入Tris-EGTA(2.5M Tris-Base，0.3M EGTA)得到表觀Fmin。細(xì)胞內(nèi)鈣的濃度通過下式計(jì)算得到細(xì)胞內(nèi)鈣濃度＝(F-Fmin/Fmax)×Kd；在此Kd＝400nm。
7.為了確定待測化合物潛在的鈣離子阻斷化合物活性，在將細(xì)胞外Ca2+濃度從1增加到2mM之前，將細(xì)胞和待測化合物(或作為對照物的載體)共同培養(yǎng)90秒鐘。以濃度依賴性方式，測定鈣離子阻斷化合物阻斷由細(xì)胞外Ca2+引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加的能力。
通常，在鈣受體拮抗抑制劑試驗(yàn)中具有較低的IC50值的化合物是更優(yōu)選的化合物。認(rèn)為IC50值大于50uM的化合物是沒有活性的，IC50值為10uM或更小的化合物是優(yōu)選的，更優(yōu)選的是IC50值為1uM，最優(yōu)選的是IC50值為0.1uM或更小的化合物。
(II)鈣受體結(jié)合作用試驗(yàn)被人甲狀旁腺鈣受體(“HuPCaR”)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293 4.0-7細(xì)胞在T180組織培養(yǎng)燒瓶中成倍放大。在緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.4，1mMEDTA，3mM氯化鎂)中，在包含1μM Leupeptin、0.04μM Pepstatin和1mMPMSF的蛋白酶抑制劑混合物(cocktail)的存在下，通過多元均漿作用(polytron homogenizeation)或玻璃杜恩斯勻漿作用(glass douncing)獲得血漿薄膜。等份的薄膜被速凍，在-80℃保存。3H標(biāo)記的化合物經(jīng)放射性同位素示蹤為44Ci/mmol的放射性活性(radiospecific activity)，為了維持放射化學(xué)的穩(wěn)定性，將其等分并儲存在液氮中。
在0.5mL的反應(yīng)容器中，在含有0.1％明膠和10％乙醇的均漿緩沖液中，典型的反應(yīng)混合物含有2nM3H化合物((R，R)-N-4′-甲氧基-t-3-3′-甲基-1′-乙基苯基-1-(1-萘基)乙胺)，或3H化合物(R)-N-[2-羥基-3-(3-氯-2-氰基苯氧基)丙基]-1，1-二甲基-2-(4-甲氧基苯基)乙胺4-10ug薄膜。培養(yǎng)在冰水浴中進(jìn)行，采用12×75聚乙烯試管。向每個(gè)試管中加入25μL的測試樣品的100％乙醇溶液，接著加入400uL冷的培養(yǎng)緩沖液和25μL的40nM3H-化合物的100％乙醇溶液，最終濃度為2nM。結(jié)合反應(yīng)通過加入50uL的用培養(yǎng)緩沖液稀釋的80-200ug/mL HEK 293 4.0-7薄膜而啟動，在4℃培養(yǎng)30min。洗滌用緩沖液是含有0.1％PEI的50mM Tris-HCl。通過加入100倍過量的未標(biāo)記的同族的配體(homologous ligand)產(chǎn)生非特異性結(jié)合，通常其是總結(jié)合量的20％。結(jié)合反應(yīng)使用Brandel Harvestor，通過快速過濾到1％PEI預(yù)處理的GF/C過濾器(filter)中而終止反應(yīng)。。將過濾器放在閃爍液體中，并通過液態(tài)閃爍計(jì)數(shù)器來評估其放射性。
實(shí)施例核磁共振波譜采用Bruker AM 250或Bruker AM 400波譜儀，相應(yīng)地在250或400MHz頻率下測得。CDCl3是氘代氯仿，DMSO-d6是六氘代二甲基亞砜，CD3OD是四氘代甲醇?；瘜W(xué)位移以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)物，以每百萬分之一(*)來定義。NMR數(shù)據(jù)中的縮寫采用如下方式s＝單峰，d＝二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，dd＝雙二重峰，dt＝雙三重峰，app＝銳峰(apparent)，br＝寬峰。J代表NMR中采用Hertz測得的偶合常數(shù)。連續(xù)紅外波譜(IR)通過Perkin-Elmer 683紅外分光光度計(jì)測定，傅里葉轉(zhuǎn)換紅外波譜(FTIR)在Nicolet Impact 400 D紅外分光光度計(jì)中測定。IR和FTIR波譜測得的是發(fā)射模式，波段位置以波長的導(dǎo)數(shù)為單位標(biāo)記。質(zhì)譜是使用快速原子轟擊(FAB)或電子噴霧(ES)離子化技術(shù)在VG 70 FE，PE Syx API III或VG ZAB HF儀器上測定。元素分析在Perkin-Elmer 240C元素分析儀上測定。熔點(diǎn)在Thomas-Hoover熔點(diǎn)儀上測定，并且沒有經(jīng)過校正。所有的溫度指的是攝氏溫度。
Analtech Silica Gel GF和E.Merck Silica Gel 60 F-254薄層板用于薄層色譜分析。在E.Merck Kieselgel 60(230-400目)的硅膠上進(jìn)行快速和重力色譜(flash and gravity chromatogramph)。在Rainin或Gilson色譜儀上進(jìn)行分析性和制備性的HPLC。ODS指的是十八烷基甲硅烷基衍生的硅膠色譜載體。5μApex-ODS指的是標(biāo)稱粒徑為5μ的十八烷基甲硅烷基衍生的硅膠色譜載體(Jones Chromatography，Littleton，Colorado制備)。YMC ODS-AQ是一種ODS色譜載體(support)，是YMC Co.Ltd.，Kyoto，Japan的注冊商標(biāo)。PRP-1是一種聚(苯乙烯-二乙烯基苯)色譜載體，是Hamilton Co.，Reno，Nevada的注冊商標(biāo)。Celite是一種由酸洗硅藻土硅膠(acid-washed diatomaceous silica)構(gòu)成的過濾助劑，是Manville Corp.，Denver，Colorado的注冊商標(biāo)。
根據(jù)上述一般的合成方法，合成了下列化合物實(shí)施例13-(5-羥基-6-氰基-吡啶-2-基)丙酸乙酯的制備a)2-溴-3-叔丁氧基吡啶在-78℃，硫酸的存在下，用異丁烯的二氯甲烷溶液處理2-溴-吡啶-3-酚，然后回流條件下攪拌18h。濃縮反應(yīng)混合物，在乙酸乙酯中的殘余物用5％的碳酸鈉(水)洗滌，干燥，濃縮得到上述標(biāo)題化合物。
b)3-叔丁氧基-吡啶-2-腈采用Maligres等(四面體快報(bào)》40，8193，2000)記載的方法，將在DMF中的實(shí)施例1(a)化合物與氰化鋅Zn(CN)2、Pd2(dba)3和DPPF在120℃反應(yīng)20小時(shí)。濃縮反應(yīng)混合物，在乙酸乙酯中的殘余物用5％的碳酸鈉(水)洗滌，干燥，濃縮，通過快速色譜純化得到上述標(biāo)題化合物。
c)6-溴-3-叔丁氧基-吡啶-2-腈將在醋酸中的實(shí)施例1(b)化合物與1當(dāng)量的溴(Br2)在0℃反應(yīng)。在消耗掉所有的起始原料后，通過加入硫代硫酸鈉淬滅反應(yīng)。濃縮反應(yīng)混合物，在乙酸乙酯中的殘余物用5％的碳酸鈉(水)洗滌，干燥，濃縮，通過快速色譜純化得到上述標(biāo)題化合物。
d)3-(5-叔丁氧基-6-氰基-吡啶-2-基)-丙烯酸乙酯將實(shí)施例1(c)化合物、丙烯酸乙酯、醋酸鈀(Pd(OAc)2)、P(鄰甲苯基)3和DIEA在DMF中的混合物脫氣并在100℃加熱2h。冷卻反應(yīng)混合物，用水稀釋，用二氯甲烷提取。干燥有機(jī)部分，濃縮得到上述標(biāo)題化合物。
e)3-(5-叔丁氧基-6-氰基-吡啶-2-基)-丙酸乙酯將實(shí)施例1(d)化合物和10％Pd/C的乙醇溶液在60psi壓力下加H2反應(yīng)2h。濾除催化劑，濃縮濾液得到上述標(biāo)題化合物。
f)3-(6-氰基-5-羥基-吡啶-2-基)-丙酸乙酯鹽酸鹽實(shí)施例1(e)的化合物的二氧六環(huán)(dioxine)溶液與4N的HCl的二氧六環(huán)溶液在室溫下反應(yīng)1h。濃縮反應(yīng)液，得到上述標(biāo)題化合物，為其鹽酸鹽。
實(shí)施例2
3-[6-氰基-5-((R)-1-環(huán)氧乙烷基甲氧基)-吡啶-2-基]-丙酸乙酯在干丙酮中的實(shí)施例1(f)的化合物與(2R)-脫水甘油基3-硝基苯磺酸酯的1∶1的混合物溶液，用碳酸鉀(3當(dāng)量)處理，并在氬氣保護(hù)下，加熱回流18h。冷卻反應(yīng)混合物，過濾，真空濃縮濾液，通過快速柱層析純化殘余物得到上述標(biāo)題化合物。
實(shí)施例32-茚滿-2-基-1，1-二甲基-乙胺的制備a)茚滿-2-基-乙酸甲酯在冰浴中，將茚滿-2-基-乙酸(Lancaster，20g，0.11mol)的甲醇(200mL)溶液攪拌，并冷卻到0-10℃，通過滴加亞硫酰(二)氯(14.8g，0.125mol)而進(jìn)行反應(yīng)。將混合物在室溫?cái)嚢?6h，真空濃縮，用乙酸乙酯溶解油狀殘余物，用2.5N氫氧化鈉，水和鹽水洗滌，干燥(硫酸鎂)，真空濃縮得到固化的標(biāo)題化合物(21g，97％)。
b)1-茚滿-2-基-2-甲基-丙-2-醇在冰浴中，將實(shí)施例3(a)化合物(6.3g，33mmol)的乙醚(ether)(150mL)溶液攪拌下滴加到1.4 M甲基鋰的乙醚(100mL，4.25eq)中。將混合物溫?zé)嶂潦覝兀瑪嚢?h，通過滴加飽和氯化銨溶液(150mL)來小心地終止反應(yīng)。分離出水相，用乙醚提取，合并乙醚層，用鹽水洗滌，干燥(硫酸鎂)，真空濃縮，得到油狀的標(biāo)題化合物，靜置可結(jié)晶(～89％)。
c)N-(2-茚滿-2-基-1，1-二甲基-乙基)-乙酰胺在冰浴中，攪拌下，向濃硫酸(1.7mL)和乙腈(6mL)的混合液中，在45min內(nèi)，滴加實(shí)施例3(b)化合物(3.3g，17.3mmol)的冰醋酸(5mL)溶液。將混合物放至室溫，攪拌16h，傾倒進(jìn)冰水中，用乙酸乙酯提取。合并有機(jī)相，用2.5N氫氧化鈉、水和鹽水洗滌，干燥(硫酸鎂)，真空濃縮，得到油狀殘余物，用己烷和幾滴乙酸乙酯將其研磨(triturate)，加入晶種，冷卻得到固體，過濾分離出固體，得到棕褐色固體標(biāo)題化合物(1.9g，47％)。MS(ES)m/e 23 1.9[M+H]+。將濾液真空濃縮，另外得到油狀標(biāo)題化合物(1.5g，37％)。
d)2-茚滿-2-基-1，1-二甲基-乙胺將實(shí)施例3(c)的化合物(6.5g，28mmol)在乙二醇(170mL)中的混合物用壓碎的氫氧化鉀球(pellets)(13g)處理，攪拌、加熱到190℃，持續(xù)24h。將混合物傾倒進(jìn)水中，用乙酸乙酯提取。合并有機(jī)相，用鹽水洗滌，用1N鹽酸提取。合并酸性提取液，用乙酸乙酯洗滌，用2.5N氫氧化鈉堿化，用乙酸乙酯提取。合并有機(jī)提取物，用鹽水洗滌，干燥(硫酸鎂)，真空濃縮，得到上述標(biāo)題化合物(3.2g，60％)。MS(ES)m/e 190.6[M+H]+。
實(shí)施例43-{6-氰基-5-[(R)-2-羥基-3-(2-茚滿-2-基-1，1-二甲基-乙基氨基)-丙氧基]-吡啶-3-基}-丙酸乙酯鹽酸鹽的制備將在無水乙醇中的1∶1的實(shí)施例2化合物和實(shí)施例3(d)化合物的混合物攪拌，加熱至回流進(jìn)行8h，冷卻，真空濃縮。用二氯甲烷溶解殘余物，并用1.0N的HCl的乙醚溶液酸化，得到上述標(biāo)題化合物。
實(shí)施例53-{6-氰基-5-[(R)-2-羥基-3-(2-茚滿-2-基-1，1-二甲基-乙基氨基)-丙氧基]-吡啶-3-基}-丙酸的制備在室溫、氬氣保護(hù)下，將實(shí)施例4化合物在乙醇和水(3∶1)中的溶液與2.5N氫氧化鈉(1.1當(dāng)量)反應(yīng)，攪拌過夜。真空除去乙醇，攪拌下，用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH到等電點(diǎn)。過濾收集沉淀出的固體，用水洗滌，真空干燥，得到上述標(biāo)題化合物。
權(quán)利要求
1.具有下述通式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 其中A是芳基或稠合的芳基、二氫或四氫稠合的芳基、雜芳基或稠合的雜芳基、二氫或四氫稠合的雜芳基，它們是未取代的或被選自O(shè)H、鹵素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C3-6環(huán)烷基、CF3、OCF3、CN和NO2的基團(tuán)取代的；D是C或N，在環(huán)中具有1-2-N，條件是當(dāng)D為N時(shí)，X1-X5不存在；X1和X5獨(dú)立地選自氫、鹵素、CN和NO2，條件是X1或X5是氫；另外條件還有當(dāng)D為N時(shí)，X1和X5不存在；X2、X3和X4選自氫、鹵素、O-C1-4烷基和J-K，其中J是共價(jià)鍵、亞烷基、O-亞烷基或亞烯基；和K選自CO2R5、CONR4R4’、OH、NR4R4’和CN，條件是當(dāng)D是N時(shí)，X2、X3和X4不存在；R4和R4’獨(dú)立地是氫、烷基、芳基或雜芳基；R5是氫、烷基、烷基-(O-烷基)m-O-烷基、芳基或雜芳基；n是0-4的整數(shù)；和，m是1-3的整數(shù)。
2.按照權(quán)利要求1所述的化合物，所述化合物選自3-{6-氰基-5-[(R)-2-羥基-3-(2-茚滿-2-基-1，1-二甲基-乙基氨基)-丙氧基]-吡啶-2-基}-丙酸乙酯；3-{6-氰基-5-[(R)-2-羥基-3-(2-茚滿-2-基-1，1-二甲基-乙基氨基)-丙氧基]-吡啶-2-基}-丙酸；3-(6-氰基-5-{(R)-2-羥基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-乙基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸乙酯；3-(6-氰基-5-{(R)-2-羥基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-乙基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸；3-(6-氰基-5-{(R)-2-羥基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-丁基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸乙酯；和3-(6-氰基-5-{(R)-2-羥基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-丁基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸。
3.一種拮抗鈣受體的方法，其包括給有所需要的受試主體服用有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。
4.一種治療特征為骨或礦物質(zhì)體內(nèi)平衡異常的疾病或失調(diào)的方法，其包括給有所需要的受試主體服用有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其中骨或礦物質(zhì)疾病或失調(diào)選自骨肉瘤、牙周病、骨折愈合、骨關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)復(fù)位、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Paget氏疾病、體液性血鈣過多、惡性腫瘤和骨質(zhì)疏松。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其中骨或礦物質(zhì)疾病或失調(diào)是骨質(zhì)疏松。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其中化合物與抗吸收劑聯(lián)合應(yīng)用。
8.按照權(quán)利要求7所述的方法，其中抗吸收劑選自雌激素、1，25-二羥基維生素D3、降血鈣素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、血漿糖蛋白受體拮抗劑、V-H+-ATP酶抑制劑、src SH2拮抗劑、二膦酸和組織蛋白酶K抑制劑。
9.一種增加血清甲狀旁腺量的方法，其包括給有所需要的受試主體服用有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。
10.按照權(quán)利要求9所述的方法，其中化合物與抗吸收劑聯(lián)合應(yīng)用。
11.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中抗吸收劑選自雌激素、1，25-二羥基維生素D3、降血鈣素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、血漿糖蛋白受體拮抗劑、V-H+-ATP酶抑制劑、src SH2拮抗劑、二膦酸和組織蛋白酶K抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的磷酸酯類化合物以及將其作為鈣離子阻斷化合物應(yīng)用的方法。
文檔編號A61K38/23GK1520401SQ01821324
公開日2004年8月11日 申請日期2001年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月25日
發(fā)明者普拉迪普·巴特納加爾, 喬爾·L·伯吉斯, 詹姆斯·F·卡拉漢, 瑪麗亞·A·拉戈, A 拉戈, F 卡拉漢, L 伯吉斯, 普拉迪普 巴特納加爾 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司