專(zhuān)利名稱(chēng)：：具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物dna病毒的制作方法根據(jù)美國(guó)法典第35章第119條，本申請(qǐng)要求于1996年9月11日申請(qǐng)的美國(guó)序列號(hào)60/026,297的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及使用非哺乳動(dòng)物DNA病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的現(xiàn)行方法包括使用哺乳動(dòng)物病毒載體，例如那些源自反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒或腺伴隨病毒的載體。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的其它方法包括DNA直接注射、使用配體-DNA綴合物、使用腺病毒-配體-DNA綴合物、磷酸鈣沉淀、和利用脂質(zhì)體或聚陽(yáng)離子-DNA復(fù)合物的方法。在一些情況下，脂質(zhì)體或聚陽(yáng)離子-DNA復(fù)合物可以將外源基因?qū)蛱囟ńM織類(lèi)型，例如肝組織。一般地，通過(guò)從已知感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制的病毒中除去不需要的特征，構(gòu)建用于表達(dá)目的基因的病毒。例如，經(jīng)常除去編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白和參與病毒復(fù)制的蛋白的基因以產(chǎn)生缺陷病毒，然后加入治療基因。已使用該原理從諸如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和皰疹病毒的許多類(lèi)型的動(dòng)物病毒產(chǎn)生基因治療載體。該方法亦已用于辛德畢斯病毒，它是RNA病毒，一般感染蚊子，但是可以在人體中復(fù)制，導(dǎo)致疹和關(guān)節(jié)炎綜合癥。已使用非哺乳動(dòng)物病毒在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因。例如，已使用桿狀病毒科的病毒(通常稱(chēng)為桿狀病毒)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)外源基因。研究最多的是苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)。盡管已描述了感染甲殼動(dòng)物的一些桿狀病毒種(Blissard，等，1990，Ann.Rev.Entomology35127)，但桿狀病毒AcMNPV的正常宿主范圍限于鱗翅目。已報(bào)道桿狀病毒進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Volkman和Goldsmith，1983，Appl.andEnviron.Microbiol.451085-1093；CarbonellandMiller，1987，App.AndEnviron.Microbiol.531412-1417；Brusca等，1986，Intervirology26207-222；和Tjia等，1983，Virology125107-117)。盡管出現(xiàn)了一篇哺乳動(dòng)物細(xì)胞中桿狀病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)的早期報(bào)道，但其作者后來(lái)將明顯的報(bào)道基因活性歸因于細(xì)胞與病毒較長(zhǎng)期溫育后，報(bào)道基因產(chǎn)物被帶入細(xì)胞(Carbonell等，1985，J.Virol.56153-160；和Carbonell和Miller，1987，Appl.andEnviron.Microbiol.531412-1417)。這些作者報(bào)道，當(dāng)所述外源基因做為桿狀病毒基因組的一部分得以進(jìn)入所述細(xì)胞時(shí)，所述外源基因沒(méi)有再表達(dá)。后續(xù)的研究證實(shí)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中桿狀病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)(Boyce和Bucher，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.932348-2352)。除桿狀病毒科之外，其它的病毒科僅在無(wú)脊椎動(dòng)物中繁殖；在表1中列出了一些這些病毒。目前正在研究基因治療方法在治療各種疾病方面的用途。絕大多數(shù)的基因治療方法涉及提供外源基因以克服患者中基因表達(dá)的缺陷。其它基因治療方法被設(shè)計(jì)為對(duì)抗疾病的效應(yīng)。再有其它的基因治療方法涉及提供反義核酸(例如，RNA)，以抑制宿主細(xì)胞基因(例如，癌基因)的表達(dá)或病原(例如，病毒)的基因表達(dá)。正在檢查某些基因治療方法糾正例如尿素循環(huán)的先天性錯(cuò)誤的能力(參見(jiàn)，例如，Wilson等，1992，J.Biol.Chem.26711483-11489)。尿素循環(huán)是從機(jī)體排除氮廢物的主要代謝途徑。尿素循環(huán)的步驟基本上局限于肝臟，前二步發(fā)生在肝線粒體中。在第一步中，在一個(gè)反應(yīng)中合成氨甲酰磷酸，該反應(yīng)由氨甲酰磷酸合成酶I(CPS-I)催化。在第二步中，在由鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(OTC)催化的反應(yīng)中形成瓜氨酸。然后瓜氨酸被運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)，與天冬氨酸一起由精氨琥珀酸合成酶(AS)縮合為精氨琥珀酸。在下一步驟中，精氨琥珀酸裂解酶(ASL)將精氨琥珀酸酶切產(chǎn)生精氨酸和延胡索酸。在該循環(huán)的最后一步，精氨酸酶將精氨酸轉(zhuǎn)化為鳥(niǎo)氨酸和尿素。參與尿素循環(huán)的這五個(gè)酶中任何一個(gè)的缺陷都有顯著的病理效應(yīng)，例如昏睡、進(jìn)食不良、精神發(fā)育遲緩、昏迷或新生兒期內(nèi)死亡(參見(jiàn)，例如，Emery等，1990，載于醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的原理和實(shí)踐，ChurchillLivingstone，NewYork)。OTC缺乏通常表現(xiàn)為新生兒期內(nèi)致命的血氨過(guò)多性昏迷。AS缺乏導(dǎo)致瓜氨酸血，其特征是血液中瓜氨酸水平高。ASL缺乏導(dǎo)致精氨琥珀酸尿(ASA)，其導(dǎo)致各種病癥，包括嚴(yán)重新生兒血氨過(guò)多和輕微精神發(fā)育遲緩。精氨酸酶缺乏導(dǎo)致血精氨酸過(guò)多，其可以表現(xiàn)為兒童早期的進(jìn)行性痙攣和精神發(fā)育遲緩。目前使用的其它肝臟疾病的治療法包括控制飲食；肝移植；和給予精氨酸游離堿、苯甲酸鈉和/或苯乙酸鈉。發(fā)明概述已發(fā)現(xiàn)可以使用攜帶外源基因表達(dá)構(gòu)建物、或具有“改變的”外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒，增強(qiáng)所述非哺乳動(dòng)物DNA病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的效率。例如，做為桿狀病毒病毒顆粒表面的改變的外殼蛋白表達(dá)皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G(VSV-G)，增強(qiáng)了所述桿狀病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因(例如，治療基因)的能力。雖然沒(méi)有責(zé)任去了解或公開(kāi)本發(fā)明起作用的方式，并且不受任何理論限制，但推測(cè)基因表達(dá)的增強(qiáng)是由于病毒顆粒進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞溶膠的能力增強(qiáng)。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明描繪了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的方法，包括(i)將具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒導(dǎo)入所述細(xì)胞，該病毒的基因組攜帶在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子控制下的外源基因，和(ii)在使得所述外源基因表達(dá)的條件下保持所述細(xì)胞。在第二個(gè)方面，本發(fā)明描繪治療哺乳動(dòng)物(例如，人或小鼠)中基因缺陷疾病的方法，涉及將治療有效量的具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒導(dǎo)入(體內(nèi)或活體外)細(xì)胞，該病毒的基因組攜帶外源基因，并在使得所述外源基因在所述哺乳動(dòng)物中表達(dá)的條件下保持所述細(xì)胞。本發(fā)明還描繪治療哺乳動(dòng)物中腫瘤的方法，涉及將具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒(例如，桿狀病毒)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的癌性細(xì)胞(例如，癌性肝細(xì)胞)，該病毒的基因組表達(dá)癌癥治療基因(編碼，例如，腫瘤壞死因子、胸苷激酶、白喉毒素嵌合體或胞苷脫氨酶)。所述外源基因可以在各種細(xì)胞中表達(dá)，例如，肝細(xì)胞；中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞，包括諸如大腦、脊髓或外周神經(jīng)的神經(jīng)元；腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；皮膚細(xì)胞；脾細(xì)胞；肌肉細(xì)胞；腎細(xì)胞和膀胱細(xì)胞。因此，本發(fā)明可以用于治療各種癌性或非癌性腫瘤，包括癌(例如，肝細(xì)胞癌)、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)瘤。本發(fā)明包括治療肺癌、乳腺癌和前列腺癌的方法。在本發(fā)明的這一方面，可以使用或者體內(nèi)或者體外方法將所述病毒導(dǎo)入所述細(xì)胞。最好是，所述外源基因可操作地連接至在所述哺乳動(dòng)物的癌性細(xì)胞中而不在其它細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。例如，甲胎蛋白啟動(dòng)子在肝細(xì)胞癌和胎兒組織的細(xì)胞中有活性，而在成熟組織中無(wú)活性。因此，為治療肝細(xì)胞癌，最好使用這種啟動(dòng)子表達(dá)癌癥治療基因。本發(fā)明亦描繪治療哺乳動(dòng)物中神經(jīng)疾病(例如，帕金森病、早老性癡呆或由中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的疾病)的方法。所述方法包括(a)將治療有效量的具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒(例如，桿狀病毒)導(dǎo)入細(xì)胞，該病毒的基因組包括編碼治療蛋白的外源基因，和(b)在使得所述外源基因在所述哺乳動(dòng)物中表達(dá)的條件下保持所述細(xì)胞。特別有用的外源基因包括那些編碼治療蛋白的基因，所述治療蛋白例如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)、酪氨酸羥化酶、多巴脫羧酶、大腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、sonichedeghog蛋白、膠質(zhì)源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)和RETLI(亦稱(chēng)為GDNFα、GFR-1和TRN1)。神經(jīng)元細(xì)胞和非神經(jīng)元細(xì)胞(例如，成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞和腎細(xì)胞)都可以用于本發(fā)明的這一方面。這類(lèi)細(xì)胞可以是受治療哺乳動(dòng)物自體的或異源的。最好是，所述細(xì)胞是所述哺乳動(dòng)物自體的，因?yàn)檫@種細(xì)胞排除了對(duì)移植排斥的擔(dān)心。最好是，所述細(xì)胞是初級(jí)細(xì)胞，例如初級(jí)神經(jīng)元細(xì)胞或初級(jí)成肌細(xì)胞。在本發(fā)明的每個(gè)方面，所述非哺乳動(dòng)物DNA病毒均最好為“無(wú)脊椎動(dòng)物病毒”(即，感染無(wú)脊椎動(dòng)物并在無(wú)脊椎動(dòng)物中復(fù)制的病毒)。例如，列于表1中的DNA病毒可以工程改造使其具有改變的外殼蛋白并用于本發(fā)明。最好是，所述無(wú)脊椎動(dòng)物DNA病毒是桿狀病毒，例如諸如苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒的核型多角體病毒。如果需要，可以工程改造所述核型多角體病毒，使得其缺失功能性多角體蛋白基因。可以使用病毒(例如，桿狀病毒)的包含體型或芽生型之一或二者都用。另一優(yōu)選的病毒是家蠶核型多角體病毒(BmNPV)。表1.可以用于本發(fā)明的非哺乳動(dòng)物DNA病毒I.科桿狀病毒桿狀病毒科亞科包含體型桿狀病毒EUBACULOVIRINAE屬核型多角體病毒(NPV)多核殼病毒(MNPV)1這些病毒列于“國(guó)際病毒分類(lèi)學(xué)委員會(huì)第五次報(bào)告”(ICTV)，CorneliabuchenOsmond，1991，ResearchSchoolofBiologicalSciences，Canberra，Australia。本文列出的大多數(shù)病毒可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心得到。)亞屬優(yōu)選種苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角體病毒(AcMNPV)其它成員云杉卷葉蛾(Choristoneurafumiferana)MNPV(CfMNPV)甘藍(lán)夜蛾(Mamestrabrassicae)MNPV(MbMNPV)花旗松毒蛾(Orgyiapseudotsugata)MNPV(OpMNPV)和約400-500個(gè)從七個(gè)昆蟲(chóng)目和甲殼綱中分離的種亞屬單核殼病毒(SNPV)優(yōu)選種家蠶(Bombrxmori)S核型多角體病毒(BmNPV)其它成員美洲棉鈴蟲(chóng)(Heliothiszea)SNPV(HzSnpv)甘蘭尺蠖(Trichoplusiani)SNPV(TnSnpv)和從七個(gè)昆蟲(chóng)目和甲殼綱中分離的類(lèi)似的病毒屬顆粒癥病毒(GV)優(yōu)選種印度谷螟(Plodiainterpunctella)顆粒體病毒(PiGV)其它成員甘蘭尺蠖顆粒體病毒(TnGV)甘蘭菜粉蝶(Pierisbrassicae)顆粒體病毒(PbGV)菜粉蝶(Artogeiarapae)顆粒體病毒(ArGV)蘋(píng)蠹蛾(Cydiapomonella)顆粒體病毒(CpGV)和鱗翅目的約50個(gè)種的類(lèi)似病毒亞科非包含體型桿狀病毒NUDIBACULOVIRINAE屬非包含體型桿狀病毒(NOB)優(yōu)選種美洲棉鈴蟲(chóng)NOB(HzNOB)其它成員榔二龐獨(dú)角仙(Oryctesrhinoceros)病毒已在真菌(Strongwellseamagna)、蜘蛛和歐洲蟹(Carcinusmaenas)和藍(lán)蟹(Callinesapidus)中觀察到其它的病毒。II.科二十面體胞質(zhì)型脫氧核糖核酸病毒虹彩病毒科屬小虹彩虹彩病毒昆蟲(chóng)病毒群優(yōu)選種稻螟虹彩病毒其它成員昆蟲(chóng)虹彩病毒1昆蟲(chóng)虹彩病毒2昆蟲(chóng)虹彩病毒6昆蟲(chóng)虹彩病毒9昆蟲(chóng)虹彩病毒10昆蟲(chóng)虹彩病毒16昆蟲(chóng)虹彩病毒17昆蟲(chóng)虹彩病毒18昆蟲(chóng)虹彩病毒19昆蟲(chóng)虹彩病毒20昆蟲(chóng)虹彩病毒21昆蟲(chóng)虹彩病毒22昆蟲(chóng)虹彩病毒23昆蟲(chóng)虹彩病毒24昆蟲(chóng)虹彩病毒25昆蟲(chóng)虹彩病毒26昆蟲(chóng)虹彩病毒27昆蟲(chóng)虹彩病毒28昆蟲(chóng)虹彩病毒29昆蟲(chóng)虹彩病毒30昆蟲(chóng)虹彩病毒31昆蟲(chóng)虹彩病毒32屬大虹彩綠虹彩病毒昆蟲(chóng)病毒群優(yōu)選種蚊虹彩病毒(虹彩病毒-3型，一般毒株)其它成員昆蟲(chóng)虹彩病毒3昆蟲(chóng)虹彩病毒4昆蟲(chóng)虹彩病毒5昆蟲(chóng)虹彩病毒7昆蟲(chóng)虹彩病毒8昆蟲(chóng)虹彩病毒11昆蟲(chóng)虹彩病毒12昆蟲(chóng)虹彩病毒13昆蟲(chóng)虹彩病毒14昆蟲(chóng)虹彩病毒15推定成員飛羽搖蚊虹彩屬蛙病毒群蛙病毒優(yōu)選種蛙病毒3(FV3)其它成員蛙病毒1蛙病毒2蛙病毒5蛙病毒6蛙病毒7蛙病毒8蛙病毒9蛙病毒10蛙病毒11蛙病毒12蛙病毒13蛙病毒14蛙病毒15蛙病毒16蛙病毒17蛙病毒18蛙病毒19蛙病毒20蛙病毒21蛙病毒22蛙病毒23蛙病毒24L2L4L5LT1LT2LT3LT4T21T6T7T8T9T10T11T12T13T14T15T16T17T18T19T20蠑螈蝌蚪水腫病毒牛蛙(Ranacatesbriana)蝌蚪水腫病毒非洲爪蟾屬蝌蚪水腫病毒屬淋巴囊腫病病毒群淋巴囊腫病病毒優(yōu)選種川鰈(Flounder)分離物(LCDV-1)其它成員淋巴囊腫病病毒dab分離物(LCDV-2)推定成員真蛸病病毒屬金魚(yú)病毒群優(yōu)選種金魚(yú)病毒1(GFV-1)其它成員金魚(yú)病毒2(GF-2)III.科細(xì)小病毒科屬昆蟲(chóng)細(xì)小病毒群濃病毒屬優(yōu)選種大蠟螟(Galleria)濃病毒其它成員鹿眼(Junonia)濃病毒Agraulis濃病毒家蠶濃病毒伊蚊(Aedes)濃病毒推定成員艾奇塔濃病毒Simulium濃病毒Diatraea濃病毒切根蟲(chóng)(Euxoa)濃病毒Leucorrhinia濃病毒大蠊(Periplanata)濃病毒菜粉蝶(Pieris)濃病毒鞍背毛蟲(chóng)(Sibine)濃病毒PC84(Carcinusmediterraneus蟹細(xì)小樣病毒)對(duì)蝦(Penaeidshrimp)肝胰細(xì)小樣病毒IV.科痘病毒組痘病毒科亞科脊椎動(dòng)物痘病毒脊椎動(dòng)物瘟病毒亞科屬傳染性軟疣亞群Molluscipoxvirus優(yōu)選種傳染性軟疣病毒亞科昆蟲(chóng)痘病毒昆蟲(chóng)痘病毒亞科推定屬昆蟲(chóng)痘病毒屬A鞘翅目痘病毒優(yōu)選種金龜子(Melolontha)痘病毒其它成員鞘翅目大綠麗金龜(Anomalacuprea)塔斯馬尼亞金龜(Aphodiustasmaniae)DemodemaboranensisDermolepidaalbohirtum甲蟲(chóng)(Figulussublaevis)Geotrupessylvaticus推定屬昆蟲(chóng)痘病毒屬B鱗翅目和直翅目痘病毒優(yōu)選種桑燈蛾(Amasctamoorei)(鱗翅目)痘病毒其它成員鱗翅目Acrobasiszelleri卷葉蛾(Choristoneurabiennis)柳色卷蛾(Choristoneuraconflicta)異色卷蛾(Choristoneuradiversuma)Chorizagrotisauxiliaris冬尺蠖(Operophterabrumata)直翅目Arphiaconspersa蝗蟲(chóng)(Locustamigratoria)遷徙蚱蜢(Melanoplussanguinipes)OedaleussenugalensisSchistocercagregaria推定屬昆蟲(chóng)痘病毒屬C雙翅目痘病毒優(yōu)選種淡色搖蚊(Chironomusluridus)(雙翅目)痘病毒其它成員雙翅目埃及伊蚊(Aedesaegypti)Camptochironomustentans弱搖蚊(Chironomusattenuatus)飛羽搖蚊(Chironomusplumosus)搖蚊(Goeldichironomusholoprasimus)痘病毒科的其它成員信天翁痘(albatrosspox)(禽痘病毒屬)科蒂亞埃姆布絨猴痘袋鼠痘(澳大利亞“奎歐卡”)黑尾鹿(Muledeer)痘病毒(哥倫比亞黑尾鹿；山羊痘病毒屬)Volepox(Microtusoeconomus，Microtuspennsylvanicus)臭鼬(skunk)痘病毒(Mephitis；正痘病毒屬)V.花椰菜花椰菜花葉病毒花葉病毒群優(yōu)選成員花椰菜花葉病毒(CaMV)(cabbageb，davis分離物)其它成員烏飯樹(shù)(Bluebeery)紅環(huán)點(diǎn)(327)香石竹蝕環(huán)(182)大麗菊花葉(51)玄參花葉辣根潛伏(Horseradishlatene)紫茉莉花葉花生褪綠條死大豆褪綠斑點(diǎn)(331)草莓葉脈帶(219)薊斑點(diǎn)推定成員耬斗菜(Aquilegia)壞死花葉木薯葉脈花葉夜香樹(shù)(Cestrum)病毒牽牛花脈明車(chē)前草病毒4苦苣菜斑點(diǎn)VI.群雙病毒亞群I(即，屬)玉米線條病毒優(yōu)選成員玉米線條病毒(MSV)(133)其它成員虎尾草條紋花葉(221)馬唐條斑M(jìn)iscanthus條斑小麥矮縮推定成員Bajra條斑雀麥條紋花葉馬唐條紋花葉燕麥褪綠條紋雀稗條點(diǎn)花葉亞群II(即，屬)甜菜曲頂病毒優(yōu)選成員甜菜曲頂病毒(BCTV)(210)其它成員番茄偽曲頂病毒夏季菜豆死病毒煙草黃矮病毒番茄卷葉病病毒亞群III(即，屬)菜豆金色花葉病毒優(yōu)選成員菜豆金色花葉病毒(BGMV)(192)其它成員苘麻花葉病毒非洲木薯花葉病毒棉花葉皺折病毒大戟花葉病毒雙花扁豆(Horsegram)黃色花葉病毒印度木薯花葉病毒麻風(fēng)樹(shù)(Jatropha)花葉病毒利馬豆金色花葉病毒錦葵屬缺綠癥病毒甜瓜縮葉病病毒綠豆黃色花葉病毒馬鈴薯黃色花葉病毒Rhynochosia花葉病毒南瓜縮葉病病毒Tigre病病毒煙草縮葉病病毒番茄金色花葉病毒番茄縮葉病病毒番茄黃矮病毒番茄黃色縮葉病病毒番茄黃色花葉病毒西瓜曲斑紋病毒西瓜褪綠矮化病毒忍冬黃葉脈花葉病毒推定成員棉花縮葉病病毒豇豆金色花葉病毒茄子黃色花葉病毒澤蘭(Eupatorium)黃葉脈病毒白羽扇豆縮葉病病毒大豆皺葉病病毒茄頂縮葉病病毒隔蒴苘(Wissadula)花葉病毒VII.科dsDNA海藻病毒藻DNA病毒科屬dsDNA藍(lán)噬體藻DNA病毒群優(yōu)選種Parameciumbursaria小球藻病毒-1(PBCV-1)以下的病毒Parameciumbursaria小球藻NC64A病毒(NC64A病毒)Parameciumbursaria小球藻Pbi病毒(Pbi病毒)Hydravirdis小球藻病毒(HVCV)其它成員小球藻NC64A病毒(37個(gè)NC64A病毒，包括PBCV-1)小球藻病毒NE-8D(CV-NE8D；異名NE-8D)CV-NYb1CV-CA4BCV-AL1ACV-NY2CCV-NC1DCV-NC1CCV-CA1ACV-CA2ACV-IL2ACV-IL2BCV-IL3ACV-IL3DCV-SC1ACV-SC1BCV-NC1ACV-NE8ACV-AL2CCV-MA1ECV-NY2FCV-CA1DCV-NC1BCV-NYs1CV-IL5-2s1CV-AL2ACV-MA1DCV-NY2BCV-CA4ACV-NY2ACV-XZ3ACV-SH6ACV-BJ2CCV-XZ6ECV-XZ4CCV-XZ5CCV-XZ4A小球藻Pbi病毒CVA-1CVB-1CVG-1CVM-1CVR-1Hydraviridis小球藻病毒HVCV-1HVCV-2HVCV-3VIII.科多DNA病毒組多DNA病毒科屬I(mǎi)chnovirus優(yōu)選種Campoletissonorensis病毒(CsV-1)其它成員Glyptasp.的病毒屬Bracovirus優(yōu)選種Cotesiamelanoscela病毒(CmV)可以工程改造所述非哺乳動(dòng)物DNA病毒的基因組，使其包括一個(gè)或多個(gè)遺傳元件。一般地，這些元件的選擇是基于它們促進(jìn)(i)病毒顆粒表面上改變的外殼蛋白的表達(dá)和/或(ii)外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的能力?？梢允褂门c靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合、或介導(dǎo)膜融合以從內(nèi)體逃逸的任何跨膜蛋白，做為所述非哺乳動(dòng)物DNA病毒上改變的外殼蛋白。最好是，所述改變的外殼蛋白是天然介導(dǎo)病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的糖蛋白(例如，諸如慢病毒屬、流感病毒、肝炎病毒或彈狀病毒的哺乳動(dòng)物病毒外殼蛋白)的多肽(最好為糖基化形式)。其它有用的改變的外殼蛋白包括與哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的受體結(jié)合并刺激胞吞作用的蛋白質(zhì)。合適的改變的外殼蛋白的實(shí)例包括但不限于列于表2的外殼蛋白，它們?cè)醋灾T如HIV、流感病毒、彈狀病毒和人呼吸道病毒的病毒。典型的皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G(VSV-G)由質(zhì)粒BV-CZPG編碼，其核苷酸序列示于圖23。如果需要，可以使用多于一個(gè)的外殼蛋白做為改變的外殼蛋白。例如，第一個(gè)改變的外殼蛋白可以是與哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合的跨膜蛋白，第二個(gè)外殼蛋白可以介導(dǎo)膜融合和從內(nèi)體逃逸。表2.合適的改變的外殼蛋白的實(shí)例aGenBank登記號(hào)指編碼病毒外殼蛋白的核酸序列。在推薦實(shí)施方案中，將改變的外殼蛋白做為融合(即，嵌合)蛋白產(chǎn)生。特別有用的融合蛋白包括(i)跨膜多肽(例如，諸如IgM、IgG的抗體，和單鏈抗體)，其融合于(ii)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合的多肽(例如，VCAM、NCAM、整聯(lián)蛋白和選擇蛋白)或與生長(zhǎng)因子結(jié)合的多肽。合適的跨膜多肽之中包括自然存在于非哺乳動(dòng)物病毒或哺乳動(dòng)物病毒顆粒表面的各種外殼蛋白(例如，桿狀病毒gp64、流感血凝素蛋白和皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G)?？梢允褂每缒ざ嚯牡娜炕蚱洳糠郑灰龆嚯目缭皆摬《绢w粒的膜，使得所述多肽錨定于膜中。亦可以使用非病毒跨膜多肽。例如，可以將膜結(jié)合受體與結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多肽融合，并做為改變的的外殼蛋白使用。最好是，所述融合蛋白包括病毒外殼蛋白(例如，gp64)和導(dǎo)向分子(例如，VSV-G)。包括細(xì)胞粘著分子的全部或其細(xì)胞結(jié)合部分的融合多肽亦包括于本發(fā)明中(例如，gp64-VCAM融合蛋白)。一般地，將編碼改變的外殼蛋白的基因可操作地連接至啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在欲用所述病毒感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中無(wú)活性，但在用于繁殖所述病毒的非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有活性(即，“非哺乳動(dòng)物活性”啟動(dòng)子)。與之相反，使用哺乳動(dòng)物活性的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的外源基因(例如，治療基因)的表達(dá)，如下所述。一般地，源自在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不復(fù)制的病毒的啟動(dòng)子，可以做為非哺乳動(dòng)物活性啟動(dòng)子。例如，當(dāng)使用桿狀病毒做為非哺乳動(dòng)物DNA病毒時(shí)，可以使用桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)改變的外殼蛋白的表達(dá)，因?yàn)闂U狀病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不復(fù)制。合適的非哺乳動(dòng)物活性啟動(dòng)子的其它實(shí)例包括p10啟動(dòng)子、p35啟動(dòng)子、etl啟動(dòng)子和gp64啟動(dòng)子，它們?cè)跅U狀病毒中均有活性。當(dāng)使用昆蟲(chóng)細(xì)胞制備病毒貯液時(shí)，該非哺乳動(dòng)物活性啟動(dòng)子使得所述改變的外殼蛋白能夠在產(chǎn)生的病毒顆粒的表面表達(dá)。在用具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，所述多角體蛋白啟動(dòng)子無(wú)活性。用于驅(qū)動(dòng)改變的外殼蛋白表達(dá)的合適的非哺乳動(dòng)物活性啟動(dòng)子的實(shí)例，包括桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子(例如，得自Pharmingen，Inc.的pAcAb4)、p10啟動(dòng)子(例如，得自Pharmingen，Inc.的pAcAb4)、p39啟動(dòng)子(參見(jiàn)Xu等，1995，J.Virol.692912-2917)、gp64啟動(dòng)子(包括TATA依賴性啟動(dòng)子；參見(jiàn)Kogan等，1995，J.Virol.691452-1461)、桿狀病毒IE1啟動(dòng)子(參見(jiàn)Jarvis等，1996，Prot.Expr.Purif.8191-203)和果蠅屬乙醇脫氫酶啟動(dòng)子(參見(jiàn)Heberlein等，1995，Cell41965-977)。如果需要，可操作地連接至編碼改變的外殼蛋白基因的所述非哺乳動(dòng)物活性啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在所述病毒繁殖的非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被激活。合適的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括基于孕酮受體突變體的啟動(dòng)子(Wang等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.918180-8184)、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gossen等，1995，Science2681766-1760；1992，Proc.Natl.Acad.Sci.895547-5551，可以從Clontech，Inc.得到)、納巴霉素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Rivera等，1996，Nat.Med.21028-1032)和蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(No等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.933346-3351)。原則上，在或者非哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可以激活的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以用于本發(fā)明的該實(shí)施方案，盡管實(shí)際上一般要將所述啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物加入所述病毒繁殖的非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，而不是加入所述外源基因表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。做為一個(gè)實(shí)例，可以將編碼一個(gè)改變的外殼蛋白的基因可操作地連接至可由蛻皮激素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(No等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.933346-3351)。在這種情況下，工程改造該非哺乳動(dòng)物DNA病毒的基因組，使之包括一個(gè)成對(duì)的與編碼所述改變的外殼蛋白的基因可操作地連接的蛻皮激素效應(yīng)元件。在存在加入所述細(xì)胞的蛻皮激素(或蛻皮激素類(lèi)似物)的情況下，異二聚體蛻皮激素受體的表達(dá)激活了來(lái)自與編碼改變的外殼蛋白的基因可操作地連接的啟動(dòng)子的基因表達(dá)。使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼改變的外殼蛋白的基因的表達(dá)，提供的優(yōu)點(diǎn)是提供了控制改變的外殼蛋白表達(dá)的另一機(jī)制。可以工程改造非哺乳動(dòng)物DNA病毒的基因組使之包括其它遺傳元件，例如轉(zhuǎn)座因子或反轉(zhuǎn)錄病毒(例如，勞斯肉瘤病毒)的長(zhǎng)末端重復(fù)序列的哺乳動(dòng)物活性啟動(dòng)子；腺伴隨病毒和腺伴隨rep基因的末端反向重復(fù)序列；和/或細(xì)胞永生化序列，諸如SV40T抗原或c-myc。如果需要，所述非哺乳動(dòng)物DNA病毒的基因組可以包括在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用的復(fù)制起點(diǎn)(例如，EB病毒(EBV)復(fù)制起點(diǎn)或哺乳動(dòng)物復(fù)制起點(diǎn))。哺乳動(dòng)物復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例包括靠近二氫葉酸還原酶基因的序列(Burhans等，1990，Cell62955-965)、靠近β-珠蛋白的序列(Kitsberg等，1993，Cell366588-590)、靠近腺苷酸脫氨酶基因的序列(Carroll等，1993，Mol.Cell.Biol.132927-2981)、和其它人類(lèi)序列(參見(jiàn)Krysan等，1989，Mol.Cell.Biol.91026-1033)。如果需要，所述復(fù)制起點(diǎn)可以與促進(jìn)自主因子復(fù)制的因子聯(lián)合使用，例如EBV的EBNA1基因。用于本發(fā)明的非哺乳動(dòng)物DNA病毒的基因組可以包括多聚腺苷酸化信號(hào)和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用的RNA剪接信號(hào)(即，“哺乳動(dòng)物RNA剪接信號(hào))，所述信號(hào)為正確加工所述外源基因的產(chǎn)物而定位。另外，可以工程改造所述病毒，以編碼正確導(dǎo)向所述基因產(chǎn)物的信號(hào)序列。將欲在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的外源基因可操作地連接至“哺乳動(dòng)物活性”啟動(dòng)子(即，指導(dǎo)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子)。在需要細(xì)胞類(lèi)型特異性表達(dá)所述外源基因的情況下，可以將病毒基因組中的所述外源基因可操作地連接至哺乳動(dòng)物活性的細(xì)胞類(lèi)型特異性啟動(dòng)子，例如對(duì)肝細(xì)胞、大腦細(xì)胞(例如，神經(jīng)元細(xì)胞)、膠質(zhì)細(xì)胞、許旺細(xì)胞、肺細(xì)胞、腎細(xì)胞、脾細(xì)胞、肌細(xì)胞或皮膚細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子。例如，肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子可以包括編碼白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、丙酮酸激酶、烯醇丙酮酸磷酸羧化酶、運(yùn)鐵蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白、甲胎蛋白、α-血纖蛋白原或β-血纖蛋白原的基因的啟動(dòng)子?；蛘?，可以使用肝炎病毒啟動(dòng)子(例如，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎或丁型肝炎病毒啟動(dòng)子)。如果需要，可以將乙型肝炎病毒增強(qiáng)子與乙型肝炎病毒啟動(dòng)子聯(lián)合使用。最好是，使用白蛋白啟動(dòng)子。當(dāng)本發(fā)明用于表達(dá)治療肝細(xì)胞癌的基因時(shí)，甲胎蛋白對(duì)驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)特別有用。其它優(yōu)選的肝臟特異性啟動(dòng)子包括編碼以下蛋白的基因的啟動(dòng)子低密度脂蛋白受體、α2-巨球蛋白、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α2-HS糖蛋白、觸珠蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、纖溶酶原、補(bǔ)體蛋白(C1q、C1r、C2、C3、C4、C5、C6、C8、C9、補(bǔ)體因子I和因子H)、C3補(bǔ)體激活劑、β-脂蛋白和α1-酸性糖蛋白。為特異性地在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)外源基因，可以使用神經(jīng)元特異性烯醇化酶啟動(dòng)子(參見(jiàn)Forss-Petter等，1990，Neuron5187-197)。為在多巴胺能神經(jīng)元中表達(dá)外源基因，可以使用酪氨酸羧化酶啟動(dòng)子。為在垂體細(xì)胞中表達(dá)，可以使用諸如POMC的垂體特異性啟動(dòng)子(Hammer等，1990，Mol.Endocrinol.41689-97)。一般地，與所述外源基因可操作地連接的啟動(dòng)子不同于與編碼改變的外殼蛋白的基因可操作地連接的啟動(dòng)子。亦可以使用由外部刺激物誘導(dǎo)的啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)表達(dá)外源基因。這種啟動(dòng)子提供了在細(xì)胞培養(yǎng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞中控制所述外源基因表達(dá)的方便手段。優(yōu)選的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括腦啡肽啟動(dòng)子(例如，人腦啡肽啟動(dòng)子)、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、小鼠乳腺瘤病毒啟動(dòng)子、基于孕酮受體突變體的啟動(dòng)子、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、納巴霉素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)來(lái)自每個(gè)這種啟動(dòng)子的基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已知的。基本上任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞都可以用于本發(fā)明；最好是，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是初級(jí)細(xì)胞(例如，初級(jí)肝細(xì)胞，初級(jí)神經(jīng)元細(xì)胞或初級(jí)成肌細(xì)胞)，或者可以是確立細(xì)胞株的細(xì)胞。不需要所述細(xì)胞具有細(xì)胞分裂的能力；終末分化的細(xì)胞可以用于本發(fā)明。如果需要，可以在初級(jí)細(xì)胞鋪平板后約24小時(shí)將所述病毒導(dǎo)入初級(jí)細(xì)胞。最好是，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是肝源細(xì)胞，諸如HepG2細(xì)胞、Hep3B細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞、FTO2B細(xì)胞、Hepal-6細(xì)胞或SK-Hep-1細(xì)胞或Kupffer細(xì)胞；腎細(xì)胞，諸如腎細(xì)胞系293的細(xì)胞、PC12細(xì)胞(例如，由神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的分化PC12細(xì)胞)、COS細(xì)胞(例如，COS7細(xì)胞)或Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)；神經(jīng)元細(xì)胞，諸如胎神經(jīng)元細(xì)胞、皮質(zhì)錐體細(xì)胞、僧帽細(xì)胞、粒細(xì)胞或腦細(xì)胞(例如，大腦皮質(zhì)細(xì)胞；星形膠質(zhì)細(xì)胞；許旺細(xì)胞)；肌細(xì)胞，諸如成肌細(xì)胞或肌管細(xì)胞(例如，C2C12細(xì)胞)；胚胎干細(xì)胞、脾細(xì)胞(例如，巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞)；上皮細(xì)胞，諸如HeLa細(xì)胞(人宮頸癌上皮細(xì)胞系)；成纖維細(xì)胞，諸如NIH3T3細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞；WISH細(xì)胞；A549細(xì)胞；或骨髓干細(xì)胞。其它優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括CHO/dhfr-細(xì)胞、Ramos、Jurkat、HL60和K-562細(xì)胞。可以體外或體內(nèi)將病毒導(dǎo)入細(xì)胞。在體外將病毒導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，如果需要，可以將受感染的細(xì)胞接著導(dǎo)入哺乳動(dòng)物。因此，通過(guò)體外、體內(nèi)或體外和體內(nèi)順序保持所述細(xì)胞，可以完成所述外源基因的表達(dá)。類(lèi)似地，當(dāng)本發(fā)明用于在超過(guò)一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)外源基因時(shí)，可以聯(lián)合使用體外和體內(nèi)方法，將所述基因?qū)胍粋€(gè)以上的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。如果需要，通過(guò)將病毒給予攜帶所述細(xì)胞的哺乳動(dòng)物，可以將所述病毒導(dǎo)入所述細(xì)胞。例如，通過(guò)皮下、血管內(nèi)或腹膜內(nèi)注射可以將病毒給予哺乳動(dòng)物。如果需要，可以使用諸如可植入泵的緩釋裝置，以有助于將所述病毒傳遞到該哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。通過(guò)調(diào)節(jié)給予哺乳動(dòng)物的病毒量和通過(guò)控制傳遞方法，可以導(dǎo)向哺乳動(dòng)物體內(nèi)的特定細(xì)胞類(lèi)型。例如，可以使用血管內(nèi)將病毒給予至門(mén)靜脈、脾靜脈或腸系膜靜脈或給予至肝動(dòng)脈，以便于將病毒導(dǎo)向肝細(xì)胞。在另一方法中，可以在將細(xì)胞或器官移植給接受者之前，將病毒給予供體個(gè)體(人或非人類(lèi))的細(xì)胞或器官。在優(yōu)選的給藥方法中，將所述病毒給予哺乳動(dòng)物的具有靶細(xì)胞的組織或器官。通過(guò)將含有病毒的溶液注射進(jìn)入組織，可以完成這種給予，所述組織例如皮膚組織、腦組織(例如，大腦皮質(zhì))、腎臟組織、膀胱組織、肝組織、脾組織、肌肉組織、甲狀腺組織、胸腺組織、肺組織或結(jié)腸組織?；蛘?，或者另外，按照常規(guī)灌注方法，通過(guò)用含有所述病毒的溶液對(duì)器官灌注可以完成給予。在另一優(yōu)選的方法中，鼻腔內(nèi)給予所述病毒，例如，將所述病毒的溶液給予哺乳動(dòng)物的鼻粘膜?？梢允褂迷摻o藥方法促進(jìn)逆行運(yùn)輸所述病毒至大腦。該方法由此提供了一種手段，以不用對(duì)所述哺乳動(dòng)物進(jìn)行手術(shù)而將所述病毒傳遞至腦細(xì)胞(例如，嗅球的僧帽細(xì)胞和顆粒神經(jīng)元細(xì)胞)。在使用所述病毒在大腦中表達(dá)外源基因中替代方法中，按照誘導(dǎo)滲壓震擾的常規(guī)方法，通過(guò)滲壓震擾將所述病毒傳遞至大腦。在體外條件下保持所述細(xì)胞時(shí)，可以使用常規(guī)組織培養(yǎng)條件和方法。在優(yōu)選方法中，在含有諸如I型膠原蛋白或大鼠尾膠原蛋白的膠原蛋白的基質(zhì)(substrate)或含有層粘連蛋白的基質(zhì)(matrix)上保持所述細(xì)胞。做為體外條件下保持細(xì)胞的替代方法或其它方法，可以在體內(nèi)條件(例如，在人體中)下保持所述細(xì)胞?？芍踩胄问降哪z原蛋白基質(zhì)亦適合于在實(shí)踐本發(fā)明的體內(nèi)條件下保持所述病毒感染的細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，Hubbell等，1995，Bio/Techonology13565-576和Langer和Vacanti，1993，Science260920-925)。可以使用本發(fā)明表達(dá)編碼諸如多肽或蛋白質(zhì)、反義RNA和催化性RNA的基因產(chǎn)物的各種外源基因。如果需要，可以從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞純化所述基因產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì)或RNA)。因此，本發(fā)明可以用于生產(chǎn)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有用的廣泛種類(lèi)的蛋白質(zhì)。當(dāng)本發(fā)明用于表達(dá)反義RNA時(shí)，優(yōu)選的反義RNA與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病原體(例如，病毒、細(xì)菌或真菌)的核酸(例如，mRNA)互補(bǔ)。例如，本發(fā)明可以用于通過(guò)表達(dá)與必需肝炎病毒基因產(chǎn)物的mRNA(例如，聚合酶mRNA)雜交的反義RNA治療肝炎病毒感染的方法之中。其它優(yōu)選的反義RNA包括那些與細(xì)胞中天然存在的基因互補(bǔ)的反義RNA，所述基因以不合需要的高水平表達(dá)。例如，可以設(shè)計(jì)反義RNA以抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中癌基因的表達(dá)。類(lèi)似地，可以使用所述病毒表達(dá)催化性RNA(即，核酶)，該催化性RNA通過(guò)水解編碼靶基因產(chǎn)物的mRNA來(lái)抑制細(xì)胞中靶基因表達(dá)。可以通過(guò)采用常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)反義RNA和催化性RNA。如果需要，本發(fā)明可以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)顯性失活突變體。例如，通過(guò)在細(xì)胞表達(dá)病毒殼體蛋白的顯性失活突變體，可以抑制或防止所述細(xì)胞中的病毒裝配(參見(jiàn)，例如，Scaglioni等，1994，Virology205112-120；Scaglioni等，1996，Hepatology241010-1017；和Scaglinoni等，1997，J.Virol.71345-353)。本發(fā)明可以用于在細(xì)胞中表達(dá)任何各種“治療”基因。“治療”基因是當(dāng)表達(dá)時(shí)賦予包含該基因的細(xì)胞或組織或該基因在其中表達(dá)的哺乳動(dòng)物有益效果的基因?！坝幸嫘Ч钡膶?shí)例包括減輕病癥或疾病癥候或癥狀、防止或抑制病癥或疾病或賦予所需要的特性。治療基因包括那些糾正細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中基因缺陷疾病的基因。例如，氨甲酰合成酶I當(dāng)其在先前未能表達(dá)或不能足量表達(dá)氨甲酰合成酶I的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，可以糾正基因缺陷疾病?！凹m正”基因缺陷疾病不必等同于治愈患有疾病的患者。所有所需要的是賦予有益效果，甚至包括暫時(shí)性地減輕該疾病的癥候或癥狀。亦包括在一種細(xì)胞中表達(dá)，卻賦予第二種細(xì)胞有益效果的基因。例如，可以在胰臟細(xì)胞中表達(dá)編碼胰島素的基因，從胰臟細(xì)胞分泌胰島素，對(duì)所述哺乳動(dòng)物的其它細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)。其它治療基因包括編碼抑制以不合需要的高水平表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的反義RNA核酸的序列。例如，抑制編碼癌蛋白的基因表達(dá)的反義RNA認(rèn)為是治療基因?！鞍┌Y治療”基因是那些對(duì)癌性細(xì)胞或患有癌癥的哺乳動(dòng)物賦予有益效果的基因。特別有用的癌癥治療基因包括p53基因、單純皰疹病毒胸苷激酶基因和與癌基因互補(bǔ)的反義基因。本發(fā)明可以用于表達(dá)治療基因以治療基因缺陷疾病。特別適于表達(dá)的基因包括那些被認(rèn)為在受治療的哺乳動(dòng)物的靶細(xì)胞中以低于正常水平表達(dá)的基因。特別有用的基因產(chǎn)物包括氨甲酰合成酶I、鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶和精氨酸酶。其它需要的基因產(chǎn)物包括延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羥化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受體、膽色素原脫氨基酶、因子VIII、因子IX、cystathioneβ-合酶、支鏈酮酸脫羧酶、白蛋白、異戊酰輔酶A脫氫酶、丙酰輔酶A羧化酶、甲基丙二酰輔酶A變位酶、戊二酰輔酶A脫氫酶、胰島素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脫羧酶(亦稱(chēng)為P-蛋白)、H-蛋白、T-蛋白、Menkes病銅運(yùn)輸ATP酶、Wilson病銅運(yùn)輸ATP酶和CFTR(例如，用于治療囊性纖維化)。本發(fā)明亦可以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)預(yù)期在哺乳動(dòng)物而不是在昆蟲(chóng)中具有生物學(xué)效應(yīng)的基因(即，“哺乳動(dòng)物特異性”基因)。例如，可以使用桿狀病毒基因組表達(dá)哺乳動(dòng)物myoD基因，并由此產(chǎn)生肌肉蛋白；預(yù)期這種基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中而不是在昆蟲(chóng)細(xì)胞中具有生物學(xué)效應(yīng)。哺乳動(dòng)物特異性基因的其它實(shí)例包括但不限于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞而不是在昆蟲(chóng)細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄因子。例如，當(dāng)從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的昆蟲(chóng)基因組(例如，桿狀病毒基因組)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子c/ebp-α和chop10時(shí)，所述轉(zhuǎn)錄因子將激活肝細(xì)胞分化途徑。與之相反，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)這些哺乳動(dòng)物特異性轉(zhuǎn)錄因子，預(yù)期對(duì)所述昆蟲(chóng)細(xì)胞具有極小的或沒(méi)有效應(yīng)。如果需要，可以使用本發(fā)明的載體在非哺乳動(dòng)物(例如，昆蟲(chóng))細(xì)胞中繁殖遺傳構(gòu)建物，具有抑制該產(chǎn)物DNA甲基化的優(yōu)點(diǎn)。已觀察到啟動(dòng)子在其通常不表達(dá)的細(xì)胞系或組織中會(huì)甲基化，這種甲基化對(duì)正常組織特異性表達(dá)有抑制性(Okuse等，1997，BrainRes.Mol.BrainRes.46197-207；Kudo等，1995，J.Biol.Chem.27013298-13302)。例如，神經(jīng)啟動(dòng)子在非神經(jīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中會(huì)甲基化。通過(guò)使用例如昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如，Sf9細(xì)胞)繁殖攜帶外源基因和哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(例如，神經(jīng)啟動(dòng)子)的桿狀病毒，本發(fā)明提供了在給予欲表達(dá)所述外源基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，神經(jīng)細(xì)胞)所述桿狀病毒和外源基因之前、抑制所述啟動(dòng)子DNA甲基化的手段。定義“非哺乳動(dòng)物”DNA病毒指具有DNA基因組(而不是RNA)、并且天然就不能在脊椎動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物)細(xì)胞中復(fù)制的病毒。包括昆蟲(chóng)病毒(例如，桿狀病毒)、兩棲動(dòng)物病毒、植物病毒和真菌病毒。天然在原核生物中復(fù)制的病毒排除在本定義之外?？捎糜趯?shí)踐本發(fā)明的病毒的實(shí)例列于表1中。本文使用的“基因組”可以包括天然存在的非哺乳動(dòng)物DNA病毒中存在的全部或部分核酸序列。如果需要，基因或序列可以從所述病毒基因組除去或失效(例如，通過(guò)突變發(fā)生)，只要所述病毒保留或通過(guò)工程改造保留其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的能力。例如，可以工程改造所述病毒，使其缺失功能性多角體蛋白基因。通過(guò)從病毒基因組(例如，桿狀病毒基因組)缺失全部或部分多角體蛋白基因，或通過(guò)向多角體蛋白基因內(nèi)導(dǎo)入突變(例如，移碼突變)，產(chǎn)生這種病毒，使得該基因產(chǎn)物的活性受抑制?！袄ハx(chóng)”DNA病毒指具有DNA基因組、并且天然可以在昆蟲(chóng)細(xì)胞中復(fù)制的病毒(例如，桿狀病毒科、虹彩病毒科、痘病毒科、多DNA病毒科、濃病毒科、花椰菜花葉病毒科和藻DNA病毒科)。“外源”基因或啟動(dòng)子指不是非哺乳動(dòng)物DNA病毒(例如，桿狀病毒)基因組的正常部分的任何基因或啟動(dòng)子。這類(lèi)基因包括那些通常存在于欲感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因；亦包括通常不存在于欲感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因(例如，其它細(xì)胞或物種的相關(guān)或不相關(guān)基因)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“外源基因”排除編碼“改變的外殼蛋白”的基因。“改變的外殼蛋白”指這樣的任何多肽，所述多肽(i)被工程改造以在病毒顆粒表面表達(dá)，(ii)通常不存在于用于感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的非哺乳動(dòng)物DNA病毒表面和(iii)允許通過(guò)與細(xì)胞結(jié)合進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞和/或有助于從哺乳動(dòng)物內(nèi)體逃逸進(jìn)入所述細(xì)胞的細(xì)胞溶膠。通常，將編碼改變的外殼蛋白的基因加入用于本發(fā)明的非哺乳動(dòng)物DNA病毒的基因組中。如果需要，可以構(gòu)建病毒基因組，使得該病毒表達(dá)結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的哺乳動(dòng)物受體或反受體的多肽。改變的外殼蛋白可以包括“哺乳動(dòng)物”病毒的所有或部分外殼蛋白，所述“哺乳動(dòng)物”病毒即天然感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制的病毒(例如，流感病毒)。如果需要，所述改變的外殼蛋白可以是“融合蛋白”，即包括源自一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特來(lái)源的二種(或多種)獨(dú)特蛋白(例如，不同物種的蛋白)的部分或全部的工程改造蛋白。通常，用于本發(fā)明的融合蛋白包括(i)具有跨膜蛋白(例如桿狀病毒gp64)的跨膜區(qū)的多肽，其融合于(ii)結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多肽(例如，VSV-G的胞外域)。盡管術(shù)語(yǔ)“改變的”與外殼蛋白相關(guān)使用(因?yàn)樵谕ǔ](méi)有發(fā)現(xiàn)這種蛋白的病毒顆粒表面表達(dá)的意義上它是改變的)，該蛋白自身不必與所述蛋白的野生型的序列或結(jié)構(gòu)有區(qū)別。因此，結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞的野生型跨膜蛋白可以做為改變的外殼蛋白使用(例如，野生型流感病毒血凝素蛋白)。實(shí)際上，最好使用野生型蛋白。然而，亦可以將非野生型蛋白做為“改變的”外殼蛋白使用，只要該非野生型外殼蛋白保持與哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合的能力。非野生型蛋白的實(shí)例包括截短的蛋白、突變蛋白(例如，缺失突變體)和結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞的跨膜多肽的保守性變異?！氨Ｊ匦宰儺悺敝敢粋€(gè)氨基酸殘基由另一個(gè)功能類(lèi)似的殘基置換。保守性變異的實(shí)例包括以一個(gè)疏水性殘基例如丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置換另一個(gè)疏水性殘基，或以一個(gè)極性殘基置換另一個(gè)極性殘基，例如精氨酸置換賴氨酸、谷氨酸置換天冬氨酸或谷氨酰胺置換天冬酰胺等等。術(shù)語(yǔ)“保守性變異”亦包括使用取代的氨基酸(例如，修飾的氨基酸，例如羥賴氨酸)置換未取代的親代氨基酸。“定位以表達(dá)”指包括相關(guān)(reference)基因(例如，外源基因)的DNA序列被定位于鄰近指導(dǎo)所述DNA轉(zhuǎn)錄的DNA序列，如果需要，鄰近指導(dǎo)RNA翻譯的DNA序列(即，促進(jìn)末端基因產(chǎn)物的產(chǎn)生)?！皢?dòng)子”指至少足以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的最小序列。“哺乳動(dòng)物活性”啟動(dòng)子是可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物活性”啟動(dòng)子包括源自哺乳動(dòng)物基因組的啟動(dòng)子即“哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子”和天然可以指導(dǎo)在哺乳動(dòng)物中轉(zhuǎn)錄的病毒啟動(dòng)子(例如，MMTV啟動(dòng)子)。可用于本發(fā)明的其它啟動(dòng)子包括足以賦予可控制的依賴啟動(dòng)子的細(xì)胞類(lèi)型特異性、細(xì)胞階段特異性或組織特異性(例如，肝臟特異性啟動(dòng)子)的基因表達(dá)的那些啟動(dòng)子、和可以由外源信號(hào)或試劑“誘導(dǎo)”的那些啟動(dòng)子(例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子、MMTV啟動(dòng)子和pENK啟動(dòng)子)；這類(lèi)元件可以位于所述天然基因的5’或3’區(qū)。所述啟動(dòng)子序列可以不是天然存在的序列，只要它在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子是這樣一種啟動(dòng)子，其(a)缺乏誘導(dǎo)物時(shí)，不指導(dǎo)表達(dá)或指導(dǎo)低水平表達(dá)可操作地連接至該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的基因；或(b)存在調(diào)節(jié)因子時(shí)表現(xiàn)出低水平表達(dá)，當(dāng)除去該調(diào)節(jié)因子時(shí)，使得該啟動(dòng)子高水平表達(dá)(例如，tet系統(tǒng))。在存在誘導(dǎo)物時(shí)，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子指導(dǎo)提高水平的轉(zhuǎn)錄?！翱刹僮鞯剡B接”指基因或調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子)以這種方式連接，使得在適當(dāng)?shù)姆肿?例如，轉(zhuǎn)錄激活蛋白)與調(diào)節(jié)序列結(jié)合時(shí)允許基因表達(dá)?！凹?xì)胞永生化序列”指當(dāng)存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)可以轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞延長(zhǎng)抑制衰老的核酸分子。包括SV40T-抗原、c-mys、端粒酶和E1A?！胺戳x”核酸指與編碼目的多肽的靶核酸(例如，基因或mRNA)的全部或部分互補(bǔ)(即，可以雜交)的核酸分子(即，RNA)。如果需要，可以使用常規(guī)方法產(chǎn)生具有所需修飾的反義核酸。例如，可以使用硫代磷酸寡核苷酸做為反義核酸，以抑制體內(nèi)核酸酶降解所述反義寡核苷酸。在所述反義核酸僅與編碼欲抑制的多肽的靶核酸的部分互補(bǔ)的情況下，所述反義核酸應(yīng)與所述靶核酸的一些關(guān)鍵部分(例如，在非編碼序列的翻譯控制區(qū)，或編碼序列的5’端)足夠近地雜交，使得其抑制功能多肽(即，執(zhí)行欲抑制的活性(例如，酶活性)的多肽)的翻譯。通常，這意味著所述反義核酸應(yīng)與該反義核酸雜交的靶mRNA的5’一半或三分之一內(nèi)的序列互補(bǔ)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“反義基因”是轉(zhuǎn)錄成為反義RNA的核酸。通常，這種反義基因包括靶核酸的全部或部分，但是該反義基因可操作地連接至一個(gè)啟動(dòng)子，使得該反義基因的定向與天然存在的基因中該序列的定向相反。用途本發(fā)明可用于體外或體內(nèi)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如HepG2細(xì)胞)中表達(dá)外源基因。該方法可以用于生產(chǎn)欲純化的蛋白，例如做為藥物給予的蛋白(例如，胰島素)。亦可以治療性地使用本發(fā)明的病毒。例如，本發(fā)明可以用于在患者中表達(dá)編碼糾正基因表達(dá)缺陷的蛋白的基因。在治療法的替代方法中，本發(fā)明可以用于在細(xì)胞中表達(dá)任何蛋白、反義RNA或催化性RNA。本發(fā)明的非哺乳動(dòng)物病毒表達(dá)系統(tǒng)提供了幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。病毒上的改變的外殼蛋白增強(qiáng)了所述非哺乳動(dòng)物DNA病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)基因的能力。亦可以使用這種外殼蛋白賦予工程改造的病毒的細(xì)胞類(lèi)型特異性。例如，在細(xì)胞上表達(dá)CD4+，增強(qiáng)了表達(dá)HIV包膜gp120蛋白的病毒感染這種CD4+細(xì)胞的能力(Mebatsion等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.9311366-11370)。本發(fā)明允許外源基因的從頭表達(dá)；由此，在受感染的細(xì)胞中檢測(cè)到外源蛋白(例如，β-半乳糖苷酶)代表實(shí)際上在受感染細(xì)胞中合成的蛋白，與所述病毒異常地?cái)y帶的蛋白形成對(duì)比。因?yàn)橛糜诒景l(fā)明的非哺乳動(dòng)物病毒通常對(duì)人類(lèi)無(wú)致病性，并且不在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，因此極大地降低了對(duì)安全處理這些病毒的憂慮。類(lèi)似地，因?yàn)榇蠖鄶?shù)天然存在的病毒啟動(dòng)子通常在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中無(wú)活性，所以極大地降低了不合需要的病毒蛋白的產(chǎn)生。傳統(tǒng)的基因治療載體基于與輔助病毒一起或在包裝系上繁殖的缺陷病毒，而本發(fā)明采用了對(duì)于為繁殖病毒而在昆蟲(chóng)細(xì)胞上的生長(zhǎng)無(wú)缺陷的病毒，但是所述病毒固有的并且是所需要的對(duì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上生長(zhǎng)有缺陷。因此，與一些基于哺乳動(dòng)物病毒的基因治療方法相反，本發(fā)明的基于非哺乳動(dòng)物病毒的方法應(yīng)不會(huì)引起宿主對(duì)病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白的免疫應(yīng)答?？梢杂迷跓o(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞繁殖用于本發(fā)明的非哺乳動(dòng)物病毒，消除了有時(shí)會(huì)存在于血清中的外來(lái)感染物質(zhì)污染病毒制備物的風(fēng)險(xiǎn)。另外，使用無(wú)血清培養(yǎng)基消除了哺乳動(dòng)物病毒的使用者面臨的龐大開(kāi)支。某些非哺乳動(dòng)物病毒例如桿狀病毒可以生長(zhǎng)至高滴度(即，108pfu/ml)。一般地，可以用于本發(fā)明的大病毒基因組(例如，130kbp的桿狀病毒基因組)可以接受大的外源DNA分子(例如，100kb)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明使用了其基因組已被工程改造而含有外源復(fù)制起點(diǎn)(例如，EBVoriP)的病毒。在病毒基因組上存在這種序列，允許病毒游離型復(fù)制，增加了在細(xì)胞中的持久性。當(dāng)本發(fā)明用于生產(chǎn)從所述細(xì)胞純化的蛋白時(shí)，本發(fā)明提供了采用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)。因此，可以預(yù)期外源基因產(chǎn)物的正確翻譯后加工和修飾(例如，糖基化)。根據(jù)以下詳細(xì)描述和權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)是顯而易見(jiàn)的。附圖簡(jiǎn)述圖1是AcMNPVRSV-lacZ轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pZ4的圖解表述。圖2是包含體型AcMNPVRSV-lacZ轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pZ5的圖解表述。圖3是游離型轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pZ-EBV#1的圖解表述，該質(zhì)粒是桿狀病毒和EB病毒序列的嵌合體。用該轉(zhuǎn)移質(zhì)粒產(chǎn)生的病毒可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制。圖4A是允許切除基因盒的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的圖解表述。圖4B是由圖4A的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒切除的基因盒的圖解表述。所述基因盒的切除由cre-lox重組介導(dǎo)。該策略使得在缺失病毒序列時(shí)外源基因持久。圖5是轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBV-AVneo的圖解表述，該質(zhì)粒是桿狀病毒和腺伴隨病毒序列的嵌合體。該質(zhì)?？梢哉先胧芨腥炯?xì)胞的基因組。圖6是AcMNPV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCMV-BV的圖解表述。圖7是AcMNPV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCMVZ-BV的圖解表述。圖8是AcMNPV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAct-BV的圖解表述。圖9是AcMNPV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAZ-BV的圖解表述。圖10是AcMNPV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pIE45-BV的圖解表述。圖11是AcMNPV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pNSE4-BV的圖解表述。圖12是AcMNPV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pTH/SV40/BP9的圖解表述。圖13是AcMNPV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pTH-Lac/BP9的圖解表述。圖14A-D是用含有RSV-lacZ盒的AcMNPV病毒感染后一天用X-gal染色的細(xì)胞照片。表達(dá)lac-Z基因的細(xì)胞用X-gal染色很深。圖14A是以感染復(fù)數(shù)(multiplicitiesofinfection)15感染的HepG2細(xì)胞的典型視野照片。圖14B是以感染復(fù)數(shù)125感染的HepG2細(xì)胞的典型視野照片；超過(guò)25％的細(xì)胞被染色。圖14C是以感染復(fù)數(shù)125感染的Sk-Hep-1細(xì)胞的典型視野，顯示無(wú)陽(yáng)性染色細(xì)胞。圖14D是以感染復(fù)數(shù)125感染的Sk-Hep-1細(xì)胞的較不典型的視野，顯示陽(yáng)性染色細(xì)胞。條帶＝55μm。圖15是桿狀病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入大鼠肝細(xì)胞初級(jí)培養(yǎng)物后得到的細(xì)胞照片。超過(guò)70％的細(xì)胞被染成藍(lán)色。圖16是一顯示桿狀病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的劑量依賴性的圖。這里將106HepG2細(xì)胞接種入60mm平皿，一天后將細(xì)胞暴露給標(biāo)明劑量的含有RSV-lacZ盒的AcMNPV病毒(病毒滴度＝1.4×109pfu/ml)。感染后一天時(shí)，收獲細(xì)胞，制備提取物并檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性。如先前定義(Norton和Coffin，1985，Mol.Cell.Biol.5281-290)以β-半乳糖苷酶活性單位表述提取物的活性。相對(duì)于每種提取物的蛋白含量將酶活性歸一化。每個(gè)點(diǎn)是三次獨(dú)立測(cè)定的平均，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)差。圖17是桿狀病毒介導(dǎo)的表達(dá)時(shí)間進(jìn)程中獲得的結(jié)果的圖示。于時(shí)間零點(diǎn)用含有RSV-lacZ盒的AcMNPV病毒感染HepG2細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)＝15)。一小時(shí)后，除去含有病毒的培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基替換。在標(biāo)明的時(shí)間點(diǎn)收獲受感染的細(xì)胞，如上述檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性。每個(gè)繪制的點(diǎn)表示三次獨(dú)立檢測(cè)的平均，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)差。對(duì)總細(xì)胞蛋白歸一化，感染后12-24小時(shí)病毒表達(dá)達(dá)到高峰，其后下降。圖18是AcMNPV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒VSVG/BP9的圖解表述。圖19是AcMNPV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒VGZ3的圖解表述。圖20是具有改變的外殼蛋白的芽生桿狀病毒的圖解表述。用“gp64”和“VSVG”代表天然桿狀病毒細(xì)胞表面蛋白(gp64)和VSV-G蛋白。圖21是各種桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的圖解表述，其中一個(gè)外源基因可操作地連接至病毒或哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。圖22是Z4和VGZ3在HeLa和HepG2細(xì)胞中相對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的圖解表述。用缺失VSFVG的桿狀病毒Z4或含有VSVG的桿狀病毒BGZ3，以感染復(fù)數(shù)1、10和100處理HeLa和HepG2細(xì)胞。用體外化學(xué)發(fā)光檢測(cè)在次日測(cè)定lacZ基因的表達(dá)。-●-，用VGZ3處理的HepG2細(xì)胞；-○-，用Z4處理的HepG2；-■-，用VGZ3處理的HeLa；-□-，用Z4處理的HeLa。圖23是編碼皰疹性口腔炎病毒G糖蛋白的質(zhì)粒BV-CZPG的核苷酸序列列表。發(fā)明詳述病毒的遺傳操作與常規(guī)基因表達(dá)方法相反，本發(fā)明涉及修飾天然不感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并不在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制的非哺乳動(dòng)物DNA病毒。因此，本發(fā)明基于將新特性加入非哺乳動(dòng)物DNA病毒，使其能夠?qū)⒒騻鬟f給哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并指導(dǎo)在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)。與之相反，常規(guī)基因治療載體需要使病毒功能失效，所述功能諸如病毒基因的表達(dá)和病毒基因組復(fù)制。在本發(fā)明的方法中，病毒顆粒用做將DNA傳遞給哺乳動(dòng)物細(xì)胞的“殼”。工程改造病毒DNA，使之含有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有活性的轉(zhuǎn)錄控制序列，以在靶細(xì)胞中表達(dá)目的基因?？梢允褂贸Ｒ?guī)重組DNA技術(shù)插入這種序列。由于本發(fā)明使用的非哺乳動(dòng)物DNA病毒不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，因此不需要缺失基本病毒功能以使之缺陷。但是，最好所述病毒天然就在真核生物物種(例如，昆蟲(chóng)、植物或真菌)中復(fù)制?？梢怨こ谈脑煲园凑毡景l(fā)明表達(dá)外源基因的病毒的實(shí)例列于表1中。最好是，本發(fā)明中使用的病毒基因組在其天然宿主物種中通常被運(yùn)輸至核，因?yàn)楹硕ㄎ恍盘?hào)在無(wú)脊椎動(dòng)物和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起類(lèi)似作用。以下概括的數(shù)據(jù)顯示與常規(guī)知識(shí)相反，非哺乳動(dòng)物DNA病毒可以(1)感染廣泛種類(lèi)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以及(2)指導(dǎo)外源基因在所述細(xì)胞中表達(dá)。另外，在病毒顆粒表面表達(dá)改變的外殼蛋白，增強(qiáng)了病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的能力?？梢詫⒁呀⒌牟僮髦亟M病毒的方法結(jié)合到在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的這些新方法中。例如，可以從病毒中刪除病毒基因，并借助包裝系以反式提供?？赡苄枰笔н@類(lèi)基因，以(1)抑制可能引起免疫應(yīng)答的病毒基因產(chǎn)物的表達(dá)，(2)在病毒載體中提供額外空間，或(3)提供在細(xì)胞中保持所述病毒的額外的安全水平。本發(fā)明涉及在病毒顆粒表面表達(dá)改變的外殼蛋白，以增強(qiáng)非哺乳動(dòng)物DNA病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的能力?？梢允褂贸Ｒ?guī)分子生物學(xué)技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)，鑒別并在病毒上表達(dá)結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多肽。通常，編碼改變的外殼蛋白的基因可操作地與非哺乳動(dòng)物活性啟動(dòng)子連接，并從所述病毒基因組表達(dá)?；蛘?，可以由所述病毒在其中繁殖的非哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中含有的序列編碼所述改變的外殼蛋白。在從所述細(xì)胞染色體表達(dá)所述改變的外殼蛋白時(shí)，所述改變的外殼蛋白與非哺乳動(dòng)物DNA病毒一起包裝。在再一替代方法中，可以從共感染所述非哺乳動(dòng)物DNA病毒在其中繁殖的非哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二種病毒的基因組，表達(dá)所述改變的外殼蛋白。因此，在第二種病毒共感染并從第二種病毒的基因組表達(dá)所述改變的外殼蛋白時(shí)，所述改變的外殼蛋白與所述非哺乳動(dòng)物DNA病毒一起包裝。不管使用的表達(dá)改變的外殼蛋白的方法如何，在使得所述改變的外殼蛋白在所述病毒顆粒表面表達(dá)的條件下，保持所述非哺乳動(dòng)物DNA病毒。為此目的，可以使用常規(guī)的在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中繁殖病毒的方法(以下進(jìn)一步討論)。如果需要，使用常規(guī)技術(shù)，諸如免疫印跡、免疫熒光等等，可以確認(rèn)改變的外殼蛋白在病毒顆粒表面上的表達(dá)?？梢允褂贸Ｒ?guī)分子生物學(xué)技術(shù)，產(chǎn)生做為改變的外殼蛋白使用的合適的融合蛋白。例如，當(dāng)使用桿狀病毒做為所述非哺乳動(dòng)物DNA病毒時(shí)，使用桿狀病毒外殼蛋白gp64可以產(chǎn)生廣泛種類(lèi)的融合蛋白(Whitford等，1989，J.Virol.631393-1399和Ayres等，1994，Virology202586-605)。桿狀病毒表達(dá)載體pAcSurf-2提供了這樣的gp64基因，該基因在gp64信號(hào)序列和編碼成熟糖蛋白序列之間具有同相定位的多克隆位點(diǎn)(Boublik等，1995，Biotechnology131079-1084)。可以容易地將編碼結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多肽的序列插入該載體的多克隆位點(diǎn)，產(chǎn)生的融合蛋白的表達(dá)由所述gp64序列可操作地連接的多角體蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。如果需要，所述病毒殼體或包膜可以含有做為改變的外殼蛋白的一部分，或做為改變的外殼蛋白之外的獨(dú)立分子的配體，該配體與哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合以促進(jìn)進(jìn)入。例如，所述病毒可以包括做為配體的脫唾液酸糖蛋白，該糖蛋白與哺乳動(dòng)物凝集素(例如，肝脫唾液酸糖蛋白受體)結(jié)合，促進(jìn)進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。因?yàn)榇蠖鄶?shù)非哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中無(wú)活性，所述外源基因應(yīng)可操作地連接至可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子(即，“哺乳動(dòng)物活性”啟動(dòng)子)。合適的啟動(dòng)子的實(shí)例包括RSVLTR、SV40早期啟動(dòng)子、CMVIE啟動(dòng)子(例如，人CMVIE1啟動(dòng)子)、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子和乙型肝炎病毒啟動(dòng)子。其它合適的“哺乳動(dòng)物活性”啟動(dòng)子包括“哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子”，即對(duì)應(yīng)于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中天然存在并驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子的序列?！安溉閯?dòng)物啟動(dòng)子”在指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的能力方面常常亦是細(xì)胞類(lèi)型特異性、細(xì)胞階段特異性或組織特異性的，這類(lèi)啟動(dòng)子可以有利地用于本發(fā)明做為控制所述外源基因表達(dá)的手段。例如，已描述了幾種肝臟特異性啟動(dòng)子，諸如白蛋白啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，它們可以用于達(dá)到所述外源基因的肝臟特異性表達(dá)(參見(jiàn)，例如，Shen等，1989，DNA8101-108；Tan等，1991，Dev.Biol.14624-37；McGrane等，1992，TIBS1740-44；Jones等，J.Biol.Chem.26514684-14690；和Shimada等，1991，F(xiàn)EBSLetters279198-200)。當(dāng)使用本發(fā)明治療肝細(xì)胞癌時(shí)，甲胎蛋白啟動(dòng)子特別有用。該啟動(dòng)子通常僅在胎兒組織中有活性；但是，它在肝臟腫瘤細(xì)胞中亦有活性(Huber等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.888039-8043)。因此，可以使用甲胎蛋白啟動(dòng)子對(duì)肝臟腫瘤細(xì)胞定向表達(dá)肝癌治療劑。如果需要，可以工程改造病毒基因組使之?dāng)y帶復(fù)制起點(diǎn)，以促進(jìn)所述外源基因在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中持久。已鑒別了源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)(即，“哺乳動(dòng)物復(fù)制起點(diǎn)”)(Burhans等，1994Science263639-640)。其它在哺乳動(dòng)物中起作用的復(fù)制起點(diǎn)(即“哺乳動(dòng)物活性”起點(diǎn)，例如EB病毒oriP)亦可以在存在適當(dāng)反式作用因子(例如EBNA-1)的情況下促進(jìn)保持表達(dá)。如果需要，可以工程改造所述病毒，以表達(dá)超過(guò)一個(gè)的外源基因(例如，所述病毒可以被工程改造以同時(shí)表達(dá)OTC和AS)或超過(guò)一種的改變的外殼蛋白。以下是在下述實(shí)施例中使用的幾種病毒的描述。這些實(shí)施例僅供說(shuō)明之用，不限制本發(fā)明的范圍。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的實(shí)施例構(gòu)建pZ4轉(zhuǎn)移質(zhì)粒使用原先為在桿狀病毒中表達(dá)蛋白而開(kāi)發(fā)的眾所周知的重組技術(shù)(參見(jiàn)，例如，O’Reilly等，1992，載于桿狀病毒表達(dá)載體，W.H.Freeman，NewYork)，可以完成用于本發(fā)明的桿狀病毒的遺傳操縱。在該實(shí)施例中，通過(guò)用指導(dǎo)報(bào)道基因表達(dá)的盒打亂所述病毒的多角體蛋白基因構(gòu)建AcMNPV。所述報(bào)道基因盒包括對(duì)應(yīng)于勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子的DNA序列，該序列可操作地連接至大腸桿菌lacZ基因(圖1)。所述報(bào)道基因盒亦包括編碼猴病毒40(SV40)RNA剪接和多聚腺苷酸化信號(hào)的序列。將用于以下描述的幾個(gè)實(shí)施例中的RSV-lacZAcMNPV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒命名為Z4并如下構(gòu)建。使用BglII和BamHI切出包括SV40RNA剪接信號(hào)和多聚腺苷酸化信號(hào)的pRSVPL9的847bp片段。質(zhì)粒pRSVPL9源自pRSV珠蛋白(Gorman等，Science221551-553)，方法是用BglII消化pRSV珠蛋白，加入HindIII接頭，然后用HindIII酶切所述DNA。將使寡聚核苷酸5’AGCTGTCGACTGGAGGTACCAGATCTCTAGA3’(SEQIDNO1)和5’AGCTTCTAGAGATCTGGTACCTCGAGTCGAC3’(SEQIDNO2)雜交而制備的雙鏈多接頭，連接至具有RSV啟動(dòng)子和SV40剪接和多聚腺苷酸信號(hào)的4240bp片段。產(chǎn)生的質(zhì)粒具有取代了珠蛋白序列的所述多接頭。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將pRSVPL9的SV40序列克隆入pVL1392(Invitrogen和Pharmingen)的BamHI位點(diǎn)。將產(chǎn)生的中間質(zhì)粒命名為pVL/SV40。用BglI和SpeI從pRSVlacZII(Lin等，1991，Biotechniques11344-348，和350-351)切出RSV-lacZ盒，并插入pVL/SV40的BglII和XbaI位點(diǎn)。通過(guò)Z4轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與線性化AcMNPVDNA的同源重組，制備命名為Z4的AcMNPVRSV-lacZ病毒。用于制備該DNA的AcMNPV病毒是AcV-EPA(Hatig等，1992，J.Virol.Methods3861-70)。構(gòu)建pZ5轉(zhuǎn)移質(zhì)粒某些非哺乳動(dòng)物病毒(例如，桿狀病毒)可以包含于蛋白包含體中(即，包含體源病毒(ODV))，或者它們可以以質(zhì)膜芽生形式存在。當(dāng)在本發(fā)明中使用包含體型病毒時(shí)，如果需要可以首先從蛋白包含體釋放病毒?？梢允褂贸Ｒ?guī)的使用堿的方法釋放病毒(O’Reilly等，1992，載于桿狀病毒表達(dá)載體，W.H.Freeman，NewYork)。包含體型的堿釋放的桿狀病毒比非包含體型芽生病毒更易被細(xì)胞攝入(Volkmar和Goldsmith，1983，Appl.AndEnviron.Microbiol.451085-1093)。為在本發(fā)明中使用包含體型病毒而構(gòu)建pZ5轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，使用BglII和BamHI從pZ4轉(zhuǎn)移質(zhì)粒切出RSV-lacZ盒，然后插入pAcUW1(Weyer等，1990，J.Gen.Virol.711525-1534)的BglII位點(diǎn)。構(gòu)建pZ-EBV#1轉(zhuǎn)移質(zhì)?？梢怨こ谈脑毂景l(fā)明使用的非哺乳動(dòng)物DNA病毒，以允許病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中游離型復(fù)制。這種病毒持久性更長(zhǎng)，由此優(yōu)化了外源基因在細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)的方法。這種復(fù)制型病毒的實(shí)例是pZ-EBV#1(圖3)，如下構(gòu)建。使用EcoRI和XbaI從pREP9(Invitrogen)切出EBVoriP和EBNA-1區(qū)，然后插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacPAK9(Clontech)的EcoRI和XbaI位點(diǎn)，產(chǎn)生pEBVBP9。使用BglII和BamHI從pZ4轉(zhuǎn)移質(zhì)粒切出RSV-lacZ盒，然后插入pEBVBP9的BamHI位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pZ-EBV#1。構(gòu)建pZ4loxPZ4loxP病毒基因組是使用噬菌體P1cre重組酶的重組的底物。采用標(biāo)準(zhǔn)程序，可以使用該病毒將攜帶loxP位點(diǎn)的基因盒插入病毒(Patel等，1992，Nucl.AcidsRes.2097-104)?？梢怨こ谈脑熳儺惖脑摬迦胂到y(tǒng)，使得從剩余的基因表達(dá)序列切出病毒序列。例如，可以構(gòu)建自主切除轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(圖4A-4B)，以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因。該質(zhì)粒具有促進(jìn)切除桿狀病毒序列的loxP序列。通過(guò)將合成的loxP位點(diǎn)插入pZ4轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，構(gòu)建pZ4loxP轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。合成二個(gè)loxP寡聚核苷酸并相互退火。所述寡聚核苷酸是5’GATCTGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGG3’(SEQIDNO3)和5’GATCCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCA3’(SEQIDNO4)。在用于連接反應(yīng)之前，通過(guò)將寡核苷酸在存在0.25MNaCl時(shí)加熱至80C，然后使混合物緩慢冷卻至室溫，將所述寡聚核苷酸退火。然后將退火的寡聚核苷酸連接至已用BglII消化的pZ4轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)生的質(zhì)粒的連接和分析。然后使用常規(guī)的重組進(jìn)入線性桿狀病毒DNA的方法產(chǎn)生重組Z4loxP桿狀病毒。構(gòu)建pBV-AVneo，一種AAV嵌合體轉(zhuǎn)移質(zhì)?？梢哉先胨拗骷?xì)胞染色體的桿狀病毒基因組亦可以用于本發(fā)明。這種整合病毒可以比非整合病毒在細(xì)胞中更加持久。因此，涉及這種病毒的基因表達(dá)方法可以消除將病毒重復(fù)給予細(xì)胞的需要，由此降低了對(duì)所述病毒產(chǎn)生免疫應(yīng)答的可能性。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBV-AVneo(圖5)包括腺伴隨病毒(AAV)的末端反向重復(fù)序列。通過(guò)從pFasV.neo切出編碼G418抗性、做為BglII-BamHI片段的neo基因，并將此片段插入pAVgal的BamHI位點(diǎn)以取代lacZ基因，而構(gòu)建該轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。通過(guò)用CMV啟動(dòng)子和lacZ基因取代AAV的rep和cap編碼序列，構(gòu)建質(zhì)粒pAVgal。將產(chǎn)生的命名為pAV.neo的中間片段用PvuI消化。然后將具有驅(qū)動(dòng)表達(dá)neo基因的CMV啟動(dòng)子、側(cè)翼為AAVITR的大PvuI片段插入pBacPAK9的PacI位點(diǎn)。如果需要，可以將合適的可操作地連接至AAVrep基因的啟動(dòng)子插入該構(gòu)建物(例如，在AAVITR和多角體蛋白啟動(dòng)子之間)，以促進(jìn)切除和重組入所述基因組?？梢圆迦朐摌?gòu)建物的rep基因的實(shí)例包括rep40、rep52、rep68和rep78。構(gòu)建pCMV-BV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒從pCMV-EBNA(Invitrogen)的HindIII、BamHI切出人細(xì)胞肥大病毒立即早期啟動(dòng)子，它是758bpHindIII-XbaI片段，將其插入pBluescript(SKII+)的HindIII位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pCMV-SKII+。然后從CMV-SKII+的XboI、BamHI位點(diǎn)切出啟動(dòng)子，并插入pSV/BV的XhoI、BglII位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pCMV-BV(圖6)。pSV/BV是桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacPAK9(Clontech)的修飾形式，具有改變的多接頭和SV40剪接和多聚腺苷酸化信號(hào)。通過(guò)用NotI限制性酶切pBacPAK9，用T4DNA聚合酶產(chǎn)生平端，并自連接去除NotI位點(diǎn)，構(gòu)建pSV/BV。然后通過(guò)將接頭pGCGGCCGC連接入SmaI位點(diǎn)，加入一個(gè)新的NotI位點(diǎn)。最后，通過(guò)用BglII-BamHI消化pRSVPL，將847bp片段插入修飾的BacPAK9的BamHI位點(diǎn)，加入SV40剪接和多聚腺苷酸化信號(hào)，產(chǎn)生pSV/BV。構(gòu)建pCMVZ-BV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒通過(guò)用NotI限制性酶切pCMV-BV，并連接插入3kblacZ片段，構(gòu)建pCMVZ-BV(圖7)。通過(guò)用NotI限制性酶切pAlb-Gal制備lacZ片段。構(gòu)建pAct-BV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒從pINA(Morgenstern，JP，1989，博士論文，UniversityCollege，London，UK)于BglII、BamHI切出345bp大鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，插入pSV-BV的BglII位點(diǎn)，產(chǎn)生pAct-BV(圖8)。構(gòu)建pAZ-BV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒通過(guò)用NotI限制性酶切pAct-BV并連接插入3kblacZ片段，構(gòu)建pAZ-BV(圖9)。通過(guò)用NotI限制性酶切pAlb-Gal制備lacZ片段。構(gòu)建pIE45-BV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒通過(guò)用SphI限制性酶切pHSVPrPUC(Neve等，1997，Neuroscience79435-447)，接著在存在三磷酸核苷酸時(shí)用T4DNA聚合酶處理產(chǎn)生平端，構(gòu)建pIE45-BV(圖10)。然后通過(guò)用T4DNA連接酶處理，加入PstI接頭(NewEnglandBiolabs，目錄號(hào)#1024，pGCTGCAGC)，用PstI消化約850bp的片段，并克隆入pSV/BV的PstI位點(diǎn)。構(gòu)建pNSE4-BV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒通過(guò)用SalI和EcoRI限制性酶切pNSE4(參見(jiàn)，例如，Quon等，1991，Nature352239-241和Forss-Petter等，1990，Neuron5187-197)，并連接入pSV/BV的XhoI和EcoRI位點(diǎn)，構(gòu)建pNSE4-BV(圖11)。構(gòu)建nTH/SV40/BP9轉(zhuǎn)移質(zhì)粒通過(guò)用EcoRI和NotI限制性酶切pTH4.8Thdno(Banerjee等，1992，J.Neuroscience124460-4467)，并將4.0kb啟動(dòng)子片斷連接入也用EcoRI和NotI消化的pSV/BV，構(gòu)建pTH/SV40/BP9(圖12)。構(gòu)建pTH-Lac/BP9轉(zhuǎn)移質(zhì)粒通過(guò)用NotI限制性酶切pALB-Gal并分離3kblacZ片段，然后使用T4DNA連接酶將該片段連接入亦用NotI限制性酶切的pTH/SV40/BP9，構(gòu)建pThlac(圖13)。病毒繁殖可以使用常規(guī)方法繁殖本發(fā)明中使用的病毒(參見(jiàn)，例如，Burleson等，1992，病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，AcdemicPress，Inc.，SanDiego，CA和Mahy編輯，1985，病毒學(xué)實(shí)用方法，IRLPress，Oxford，UK)。繁殖病毒的常規(guī)條件適合允許改變的外殼蛋白在用于本發(fā)明的病毒顆粒表面上表達(dá)。例如，按照標(biāo)準(zhǔn)程序，將用于下述實(shí)驗(yàn)的桿狀病毒進(jìn)行噬斑純化和擴(kuò)增(參見(jiàn)，例如，O’Reilly等，見(jiàn)下述和Summers和Smith，1987，桿狀病毒載體和昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)程序方法手冊(cè)，TexasAgriculturalExperimentStationBulletinNo.1555，CollegeStation，Texas)。通過(guò)在含有10％胎牛血清(FBS)和0.1％PLURONICF-68TM的HinksTNM-FH培養(yǎng)基(JRHBiosciences)上旋動(dòng)培養(yǎng)，繁殖AcMNPV和Sf21細(xì)胞。使用5mMNaCl、10mMTrispH7.5和10mMEDTA中的27％(w/v)蔗糖墊層，在SW28轉(zhuǎn)頭(24,000rpm，75分鐘)中通過(guò)超離心濃縮擴(kuò)增的病毒。然后將病毒沉淀再懸浮于磷酸緩沖鹽水(PBS)中，通過(guò)0.45μm濾器(Nalgene)除菌。如果需要，可以在杯式超聲波儀(cupsonicator)中通過(guò)超聲處理再懸浮病毒。通過(guò)在Sf21昆蟲(chóng)細(xì)胞上的噬斑檢測(cè)測(cè)定AcMNPV滴度。外源基因表達(dá)的實(shí)施例因?yàn)殚L(zhǎng)期以來(lái)都認(rèn)為非哺乳動(dòng)物DNA病毒不能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)基因表達(dá)，下述實(shí)施例的A部分提供了非哺乳動(dòng)物DNA病毒(例如，桿狀病毒)事實(shí)上可以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的證據(jù)。盡管A部分中描述的實(shí)施例使用了外殼蛋白未改變的病毒，但這些實(shí)施例對(duì)非哺乳動(dòng)物DNA病毒可以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的主張?zhí)峁┝酥С帧Ａ硗猓@些實(shí)施例為使用具有改變的外殼蛋白的病毒實(shí)踐本發(fā)明提供了指南。下述B部分的實(shí)施例使用了具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒。由于改變的外殼蛋白的存在是本發(fā)明的病毒與缺乏改變的外殼蛋白的病毒之間的唯一顯著區(qū)別，所以這些實(shí)施例證明，改變的外殼蛋白的表達(dá)增強(qiáng)非哺乳動(dòng)物DNA病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的能力。因此，在下述的每一個(gè)方法中(例如，體內(nèi)表達(dá)外源基因)，預(yù)期具有改變的外殼蛋白的病毒比缺乏改變的外殼蛋白的病毒優(yōu)越。A部分可以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的非哺乳動(dòng)物DNA病毒I.體外在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的實(shí)施例幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞都是非哺乳動(dòng)物病毒的潛在靶，可以快速地測(cè)試任何培養(yǎng)的細(xì)胞或初級(jí)細(xì)胞。在以下實(shí)施例中，檢測(cè)了Z4桿狀病毒感染19種不同類(lèi)型細(xì)胞的能力。在該實(shí)施例中，所述桿狀病毒是Z4病毒，通過(guò)Z4轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與線性化AcMNPVDNA同源重組制備。受檢測(cè)的細(xì)胞是HepG2、Sk-Hep-1、NIH3T3、表達(dá)細(xì)胞表面脫唾液酸糖蛋白受體的NIH3T3細(xì)胞、HeLa、CHO/dhfr-、293、COS、Ramos、Jurkat、HL60、K-562、C2C12成肌細(xì)胞、C2C12肌管細(xì)胞、初級(jí)人肌肉成肌細(xì)胞、Hep3B細(xì)胞、FTO2B細(xì)胞、Hepa1-6細(xì)胞和神經(jīng)生長(zhǎng)因子-分化的PC12細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)可以使用常規(guī)的組織培養(yǎng)方法生長(zhǎng)欲感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Freshney，1987，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)手冊(cè)，第二版，AlanR.Liss，Inc.NewYork，NY)。如上述使這些細(xì)胞生長(zhǎng)并進(jìn)行感染。如下述使細(xì)胞生長(zhǎng)。在含有10％FBS的Eagle改良極限必需培養(yǎng)基(EMEM)中培養(yǎng)HepG2和Sk-Hep-1細(xì)胞。在含有10％FBS的DMEM中培養(yǎng)NIH3T3、HeLa、293和COS細(xì)胞。在含有10％FBS的MEMα中培養(yǎng)CHO/dhfr-細(xì)胞。在含有10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)Ramos、Jurkat、HL60和K-562細(xì)胞。通過(guò)在含有0.5％二甲基亞砜和1μm視黃酸(Sigma)的同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化。在含有20％FBS的DMEM中繁殖C2C12成肌細(xì)胞，并在含有10％馬血清的DMEM中培養(yǎng)期間分化成為肌管。在含有5％FBS和10％馬血清的DMEM中繁殖PC12細(xì)胞，在含有10％FBS、5％馬血清和100ng/ml神經(jīng)生長(zhǎng)因子的DMEM中培養(yǎng)期間被誘導(dǎo)分化。在用AcMNPV感染前一天將所有的細(xì)胞接種，假設(shè)在此期間細(xì)胞數(shù)量翻倍來(lái)計(jì)算感染復(fù)數(shù)(multiplicitiesofinfection)。C2C12和PC12細(xì)胞在分化時(shí)細(xì)胞數(shù)量可能增加，因此反映出略低的moi。體外感染細(xì)胞可以通過(guò)使病毒吸附至細(xì)胞上0.1-6小時(shí)，完成病毒對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的體外感染；最好是，持續(xù)吸附1-2小時(shí)。一般地，0.1-1,000的感染復(fù)數(shù)是合適的；moi優(yōu)選為100-500。對(duì)于相對(duì)難感染的細(xì)胞，優(yōu)選moi為100-1,000。對(duì)于用于本發(fā)明的病毒，使用所述病毒天然感染的非哺乳動(dòng)物細(xì)胞的常規(guī)方法可以確定滴度。如果需要，可以在含有膠原蛋白(例如，大鼠尾類(lèi)型I膠原蛋白)的基質(zhì)上保持欲感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞?；谠谀z原蛋白包被板上培養(yǎng)和感染細(xì)胞后細(xì)胞計(jì)數(shù)和與在常規(guī)EHS基質(zhì)上生長(zhǎng)的細(xì)胞之間的比較，本人發(fā)現(xiàn)與常規(guī)EHS基質(zhì)相比，膠原蛋白基質(zhì)將細(xì)胞(例如，肝細(xì)胞)受非哺乳動(dòng)物病毒感染的易感性提高10-100倍。可以得到市售的含有膠原蛋白基質(zhì)的平板(例如，BIO-COATTM板，CollaborativeResearch)，大鼠尾膠原蛋白亦有市售(SigmaChemicalandCollaborativeResearch)。在以下描述的體外檢測(cè)中，感染的標(biāo)準(zhǔn)條件使用了2×106細(xì)胞和moi為15的RSV-lacZAcMNPV。在感染一天前將貼壁細(xì)胞系接種。將細(xì)胞暴露給2ml培養(yǎng)基中的病毒90分鐘，然后除去含有病毒的培養(yǎng)基，并用新鮮培養(yǎng)基更換。模擬感染的細(xì)胞用缺乏病毒接種物的2ml培養(yǎng)基處理。檢測(cè)感染和基因表達(dá)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以監(jiān)測(cè)病毒傳遞至細(xì)胞和外源基因的表達(dá)。例如，通過(guò)檢測(cè)病毒DNA或RNA(例如，通過(guò)DNA印跡法或RNA印跡法、狹線印跡法或斑點(diǎn)印跡法、或原位雜交、用或不用PCR擴(kuò)增)，可以測(cè)定病毒(例如，AcMNPV)傳遞至細(xì)胞。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以方便地制備與所述病毒、調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子)或所述外源基因雜交的合適的探針。當(dāng)本發(fā)明用于體內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)，通過(guò)在活檢中得到細(xì)胞，可以檢測(cè)病毒傳遞至細(xì)胞。例如，當(dāng)本發(fā)明用于在肝細(xì)胞中表達(dá)基因時(shí)，可以進(jìn)行肝活檢，可以使用常規(guī)方法檢測(cè)肝細(xì)胞中的病毒。亦可以通過(guò)檢測(cè)從所述哺乳動(dòng)物得到的細(xì)胞或體液(例如，血清)中對(duì)應(yīng)于所述基因的RNA或蛋白質(zhì)，跟蹤哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中外源基因的表達(dá)?？梢允褂梅肿由飳W(xué)家通常使用的檢測(cè)技術(shù)(例如，RNA印跡法或蛋白質(zhì)印跡法、原位雜交、狹線印跡法或斑點(diǎn)印跡法、PCR擴(kuò)增、SDS-PAGE、免疫染色、RIA和ELISA)測(cè)定基因表達(dá)。如果需要，可以使用報(bào)道基因(例如，lacZ)測(cè)定特定桿狀病毒將基因表達(dá)導(dǎo)向某些組織或細(xì)胞的能力。組織檢查可以涉及(a)在用液氮冷凍的異戊烷中快速冷凍所述組織；(b)使用O.C.T.將組織固定于木栓上并冷凍；(c)在恒冷箱切片機(jī)上將所述組織切成10μm切片；(d)干燥所述切片，用PBS中的4％多聚甲醛處理所述切片，接著在PBS中漂洗；(e)將所述組織用PBS中的X-gal(0.5mg/ml)/亞鐵氰化物(35mM)/高鐵氰化物(35mM)染色；和(f)通過(guò)顯微鏡術(shù)分析組織。為檢測(cè)報(bào)道基因在受感染細(xì)胞中的表達(dá)，使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性的比色測(cè)定(Norton等，Molecular&amp;CelluarBiology5281-290)。可以使用檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性的其它常規(guī)方法代替在該實(shí)施例中使用的方法。于感染后一天制備細(xì)胞提取物。用PBS漂洗細(xì)胞單層三次，從平皿刮下，通過(guò)低速離心收集。將細(xì)胞沉淀再懸浮于25mMTrispH7.4/0.1mMEDTA中，然后進(jìn)行三個(gè)循環(huán)的液氮中冷凍和37℃水浴解凍。通過(guò)于14,000×g離心5分鐘澄清提取物。檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性的標(biāo)準(zhǔn)條件使用了0.1ml細(xì)胞提取物、0.8mlPM-2緩沖液和0.2mlPM-2緩沖液中的鄰硝基苯-α-D-半乳吡喃糖苷(4mg/ml)，于37℃10分鐘(Norton等，1985，Mol.&amp;Cell.Biol.5281-290)。通過(guò)加入0.5ml1M碳酸鈉終止反應(yīng)。于420nm分光光度分析檢測(cè)底物水解量，使用常規(guī)方法計(jì)算β-半乳糖苷酶活性(Norton等，1985，Mol.&amp;Cell.Biol.5281-290)。確認(rèn)所述檢測(cè)與提取物濃度和時(shí)間成線性關(guān)系。用牛血清白蛋白做為標(biāo)準(zhǔn)，使用CoomassiePlus蛋白分析(Pierce)測(cè)定提取物蛋白濃度，以每毫克蛋白質(zhì)β-半乳糖苷酶活性單位表達(dá)β-半乳糖苷酶活性水平。如果需要，可以使用其它標(biāo)準(zhǔn)蛋白分析法。為進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性的組織化學(xué)染色，用PBS中的2％(w/v)甲醛-0.2％(v/v)多聚甲醛固定細(xì)胞5分鐘。用PBS漂洗幾次后，通過(guò)加入PBS中的0.5mg/mlX-gal(BRL)，于37℃將細(xì)胞染色2-4小時(shí)。檢測(cè)19種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型以下19個(gè)實(shí)例描述了可以在測(cè)試的19種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型中的14種檢測(cè)到外源基因的表達(dá)。這些分析使用了二種不同的β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)法。使用更加敏感的檢測(cè)即X-gal染色，在19種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型中的14種中檢測(cè)到外源基因表達(dá)。使用敏感性略低的檢測(cè)即細(xì)胞提取物的ONPG檢測(cè)，三個(gè)細(xì)胞系(HepG2、293和PC12)在暴露給病毒后顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(P＜0.05，斯氏t檢驗(yàn))的較高的β-半乳糖苷酶活性。暴露給RSV-lacZ桿狀病毒的人肝臟腫瘤系HepG2表達(dá)的β-半乳糖苷酶水平比模擬感染的對(duì)照高80倍。腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞系293表達(dá)的lacZ報(bào)道基因比本底高約4倍。另外，用神經(jīng)生長(zhǎng)因子分化成為神經(jīng)元樣表現(xiàn)型的PC12細(xì)胞在用RSV-lacZ桿狀病毒感染后，表現(xiàn)出高約2倍的β-半乳糖苷酶水平。該差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P＝0.019)。表3.桿狀病毒介導(dǎo)的RSV-LacZ報(bào)道基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的表達(dá)β-半乳糖苷酶活性(單位/mg)平均值±SD通過(guò)更加敏感的檢測(cè)即組織化學(xué)染色，在暴露給病毒的19個(gè)細(xì)胞系中的14個(gè)細(xì)胞系中檢測(cè)到β-半乳糖苷酶活性。因此，某些細(xì)胞系在提取物中沒(méi)有檢測(cè)到產(chǎn)生了顯著高水平的β-半乳糖苷酶，它們實(shí)際上可以用更加敏感的X-gal染色程序，檢測(cè)到低但是可重復(fù)的頻率表達(dá)β-半乳糖苷酶。通過(guò)使用更高的感染復(fù)數(shù)可以提高該頻率，使得在低moi下好象不表達(dá)所述基因的細(xì)胞，在較高的moi下染成藍(lán)色?？梢砸源朔绞睫D(zhuǎn)染的細(xì)胞系的實(shí)例包括SK-Hep-1、NIH3T3、HeLa、CHO/dhfr-、293、Cos和C2C12細(xì)胞。另外，在暴露給病毒的初級(jí)人肌肉成肌細(xì)胞中檢測(cè)到β-半乳糖苷酶活性。該發(fā)現(xiàn)表明，桿狀病毒既可以介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移至初級(jí)細(xì)胞，亦可以介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)的確立細(xì)胞系(C2C12)，表明外源基因在確立細(xì)胞系中的表達(dá)對(duì)用初級(jí)細(xì)胞得到的結(jié)果具有預(yù)測(cè)價(jià)值。在用所述病毒處理的Hep3B細(xì)胞中亦檢測(cè)到β-半乳糖苷酶活性；這些細(xì)胞中表達(dá)水平幾乎與在HepG2細(xì)胞中檢測(cè)到的水平相同。另外，在暴露給病毒的FTO2B(大鼠肝細(xì)胞癌)細(xì)胞和Hepa1-6(人肝細(xì)胞癌)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶活性。在已工程改造以在所述細(xì)胞表面上表達(dá)脫唾液酸糖蛋白受體的NIH3T3細(xì)胞中，亦檢測(cè)到β-半乳糖苷酶活性。這些細(xì)胞表達(dá)的β-半乳糖苷酶水平約是正常NIH3T3細(xì)胞的二倍。這個(gè)觀察提示，可以使用脫唾液酸糖蛋白受體增強(qiáng)對(duì)病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的易感性。感染后的β-半乳糖苷酶酶測(cè)定揭示，在使用的moi下，Ramos、Jurkat、HL60和K-562細(xì)胞系不表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平的β-半乳糖苷酶?；谑褂闷渌溉閯?dòng)物細(xì)胞系得到的結(jié)果，預(yù)期當(dāng)采用較高的病毒劑量(即，moi)或較長(zhǎng)的吸附時(shí)間時(shí)，可以在這些明顯較難感染的細(xì)胞系中檢測(cè)到β-半乳糖苷酶活性。即使將細(xì)胞暴露給所述病毒導(dǎo)致在相對(duì)低百分比的細(xì)胞中表達(dá)所述外源基因(體外或體內(nèi))時(shí)，可以使用本發(fā)明鑒別或確認(rèn)驅(qū)動(dòng)外源基因(例如，諸如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、堿性磷酸酶基因、熒光素酶基因或綠熒光蛋白基因的報(bào)道基因)表達(dá)的啟動(dòng)子的細(xì)胞或組織類(lèi)型特異性。一旦鑒別出，可以將這種啟動(dòng)子用于任何常規(guī)基因表達(dá)方法中。類(lèi)似地，僅僅相對(duì)低水平的表達(dá)對(duì)在哺乳動(dòng)物中引起針對(duì)所述異源基因產(chǎn)物的免疫應(yīng)答(即，產(chǎn)生抗體)是必需的。因此，本發(fā)明的基因表達(dá)方法，可以用于通過(guò)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所述抗原制備抗優(yōu)選的異源抗原的抗體。這類(lèi)抗體特別可以用來(lái)純化所述異源抗原。所述基因表達(dá)方法亦可以用于在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)抗異源抗原的免疫保護(hù)應(yīng)答(即，做為疫苗使用)。另外，本發(fā)明可以用于從其中病毒介導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞永生化序列(例如，SV40T抗原)的細(xì)胞產(chǎn)生永久細(xì)胞系。使用X-gal的組織化學(xué)染色提供了在暴露給修飾的AcMNPV的細(xì)胞中檢測(cè)β-半乳糖苷酶表達(dá)的高度敏感方法。當(dāng)HepG2細(xì)胞暴露給moi為15的修飾AcMNPV時(shí)，約5-10％的細(xì)胞被X-gal染色(圖14A)。當(dāng)感染復(fù)數(shù)(moi)為125時(shí)，約25-50％的細(xì)胞被染色(圖14B)。未觀察到任何暴露給所述病毒的不良效應(yīng)，例如核膨脹。這些數(shù)據(jù)證明，當(dāng)使用足夠劑量的病毒時(shí)，修飾的AcMNPV在將基因轉(zhuǎn)移入HepG2細(xì)胞方面高度有效。當(dāng)Sk-Hep-1細(xì)胞暴露給moi為15的病毒時(shí)，未觀察到染色細(xì)胞(未給出數(shù)據(jù))。雖然大多數(shù)暴露給moi為125的病毒的Sk-Hep-1細(xì)胞未染成藍(lán)色(圖14C)，但發(fā)現(xiàn)少數(shù)細(xì)胞在用該較高劑量病毒處理后染色很深(圖14D)。這些數(shù)據(jù)表明，在相對(duì)moi下看來(lái)較難感染病毒的細(xì)胞，實(shí)際上在較高moi下可以被感染并表達(dá)所述外源基因。在模擬感染的培養(yǎng)物中未發(fā)現(xiàn)染色的細(xì)胞(未給出數(shù)據(jù))。據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)確定，估計(jì)在暴露給相同劑量的所述修飾病毒后，Sk-Hep-1細(xì)胞系中染色細(xì)胞的頻率比HepG2細(xì)胞中低2,000-4,000倍。因此，由修飾的AcMNPV證明的細(xì)胞類(lèi)型特異性是相對(duì)的，而不是絕對(duì)的。這些數(shù)據(jù)亦表明，當(dāng)細(xì)胞混合物與病毒接觸時(shí)(體外或體內(nèi))，可以調(diào)節(jié)病毒劑量以在較低感染復(fù)數(shù)下將病毒導(dǎo)向被感染的細(xì)胞。大鼠肝細(xì)胞初級(jí)培養(yǎng)物中的表達(dá)該實(shí)施例描述了非哺乳動(dòng)物DNA病毒亦可以用于在大鼠肝細(xì)胞初級(jí)培養(yǎng)物中高水平表達(dá)外源基因。在該實(shí)驗(yàn)中，將新鮮制備的大鼠肝細(xì)胞鋪平板于如前述用大鼠尾膠原蛋白包被的平皿(Rana等，1994，Mol.Cell.Biol.145858-5869)。24小時(shí)后，用含有感染復(fù)數(shù)約430的RSV-lacZ桿狀病毒的新鮮培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞。再24小時(shí)后，固定細(xì)胞并用X-gal染色。超過(guò)70％的細(xì)胞被染成藍(lán)色，表明它們已攝入并表達(dá)RSV-lacZ盒(圖15)。在該實(shí)施例中得到的表達(dá)頻率比使用基因治療中使用的常規(guī)病毒載體(例如，反轉(zhuǎn)錄病毒載體和單純皰疹病毒載體)報(bào)道的頻率高。模擬感染的培養(yǎng)物沒(méi)有含有任何陽(yáng)性染色的細(xì)胞(未給出數(shù)據(jù))?？梢允褂闷渌鼉?yōu)選的外源基因代替lacZ基因。另外，可以容易地將其它初級(jí)細(xì)胞鋪平板，并與非哺乳動(dòng)物細(xì)胞溫育以取代初級(jí)大鼠肝細(xì)胞。皮質(zhì)培養(yǎng)物中的表達(dá)以下二個(gè)實(shí)施例描述非哺乳動(dòng)物DNA病毒可以用于在培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)外源基因。對(duì)此實(shí)施例，如上述從在含有10％FCS的HinkTNM-FH培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Sf9細(xì)胞制備Z4病毒。通過(guò)在磷酸緩沖鹽水中的20-60％蔗糖梯度中形成區(qū)帶，純化所述病毒。在以下實(shí)驗(yàn)中使用的病毒滴度是3×108pfu/ml(病毒貯液#1)或2×109pfu/ml(病毒貯液#2)，系在Sf9細(xì)胞上測(cè)定。在使用前將每種病毒貯液進(jìn)行超聲處理。對(duì)于第一個(gè)實(shí)施例，從E16胚胎幼仔制備大鼠大腦皮質(zhì)培養(yǎng)物。用300,000細(xì)胞/孔接種24孔平皿，植板后4天，通過(guò)將含血清培養(yǎng)基中的各種量的病毒加入所述孔中感染所述細(xì)胞，如表4中表明。使病毒吸附至細(xì)胞上24小時(shí)。表4.外源基因在大鼠皮質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)通過(guò)計(jì)數(shù)用X-gal染色細(xì)胞后藍(lán)色細(xì)胞的數(shù)目，測(cè)定外源β-半乳糖苷酶基因的表達(dá)。表4提供了10X放大倍數(shù)時(shí)顯微鏡的5個(gè)視野內(nèi)觀察到的藍(lán)色細(xì)胞的數(shù)目，每孔含有約65個(gè)視野。在一些孔中，孔周邊的細(xì)胞被優(yōu)先染色。這些數(shù)據(jù)表明，從培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞中的病毒表達(dá)了外源β-半乳糖苷酶基因。與之相反，當(dāng)用PBS模擬感染所述細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，未檢測(cè)到任何藍(lán)色細(xì)胞。因此，通過(guò)按照標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)則，將藍(lán)色細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒別為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的檢測(cè)確定，該非哺乳動(dòng)物病毒可以用于在神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)外源基因。在第二個(gè)實(shí)施例中，使用Z4桿狀病毒，在從E20和P1階段的大鼠幼仔得到的培養(yǎng)皮質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)外源基因。將E20幼仔的細(xì)胞以380,000細(xì)胞/孔植板于24孔平皿。將P1幼仔的細(xì)胞以300,000細(xì)胞/孔植板。植板后6天，用araC(以抑制膠質(zhì)生長(zhǎng))處理E20培養(yǎng)物，植板后10天將其感染。P1培養(yǎng)物于植板后2天用araC處理，于植板后6天感染。用滴度為2×109pfu/ml的各種稀釋度的Z4病毒感染每個(gè)培養(yǎng)物的樣品。為測(cè)定RSV啟動(dòng)子的強(qiáng)度，在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，用在二個(gè)不同啟動(dòng)子下表達(dá)lacZ基因的單純皰疹病毒(HSV)感染所述細(xì)胞。在一種情況下，用lacZ基因在RSV啟動(dòng)子控制下的HSV感染細(xì)胞。該HSV貯液的滴度是2×107IU/ml，由在PC12細(xì)胞上用X-gal組織化學(xué)測(cè)定。為了對(duì)比，用lacZ基因在HSVIE4/5啟動(dòng)子控制下的HSV感染細(xì)胞。該病毒的滴度是2×108IU/ml，由在PC12細(xì)胞上用X-gal組織化學(xué)測(cè)定。對(duì)于陰性對(duì)照，將細(xì)胞用PBS模擬感染。通過(guò)計(jì)數(shù)用X-gal對(duì)細(xì)胞染色時(shí)得到的藍(lán)色細(xì)胞數(shù)，測(cè)定外源lacZ基因的表達(dá)。本發(fā)明的非哺乳動(dòng)物Z4病毒成功地在從E20和P1發(fā)育階段大鼠幼仔得到的培養(yǎng)皮質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)了外源lacZ基因。使用1-100μlZ4病毒，4.9-10％的E20階段的皮質(zhì)細(xì)胞和2.1-5.75％的P1階段的皮質(zhì)細(xì)胞被X-gal染成藍(lán)色，表明所述外源基因在這些細(xì)胞中的表達(dá)。用做為陽(yáng)性對(duì)照的0.1-5.0μlHSVRSVlacZ病毒感染的細(xì)胞中，1.9-3.4％的E20細(xì)胞和0.45-4.2％的P1細(xì)胞被X-gal染成藍(lán)色。當(dāng)用5μl從IE4/5啟動(dòng)子表達(dá)lacZ的HSV樣品感染所述細(xì)胞時(shí)，幾乎100％的細(xì)胞被染成藍(lán)色。當(dāng)用PBS模擬感染E20或P1皮質(zhì)細(xì)胞時(shí)，未檢測(cè)到藍(lán)色細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)提供了非哺乳動(dòng)物Z4桿狀病毒可以用于在皮質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)外源基因的另一證據(jù)。這些數(shù)據(jù)亦表明，用Z4病毒得到的表達(dá)水平與用HSV得到的表達(dá)水平相當(dāng)。桿狀病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的劑量反應(yīng)上述組織化學(xué)數(shù)據(jù)表明，將哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露給增加量的病毒時(shí)，產(chǎn)生了增加量的β-半乳糖苷酶。為將桿狀病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)的劑量依賴性定量，將HepG2細(xì)胞暴露給增加劑量的病毒，并檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性。產(chǎn)生的酶量與以廣泛劑量范圍內(nèi)使用的病毒接種物成線性關(guān)系(圖16)。這提示每個(gè)病毒顆粒的進(jìn)入獨(dú)立于其它病毒顆粒的進(jìn)入。在該檢測(cè)中使用的最大病毒劑量受限于病毒貯液的滴度和體積，使用較高劑量病毒時(shí)未觀察到表達(dá)量的平臺(tái)。因此，這些數(shù)據(jù)表明，在實(shí)踐本發(fā)明時(shí)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)病毒的使用劑量調(diào)節(jié)表達(dá)水平(即，表達(dá)外源基因的細(xì)胞的百分比)。桿狀病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的時(shí)程將HepG2細(xì)胞暴露給RSV-lacZ病毒1小時(shí)，然后在不同時(shí)間收獲細(xì)胞，并定量檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性。如圖17中所示，最早在暴露給病毒6小時(shí)后即檢測(cè)到β-半乳糖苷酶活性，感染后12-24小時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰。如同對(duì)游離DNA分子預(yù)期的那樣，RSV-lacZ盒的表達(dá)在后來(lái)減退(圖17，未給出數(shù)據(jù))。感染后12天，通過(guò)X-gal染色在少于1/1000細(xì)胞中仍然可以檢測(cè)到LacZ表達(dá)(未給出數(shù)據(jù))。LacZ的這種表達(dá)不是病毒擴(kuò)散的結(jié)果，因?yàn)橥ㄟ^(guò)Sf21細(xì)胞上的噬斑檢測(cè)測(cè)定，感染后10天的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清液的滴度為10pfu/ml。這些數(shù)據(jù)提示，當(dāng)本發(fā)明用于生產(chǎn)從HepG2細(xì)胞純化的蛋白時(shí)，可能最好是在感染細(xì)胞后6小時(shí)從所述細(xì)胞分離所述蛋白。根據(jù)所述蛋白的半衰期，可能最好在蛋白表達(dá)高峰期后不久分離所述蛋白(即，對(duì)于HepG2細(xì)胞，感染后約22-26小時(shí)(例如，約24小時(shí))后)。可以容易對(duì)每種蛋白、病毒和細(xì)胞確定最大量分離產(chǎn)生的蛋白的最佳時(shí)間。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中從頭發(fā)生表達(dá)這些實(shí)施例確認(rèn)了所述外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中從頭發(fā)生表達(dá)。為證明在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中檢測(cè)到的報(bào)道基因活性不是物理伴隨進(jìn)入所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的AcMNPV病毒體的β-半乳糖苷酶的結(jié)果，進(jìn)行了幾個(gè)實(shí)驗(yàn)，它們證明，觀察到的lacZ報(bào)道基因表達(dá)是β-半乳糖苷酶從頭合成的結(jié)果。首先，檢測(cè)RSV-lacZ病毒接種物的β-半乳糖苷酶活性，發(fā)現(xiàn)該β-半乳糖苷酶活性水平低于HepG2細(xì)胞感染后表達(dá)水平的10％。第二，用RSV-lacZ病毒感染HepG2細(xì)胞，然后在蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺的存在下培養(yǎng)。感染后加入環(huán)己酰亞胺，將β-半乳糖苷酶活性積累抑制90％以上(表5)。第三，用BacPAK6(Clontech)以相同的moi感染HepG2細(xì)胞，BacPAK6是lacZ基因在病毒多角體蛋白啟動(dòng)子而不是RSV啟動(dòng)子控制下的桿狀病毒(表5)。后一病毒在該啟動(dòng)子有活性的昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)極高水平的β-半乳糖苷酶活性(未給出數(shù)據(jù))。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，所述病毒多角體蛋白啟動(dòng)子無(wú)活性，含有該啟動(dòng)子的病毒不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提供任何酶活性(表5)。與先前桿狀病毒與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相互作用的研究相反，這些數(shù)據(jù)證明，在桿狀病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后發(fā)生lacZ的從頭合成。表5.桿狀病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)從頭發(fā)生桿狀病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移被lysomotropicagnet抑制為探索桿狀病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的機(jī)制，檢測(cè)了基因表達(dá)對(duì)lysomotropicagnet的敏感性。與其它包膜病毒類(lèi)似，AcMNPV的芽生形式通常通過(guò)胞吞進(jìn)入細(xì)胞，接著通過(guò)病毒包膜與內(nèi)體膜的低pH激發(fā)的融合，由此使之進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)(Blissard等，1993，J.Virol.666829-6835；Blissard等，1990，Ann.Rev.ofEntomol.35127-155)。為確定內(nèi)體酸化作用對(duì)桿狀病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞是否是必需的，在存在氯喹(lysomotropicagnet)的情況下用RSV-lacZAcMNPV感染HepG2細(xì)胞。將HepG2細(xì)胞在含有或缺乏抑制劑的培養(yǎng)基中暴露給AcMNPV病毒90分鐘，然后除去含有病毒的培養(yǎng)基，如所列出的用含有或缺乏抑制劑的新鮮培養(yǎng)基置換。感染后1天，收獲細(xì)胞，檢測(cè)提取物的β-半乳糖苷酶活性和蛋白含量。表中的每個(gè)值代表三個(gè)獨(dú)立測(cè)定的平均，將不存在抑制劑時(shí)由RSV-lacZAcMNPV病毒產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的量做為100％。對(duì)每個(gè)提取物的蛋白含量將β-半乳糖苷酶活性歸一化。當(dāng)HepG2細(xì)胞暴露給所述病毒時(shí)以及暴露給病毒后持續(xù)存在25μm氯喹時(shí)，完全防止了β-半乳糖苷酶的從頭表達(dá)(表5)。這提示，桿狀病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移依賴于內(nèi)體酸化。當(dāng)細(xì)胞暴露給病毒90分鐘后向細(xì)胞加入氯喹時(shí)，只觀察到部分抑制β-半乳糖苷酶表達(dá)。顯然，在暴露給病毒的90分鐘期間，一部分(≈22％)的病毒顆?？梢酝ㄟ^(guò)內(nèi)體途徑進(jìn)行。丁酸增強(qiáng)桿狀病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移該實(shí)施例描述了丁酸增強(qiáng)桿狀病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的能力。制備具有不同哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的5種轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，如圖21中所示。使用pSV/BV構(gòu)建這些載體，pSV/BV是桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacPAK9(Clontech)的修飾形式，具有一個(gè)改變的多接頭和SV40剪接和多聚腺苷酸化信號(hào)。通過(guò)用NotI限制性酶切pBacPAK9，用T4DNA聚合酶處理產(chǎn)生平端并自連接除去NotI位點(diǎn)，構(gòu)建pSV/BV。通過(guò)將接頭pGCGGCCGC連接入SmaI位點(diǎn)，加入一個(gè)新的NotI位點(diǎn)。最后，通過(guò)用BglII-BamHI消化pRSV珠蛋白的變異體，并將850bp片段插入修飾的BacPAK9的BamHI位點(diǎn)，加入SM40剪接和多聚腺苷酸化信號(hào)，產(chǎn)生pSV/BV。從pCMV-EBNA(Invitrogen)的HindIII、BamHI切出人細(xì)胞肥大病毒立即早期啟動(dòng)子的758bpHindIII-XbaI片段，并插入pBluescript(SKII+)的HindIII、BamHI位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pCMV-SKII+。然后從CMV-SKII+的XhoI、BamHI位點(diǎn)切出所述啟動(dòng)子，插入pSV/BV的XhoI、BglII位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pCMV/BV。通過(guò)用EcoRI酶切pKJ1-neo(Tybulewicz，1991，Cell651153-1163)，制備500bp小鼠磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動(dòng)子，用T4DNA聚合酶產(chǎn)生平端以除去EcoRI位點(diǎn)。通過(guò)pfu聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用引物5’ACCGCGGATCCAATACGACTCACTATAG3’(SEQIDNO5)和5’CGGAGATCTGGAAGAGGAGAACAGCGCGGCAG3’(SEQIDNO6)，擴(kuò)增產(chǎn)生的缺失EcoRI位點(diǎn)的pKJ1質(zhì)粒。然后用XhoI和BglII消化擴(kuò)增的PGK啟動(dòng)子，插入pSV/BV的同樣位點(diǎn)，產(chǎn)生PKJ1/BV。從pINA(6)的BglII、BamHI切出345bp大鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，并插入pSV/BV的BglII位點(diǎn)，產(chǎn)生pβ-肌動(dòng)蛋白/BV。從pGEMA1bSVPA(Zaret等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.859076-9080)的NaeI、NsiI切出2.3kb白蛋白增強(qiáng)子和700bp白蛋白啟動(dòng)子，并插入pSV/BV的SmaI、PstI位點(diǎn)。使用的RSVlacZ轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(本文亦稱(chēng)為Z4病毒)見(jiàn)上述。將3.0kbLacZ盒插入所有構(gòu)建的質(zhì)粒的NotI位點(diǎn)(參見(jiàn)圖21)。通過(guò)將所述桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體與線性BP6病毒DNA(Clontech)共轉(zhuǎn)染入Sf21細(xì)胞，產(chǎn)生重組病毒。通過(guò)三輪在Sf21細(xì)胞上的噬斑分離和擴(kuò)增純化重組病毒。如上述通過(guò)超離心濃縮擴(kuò)增的病毒，通過(guò)在Sf21昆蟲(chóng)細(xì)胞上的96-孔方法測(cè)定滴度(O’Reilly等，桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，W.H.Freeman，NewYork，NY)。以感染復(fù)數(shù)100用每種重組病毒感染人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2。在60mm組織培養(yǎng)皿中最終體積為1ml的Eagle極限必需培養(yǎng)基中感染200萬(wàn)細(xì)胞。使感染進(jìn)行2小時(shí)，然后將4ml完全培養(yǎng)基加入細(xì)胞。在第二系列HepG2感染中，重復(fù)第一次感染的條件，除了在感染進(jìn)行2小時(shí)后，用1.5ml的完全培養(yǎng)基將25μl丁酸鈉(100mM)加入細(xì)胞。做為對(duì)照，模擬感染細(xì)胞以評(píng)價(jià)本底β-半乳糖苷酶活性。24小時(shí)后收集細(xì)胞單層，如上述為比色測(cè)定(用ONPG)β-半乳糖苷酶活性做準(zhǔn)備。通過(guò)膠原蛋白酶灌注分離肝細(xì)胞，如前述在大鼠尾膠原蛋白上鋪平板(Boyce等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.932348-2352)。變化檢測(cè)條件(時(shí)間和使用的提取物的量)，以使之處于該檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。通過(guò)分光光度分析測(cè)定產(chǎn)物量，計(jì)算β-半乳糖苷酶活性。使用CoomassiePlus蛋白分析(Pierce)確定提取物的蛋白濃度，以對(duì)提取物總蛋白含量歸一化的β-半乳糖苷酶單位表示結(jié)果。對(duì)于每個(gè)啟動(dòng)子，從酶活性總量減去模擬感染細(xì)胞的本底活性量。每個(gè)感染進(jìn)行三份，以平均加標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá)(表6)。如表6所示，將病毒或哺乳動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)子加入桿狀病毒，使得可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因。CMV啟動(dòng)子導(dǎo)致最高水平的β-半乳糖苷酶活性，而RSV和β-肌動(dòng)蛋白產(chǎn)生較低水平的β-半乳糖苷酶活性。在該實(shí)施例中使用的病毒moi復(fù)數(shù)下，白蛋白和PGK啟動(dòng)子在未用丁酸處理的細(xì)胞的提取物中未顯示高于本底的活性，盡管通過(guò)X-gal染色檢測(cè)到了陽(yáng)性染色的細(xì)胞。感染后向細(xì)胞加入丁酸鈉，導(dǎo)致所有測(cè)試的啟動(dòng)子的可檢測(cè)水平的β-半乳糖苷酶表達(dá)。用丁酸鈉處理細(xì)胞后，CMV啟動(dòng)子顯示β-半乳糖苷酶報(bào)道基因表達(dá)增加了5倍。用丁酸鹽處理后，RSVLTR、白蛋白、pGK1和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子都導(dǎo)致基因表達(dá)增強(qiáng)。在不限于任何特定理論的情況下，推測(cè)丁酸鈉增強(qiáng)了細(xì)胞分化和組蛋白乙酰化，其增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄。表6.有或沒(méi)有丁酸鈉時(shí)比較各種啟動(dòng)子的強(qiáng)度a以單位/mgβ-半乳糖苷酶表示啟動(dòng)子強(qiáng)度。HepG2細(xì)胞中病毒啟動(dòng)子的RNA表達(dá)分析使用非哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，由于缺乏適合的宿主細(xì)胞因子，所述非哺乳動(dòng)物病毒啟動(dòng)子在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可能無(wú)活性。為確定AcMNPV病毒基因是否在HepG2細(xì)胞中表達(dá)，分析所述病毒的RNA。在這些實(shí)驗(yàn)中，以約30的moi用Z4病毒感染HepG2細(xì)胞。感染后18小時(shí)，收獲細(xì)胞，從所述細(xì)胞提取總細(xì)胞RNA。通過(guò)RNA印跡分析總細(xì)胞RNA中病毒基因的表達(dá)。探針包括源自pAcUW1(Pharmingen)的1.7kbpPacI-SalI片段，其含有病毒晚期基因p74以及極遲(超表達(dá))基因p10。使用Z4感染的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞的總細(xì)胞RNA做為陽(yáng)性對(duì)照。雖然在對(duì)照昆蟲(chóng)細(xì)胞中檢測(cè)到p10和p74的極強(qiáng)的信號(hào)，但在Z4感染的HepG2細(xì)胞或未感染的對(duì)照細(xì)胞中未觀察到任何信號(hào)。使用高敏感性方法逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR(RT-PCR)的其它實(shí)驗(yàn)，提供了大多數(shù)病毒基因未在哺乳動(dòng)物HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的進(jìn)一步的證據(jù)。使用從感染后6或24小時(shí)的Z4感染的HepG2、未感染的HepG2或感染的Sf9細(xì)胞制備的RNA進(jìn)行RT-PCR分析。以10或100的moi感染HepG2細(xì)胞。感染后6小時(shí)，在這二種病毒劑量下，在Z4感染的HepG2細(xì)胞中未觀察到病毒p39、ETL、LEF1、IE1、或IE-N基因的任何RT-PCR產(chǎn)物。與之相反，容易地在Z4感染的Sf9細(xì)胞中檢測(cè)到RT-PCR產(chǎn)物。感染后24小時(shí)，在以moi為10感染的HepG2細(xì)胞中未檢測(cè)到這些基因的表達(dá)。感染24小時(shí)后，在以moi為100感染的HepG2細(xì)胞中未檢測(cè)到病毒p39、ETL或LEF1基因的表達(dá)。但是，在此高病毒劑量下，觀察到病毒IE1和IE-N基因的低水平表達(dá)。不過(guò)moi為100下，檢測(cè)到的低水平表達(dá)顯著低于昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)水平。這些基因的表達(dá)可能是因?yàn)椴溉閯?dòng)物轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別病毒TATA盒(即，由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄立即早期基因(參見(jiàn)，例如，Hoopes和Rorhman，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.884513-4517)。與立即早期基因相反，由病毒編碼的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄晚期或極遲病毒基因，該酶不需要TATA盒，在TAAG基元起始轉(zhuǎn)錄(O’Reilly等，見(jiàn)上述)。因此，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中天然地阻斷了病毒晚期或極遲基因的表達(dá)。如果需要，使用常規(guī)方法通過(guò)缺失那些基因，可以阻斷所述立即早期基因的表達(dá)。某些病毒具有感染肝細(xì)胞的固有能力，而其它病毒感染肝細(xì)胞可以由諸如細(xì)胞表面脫唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)的細(xì)胞受體促進(jìn)。HepG2細(xì)胞不同于Sk-Hep-1人肝細(xì)胞和NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞，因?yàn)樵诩?xì)胞表面存在ASGP-R。在某些上述實(shí)驗(yàn)中，在少于HepG2細(xì)胞的Sk-Hep-1細(xì)胞(圖14B)或NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)β-半乳糖苷酶。根據(jù)X-gal染色細(xì)胞的定量計(jì)數(shù)，HepG2細(xì)胞中l(wèi)acZ基因的表達(dá)頻率估計(jì)比Sk-Hep-1細(xì)胞中的表達(dá)頻率高1000倍。正常肝細(xì)胞具有100,000-500,000個(gè)ASGP-R，每個(gè)受體每天內(nèi)化多至200個(gè)配體。ASGP-R通過(guò)提供病毒體上糖蛋白的細(xì)胞表面受體，促進(jìn)所述病毒進(jìn)入所述細(xì)胞。昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的糖基化型式不同，昆蟲(chóng)細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒體表面的碳水化合物部分缺乏末端唾液酸。那些碳水化合物部分可以介導(dǎo)病毒體的內(nèi)化和運(yùn)輸。除ASGP-R之外，存在于哺乳動(dòng)物中的其它半乳糖結(jié)合凝集素(參見(jiàn)，例如，Jung等，1994，J.Biochem.(Tokyo)116547-553)可以介導(dǎo)攝取病毒。如果需要，可以修飾欲感染的細(xì)胞，以促進(jìn)所述桿狀病毒進(jìn)入所述細(xì)胞。例如，可以在欲用所述病毒(例如，桿狀病毒)感染的細(xì)胞表面表達(dá)ASGP-R。已充隆了編碼ASGP-R的基因(Spiess等，1985，J.Biol.Chem.2601979和Spiess等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.826465)，可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺伴隨病毒載體或腺病毒載體或化學(xué)方法)，在欲用病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)ASGP-R。其它合適的哺乳動(dòng)物凝集素可以替換ASGP-R用于這種方法中(參見(jiàn)，例如，Ashwell等，1982，Ann.Rev.Biochem.51531-534)。亦可以在欲感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面表達(dá)病毒體上配體的其它受體，例如昆蟲(chóng)碳水化合物受體或HIV的CD4受體，以促進(jìn)感染(參見(jiàn)，例如，Monsigny等，1979，Biol.Cellulaire33289-300)。亦可以通過(guò)例如借助化學(xué)手段修飾病毒體促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞，使病毒體與哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的其它受體結(jié)合(參見(jiàn)，例如，Neda，等，1991，J.BioI.Chem.26614143-14146和Burns等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.908033-8037)?；蛘?，通過(guò)在源自鹽澤燈蛾(Estigmenaacrea)的Ea4細(xì)胞上生長(zhǎng)病毒，可以修飾桿狀病毒的糖基化型式和水平(例如，如Rooney等在NatureBiotech中所述)。另外，可以修飾病毒，使得它表達(dá)哺乳動(dòng)物糖基化酶(Jarvis等，1996，NatureBiotech，141288-1292)。II.表達(dá)外源基因的非哺乳動(dòng)物DNA病毒的治療用途非哺乳動(dòng)物DNA病毒在幾種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效地表達(dá)lacZ報(bào)道基因的發(fā)現(xiàn)，表明非哺乳動(dòng)物DNA病毒可以用于在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中治療性地表達(dá)外源基因。例如，本發(fā)明的方法可以有助于在患者的細(xì)胞中表達(dá)外源基因，以治療由基因表達(dá)缺陷引起的疾病。已知許多疾病由單基因缺陷引起(參見(jiàn)表7)，已鑒別和充隆了許多涉及基因缺陷疾病的基因。使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)(參見(jiàn)，例如，Ausubel等，分子生物學(xué)現(xiàn)行方法，JohnWiley&amp;Sons，(1989))，可以工程改造非哺乳動(dòng)物病毒以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，人細(xì)胞)中表達(dá)所需外源基因。表7.可以用本發(fā)明治療的疾病實(shí)例和可以用本發(fā)明生產(chǎn)的基因產(chǎn)物的實(shí)例基因產(chǎn)物疾病延胡索酰乙酰乙酸水解酶遺傳性酪氨酸血癥苯丙氨酸羥化酶苯酮尿癥LDL受體家族性高膽固醇血癥α-1抗胰蛋白酶α-1抗胰蛋白酶缺乏癥葡萄糖-6-磷酸酶糖原儲(chǔ)積病膽色素原脫氨基酶由卟啉代謝錯(cuò)誤引起的疾病，例如急性間歇性血卟啉病CPS-I，OTC，AS，ASL或精氨酸酶尿素循環(huán)紊亂因子VIII和IX血友病Cystathioneβ-合酶高胱氨酸尿支鏈酮酸脫羧酶械糖尿病白蛋白血清蛋白減少異戊酰-輔酶A脫氫酶異戊酸血癥丙酰輔酶A羧化酶丙酸血甲基丙二酰輔酶A變位酶甲基丙二酸血癥戊二酰輔酶A脫氫酶戊二酸血胰島素胰島素依賴性糖尿病β-萄糖苷酶戈謝病丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶缺乏肝磷酸化酶或磷酸化酶激酶糖原儲(chǔ)積病甘氨酸脫羧酶，H-蛋白，或T-蛋白非-ketotic高甘氨酸血癥Wilson病銅運(yùn)輸ATP酶Wilson病Menkes病銅運(yùn)輸ATP酶Menkes病囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白囊性纖維化</table></tables>本發(fā)明亦可以用于促進(jìn)所需基因在沒(méi)有明顯缺陷的細(xì)胞中表達(dá)。例如，本發(fā)明可以用于在患者的肝細(xì)胞中表達(dá)胰島素，為所述患者在機(jī)體內(nèi)提供胰島素?？梢栽诓溉閯?dòng)物細(xì)胞(例如，肝細(xì)胞)中表達(dá)以傳遞入所述哺乳動(dòng)物的系統(tǒng)循環(huán)的蛋白質(zhì)的其它實(shí)例，包括激素、生長(zhǎng)因子和干擾素。本發(fā)明亦可以用于在細(xì)胞中表達(dá)調(diào)節(jié)基因或編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因(例如，VP16-tet阻抑物基因融合物)，以控制另一基因的表達(dá)(例如，可操作地連接至tet操縱基因序列的基因；參見(jiàn)，例如，Gossen等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.895547-5551)。另外，本發(fā)明可以用于通過(guò)在細(xì)胞中表達(dá)癌癥治療基因治療癌癥的方法中，所述治療基因諸如編碼腫瘤抑制因子(例如，p53)、腫瘤壞死因子、胸苷激酶、白喉毒素嵌合體或胞苷脫氨酶的基因(參見(jiàn)，例如，Vile和Russel，1994，GeneThreapy188-98)。其它有用的基因產(chǎn)物包括用于基于RNA引誘物、反義或核酶的抑制基因表達(dá)的方法(參見(jiàn)，例如，Yu等，GeneTherapy113-26)。如果需要，本發(fā)明可以用于表達(dá)諸如胞苷脫氨酶的、其產(chǎn)物將改變藥物或藥物前體諸如5-氟胞嘧啶在細(xì)胞中的活性的基因(參見(jiàn)，例如，Harris等，1994，Genetherapy1170-175)?？梢允褂弥T如使用核酶、反義RNA、反式顯性阻抑物聚合酶突變體、或核心抗原突變體或表面抗原突變體的方法，抑制細(xì)胞中的肝炎病毒(例如，甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或丁型肝炎病毒)。通過(guò)用受影響基因的正常型式處理，亦可以用本發(fā)明治療諸如家族性血色病的其它疾病。優(yōu)選表達(dá)的基因包括編碼在正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，肝細(xì)胞或肺細(xì)胞)中表達(dá)的蛋白的那些基因。例如，可以用于本方法的有編碼參與尿素循環(huán)的酶的基因，例如編碼氨甲酰磷酸合成酶(CPS-I)、鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(OTC)、精氨琥珀酸合成酶(AS)、精氨琥珀酸裂解酶(ASL)和精氨酸酶。這些基因均已被克隆(關(guān)于OTC，參見(jiàn)Horwich等，1984，Science2241068-1074和Hata等，1988，J.Biochem(Tokyo)103302-308；關(guān)于AS，參見(jiàn)Bock等，1983，Nucl.AcidsRes.116505；Surh等，1988，Nucl.AcidsRes.169252；和Dennis等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.867947；關(guān)于ASL，參見(jiàn)O’Brien等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.837211；關(guān)于CPS-I，參見(jiàn)Adcock等，1984，(摘要)Fed.Proc.431726；關(guān)于精氨酸酶，參見(jiàn)Haraguchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.84412)。使用常用技術(shù)可以容易地完成將這些基因亞克隆入桿狀病毒。通過(guò)監(jiān)視患者疾病的已知癥候和癥狀，可以評(píng)價(jià)在細(xì)胞中表達(dá)外源基因的治療效力。例如，通過(guò)監(jiān)視血漿銨或乳清酸水平可以檢測(cè)OTC缺乏和CPS缺乏的減輕。類(lèi)似地，血漿瓜氨酸水平提供AS缺乏的指標(biāo)，通過(guò)監(jiān)視血漿精氨琥珀酸水平可以追蹤ASL缺乏。評(píng)價(jià)治療方法的參數(shù)對(duì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的(參見(jiàn)，例如，Maestri等，1991，J.Pediatrics，119923-928)。通過(guò)與用于給予哺乳動(dòng)物的藥學(xué)上可接受的無(wú)毒賦形劑或載體(例如，鹽水)混合，可以將非哺乳動(dòng)物DNA病毒(例如，桿狀病毒)配制成為藥用組合物。在實(shí)踐本發(fā)明時(shí)，可以制備所述病毒用于腸胃外給予(例如，用于靜脈注射(例如，注入門(mén)靜脈))、動(dòng)脈內(nèi)注射(例如，注入股動(dòng)脈或肝動(dòng)脈)、腹膜內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射或直接注射入組織或器官(例如，肌內(nèi)注射)。特別是，所述非哺乳動(dòng)物病毒可以以常規(guī)賦形劑中的液體溶液或懸浮液的形式制備。所述病毒亦可以制備用于鼻內(nèi)或支氣管內(nèi)給予，特別是以常規(guī)賦形劑中的滴鼻劑或氣溶膠形式。如果需要，可以超聲處理所述病毒，以在最大程度地降低制備病毒中所述病毒凝集。在實(shí)踐本發(fā)明時(shí)，可以使用所述病毒在欲治療的哺乳動(dòng)物之外感染細(xì)胞(例如，供體哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞或體外細(xì)胞)，然后將受感染的細(xì)胞給予欲治療的哺乳動(dòng)物。在該方法中，所述細(xì)胞可以是欲治療的哺乳動(dòng)物自體的或異體的。例如，可以使用肝活檢中得到的自體肝細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，Grossman等，1994，NatureGenetics6335)。然后可以將所述細(xì)胞通過(guò)注射(例如，注入門(mén)靜脈)給予所述患者。在這種方法中，最好肝細(xì)胞體積為整個(gè)肝臟體積的約1％-10％。當(dāng)本發(fā)明用于在肝細(xì)胞中表達(dá)外源基因時(shí)，可以將所述肝細(xì)胞傳遞給脾臟，所述細(xì)胞可以接著在體內(nèi)遷移至肝臟(參見(jiàn)，例如，Lu等，1995，Hepatology217752-759)。如果需要，通過(guò)使用將液體灌注入器官、細(xì)胞或組織的常規(guī)技術(shù)(包括使用輸注泵和注射器)，可以將所述病毒傳遞給細(xì)胞。對(duì)于灌注，一般在1分鐘至6小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)，以1-500ml的體積中的1×106-1×1010pfu/ml(最好是1×109-1×1010pfu/ml)的滴度給予所述病毒。如果需要，可以在幾天內(nèi)靜脈內(nèi)將多劑量的所述病毒給予患者，以增加所需要的表達(dá)水平。給予哺乳動(dòng)物的病毒的最佳量或受感染細(xì)胞的最佳數(shù)目以及給予的頻率，取決于諸如檢測(cè)外源基因表達(dá)的方法的敏感性、使用的啟動(dòng)子的強(qiáng)度、欲治療的疾病的嚴(yán)重性和所述病毒的靶細(xì)胞等因素。一般地，以約0.1-1,000的感染復(fù)數(shù)給予所述病毒；優(yōu)選感染復(fù)數(shù)是約5-100；更優(yōu)選感染復(fù)數(shù)是10-50。III.使用非哺乳動(dòng)物病毒體內(nèi)表達(dá)外源基因的實(shí)施例以下的實(shí)施例證明，非哺乳動(dòng)物DNA病毒可以用于體內(nèi)在細(xì)胞中表達(dá)外源基因。這些實(shí)施例亦證明，通過(guò)靜脈內(nèi)注射、鼻內(nèi)給予或?qū)⑺霾《局苯幼⑸淙氚薪M織給予所述病毒，可以達(dá)到體內(nèi)基因表達(dá)。第一個(gè)實(shí)施例證明體內(nèi)在大腦細(xì)胞中表達(dá)外源基因。第二個(gè)實(shí)施例提供了在靜脈內(nèi)注射所述病毒后在肝臟表達(dá)外源基因的證據(jù)。在第三個(gè)實(shí)施例中，在向受傷的皮膚局部使用Z4病毒后，在皮膚內(nèi)檢測(cè)到所述外源基因的表達(dá)。在余下的實(shí)施例中，將攜帶外源基因的病毒直接注射入器官。這些實(shí)施例證明外源基因在皮膚、肝臟、脾臟、腎臟、胃、骨骼肌、子宮和胰臟中的體內(nèi)表達(dá)。注射入門(mén)靜脈對(duì)于第一個(gè)實(shí)施例，將0.5ml的Z4病毒(≈1.4×109pfu/ml)注射(速率≈1ml/min)進(jìn)入單只大鼠的門(mén)靜脈。感染后約72小時(shí)，在用常規(guī)組織化學(xué)方法檢測(cè)的冰凍切片的至少一個(gè)肝細(xì)胞中檢測(cè)到lacZ表達(dá)。通過(guò)以下程序的任何一種或其組合可以提高表達(dá)效率(1)用生長(zhǎng)因子預(yù)先處理所述動(dòng)物；(2)部分肝切除，(3)給予免疫抑制劑以抑制對(duì)所述病毒的任何免疫應(yīng)答；(4)使用較高滴度或劑量的病毒；(5)通過(guò)外科手術(shù)灌注，將所述病毒輸注至肝臟(例如，為限制所述病毒與紅細(xì)胞的可能的非特異性結(jié)合)；和/或(6)超聲處理病毒以最大限度地降低所述病毒凝集。大腦中的表達(dá)對(duì)于第二個(gè)實(shí)施例，使用sterotactic程序，將2μl的Z4病毒樣品(滴度為4.8×1010pfu/ml)注射入麻醉的成年大鼠大腦的嗅球。緩慢地注射所述病毒(超過(guò)30分鐘)，以避免壓迫大腦組織。注射后1天，將所述大鼠無(wú)痛致死，處理大腦組織以通過(guò)X-gal組織化學(xué)檢測(cè)外源lacZ基因的表達(dá)。將Z4病毒注射入大腦導(dǎo)致體內(nèi)lacZ表達(dá)，強(qiáng)烈地染成藍(lán)色的細(xì)胞塊提供了證據(jù)。在注射約107pfu時(shí)，超過(guò)104細(xì)胞被染成藍(lán)色。這些數(shù)據(jù)由此表明，通過(guò)將其基因組包括所述外源基因的非哺乳動(dòng)物DNA病毒注射入大腦，可以在哺乳動(dòng)物的大腦中表達(dá)外源基因。局部使用和在皮膚中的表達(dá)該實(shí)施例證明，向小鼠刮擦的皮膚局部使用所述Z4病毒，可以導(dǎo)致在所述皮膚中表達(dá)異源基因。這些實(shí)驗(yàn)涉及小鼠皮膚上四種不同處理的區(qū)。二個(gè)區(qū)(一個(gè)刮擦區(qū)和一個(gè)未刮擦區(qū))用磷酸緩沖鹽水處理。另外二個(gè)區(qū)(一個(gè)刮擦區(qū)和一個(gè)未刮擦區(qū))用所述Z4病毒處理(50μl，4.8×1010pfu/ml)。處理后，使用恒冷箱切片機(jī)將每個(gè)皮膚區(qū)切成切片。向小鼠受傷的皮膚局部使用所述Z4病毒(50μl，4.8×1010pfu/ml)，導(dǎo)致所述外源基因在表皮基底層的幾乎100％的細(xì)胞中表達(dá)。未檢測(cè)到較深層結(jié)構(gòu)的染色。在一個(gè)恒冷箱切片中，表皮的各種區(qū)在多個(gè)區(qū)域中被染色。在第二個(gè)恒冷箱切片中，偶然存在藍(lán)色細(xì)胞。在第三個(gè)恒冷箱切片中，檢測(cè)到染色斑，在第四個(gè)恒冷箱切片中，染色幾乎是連續(xù)的且非常深。盡管從皮膚的這個(gè)區(qū)域得到的四個(gè)恒冷箱切片之間基因表達(dá)的型式略有不同，但該實(shí)施例證明，向刮擦的皮膚局部使用所述Z4病毒，一致地導(dǎo)致所述異源基因在皮膚中表達(dá)。注射入組織或器官在以下實(shí)施例中，在將攜帶外源基因的非哺乳動(dòng)物DNA病毒直接注射入四種不同的器官后，體內(nèi)檢測(cè)到該基因的表達(dá)。對(duì)于這些實(shí)施例，從1升Z4感染的(moi為0.5)、在無(wú)血清培養(yǎng)基的旋動(dòng)培養(yǎng)中生長(zhǎng)的Sf9細(xì)胞制備所述Z4病毒。通過(guò)將所述細(xì)胞培養(yǎng)物于2000rpm離心10分鐘除去細(xì)胞和碎片。通過(guò)蔗糖墊層在SW28轉(zhuǎn)頭中以24,000rpm離心75分鐘，沉淀所述病毒。為制備該病毒貯液，將33ml澄清的病毒在3ml蔗糖墊層(10mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA(TE)中的27％蔗糖(w/v))上鋪層。通過(guò)于4℃在0.3mlTE/管中溫育過(guò)夜，再懸浮所述病毒。通過(guò)在SW41管中的20-60％蔗糖(TE中的w/v)梯度中于38,000rpm離心75分鐘形成區(qū)帶，純化所述病毒。用注射器收集所述病毒區(qū)帶，在SW50.1轉(zhuǎn)頭中于30,000rpm離心60分鐘，沉淀所述病毒。在總共0.7mlPBS中通過(guò)于4℃溫育過(guò)夜再懸浮所述病毒沉淀。由常規(guī)噬斑檢測(cè)測(cè)定，所述濃縮Z4貯液的滴度是4.8×1010pfu/ml。為檢測(cè)體內(nèi)基因表達(dá)，通過(guò)直接注射50μl等分的濃縮病毒(總共2.4×109pfu)進(jìn)入小鼠的或者肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、子宮、胰臟或者皮膚，將Z4病毒給予Balb/c雌性小鼠。給予肝臟、脾臟和腎臟時(shí)需要手術(shù)。為使所述病毒傳播到整個(gè)器官，將50μl病毒樣品注射入器官中的二個(gè)或三個(gè)位點(diǎn)。使用50μl的PBS樣品做為陰性對(duì)照。為檢測(cè)肝臟中的基因表達(dá)，僅在肝臟的一葉注射，將接受PBS注射的獨(dú)立的小鼠做為陰性對(duì)照。為檢測(cè)脾臟中的基因表達(dá)，將未注射的小鼠做為陰性對(duì)照。為檢測(cè)腎臟、肌肉和皮膚中的基因表達(dá)，進(jìn)行對(duì)側(cè)對(duì)照(將Z4病毒注射入右邊器官，將PBS注射入所述左邊器官)。為檢測(cè)肌肉中的表達(dá)，在給小鼠剃毛后將所述病毒注射入脛骨后腿前肌(tibealisanteriorhindlegmuscle)。為檢測(cè)皮膚中的表達(dá)，將小鼠的腹部剃毛，將50μl的Z4病毒注射入腹部的標(biāo)記區(qū)。注射后24小時(shí)，處死小鼠并進(jìn)行解剖。將Z4和PBS注射的器官在液氮中冷凍，使用恒冷箱切片機(jī)(Reichert-JungCryocut1800)制備7μm的薄切片。如上述通過(guò)固定所述薄切片并用X-gal染色，測(cè)定β-半乳糖苷酶活性。接受Z4病毒的每個(gè)器官都在體內(nèi)表達(dá)外源lacZ基因。在每種情況下，PBS陰性對(duì)照未啟動(dòng)所述外源基因的表達(dá)。皮膚中注射和表達(dá)在該實(shí)施例中，在2.4×109pfu注射入皮膚后，在小鼠皮膚中觀察到Z4的外源lacZ基因的體內(nèi)表達(dá)。皮下注射所述病毒后，在真皮中達(dá)到高水平表達(dá)(注射區(qū)內(nèi)超過(guò)25％的細(xì)胞)。盡管肌肉層基本上未染色，但觀察到一些骨骼肌纖維的陽(yáng)性染色。做為陰性對(duì)照，將PBS注射入皮膚。盡管在皮脂腺中觀察到一些染色，但它很可能是由于存在細(xì)菌。亦在真皮中檢測(cè)到低水平染色。當(dāng)將所述Z4病毒局部使用于未受傷(未刮擦)的皮膚時(shí)，獲得類(lèi)似的結(jié)果，盡管未檢測(cè)到清晰的表皮染色。不過(guò)，這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)將Z4病毒皮下注射入所述哺乳動(dòng)物時(shí)，可以使用所述病毒在哺乳動(dòng)物皮膚中表達(dá)異源基因。肝臟中的表達(dá)在該實(shí)施例中，在肝臟中檢測(cè)到所述外源基因的表達(dá)。在受注射的葉的多個(gè)區(qū)域中檢測(cè)到做為β-半乳糖苷酶表達(dá)指示的藍(lán)色。盡管最深的顏色在注射點(diǎn)，但所述肝區(qū)的內(nèi)部區(qū)域展示出基因表達(dá)指示的藍(lán)色?？磥?lái)在接受所述Z4病毒的葉的肝細(xì)胞和肝巨噬細(xì)胞中都檢測(cè)到所述外源基因的表達(dá)。與之相反，同一肝臟的未注射葉是陰性的。這些結(jié)果由此表明，通過(guò)將編碼外源基因的非哺乳動(dòng)物DNA病毒注射入肝臟，可以在肝細(xì)胞中表達(dá)所述基因。脾臟中的表達(dá)在該實(shí)施例中，在將攜帶所述外源基因的病毒注射入脾臟后，檢測(cè)脾臟薄切片的基因表達(dá)。接受Z4病毒的脾細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)了lacZ基因。在位于整個(gè)脾臟的細(xì)胞中都檢測(cè)到藍(lán)色。用脾細(xì)胞得到的藍(lán)色深度低于用肝細(xì)胞得到的深度。然而，藍(lán)色是所述外源基因顯著表達(dá)的指示。在未接受所述病毒的脾臟中未檢測(cè)到藍(lán)色。這些數(shù)據(jù)由此表明，在將其基因組攜帶外源基因的非哺乳動(dòng)物DNA病毒注射后，可以體內(nèi)在脾細(xì)胞中表達(dá)所述基因。腎臟中的表達(dá)在該實(shí)施例中，在如上述用Z4注射的腎臟中檢測(cè)到外源基因的體內(nèi)表達(dá)。注射了Z4的腎臟顯示了指示lacZ表達(dá)的清晰的藍(lán)色；與之相反，注射了PBS的對(duì)照腎臟未顯示藍(lán)色。藍(lán)色主要在所述腎臟的切片邊緣。間接免疫熒光亦表明。病毒顆粒集中在所述切片的邊緣，提供了基因表達(dá)與所述病毒定位的對(duì)應(yīng)關(guān)系。這些數(shù)據(jù)由此表明，可以使用非哺乳動(dòng)物DNA病毒在腎臟細(xì)胞中體內(nèi)表達(dá)外源基因。胃中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將Z4病毒(50μl)注射入Balb/c小鼠胃的中央。注射后次日處死動(dòng)物，將胃在液氮中冷凍，如前述進(jìn)行恒冷箱切片和固定(stated)。在胃粘膜和肌肉細(xì)胞中觀察到細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在腺體中檢測(cè)到陽(yáng)性染色，大多數(shù)染色發(fā)生在腺體的基部。這些觀察表明，可以使用非哺乳動(dòng)物DNA病毒在小鼠的胃部表達(dá)異源基因。在這些實(shí)驗(yàn)中，亦在腔中檢測(cè)到藍(lán)色。在此特定區(qū)域的藍(lán)色可能由腸中的細(xì)菌引起，而不是由所述病毒的表達(dá)引起。骨骼肌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，在將病毒直接注射入脛骨前肌后，在肌肉中檢測(cè)到Z4的外源lacZ基因的體內(nèi)表達(dá)。僅在肌肉內(nèi)的分離位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)藍(lán)色，顏色的深度或分布不如在肝臟、脾臟或皮膚中觀察到的顏色。不過(guò)，藍(lán)色是顯著的，表明可以使用非哺乳動(dòng)物DNA病毒在肌肉中體內(nèi)表達(dá)外源基因。子宮中的表達(dá)在該實(shí)施例中，在子宮中檢測(cè)到lacZ報(bào)道基因的表達(dá)。將50μl等分的所述Z4病毒(2.4×109pfu)直接注射入小鼠的子宮。注射后次日處死動(dòng)物，如前述制備恒冷箱切片。用X-gal染色所述切片，在幾乎沒(méi)有組織破壞的情況下，在子宮一個(gè)區(qū)域產(chǎn)生藍(lán)色。陽(yáng)性細(xì)胞大多數(shù)是子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，而不是腺體成份。這些數(shù)據(jù)表明，可以使用非哺乳動(dòng)物DNA病毒在哺乳動(dòng)物的子宮中表達(dá)異源基因。胰臟中的表達(dá)該實(shí)施例證明，可以使用非哺乳動(dòng)物DNA病毒在哺乳動(dòng)物胰臟中表達(dá)異源基因。將50μl等分的所述Z4病毒(2.4×109pfu)直接注射入小鼠胰臟。注射后次日，處死小鼠，將胰臟用X-gal按照常規(guī)方法染色。檢測(cè)到大面積的陽(yáng)性細(xì)胞，表明所述Z4病毒成功地在所述胰臟中表達(dá)了lacZ基因。概要總之，這些實(shí)施例證明，可以使用非哺乳動(dòng)物DNA病毒(例如，桿狀病毒)，體內(nèi)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因。這些實(shí)施例使用了幾種獨(dú)特的動(dòng)物模型系統(tǒng)和給予所述病毒的方法。在每種和所有情況下，所述非哺乳動(dòng)物DNA病毒均成功地在體內(nèi)表達(dá)了所述外源基因。這些數(shù)據(jù)由此為非哺乳動(dòng)物DNA病毒可以用于在體內(nèi)在其它未舉例的細(xì)胞中表達(dá)外源基因的主張?zhí)峁┝酥С帧Ａ硗?，在至少一些組織中，體內(nèi)表達(dá)的水平令人驚異的高于從對(duì)應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)預(yù)期的水平(例如，大腦與培養(yǎng)神經(jīng)元對(duì)比)。所有的這些實(shí)施例都為本發(fā)明的體內(nèi)應(yīng)用提供了證據(jù)。B部分改變的外殼蛋白增強(qiáng)非哺乳動(dòng)物DNA病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的能力因?yàn)橐炎C明可以使用非哺乳動(dòng)物DNA病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因，所以提供以下實(shí)施例證明，改變的外殼蛋白增強(qiáng)所述非哺乳動(dòng)物DNA病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所述外源基因的能力。構(gòu)建桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVGZ3這些實(shí)施例使用的桿狀病毒已被工程改造，表達(dá)做為改變的外殼蛋白的皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G(VSV-G)。桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVGZ3是在以上概述的許多實(shí)施例中使用的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒Z4的衍生物。通過(guò)將編碼VSV-G和報(bào)道基因lacZ的表達(dá)盒插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體BacPAK9(Clontech；PaloAlto，CA)，構(gòu)建桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVGZ3。為制備此轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，從pLGRNL(Burns，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.908033-8037)切出做為l,665bpBamHI片段的編碼VSV-G的cDNA。將產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為VSVG/BP9(圖18)。使用BglII和BamHI從Z4轉(zhuǎn)移質(zhì)粒切出RSVLTR、lacZ基因和SV40多聚腺苷酸化信號(hào)，產(chǎn)生4,672bp片段。將此片段插入VSVG/BP9的BglII位點(diǎn)，使得lacZ基因定位于VSV-G基因下游，以產(chǎn)生VGZ3轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(圖19)。在VGZ3中，VSV-G和lacZ基因的轉(zhuǎn)錄方向是會(huì)聚的。換言之，啟動(dòng)子位于所述插入序列的相對(duì)端，使得lacZ和VSV-G基因朝對(duì)方方向轉(zhuǎn)錄。SV40多聚A位點(diǎn)是雙向的，VSV-G和lacZ基因都使用該SV40多聚A位點(diǎn)。由于此轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中的VSV-G基因可操作地連接至桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子，因此所述質(zhì)粒提供了在昆蟲(chóng)細(xì)胞中高水平表達(dá)VSV-G基因和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中相對(duì)低水平表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。改變的外殼蛋白的表達(dá)型式是需要的，因?yàn)樵诶ハx(chóng)細(xì)胞中有效地產(chǎn)生所述改變的外殼蛋白，在此在將所述病毒傳遞給哺乳動(dòng)物細(xì)胞之前產(chǎn)生具有蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒。在使用所述病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞之前，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中產(chǎn)生所述病毒消除了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)病毒外殼蛋白(例如，VSV-G)的憂慮。在圖20中提供了具有改變的外殼蛋白的芽生病毒的圖解說(shuō)明。一旦所述病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，則不需要表達(dá)改變的外殼蛋白。因此，最好使用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中無(wú)活性的非哺乳動(dòng)物(例如，昆蟲(chóng))病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)改變的外殼蛋白表達(dá)。與之相反，將目的外源基因(例如，lacZ報(bào)道基因)可操作地連接至RSVLTR。正如所需要的，在昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中都可以得到由RSVLTR驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)。使用標(biāo)準(zhǔn)程序從上述pVGZ3轉(zhuǎn)移質(zhì)粒產(chǎn)生重組桿狀病毒VGZ3。簡(jiǎn)言之，按照制造商說(shuō)明書(shū)，通過(guò)用pVGZ3和已用Bsu36I消化的桿狀病毒基因組DNABacPAK6(Clontech；PaloAlto，CA)脂轉(zhuǎn)染，共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。噬斑純化所述病毒，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)擴(kuò)增。使用Sf9細(xì)胞上的常規(guī)噬斑測(cè)定，測(cè)定病毒滴度為3.1×107pfu/ml。在HepG2、Vero和HeLa細(xì)胞中的增強(qiáng)表達(dá)該實(shí)施例證明，相對(duì)于上述Z4病毒而言，具有改變的外殼蛋白的桿狀病毒VGZ3具有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的增強(qiáng)能力。為提供檢測(cè)中的敏感性，在Z4病毒以相對(duì)低水平表達(dá)外源基因的條件下進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。使用了三種不同細(xì)胞類(lèi)型，包括HepG2細(xì)胞、Vero細(xì)胞(腎細(xì)胞系)和HeLa細(xì)胞(宮頸癌細(xì)胞系)。在這些實(shí)驗(yàn)中，將每種細(xì)胞類(lèi)型的1×105細(xì)胞獨(dú)立地接種入12孔培養(yǎng)板的多個(gè)孔中。次日，用新鮮培養(yǎng)基更換該組織培養(yǎng)基，向細(xì)胞獨(dú)立地加入Z4和VGZ3病毒。以0、1.25、10和80的感染復(fù)數(shù)使用病毒(假設(shè)過(guò)夜后細(xì)胞數(shù)目加倍)，雙份進(jìn)行每個(gè)實(shí)驗(yàn)。加入病毒后次日，收獲細(xì)胞，通過(guò)X-gal染色或通過(guò)使用定量化學(xué)發(fā)光β-半乳糖苷酶測(cè)定(Clontech；PaloAlto，CA)，檢測(cè)外源lacZ基因的表達(dá)。將這些檢測(cè)的結(jié)果示于表8中。表8.使用具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒達(dá)到外源基因在HepG2和HeLa細(xì)胞中的增強(qiáng)表達(dá)a以每種細(xì)胞類(lèi)型的VGZ3轉(zhuǎn)導(dǎo)單位÷Z4轉(zhuǎn)導(dǎo)單位計(jì)算優(yōu)越性。b0.02是化學(xué)發(fā)光測(cè)定中的本底水平c在確定VGZ3優(yōu)越性時(shí)考慮moi的差異(VGZ3為1.25，Z4為80)。該實(shí)施例證明，相對(duì)于缺乏所述改變的外殼蛋白的桿狀病毒，被工程改造以表達(dá)VSV糖蛋白G的桿狀病毒具有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中增強(qiáng)表達(dá)外源基因的能力。在該實(shí)施例中，在100％的用moi為80的VGZ3接觸的HepG2細(xì)胞中，檢測(cè)到外源lacZ基因的表達(dá)。與之相反，在這些條件下，只有15％的用Z4病毒(不具有改變的外殼蛋白的病毒)接觸的細(xì)胞中檢測(cè)到外源基因的表達(dá)。因此，這些數(shù)據(jù)顯示，改變的外殼蛋白增強(qiáng)病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的能力。使用Vero細(xì)胞亦達(dá)到了所述外源基因的增強(qiáng)表達(dá)用X-gal染色時(shí)，超過(guò)50％的用VGZ3處理的細(xì)胞變?yōu)樗{(lán)色，而只有5-10％的用Z4處理的細(xì)胞變?yōu)樗{(lán)色。改變的外殼蛋白增強(qiáng)病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的能力的進(jìn)一步證據(jù)，來(lái)自使用HeLa細(xì)胞的相對(duì)敏感的測(cè)定。在該實(shí)施例使用的條件下，Z4病毒在HeLa細(xì)胞中未能有效地表達(dá)外源基因。在moi為80時(shí)未檢測(cè)到藍(lán)色細(xì)胞，表明基因表達(dá)的頻率低于1×105。與之相反，約3％的用VGZ3病毒處理的HeLa細(xì)胞是藍(lán)色，表明基因表達(dá)的效率是3×10-2，比用Z4得到的效率好12,000倍。使用VGZ3病毒時(shí)，在1.25的低moi時(shí)亦檢測(cè)到藍(lán)色HeLa細(xì)胞，而用Z4病毒時(shí)在同一moi時(shí)未檢測(cè)到藍(lán)色細(xì)胞?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，非哺乳動(dòng)物DNA病毒上改變的外殼蛋白可以增強(qiáng)所述病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)基因的能力。另外，使用改變的外殼蛋白使得以較低的moi感染細(xì)胞。因此某些看來(lái)耐受給定感染復(fù)數(shù)的病毒的細(xì)胞(例如，HeLa細(xì)胞)可以用具有改變的外殼蛋白的病毒感染，由此擴(kuò)展病毒的表觀宿主范圍。具有改變的外殼蛋白的病毒由此提供的優(yōu)點(diǎn)是，相對(duì)于缺乏改變的外殼蛋白的病毒需要的感染復(fù)數(shù)，允許在低感染復(fù)數(shù)下外源基因的表達(dá)。如以上對(duì)Z4病毒所述，用VGZ3病毒處理的細(xì)胞中外源基因的表達(dá)是所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的基因從頭表達(dá)的結(jié)果。抑制蛋白合成的環(huán)己酰亞胺和抑制抑制內(nèi)體酸化作用的氯喹都獨(dú)立地抑制VGZ3處理的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中β-半乳糖苷酶表達(dá)(未給出數(shù)據(jù))。因此，這些實(shí)驗(yàn)中在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中檢測(cè)到的β-半乳糖苷酶可以歸因于所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的蛋白從合成。PC12細(xì)胞中的增強(qiáng)表達(dá)在該實(shí)施例中，相對(duì)于用Z4病毒得到的水平而言，VGZ3病毒顯示提高大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞中外源基因表達(dá)的水平。使用常規(guī)方法，將PC12細(xì)胞以10,000細(xì)胞/孔植板于24孔平皿中。第一天，用亦含有50ng/ml神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基置換該細(xì)胞培養(yǎng)基(含有5％FBS和10％馬血清的DMEM)。在第3天和第5天，再次加入含有NGF的新鮮培養(yǎng)基。在第6天，用各種稀釋度的Z4病毒和VGZ3病毒感染所述細(xì)胞，如表9中所示。在第7天時(shí)，固定細(xì)胞，用抗β-半乳糖苷酶抗體(可從5’-＞3’Inc.得到)通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行β-半乳糖苷酶染色。在這些條件下，少于1％的用2×108pfuZ4感染的PC12細(xì)胞表達(dá)所述外源基因，約17.5％的用1×107pfuVGZ3感染的細(xì)胞表達(dá)所述外源基因。因此，這些數(shù)據(jù)提供了具有改變的外殼蛋白的病毒具有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的優(yōu)越能力的額外證據(jù)。在大鼠初級(jí)皮質(zhì)細(xì)胞中的增強(qiáng)表達(dá)該實(shí)施例證明，與缺乏改變的外殼蛋白的病毒相比，具有改變的外殼蛋白的病毒提供了在大鼠皮質(zhì)細(xì)胞初級(jí)培養(yǎng)物中外源基因的增強(qiáng)表達(dá)。對(duì)于該實(shí)施例，如上述“皮質(zhì)培養(yǎng)物中的表達(dá)”中制備和感染大鼠皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物。在表9中所示的moi下使用Z4和VGZ3病毒(注Z4的moi約比VGZ3的moi高10倍)。當(dāng)將得到的藍(lán)色細(xì)胞數(shù)目與使用的Z4或VGZ3的moi相比較時(shí)，VGZ3病毒明顯地比Z4病毒更有效地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所述外源基因。另外，該實(shí)施例證明，具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒可以指導(dǎo)大鼠初級(jí)神經(jīng)元中的外源基因表達(dá)(除以上所示細(xì)胞系PC12之外)。表9.使用具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒達(dá)到外源基因在大鼠皮質(zhì)細(xì)胞初級(jí)培養(yǎng)物中的增強(qiáng)表達(dá)a基于感染前1天植板的細(xì)胞數(shù)目估計(jì)moi。b由于在此孔發(fā)生細(xì)胞死亡，因此檢測(cè)到較少的染色細(xì)胞。不過(guò)，藍(lán)色細(xì)胞的百分比很高。HepG2、HuH7、HeLa、WISH、A549、VERO、CHO和Balb/c3T3細(xì)胞中的增強(qiáng)表達(dá)該實(shí)施例提供了進(jìn)一步的數(shù)據(jù)，表明改變的外殼蛋白增強(qiáng)非哺乳動(dòng)物DNA病毒指導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中外源基因表達(dá)的能力。在此，用VGZ3桿狀病毒感染各種細(xì)胞。首先描述在這些實(shí)驗(yàn)中使用的方法。細(xì)胞從ATCC得到人肝細(xì)胞癌系HepG2和HuH7、人子宮頸癌細(xì)胞株HeLa、人羊膜細(xì)胞系WISH、人肺癌A549、非洲綠猴腎細(xì)胞系VERO、倉(cāng)鼠上皮細(xì)胞系CHO和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系Balb/c3T3。所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞均在含有10％胎牛血清和4mM谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(GibcoBRL，GrandIsland，NY)中生長(zhǎng)，除了WISH細(xì)胞之外，WISH在含有Hank鹽、20％胎牛血清和4mM谷氨酰胺的MEM(GibcoBRL)中生長(zhǎng)。感染和報(bào)道基因的檢測(cè)以2×105細(xì)胞/孔在12孔板中接種細(xì)胞。在細(xì)胞粘附至塑料后，用培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)基。以標(biāo)明的感染復(fù)數(shù)(moi)向培養(yǎng)基中加入病毒，進(jìn)行病毒感染。于37℃在50％CO2中培養(yǎng)18-24小時(shí)后，用X-gal染色細(xì)胞，以顯示表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞，或者取出細(xì)胞裂解液，按照制造商說(shuō)明書(shū)，通過(guò)發(fā)光β-半乳糖苷酶檢測(cè)(Clontech目錄號(hào)#K2048-1)定量測(cè)定β-半乳糖苷酶活性。結(jié)果與用Z4病毒得到的基因表達(dá)水平相比較，使用VGZ3病毒增強(qiáng)外源基因表達(dá)。培養(yǎng)物中的感染細(xì)胞的X-gal染色表明，與用Z4病毒(未給出數(shù)據(jù))相比，用VGZ3感染后，表達(dá)所述外源基因的HepG2細(xì)胞百分比約高10倍。另外，VGZ3處理的細(xì)胞中藍(lán)色染色較深，提示VGZ3感染的細(xì)胞中基因表達(dá)水平較高。當(dāng)使用VGZ3病毒感染HeLa細(xì)胞時(shí)，亦檢測(cè)到增強(qiáng)的基因表達(dá)。當(dāng)moi為100時(shí)，Z4病毒每孔產(chǎn)生了很少的藍(lán)色細(xì)胞(約1-5個(gè)細(xì)胞)，而約10％的VGZ3細(xì)胞被X-gal染成藍(lán)色。在圖22中顯示了β-半乳糖苷酶表達(dá)的定量檢測(cè)的結(jié)果。在測(cè)試的每個(gè)moi下，用VGZ3處理的HepG2細(xì)胞中的β-半乳糖苷酶表達(dá)水平約比用Z4病毒得到水平高10倍。在HeLa細(xì)胞中，Z4病毒和VGZ3病毒之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的差異更加明顯。在moi為1或10時(shí)，用Z4病毒未檢測(cè)到超過(guò)本底水平的β-半乳糖苷酶活性。與之相反，使用moi為1的VGZ3處理的HeLa細(xì)胞中可以檢測(cè)到β-半乳糖苷酶活性。當(dāng)以moi為100使用Z4病毒時(shí)，檢測(cè)到剛剛超出本底水平的β-半乳糖苷酶活性。當(dāng)以moi為100使用VGZ3病毒時(shí)，在HeLa細(xì)胞中檢測(cè)到的β-半乳糖苷酶活性水平約比Z4處理的細(xì)胞中檢測(cè)到的水平高約350倍。使用一組8個(gè)不同細(xì)胞系比較moi為50時(shí)Z4和VG23病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在此低moi下，如表10中所示，在用Z4病毒處理的某些細(xì)胞系中未檢測(cè)到外源基因表達(dá)。與之相反，在moi為50時(shí)，VGZ3病毒導(dǎo)致在所有的細(xì)胞系中可檢測(cè)水平的外源基因表達(dá)?？傊?，這些數(shù)據(jù)提供了改變的外殼蛋白增強(qiáng)非哺乳動(dòng)物DNA病毒的外源基因表達(dá)的進(jìn)一步證據(jù)。表10.Z4和VGZ3處理的細(xì)胞中的β-半乳糖苷酶活性β-半乳糖苷酶活性aa對(duì)于每個(gè)細(xì)胞系，測(cè)定未感染細(xì)胞中的β-半乳糖苷酶活性，從Z4處理的和VGZ3處理的細(xì)胞中的β-半乳糖苷酶活性的原始值中減去此值。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三個(gè)樣本的平均值。b在moi為50下進(jìn)行所有的Z4和VGZ3處理。其它實(shí)施方案可以將除了以上描述的苜蓿銀紋夜蛾病毒之外的非哺乳動(dòng)物病毒用于本發(fā)明；這類(lèi)病毒列于表1。最好使用核型多角體病毒，例如多核殼病毒(MNPV)或單核殼病毒(SNPV)。特別是可以使用云杉卷葉蛾MNPV、甘藍(lán)夜蛾MNPV、油桐尺蠖核型多角體病毒、花旗松毒蛾MNPV、家蠶SNPV、美洲棉鈴蟲(chóng)SNPV和甘蘭尺蠖SNPV。諸如以下病毒的顆粒癥病毒(GV)亦屬于可以用于本發(fā)明的那些病毒CryptophlebialeucotretaGV、印度谷螟GV、甘蘭尺蠖GV、甘蘭菜粉蝶GV、菜粉蝶GV和蘋(píng)蠹蛾顆粒癥病毒(CpGV)。亦可以使用非包含體桿狀病毒(NOB)，例如美洲棉鈴蟲(chóng)NOB和榔二龐獨(dú)角仙病毒。其它昆蟲(chóng)(例如，鱗翅目)和甲殼動(dòng)物病毒亦可以用于本發(fā)明。有用的病毒的其它實(shí)例包括感染真菌(例如，Strongwellseamagna)和蜘蛛的那些病毒。已從螨、甲殼綱(例如，Carcinusmaenus，藍(lán)蟹，對(duì)蝦的黃頭桿狀病毒，和Penaeusmonodon-類(lèi)型桿狀病毒)和鞘翅目分離出與桿狀病毒類(lèi)似的病毒。舞毒蛾桿狀病毒亦可以用于本發(fā)明。如果需要，可以工程改造所述病毒，以促進(jìn)所述病毒導(dǎo)向某些細(xì)胞類(lèi)型。例如，可以在病毒體的表面表達(dá)與除了ASGP-R之外的細(xì)胞表面受體結(jié)合的配體?；蛘撸梢曰瘜W(xué)修飾所述病毒，以將所述病毒導(dǎo)向特定受體。如果需要，可以首先刺激欲感染的細(xì)胞，使之有絲分裂活躍。在培養(yǎng)中，可以使用諸如氯仿的藥劑達(dá)到這種效果；在體內(nèi)，例如通過(guò)部分肝切除可以誘導(dǎo)刺激肝細(xì)胞分裂(參見(jiàn)，例如，Wilson，等，1992，.J.Biol.Chem.26711283-11489)?？蛇x地，可以工程改造病毒基因組，使之?dāng)y帶單純皰疹病毒胸苷激酶基因；這將使得包含所述病毒基因組的細(xì)胞被丙氧鳥(niǎo)苷殺傷。如果需要，可以工程改造病毒，使得其在其天然非哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞(例如，昆蟲(chóng)細(xì)胞)上生長(zhǎng)方面有缺陷。這種病毒株可以提供額外的安全，可以在互補(bǔ)包裝系上繁殖。例如，可以制備缺陷型桿狀病毒，其中缺失諸如IE1的立即早期基因。通過(guò)酵母或大腸桿菌中的定向重組，可以產(chǎn)生這種缺失，可以在其中以反式提供IE1基因產(chǎn)物的昆蟲(chóng)細(xì)胞中復(fù)制所述缺陷型病毒。如果需要，可以用神經(jīng)氨酸酶處理所述病毒，以在感染前顯露額外的末端半乳糖殘基(參見(jiàn)，例如，Morell等，1971，J.Biol.Chem.2461461-1467)。權(quán)利要求1.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的方法，所述方法包括a)將非哺乳動(dòng)物DNA病毒導(dǎo)入所述細(xì)胞，其中所述病毒具有改變的外殼蛋白，所述病毒的基因組包含在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)所述外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子控制下的外源基因；和b)在使得所述外源基因表達(dá)的條件下保持所述細(xì)胞。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述無(wú)脊椎動(dòng)物病毒是昆蟲(chóng)病毒。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述昆蟲(chóng)病毒是桿狀病毒。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述桿狀病毒是苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒。5.在哺乳動(dòng)物中治療疾病的方法，包括a)將治療有效量的非哺乳動(dòng)物DNA病毒導(dǎo)入細(xì)胞，產(chǎn)生受感染細(xì)胞，其中所述病毒具有改變的外殼蛋白，并且所述病毒的基因組包含外源基因；和b)在使得所述外源基因在所述哺乳動(dòng)物中表達(dá)的條件下保持所述受感染細(xì)胞。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述改變的外殼蛋白包含哺乳動(dòng)物病毒的外殼蛋白。7.權(quán)利要求5的方法，其中所述改變的外殼蛋白是融合蛋白。8.權(quán)利要求5的方法，其中所述病毒是昆蟲(chóng)病毒。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述昆蟲(chóng)病毒是桿狀病毒。10.在哺乳動(dòng)物中治療癌癥的方法，所述方法包括a)將具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒導(dǎo)入所述哺乳動(dòng)物的癌性細(xì)胞，產(chǎn)生受感染細(xì)胞，其中所述病毒的基因組包含編碼選自腫瘤壞死因子、p53、胸苷激酶、白喉毒素嵌合體和胞苷脫氨酶的蛋白質(zhì)的癌癥治療基因；和b)在使得所述癌癥治療基因表達(dá)的條件下在所述哺乳動(dòng)物中保持所述受感染細(xì)胞。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述改變的外殼蛋白包含哺乳動(dòng)物病毒的外殼蛋白。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述改變的外殼蛋白包含融合蛋白。13.權(quán)利要求10的方法，其中所述癌性細(xì)胞選自肝細(xì)胞、胰臟細(xì)胞、肺細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、前列腺組織細(xì)胞、乳腺組織細(xì)胞、大腦細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、脾細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、腎細(xì)胞和膀胱細(xì)胞。14.權(quán)利要求10的方法，其中所述非哺乳動(dòng)物DNA病毒是昆蟲(chóng)病毒。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述昆蟲(chóng)病毒是桿狀病毒。16.在哺乳動(dòng)物中治療神經(jīng)疾病的方法，所述方法包括a)將治療有效量的具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒導(dǎo)入細(xì)胞，產(chǎn)生受感染的細(xì)胞，其中所述病毒的基因組包含編碼選自神經(jīng)生長(zhǎng)因子、次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸羥化酶、多巴脫羧酶、大腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的治療蛋白質(zhì)的外源基因；和b)在使得所述外源基因在所述哺乳動(dòng)物中表達(dá)的條件下保持所述受感染細(xì)胞。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述病毒是昆蟲(chóng)病毒。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述昆蟲(chóng)病毒是桿狀病毒。19.權(quán)利要求16的方法，其中所述改變的外殼蛋白包含哺乳動(dòng)物病毒的外殼蛋白。20.權(quán)利要求16的方法，其中所述改變的外殼蛋白包含融合蛋白。21.包含以下的核酸非哺乳動(dòng)物DNA病毒的基因組；一個(gè)外源哺乳動(dòng)物基因；與所述外源哺乳動(dòng)物基因可操作地連接的一個(gè)外源哺乳動(dòng)物活性啟動(dòng)子；和一個(gè)編碼改變的外殼蛋白的基因。22.權(quán)利要求21的核酸，其中所述編碼改變的外殼蛋白的基因編碼哺乳動(dòng)物病毒的外殼蛋白。23.權(quán)利要求21的核酸，其中編碼所述改變的外殼蛋白的基因編碼融合蛋白。24.權(quán)利要求21的核酸，其中所述病毒是昆蟲(chóng)病毒。25.權(quán)利要求21的核酸，其中所述昆蟲(chóng)病毒是桿狀病毒。26.包含以下的核酸非哺乳動(dòng)物DNA病毒的基因組；一個(gè)編碼改變的外殼蛋白的基因；一個(gè)外源反義RNA基因，從所述外源反義RNA基因轉(zhuǎn)錄的RNA與在細(xì)胞中以不合需要的高水平表達(dá)的基因的核酸互補(bǔ)；和一個(gè)外源哺乳動(dòng)物-活躍啟動(dòng)子，其中所述外源反義RNA基因可操作地連接至所述啟動(dòng)子。27.權(quán)利要求26的核酸，其中所述編碼改變的外殼蛋白的基因編碼哺乳動(dòng)物病毒的外殼蛋白。28.權(quán)利要求26的核酸，其中編碼所述改變的外殼蛋白的基因編碼融合蛋白。29.權(quán)利要求26的核酸，其中所述病毒是昆蟲(chóng)病毒。30.權(quán)利要求29的核酸，其中所述昆蟲(chóng)病毒是桿狀病毒。31.含有核酸的細(xì)胞，其中所述核酸包含非哺乳動(dòng)物DNA病毒的基因組；一個(gè)編碼改變的外殼蛋白的基因；和與外源哺乳動(dòng)物活性啟動(dòng)子可操作地連接的一個(gè)外源哺乳動(dòng)物基因。32.權(quán)利要求31的細(xì)胞，其中所述編碼改變的外殼蛋白的基因編碼哺乳動(dòng)物病毒的外殼蛋白。33.權(quán)利要求31的細(xì)胞，其中編碼所述改變的外殼蛋白的基因編碼融合蛋白。34.權(quán)利要求31的細(xì)胞，其中所述病毒是昆蟲(chóng)病毒。35.權(quán)利要求34的細(xì)胞，其中所述昆蟲(chóng)病毒是桿狀病毒。36.包含以下的核酸非哺乳動(dòng)物DNA病毒的基因組；一個(gè)編碼改變的外殼蛋白的基因；選自腫瘤壞死因子基因、胸苷激酶基因、嵌合白喉毒素基因和胞苷脫氨酶(diaminase)基因的一個(gè)外源癌癥治療基因；和一個(gè)外源哺乳動(dòng)物活性啟動(dòng)子，其中所述外源癌癥治療基因可操作地連接至所述啟動(dòng)子。37.權(quán)利要求36的核酸，其中所述編碼改變的外殼蛋白的基因編碼哺乳動(dòng)物病毒的外殼蛋白。38.權(quán)利要求36的核酸，其中編碼所述改變的外殼蛋白的基因編碼融合蛋白。39.權(quán)利要求36的核酸，其中所述病毒是昆蟲(chóng)病毒。40.權(quán)利要求39的核酸，其中所述昆蟲(chóng)病毒是桿狀病毒。41.包含以下的核酸非哺乳動(dòng)物DNA病毒的基因組；一個(gè)編碼改變的外殼蛋白的基因；選自RNA引誘物基因和核酶基因的一個(gè)外源基因；和與所述外源基因可操作地連接的一個(gè)外源哺乳動(dòng)物活性啟動(dòng)子。42.權(quán)利要求41的核酸，其中所述編碼改變的外殼蛋白的基因編碼哺乳動(dòng)物病毒的外殼蛋白。43.權(quán)利要求41的核酸，其中編碼所述改變的外殼蛋白的基因編碼融合蛋白。44.權(quán)利要求41的核酸，其中所述病毒是昆蟲(chóng)病毒。45.權(quán)利要求44的核酸，其中所述昆蟲(chóng)病毒是桿狀病毒。46.包含以下的藥用組合物(A)藥學(xué)上可接受的賦形劑和(B)非哺乳動(dòng)物DNA病毒，其中所述病毒的基因組包含一個(gè)外源哺乳動(dòng)物基因；與所述外源哺乳動(dòng)物基因可操作地連接的一個(gè)外源哺乳動(dòng)物活性啟動(dòng)子；和一個(gè)編碼改變的外殼蛋白的基因。47.權(quán)利要求46的藥用組合物，其中所述病毒是昆蟲(chóng)病毒。48.權(quán)利要求47的藥用組合物，其中所述昆蟲(chóng)病毒是桿狀病毒。49.權(quán)利要求46的藥用組合物，其中所述改變的外殼蛋白包含哺乳動(dòng)物病毒的外殼蛋白。50.權(quán)利要求46的藥用組合物，其中編碼所述改變的外殼蛋白的基因編碼融合蛋白。51.在其表面具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒，其中所述病毒的基因組包含一個(gè)外源哺乳動(dòng)物基因和與所述外源哺乳動(dòng)物基因可操作地連接的一個(gè)外源哺乳動(dòng)物活性啟動(dòng)子。52.權(quán)利要求51的非哺乳動(dòng)物DNA病毒，其中所述病毒的基因組還包含編碼改變的外殼蛋白的基因。全文摘要公開(kāi)的是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的方法、核酸和細(xì)胞,包括將具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒(例如,桿狀病毒)導(dǎo)入所述細(xì)胞,該病毒的基因組攜帶外源基因;并且在使得該基因表達(dá)的條件下生長(zhǎng)所述細(xì)胞。亦公開(kāi)了治療哺乳動(dòng)物中基因缺陷疾病、神經(jīng)疾病或癌癥的方法,該方法為(1)向細(xì)胞提供治療有效量的具有改變的外殼蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒,該病毒的基因組攜帶外源的治療基因和(2)在使得該外源基因在所述哺乳動(dòng)物中表達(dá)的條件下生長(zhǎng)所述細(xì)胞。文檔編號(hào)C12N15/86GK1241216SQ97199427公開(kāi)日2000年1月12日申請(qǐng)日期1997年9月11日優(yōu)先權(quán)日1997年9月11日發(fā)明者F·博伊斯,J·G·巴索姆申請(qǐng)人:綜合醫(yī)院公司,生物遺傳學(xué)公司