專利名稱：來自谷氨酸棒桿菌的丙酮酸羧化酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明中的政府權(quán)利聲明本發(fā)明研發(fā)過程的部分工作使用了美國政府基金。美國政府對本發(fā)明具有部分權(quán)利。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及到一種谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)丙酮酸羧化酶蛋白和編碼這種蛋白質(zhì)的多核苷酸。
背景技術(shù)：
丙酮酸羧化酶是一種重要的添補酶，它在生長，或者工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)脯氨酸或者谷氨酸的過程中，補充因生物合成所消耗掉的草酰乙酸。
丙酮酸羧化酶所催化的兩步反應(yīng)的機制如下(2)在反應(yīng)(1)中，依賴于ATP的生物素羧化酶結(jié)構(gòu)域羧化生物素輔基，該生物素輔基連接在生物素-羧基-載體蛋白(BCCP)結(jié)構(gòu)域的一個特定的賴氨酸殘基上。乙酰基-輔酶A通過提高依賴于碳酸氫鹽的ATP裂解的速率來激活反應(yīng)(1)。在反應(yīng)(2)中，BCCP結(jié)構(gòu)域在被轉(zhuǎn)羧基酶結(jié)構(gòu)域催化的反應(yīng)中，提供CO2給丙酮酸(Actwood，P.，V.，Int..J.Biochem.Cell.Biol.27231-249(1995))。
丙酮羧化酶基因已經(jīng)被從下列中克隆和測序Rhizobium etli(Dunn，M..F.等，J.Bateriol，1785960-5970(1996))，嗜熱脂肪桿菌(Bacillus Stearothermophilus)(Kondo，H.，等，Gene19147-50(1997)，枯草桿菌(Genbank登記號Z97025)，結(jié)核分枝桿菌(Mycobaterium tuberculosis)(Genbank登記號Z83018)，和嗜熱堿甲烷桿菌(Methanbacterium thermoautrophicum)(Mukhopadhyay，B，J.Biol.Chem.2735155-5166(1998))。以前在乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)(Tasaka，0，等，Agric.Biol.Chem.431513-1519(1979))和谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中測定了丙酮酸羧化酶活性(Peters-Wendisch，P.G.，等，Microbiology1431095-1103(1997))。
先前的研究顯示，天冬氨酸家族氨基酸的生產(chǎn)力和產(chǎn)量決定性地依賴于通過添補途徑的碳流(Vallino，J.J，和Stephanopoulos，G.Biotechnol.Bioeng.41633-646(1993))?；诖x平衡，可以顯示出賴氨酸產(chǎn)生的速率，小于或者等于通過添補途徑草酰乙酸合成的速率。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，該核酸分子含有編碼一種丙酮酸羧化酶多肽的多核苷酸，該多肽有如

圖1所示(SEQ ID NO2)的氨基酸序列，或者ATCC保藏號_的細(xì)菌宿主保藏的粘粒所編碼的氨基酸序列。通過測序保藏的丙酮酸羧化酶粘?？寺〈_定的核苷酸序列，如圖1(SEQ ID NO1)所示，含有編碼一個1140個氨基酸殘基的多肽的可讀框，該多肽的推定的分子量為大約1234kDa。預(yù)測的丙酮酸羧化酶蛋白質(zhì)的1140個氨基酸的序列如圖1和(SEQ ID NO2)所示。
因此，本發(fā)明的一方面提供了分離的核酸分子，該核酸分子包括一種多核苷酸，具有選自如下的核苷酸序列(a)一種編碼丙酮酸羧化酶多肽的核苷酸序列，該丙酮酸羧化酶多肽具有SEQ ID NO2中的完整的氨基酸序列；(b)一種編碼丙酮酸羧化酶多肽的核苷酸序列，該丙酮酸羧化酶多肽具有ATCC保藏號_中的粘?？寺∷幋a的完整的氨基酸序列；以及(c)與上述的(a)或者(b)中的核苷酸序列任何一種互補的核苷酸序列。
本發(fā)明更進(jìn)一步的實施方案包括分離的核酸分子，這些分子包含的多核苷酸與上述(a)、(b)或者(c)中的任意多核苷酸序列具有至少90％，和更優(yōu)選至少95％、97％、98％或者99％的同一性，或者這些分子包含一種多核苷酸，它們在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能夠和具有的核苷酸序列與上述的(a)、(b)或者(c)中的核苷酸序列具有同一性的多核苷酸雜交。這些雜交的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)雜件交條件下不與具有僅由A殘基或僅由T殘基組成的核苷酸序列的多核苷酸雜交。
發(fā)明還涉及到含有本發(fā)明分離的核酸分子的重組載體，含有這些重組載體的宿主細(xì)胞，以及通過重組技術(shù)制備這些載體和宿主細(xì)胞的方法和使用它們生產(chǎn)丙酮酸羧化酶多肽或者肽的方法。
本發(fā)明還提供分離的丙酮酸羧化酶多肽，該丙酮酸羧化酶多肽具有的氨基酸序列選自(a)具有圖1所示(SEQ ID NO2)氨基酸序列的丙酮酸羧化酶多肽的氨基酸序列；以及(b)具有完整的，由ATCC保藏號_中包含的粘粒克隆所編碼的氨基酸序列的丙酮酸羧化酶多肽的氨基酸序列。本發(fā)明的多肽還包括所具有的氨基酸序列與上面所述(a)或者(b)中的氨基酸序列有至少90％相似性的，更優(yōu)選95％相似性的多肽，以及所具有的氨基酸序列與上面所述的有至少70％同一性，更優(yōu)選90％同一性，更優(yōu)選95％，97％、98％和99％同一性的多肽。
附圖的簡要說明圖1顯示了通過測序包含在ATCC保藏號_中的DNA克隆所確定的完整的丙酮酸羧化酶蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO1)和推定的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。蛋白質(zhì)序列具有大約1140個氨基酸殘基，推定的分子量為大約123.6kDa。
發(fā)明的詳述本發(fā)明提供了分離的核酸分子，包括通過對克隆的粘粒進(jìn)行測序得到的編碼具有如圖1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列的丙酮酸羧化酶蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的丙酮酸羧化酶蛋白與結(jié)核分枝桿菌(Mycobaterium tuberculosis)的和人的丙酮酸羧化酶蛋白共享序列同源性。通過對編碼一種丙酮酸羧化酶多肽的粘粒III F10進(jìn)行測序所獲得的核苷酸序列如圖1(SEQ ID NO1)所示，該粘粒保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801University Blvd，Manassas，VA20110-2200，所給予的登記號為_。
核酸分子除非另外說明，本文所有的核苷酸序列都是使用自動DNA測序儀(例如ABI Prism377)進(jìn)行DNA分子測序而得到的，本文所有由測定的DNA分子所編碼多肽的氨基酸序列都是由上面測定的DNA序列翻譯預(yù)測而得的。因此，如本領(lǐng)域中所知的，通過這種自動設(shè)備測定的任何DNA序列，本文測定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯誤。自動測序獲得的核苷酸序列和要測序的DNA分子的真實序列典型地有至少大約90％，更典型地有至少大約95％至至少大約99.9％的同一性。真實的核苷酸序列可以通過其它方法，包括本領(lǐng)域中眾所周知的人工DNA測序法更精確地測定。如本領(lǐng)域中所知的，較之于實際序列，在測定的核苷酸序列中單個的插入或者缺失，會導(dǎo)致核苷酸序列翻譯時移碼，從而使預(yù)測的由測定的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，從這個插入或者缺失位點開始會完全不同于測序的DNA分子真正編碼的氨基酸序列。
除非另外說明，本文所提到的“核苷酸序列”代表一個脫氧核糖核苷酸(縮寫為A、G、C、和T)的序列。然而，核酸分子或者多核苷酸的“核苷酸序列”指，DNA分子或多核苷酸，脫氧核糖核苷酸的序列，以及RNA分子，或者多核苷酸，其中特定的脫氧核苷酸序列中的每個胸腺嘧啶脫氧核苷酸(T)都被尿嘧啶核糖核苷酸(U)所替代的對應(yīng)的核糖核苷酸(A、G、C和U)的序列。例如，參照具有使用脫氧核糖核苷酸縮寫表示出的SEQ ID NO1序列的RNA分子，指的是一種RNA分子，在它的序列中SEQ ID NO1的每個脫氧核苷酸A、G或C被相應(yīng)的核糖核苷酸A、G或C替代，而每個脫氧核苷酸T被核糖核苷酸U替代。
使用本文所提供的資料，例如圖1中的核苷酸序列，通過應(yīng)用常規(guī)的克隆和篩選方法，例如使用mRNA作為起始材料克隆DNA的方法，可以獲得本發(fā)明的編碼丙酮酸羧化酶多肽的核酸分子。圖1所示的丙酮酸羧化酶蛋白(SEQ ID NO2)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobateriumtuberculosis)具有63％的同一性，和人具有44％的同一性。根據(jù)如上討論的可能的測序錯誤，以及不同的已知蛋白中前導(dǎo)序列裂解位點的變化，普通技術(shù)人員會理解保藏的粘粒編碼的真實的丙酮酸羧化酶多肽包含大約1140個氨基酸，但是可以是1133-1147個氨基酸的范圍內(nèi)的任意值。
如上所示的，本發(fā)明的核酸分子可以是以RNA的形式，例如mRNA，或者以DNA的形式，包括例如通過克隆或者合成得到的cDNA和基因組DNA。DNA可以是雙鏈的或者單鏈的。單鏈DNA或者RNA可以是編碼鏈，也被稱為正義鏈，或者也可以是非編碼鏈，也被稱為反義鏈。
術(shù)語“分離”的核酸分子，指的是一種核酸分子，DNA或者RNA，被從它的天然環(huán)境中分離出來。例如，為本發(fā)明的目的分離的包含在載體中的重組DNA分子。分離的DNA分子的更多的例子包括維持在異源宿生組胞中的重組DNA分子，和在溶液中的部分或基本純化的DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明的DNA分子在體內(nèi)或者體外的RNA轉(zhuǎn)錄體。本發(fā)明的分離的核酸分子還包括通過合成產(chǎn)生的這些分子。
本發(fā)明中分離的核酸分子包括DNA分子，它們含有從圖1所示核苷酸序列(SEQ ID1)的199-201位作為起始密碼的可讀框；DNA分子，它們含有圖1(SEQ ID NO2)所示的丙酮酶酸羧化酶蛋白的編碼序列；以及DNA分子，它們含有的序列基本上不同于上面所提到的那些，可是根據(jù)遺傳密碼的簡并性，他們同樣編碼丙酮酸羧化酶蛋白。當(dāng)然，遺傳密碼是為本領(lǐng)域眾所周知的。因此，產(chǎn)生上述的簡并變異體對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是常規(guī)技術(shù)。
另一方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，該核酸分子所編碼的丙酮酸羧化酶多肽具有保藏在ATCC登記號_中的粘?？寺∷幋a的氨基酸序列。優(yōu)選地，該核酸分子編碼上述保藏的克隆所編碼的多肽。本發(fā)明還提供了分離的核酸分子，該核酸分子具有如1(SEQ ID NO1)所示的核酸序列，或者具有上述保藏克隆含有的丙酮酸羧化酶DNA的核苷酸序列，或者該核酸分子具有的序列與上述序列的任何一種互補。
另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，包括能夠在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與上述本發(fā)明的核酸分子的一部分多核苷酸，例如保藏在ATCC登記號_中的粘?？寺〉囊徊糠侄嗪塑账徇M(jìn)行雜交的多核苷酸?！皣?yán)謹(jǐn)雜交條件”指的是42℃，在溶液中溫育過夜，溶液中含有50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM的檸檬酸三鈉)，50mM的磷酸鈉(PH7.6)，5×的Denhardt溶液，10％的硫酸葡聚糖，和20mg/ml的變性的，切碎的鮭魚精DNA；然后用0.1×SSC在大約65℃清洗濾膜?？膳c一種多核苷酸的“一部分”雜交的多核苷酸，指的是一種多核苷酸(DNA或者RNA)能夠和參照多核苷酸的至少大約15個核苷酸(nt)雜交，更優(yōu)選至少大約20個nt，更優(yōu)選至少大約30個nt，以及更優(yōu)選至少大約30-70nt。這些可用作診斷探針和引物。
當(dāng)然，依照本發(fā)明，可與參照多核苷酸(如保藏的粘?？寺?的較大部分，例如長度為50-750nt的一段，甚至可與參照多核苷酸的全長雜交的多核苷酸，也可以用作探針，同樣，對應(yīng)于保藏的DNA或者圖1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO1)的大部分，如果不是全部的話，的多核苷酸也可以。例如，“至少長度為20nt”的一部分多核苷酸，指的是一段來自參照多核苷酸核苷酸序列(例如保藏的DNA，或者如圖1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列)的20個或者更多的鄰接的核苷酸。如上所述，根據(jù)傳統(tǒng)的DNA雜交技術(shù)，這些部分可在診斷上用作探針，或者作為引物用于通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)擴增靶序列，參見如Sambrook，J.，F(xiàn)ricsch，E.F和Maniatis，T.，(1989)編《分子克隆實驗手冊》第二版，冷泉港出版社，其完整的公開內(nèi)容在本文引入作為參考。
既然已經(jīng)保藏了丙酮酸羧化酶粘?？寺?，它的已經(jīng)測定的核苷酸序列顯示在圖1(SEQ ID NO1)，那么產(chǎn)生與丙酮酸羧化酶DNA分子的一部分進(jìn)行雜交的多核苷酸，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說就屬于常規(guī)技術(shù)了。例如，通過限制內(nèi)切酸裂解或者超聲波切碎丙酮酸羧化酶粘?？寺?，就可以很容易得到不同大小的DNA部分，其是可以與丙酮酸羧化酶DNA分子的部分進(jìn)行雜交的多核苷酸?？梢怨┻x擇地，本發(fā)明的雜交的多核苷酸，可以根據(jù)已知技術(shù)通過合成的方法獲得。
如上面所述的，編碼丙酮酸羧化酶蛋白的多肽的本發(fā)明的核酸分子，可以包括，但是不限于編碼該多肽氨基酸序列的那些自身；該多肽和附加序列的編碼序列，例如，前-，原-或者前原-蛋白序列；帶有或不帶有上述附加編碼序列的多肽的編碼序列，其帶有附加的非編碼序列，包括例如，但不限于內(nèi)含子和非編碼5’和3’序列，例如在轉(zhuǎn)錄，mRNA加工中起重要作用的轉(zhuǎn)錄的，非翻譯的序列，mRNA加工包括剪接和聚腺苷酸化信號，例如-核糖體接合和mRNA的穩(wěn)定性；附加編碼序列，其編碼附加氨基酸，例如這些提供附加官能度的氨基酸。因此，編碼多肽的序列可被融合于一個標(biāo)記序列，例如編碼便于純化融合蛋白的多肽的序列。在本發(fā)明的一個特定的實施方案中，標(biāo)記的氨基酸序列為六-組氨酸肽，例如pQE(Qiangen，Inc)載體中提供的標(biāo)記物，其它的一些有很多是商業(yè)上可獲得的。如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA86821-824(1989)所敘述的，例如，六-組氨酸提供了這種融合蛋白方便的純化方法?！癏A”標(biāo)記是另一種用于純化的肽，它與來自流感病毒血凝素蛋白的一種抗原決定簇對應(yīng)，已被Wilson等，CELL，37767(1984)所述。
本發(fā)明還涉及到本發(fā)明的核酸分子的變異體，它們編碼丙酮酸羧化酶蛋白的部分，類似物或者衍生物。變異體可以是天然存在的，例如天然的等位變異體。等位變異體指的是占據(jù)一種生物體中染色體給定位點的基因的幾種替代形式中的一種。GenesII，Lewin，編。非天然存在的變異體可以通過方法上已知的誘變技術(shù)獲得。
這些變異體包括由核苷酸替換，缺失或者添加所得到的那些。這些替換，缺失或者添加可以涉及一個或者更多個核苷酸。變異體可以是在編碼區(qū)或者非編碼區(qū)，或者二者同時改變。編碼區(qū)的變化可以產(chǎn)生保守的或者非保守的氨基酸替換，缺失或者添加。其中特別優(yōu)選的是沉默替換，缺乏或者添加，其不會改變丙酮酸羧化酶蛋白或者它的部分的特征和活性。這方面同樣特別優(yōu)選的是保守替換。最優(yōu)選的是編碼具有如圖1所示的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的丙酮酸羧化酶蛋白的核酸分子。
此外，優(yōu)選是丙酮酸羧化酶的優(yōu)選表達(dá)比谷氨酸棒桿菌中高2到20倍的突變體或者變異體，以及反饋抑制突變體。
本發(fā)明更進(jìn)一步的實施方案包括分離的核酸分子，包括一種多核苷酸，其具有與下面的序列有至少90％的同一性，更優(yōu)選有至少95％，97％，98％或者99％的同一性的核苷酸序列(a)一種核苷酸序列，它所編碼的丙酮酸羧化酶多肽具有完整的SEQ ID NO2的氨基酸序列；(b)一種核苷酸序列，它所編碼的丙酮酸羧化酶多肽具有包含于ATCC保藏號_中的粘?？寺【幋a的完整的氨基酸序列；或者(c)與上面的(a)或者(b)中的核苷酸任何一種互補的核苷酸序列。
一種具有與編碼丙酮酸羧化酶多肽的參照核苷酸序列有至少例如95％的“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸指的是，除了該多核苷酸序列每100個編碼丙酮酸羧化酶多肽的參照核苷酸序列的核苷酸中有最多為5個的點突變外，該多核苷酸序列的核苷酸序列與參照序列是一致的。換句話說，為得到具有與參照核苷酸序列有至少95％核苷酸序列同一性的多核苷酸，參照序列中的高至5％的核苷酸可以刪除或者用另外的核苷酸替換，或者至多占參照序列總核苷酸5％的數(shù)目的核酸可以插入到參照序列中。這些參照序列的突變可以發(fā)生在參照核苷酸序列的5’或者3’端的位置，或者散布在這些末端位置之間的任意位置，或者單個地存在于參照序列的核苷酸間，或者以一個或更多個鄰接的組群存在于參照序列中。
特別地，可以使用已知的計算機程序，例如Bestfit程序(Wisconsin序列分析軟件包，UUNIX用8版，遺傳學(xué)計算機小組，University Research Park，575Science Drive，Madison WI53711)，方便地測定是否特定的核酸分子與圖1所示的核苷酸序列或者保藏的粘?？寺〉暮塑账嵝蛄杏欣缰辽?0％，95％，97％，98％或者99％的同一性。Bestfit程序使用Smith和Waternan運算法(Advaces inApplied Mathematics2482 489(1981))來尋找兩個序列之間的最合適的同源性片段。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)使用Bestfit或者任何其它的序列比較程序來確定是否特定的序列與本發(fā)明的參照序列有例如95％的同一性時，當(dāng)然，參數(shù)的設(shè)置使得同一性的百分比是相對于全長參照序列來計算的且與參照序列核苷酸總數(shù)至多5％的同源性缺口是允許的。
本申請指定的核酸分子與圖1所示的核酸序列(SEQ ID NO1)或者保藏的DNA的核酸序列有至少90％，95％，97％、98％或者99％的同一性，而不論它們是否編碼具有丙酮酸羧化酶活性的多肽。這是因為甚至當(dāng)特定的核酸分子不編碼具有丙酮酸羧化酶活性的多肽時，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員仍然知道如何利用這些核酸分子，例如，用作雜交探針，或者聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物。
然而，優(yōu)選的是，核酸分子與圖1所示的核酸序列(SEQ ID NO1)或者保藏的DNA的核酸序列有至少90％、95％、97％、98％或者99％的同一性，它們實際上的確編碼具有丙酮酸羧化酶蛋白活性的多肽?！熬哂斜狒然富钚缘亩嚯摹敝傅氖嵌嚯木哂械幕钚裕ㄟ^特定的生物學(xué)方法測定，與本發(fā)明的丙酮酸羧化酶蛋白相似，但是不是必須一致的。
當(dāng)然，根據(jù)遺傳密碼的簡并性，本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員可以立即識別與保藏的DNA的核酸序列或者圖1所示的核酸序列(SEQ ID NO1)具有至少90％、95％、97％、98％或者99％同一性的大量核酸分子會編碼具有丙酮酸羧化酶蛋白活性多肽。實際上，既然這些核酸序列簡并變異體都編碼相同的多肽，甚至不用上述的比較方法，技術(shù)人員也可以明白這一點。本領(lǐng)域中還進(jìn)一步認(rèn)識到甚至于對那些不是簡并變異體的核酸分子來說，合適量的這種分子也可以編碼具有丙酮酸羧化酶蛋白活性的多肽。這是因為技術(shù)人員充分認(rèn)識到很少會或者不會顯著影響蛋白質(zhì)的功能的氨基酸替代(例如，第二種脂族氨基酸替換一種脂族氨基酸)。
例如，Bowie.J.U，等“Deciphering the Message in ProteinSequencesTolerance to Amino Acid Substtutions，”Science，2471306-1310(1990)，一文中給出了如何產(chǎn)生表型沉默氨基酸替換的指導(dǎo)，其中作者指出了兩種主要的研究氨基酸序列改變的耐性的方法。第一種方法依賴于進(jìn)化過程，其中的突變被自然選擇所接受或者拋棄。第二種方法使用遺傳工程將氨基酸變化導(dǎo)入克隆基因的特定位點上，并通過選擇和篩選來鑒定保持功能的序列。如作者所述，這些研究顯示出蛋白質(zhì)對于氨基酸替換有驚人的忍耐性。作者還指出在一定位點的氨基酸變化是更有可能被接受的。例如，大多數(shù)埋入的氨基酸殘基要求非極性側(cè)鏈，而表面?zhèn)孺溚ǔＶ挥泻苌偬卣魇潜Ｊ氐?。Bowie.J.U，等在上文中敘述了其它的這種表型沉默替換，上面列出了參考文獻(xiàn)。
載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及到載體，其包括本發(fā)明的分離的DNA分子，用重組載體進(jìn)行了遺傳改造的宿主細(xì)胞，以及通過重組技術(shù)生產(chǎn)丙酮酸羧化酶多肽或其部分。
可以使用眾所周知的技術(shù)，例如，感染，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)位，結(jié)合，電穿孔和轉(zhuǎn)化將重組結(jié)構(gòu)導(dǎo)入宿主細(xì)胞。載體可以是，例如，噬菌體，質(zhì)粒，病毒或者反轉(zhuǎn)錄病毒。
多核苷酸可以連接帶有可篩選標(biāo)記的載體，以在宿主細(xì)胞中增殖。通常地將質(zhì)粒載體導(dǎo)入沉淀，例如磷酸鈣沉淀，或者帶電的脂質(zhì)復(fù)合體。如果載體是病毒，可以使用合適的包裝細(xì)胞系在體外進(jìn)行包裝，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞中。
優(yōu)選載體含有對目的多核苷酸的順式作用調(diào)控區(qū)。合適的反式作用因子可以由宿主，載體或者基于導(dǎo)入宿主的載體自身提供。
在這部分特定的優(yōu)選實施方案中，載體提供了專一性的表達(dá)，表達(dá)可以是受到誘異的，或細(xì)胞類型專一性的。在這些載體中特別優(yōu)選的是易于操作的被環(huán)境因子誘導(dǎo)的那些載體，例如受溫度和營養(yǎng)添加物誘導(dǎo)的載體。
本發(fā)明中使用的表達(dá)載體包括染色體-，游離型-和病毒-來源的載體，例如來自細(xì)菌質(zhì)粒，噬菌體，酵母附加體，酵母染色體因子，病毒，例如桿狀病毒，乳多空病毒，痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病毒，和反轉(zhuǎn)錄病毒的載體，和由它們組合而衍生的載體，例如粘粒和噬菌粒。
DNA插入片段應(yīng)該有效地連在合適的啟動子上，例如菌體λPL啟動子，大腸桿菌Lac，trp和tae啟動子，SV40早期和晚期啟動了和反轉(zhuǎn)錄病毒LTPs啟動子，此處列出了一些。其它的合適的啟動子為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。表達(dá)構(gòu)建體還包括轉(zhuǎn)錄起始點，終止位點和在被轉(zhuǎn)錄區(qū)的翻譯所需的核糖結(jié)合位點。由此構(gòu)建體所表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄體的編碼部分包括在要翻譯多肽開始部位的翻譯起始密碼子(AUG或者GUG)和適當(dāng)?shù)匚挥谝g多肽末端合適部位的終止密碼子。
如已說明的，表達(dá)載體優(yōu)選包括至少一個選擇性標(biāo)記。這些標(biāo)記包括真核細(xì)胞培養(yǎng)所需的二氫葉酸還原酸酶或者新霉素抗性，以及大腸桿菌和其它細(xì)菌培養(yǎng)所需的四環(huán)素，青霉素，氯霉素和卡那霉素抗性基因。合適的宿主細(xì)胞的代表性例子包括細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌，谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)，鏈霉菌屬(Streptomyces)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)等的細(xì)胞；真菌細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞的合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為本領(lǐng)域已知。
細(xì)菌中使用的優(yōu)選的載體包括從Qiagen公司獲得的pA2，pQE70和pQE60和pQE-9；從Stratagene公司獲得的pBS載體，Phagescript載體，Bluescript載體，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A，從Pharmacia公司獲得的ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5。優(yōu)選的真核載體包括從Stratagene公司獲得的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和pSG；可從Pharmalia公司獲得的pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL。其它合適的載體也為技術(shù)人員所知。
本發(fā)明使用的合適的細(xì)菌啟動子包括大腸桿菌lacI和lacZ啟動子，T3和T7啟動子，gpt啟動子和λPR和PL啟動子和trp啟動子。合適的真核啟動了包括CMV立即早期啟動子，HSV胸苷激酶啟動子，早期和晚期SV40啟動子，反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs啟動子，例如Rous肉瘤病毒(RSV)的那些，和金屬硫蛋白啟動子，比如鼠金屬硫蛋白-I啟動子。
使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，DEAE-葡萄糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法，陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法，電穿孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)，感染或者其它方法，可以有效地將重組結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。例如在許多標(biāo)準(zhǔn)實驗手冊中途述的方法，如Davis等，分子生物學(xué)基本方法”(1986)。
在高等真核生物中，通過向載體中插入增強子序列可以提高編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常大約10至300bp，它在一定的宿主細(xì)胞類型中提高啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。增強子的例子包括SV40增強子，它位于復(fù)制起始點晚側(cè)100至270bp處，巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強子，在復(fù)制起始位點的晚期側(cè)的多瘤病毒增強子，和腺病毒病毒增強子。
為了使轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)分泌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔中，周質(zhì)空間或者細(xì)胞外環(huán)境中，可以將合適的分泌信號引入到表達(dá)的多肽上。這些信號對于多肽來說可以是內(nèi)源的或者它們也可以是外源信號。
多肽可以以修飾的形式表達(dá)，例如融合蛋白，可以不但包括分泌信號，而且有附加的異源功能區(qū)。因此，例如，可以將附加的氨基酸區(qū)，特別是帶電的氨基酸加到多肽的N-端，以提高在純化過程中，或者在后面的操作和貯存過程中多肽的穩(wěn)定性和持久性。而且，可以將肽部分加到多肽上以便于純化。
丙酮酸羧化酶蛋白可以通過眾所周知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，包括硫酸銨和乙醇沉淀，酸抽提，陰離子或者陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，親和層析，疏水相互作用層析，羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優(yōu)選地，使用高效液相層析(HPLC)進(jìn)行純化。
本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物，化學(xué)合成獲得的產(chǎn)物，和利用重組技術(shù)在原核和真核宿主，包括例如細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生的產(chǎn)物。依賴于重組生產(chǎn)過程中使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或者可以是非糖基化的，而且，在一些情況下作為宿主介導(dǎo)的過程的結(jié)果，本發(fā)明的多肽可以包括起始修飾的甲硫氨酸殘基。
丙酮酸羧化酶多肽和肽本發(fā)明還提供了一種分離的丙酮酸羧化酶多肽，其有保藏的DNA所編碼的氨基酸序列，或者圖1所示的氨基酸序列(SEQ ID NL2)，或者是含有上面多肽一部分的肽或多肽。名詞“肽”和“寡肽”是同義的(如通稱所認(rèn)識的)，兩個名詞可交換使用，作為一個概念，表示至少兩個氨基酸由肽鍵連結(jié)而成的鏈。名詞“多肽”此處用于表示由多于10個氨基酸殘基構(gòu)成的鏈。此處所有的寡肽和多肽的式和序列都是從左向右書寫，在方向上是從氨基端到羧基端。
本領(lǐng)域可以認(rèn)識到丙酮酸羧化酶多肽的一些氨基酸序列可以變化，而對于蛋白的結(jié)構(gòu)和功能沒有明顯的影響。如果考慮這種序列的變化，應(yīng)該記住蛋白質(zhì)上存在決定活性的關(guān)鍵區(qū)域。通常，如果使用表現(xiàn)出相似的功能的酸殘基，是可能替換形成三級結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基的。在其它的例子中，如果變化處于蛋白質(zhì)的非關(guān)鍵區(qū)域，則殘基的類型可以是完全不重要的。
因此，本發(fā)明還提供了丙酮酸羧化酶多肽的變異體，它們顯示出丙酮酸化酶的基本活性，或者它們包括丙酮酸化酶蛋白的一些區(qū)域，例如如下所討論的區(qū)域。這些突變包括缺失，插入，倒置，重復(fù)和類型替換(例如，用一個親水殘基替換另一個，但是作為一個規(guī)則，不用強親水性的替換強疏水性的)。小的變化或者這些“中性”氨基酸的替換通常對活性只有很小的影響。
通常所見到的保守替換是，脂族氨基酸Ala，val，leu和Ile中的一個替換另一個；帶羥基殘基Ser和Thr的相互替換，酸性殘基Asp和Glu的交換，酰胺殘基Asn和Gln的取代，堿性殘基Lys和Arg的交換和芳族氨基酸Phe和Tyr的替換。
如上面所詳述的，更多的關(guān)于氨基酸改變可能是表型沉默(即對于功能不可能具有明顯的有害效果)的指導(dǎo)可以在例如，Bowie.J.U，等“Deciphering the Message in Protein SequencesTolerance toAmino Acid Substtutions，”Science，2471306--1310(1990)，中找到。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選以分離的形式提供，且優(yōu)選以基本純化形式提供。如Smith和Johnson，Gene6731-40(1998)所敘述的，一種重組產(chǎn)生的丙酮酸羧化酶多肽，可以通過一步法得到基本上的純化。
本發(fā)明的多肽包括保藏的DNA編碼的多肽，SEQ ID NO2的多肽，以及與上述多肽有至少90％相似性，更優(yōu)選有至少95％相似性，更優(yōu)選有至少97％，98％或99％相似性的多肽。本發(fā)明更多的多肽包括與保藏DNA編碼的多肽，SE ID NO2多肽有70％同一性，更優(yōu)選有至少90％或者95％同一性，更優(yōu)選至少97％、98％、或99％同一性的多肽，也包括有至少30個氨基酸，更優(yōu)選至少50個氨基酸的這些多肽的一部分。
兩種多肽％相似性”指的是，通過使用Bestfit程序(Wisconsin序列分析軟件包，UNIX用8版，遺傳學(xué)計算機小組，UniversityResearch Park，575Science Drive，Madison WI53711)和確定相似性的缺席設(shè)置對兩種多肽的氨基酸序列進(jìn)行比較而得到的一種相似性分?jǐn)?shù)。Bestfit使用Smith和Waternan局部同源性運算法(Advaces inApplied Mathematics 2482-489(1981))來尋找兩個序列之間的最好的相似性片段。
一種多肽具有的氨基酸序列與丙酮酸羧化酶多肽的氨基酸序列，有例如至少95％的“同一性”，指的是，除了每100個參照丙酮酸羧化酶多肽氨基酸序列的氨基酸中有最多為5個氨基酸的改變外，該多肽的氨基酸序列與參照序列是一致的。換句話說，為得到氨基酸序列與參照氨基酸序列有至少95％同一性的多肽，參照序列中的高至5％的氨基酸殘基可以刪除或者用其他的氨基酸替換，或者最多占參照序列總氨基酸殘基數(shù)5％的氨基酸數(shù)可以插入到參照序列中。這些參照序列的改變可以發(fā)生參照氨基酸序列的氨基端或者羧基端的位置，或者散布在這些末端位置之間的任意位置—或者單個地存在于參照序列的殘基中，或者以一個或更多個相鄰接的組群存在于參照序列中。
特別地，可以使用已知的計算機程序，例如Bestfit程序(Wisconsin序列分析軟件包，UNIX用8版，遺傳學(xué)計算機小組，University Research Park，575Science Drive，Madison WI 53711)，可以方便地測定是否特定的多肽與圖1所示的氨基酸序列(SEQ IDNO2)或者保藏的粘?？寺【幋a的氨基酸序列有至少90％，95％，97％，98％或者99％的同一性。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)使用Bestfit或者任何其它的序列比較程序來確定是否特定的序列與本發(fā)明的參照序列有例如95％的同一性時，當(dāng)然，參數(shù)的設(shè)置使得同一性的百分比是相對于全長參照氨基酸序列來計算的。與參照序列氨基酸殘基總數(shù)高至5％的同源性空隙是允許的。
用于棒狀桿菌(Corynebaterium)操作的遺傳工具為制造出在棒狀桿菌(Corynebaterium)中代謝工程所必需的遺傳變化，研究者需要鑒定和克隆涉及到目的途徑的基因。他們還需要一些方法來改變這些基因以影響他們編碼的酶的調(diào)節(jié)或水平，然后將改變了的基因重新導(dǎo)入棒狀桿菌(Corynebaterium)中，以檢查它們對于氨基酸生物合成的效果。因此，代謝工程需要在其處理時能同時在棒狀桿菌(Corynebaterium)和其它更易于操作的宿主中，比如大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制的一批質(zhì)粒。同時需要編碼，例如，抗生素抗性的選擇性標(biāo)記，可以對變化的基因進(jìn)行調(diào)節(jié)的良好表征的轉(zhuǎn)錄啟動子，以及能將質(zhì)粒插入目的棒狀桿菌(Corynebaterium)株中的有效的轉(zhuǎn)化和接合系統(tǒng)。
質(zhì)粒已經(jīng)分離和發(fā)展了幾種不同的可以將基因?qū)氩⒃诎魻顥U菌(Corynebaterium)中表達(dá)的質(zhì)粒(Sonnen，H.等，Gene10769-74(1991))。這些大部分原始被鑒定為小的(3-5Kb)，隱蔽性的質(zhì)粒，來自谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)，美棒狀桿菌(C.callunae)，和乳發(fā)酵棒狀桿菌(C.lactofermentum)。它們分為四個相容組群，分別以質(zhì)粒pCC1，PBL1，PHM1519和pGA1為例子。通過將已知大腸桿菌質(zhì)粒的元件(特別是來自pBR322或者pUC18的ColE1復(fù)制起始位點)，以及抗生素抗性標(biāo)記引入，可以這些隱蔽性質(zhì)粘開發(fā)出能同時在棒狀桿菌(Corynebaterium)和大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒 穿梭載體。第5個對于棒狀桿菌(Corynebaterium)的操作非常有用的質(zhì)粒是基于pNG2構(gòu)建的，最初分離自白喉棒狀桿菌(Corynebaterium diptheriae)(Serwold-Davis，T.M等，Proc，Natl，Acad，Sci，USA，844964-4968(1987))的質(zhì)粒。這個質(zhì)粒和它的衍生物能在許多種的棒狀桿菌(Corynebaterium)和大腸桿菌中有效地復(fù)制。既然pNG2(一個僅1.8kbp的元件)的單獨的復(fù)制起始點能夠同時在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性宿主中起作用，那么不需要給它另外添加ColE1型的元件。因此，pNG2衍生物(如pEP2)比其它的棒狀桿菌(Corynebaterium)穿梭載體小得多，因此更容易操作。
選擇性標(biāo)記幾種賦予抗生素抗性的基因已被證明可用于在棒狀桿菌(Corynebaterium)中的質(zhì)粒篩選和其他的重組DNA工作。這些基因包括來自Tn903的卡那霉素抗性決定子，分離自吸濕鏈霉菌(Streptomyces bygroscopicus)的潮霉素抗性標(biāo)記，來自淀粉鏈球菌(Streptococcus faecalis)的四環(huán)素抗性基因，來自Tn5的博來霉素抗性標(biāo)記，來自Streptomyces acrimycini的氯霉素抗性標(biāo)記。在許多大腸桿菌質(zhì)粒，如P3R322中使用的β-內(nèi)酰胺酶基因在棒狀桿菌(Corynebaterium)中不賦予氨芐青霉素抗性。
轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 幾種方法被設(shè)計用于將外源DNA導(dǎo)入棒狀桿菌(Corynebaterium)中。最早的常規(guī)采用的方法是基于已在其它革蘭氏陽性種中獲得成功的方法，包括在DNA和聚乙二醇存在的情況下溫育原生質(zhì)球(Yoshihama，M等，J，Bacteriol，162591-597(1985))。雖然這種方法可以使用，但是它的效率通常是比較低的，常常用每毫克DNA只能獲得少于105個轉(zhuǎn)化體。棒狀桿菌(Corynebaterium)原生質(zhì)球的電穿孔被證明為一種更有效和更可靠的轉(zhuǎn)化方法。原生質(zhì)球的制備產(chǎn)生通常是將細(xì)胞培養(yǎng)在豐富培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基含有甘氨酸和或低濃度的其他的細(xì)胞壁生物合成抑制劑的，比如異煙肼，氨芐青霉素，青霉素G，或者吐溫-80。然后用含有甘油的低鹽緩沖液清洗原生質(zhì)球，在電穿孔前將原生質(zhì)球與DNA混合。據(jù)報道，使用這種方法的轉(zhuǎn)化效率可以高達(dá)每微克質(zhì)粒DNA107個轉(zhuǎn)化體。
第三種將DNA轉(zhuǎn)入棒狀桿菌(Corynebaterium)的方法涉及到轉(zhuǎn)接合。這種方法利用攜帶RP4質(zhì)粒衍生物的各種大腸桿菌菌株的混雜。在大腸桿菌中，RP4編碼許多功能，這些功能介導(dǎo)質(zhì)粒從宿主菌株向大腸桿菌的其他受體菌株，甚至其它種中接合轉(zhuǎn)移。這些“tra功能”介導(dǎo)菌毛形成和質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。RP4還帶有轉(zhuǎn)移起始區(qū)，Ori T，一個被轉(zhuǎn)移設(shè)置識別的順式作用元件，它使得質(zhì)粒通過菌毛傳導(dǎo)并進(jìn)入受體菌株。從這一系統(tǒng)，Simon等(Bio/Technology 1784-791(1985)開發(fā)出一種有用的用于將質(zhì)粒從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到棒狀桿菌(Corynebaterium)的轉(zhuǎn)接合工具。他們將從RP4來的tra功能重新定位到一株被命名為S17-1的大腸桿菌菌株的染色體中。帶有RP4oriT的質(zhì)粒，能被從S17-1高效地轉(zhuǎn)入其它的受體。盡管此方法已被證明對于導(dǎo)入復(fù)制質(zhì)粒到棒狀桿菌是有用的，其被證明對產(chǎn)生基因破壞更為有用。此可以通過導(dǎo)入一個可選擇性的標(biāo)記到棒狀桿菌基因的克隆中來完成，其中的基因是破壞的目標(biāo)。此構(gòu)建物然后被連接于攜帶RP4oriT但缺少來支持在棒狀桿菌復(fù)制的起點的大腸桿菌質(zhì)粒。攜帶此質(zhì)粒的S17-1然后被與受體菌株溫育，且混合物然后轉(zhuǎn)入到選擇性培養(yǎng)基上。因為被導(dǎo)入的質(zhì)粒不能在棒狀桿菌(Corynebaterium)中復(fù)制，表達(dá)選擇性標(biāo)記的轉(zhuǎn)接合體非常有可能在基因組DNA內(nèi)發(fā)生了交換重組。
限制性缺陷株盡管使用了這種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，在文獻(xiàn)中有很明顯的先例就是棒狀桿菌(Corynebaterium)能將大腸桿菌來源的DNA識別為外源DNA并通常降解它。這個功能是由棒狀桿菌(Corynebaterium)的限制和修飾系統(tǒng)造成的。為克服這一系統(tǒng)的作用，一些轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)接合方法要求在轉(zhuǎn)化前對受體菌株進(jìn)行簡短地加熱。熱處理大概能失活負(fù)責(zé)限制性系統(tǒng)的酶，使導(dǎo)入的DNA在酶被周轉(zhuǎn)之前變成確定的。另一個用來提高DNA轉(zhuǎn)移效率的策略是分離棒狀桿菌(Corynebaterium)突變體，其中的限制性系統(tǒng)是缺陷的。這些菌株以和已在棒狀桿菌(Corynebaterium)中擴增的質(zhì)粒幾乎同樣的效率引入在大腸桿菌擴增的質(zhì)粒。在另一個用于克服棒狀桿菌(Corynebaterium)中的限制性系統(tǒng)的策略中，Leblon和其同事發(fā)展了一種基因破壞的“整合子”系統(tǒng)(Reyes，O.等，GENE10761-68(1991))。整合子是與目的宿主DNA有相同的限制/修飾特性的DNA分子，它所攜帶的DNA與宿主基因組的一部分(即基因組要被破壞的一個區(qū)域)同源，不能在宿主細(xì)胞中復(fù)制。一個從棒狀桿菌(Corynebaterium)中克隆的基因，首先在一個可以在棒狀桿菌(Corynebaterium)菌株中復(fù)制的質(zhì)粒中用選擇性標(biāo)記間斷。這個構(gòu)建體然后被從棒狀桿菌(Corynebaterium)質(zhì)粒上切割下來，并自連接形成一個非復(fù)制的環(huán)狀分子。這個整合子然后通過電穿孔被導(dǎo)入限制性宿主中。DNA的修飾使得整合子可以躲避宿主的限制性系統(tǒng)，并且它進(jìn)入宿主基因組中的重組，使選擇性標(biāo)記得到表達(dá)。
啟動子 外源基因在棒狀桿菌(Corynebaterium)中的表達(dá)需要可靠的轉(zhuǎn)錄啟動子。對一些特定實驗來說，也需要它的活性可以在特定的培養(yǎng)條件下被誘導(dǎo)的受調(diào)節(jié)的啟動子。來自棒狀桿菌(Corynebaterium)基因的啟動子，例如fda，thrC和hom啟動子被證明可用于外源基因表達(dá)。來自大腸桿菌的可誘導(dǎo)的啟動子，例如，當(dāng)lac抑制子(LacI)存在時受異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的Plac和Ptrc啟動子；當(dāng)Trp抑制子(trpR)存在時對誘導(dǎo)物吲哚丙烯酸響應(yīng)的Ptrp啟動子；當(dāng)溫度敏感的λ抑制子(cI857)存在時受到抑制的λPL，都被用于在棒狀桿菌(Corynebaterium)中調(diào)節(jié)基因表達(dá)。
基因鑒定 雖然存在所有其它的遺傳工具，鑒定來自棒狀桿菌(Corynebaterium)的相關(guān)基因仍然是一個挑戰(zhàn)。在大腸桿菌中，一些已用于分離基因的來源是轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體，轉(zhuǎn)座因子，從轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)結(jié)合實驗得到的大腸桿菌染色體的遺傳圖譜，以及最近，完整的染色體的物理和序列圖。目前從棒狀桿菌(Corynebaterium)中鑒定和回收基因的最成功的方法是使用棒狀桿菌(Corynebaterium)基因組DNA補充(Complement)已知的大腸桿菌的營養(yǎng)缺陷型。在這個實踐中，帶有棒狀桿菌(Corynebaterium)基因組片段的質(zhì)粒文庫，被導(dǎo)入特定的酶或者功能缺陷的大腸桿菌菌株中。不再顯示出營養(yǎng)缺陷型(例如，高絲氨酸缺陷)的轉(zhuǎn)化體，可能帶有來自棒狀桿菌(Corynebaterium)的互補基因。這種策略導(dǎo)致大量的棒狀桿菌(Corynebaterium)基因被分離，包括幾種來自負(fù)責(zé)天冬氨酸衍生的和芳香族氨基酸的合成途徑，中間代謝和其它的細(xì)胞過程的基因。這一策略的一個限制是，不是所有的棒狀桿菌(Corynebaterium)基因都可以在大腸桿菌宿主中表達(dá)的。因此，盡管一個基因可能顯示于質(zhì)粒文庫中，它可能不能補充大腸桿菌的突變，因此不能過篩選來回收。為克服這個限制，一小部分基因是通過類似的策略鑒定的，這里將野生型棒狀桿菌(Corynebaterium)的質(zhì)粒文庫，直接用于補充其它棒狀桿菌(Corynebaterium)的突變。盡管這一策略避免了在營養(yǎng)缺陷型宿主中基因表達(dá)的量不夠的問題，它的應(yīng)用仍然被營養(yǎng)缺陷型中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率低的問題所限制。還有其它的一些基因是通過與基于其它物種同源基因的核酸探針雜交，以及使用聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和簡并寡核苷酸引物進(jìn)行直接擴增而鑒定的。
轉(zhuǎn)座因子轉(zhuǎn)座因子在基因鑒定中是非常有力的工具，因為它們偶聯(lián)基因恢復(fù)和誘變。不象經(jīng)典的誘變技術(shù)那樣在基因中產(chǎn)生點突變或者小的缺失，當(dāng)轉(zhuǎn)座因子插入基因中時，它們形成大的破壞，因此“標(biāo)記”變化的基因以更易于被鑒定。已有一定數(shù)量的在棒狀桿菌(Corynebaterium)中轉(zhuǎn)位的轉(zhuǎn)座因子被發(fā)現(xiàn)。在C.xerosi的pTP10質(zhì)粒和白喉棒狀桿菌(C.diphtherine)的PNG2質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)位子，顯示出可以在谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)中轉(zhuǎn)位并賦予紅霉素抗性。日本Mitsubishi化學(xué)公司的一個小組從他們在谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)中發(fā)現(xiàn)的一個插入序列，IS31831，開發(fā)出一系列的人工轉(zhuǎn)位子(Vertes，A.A等，Mol.Gen.Genet.245397-405(1994)).在向IS31831的倒轉(zhuǎn)重復(fù)間插入一個選擇性標(biāo)記后，這些研究者將獲得的在一個大腸桿菌質(zhì)粒上(不能在棒狀桿菌(Corynebaterium)中復(fù)制)的轉(zhuǎn)位子，通過電穿孔的方法導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)菌株中。他們發(fā)現(xiàn)選擇性標(biāo)記以大約4×104突變體/毫克DNA的頻率插入目的細(xì)胞的基因組中。使用這些轉(zhuǎn)位子產(chǎn)生棒狀桿菌(Corynebaterium)營養(yǎng)缺陷型，由此分離出幾種負(fù)責(zé)氨基酸生物合成，和棒狀桿菌(Corynebaterium)中其它功能的基因。
轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體已用于其它系統(tǒng)中對遺傳基因座作圖和分離基因。1976年，日本Ajinomoto公司的研究者們研究了150株經(jīng)鑒定和未經(jīng)鑒定的各種產(chǎn)谷氨酸的棒狀桿菌菌株，鑒定可能用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的噬菌體(Mornose等，.J.Gen.Appl.microbiol.Rev，16243-252(1995))。從這些篩選中回收的24個不同的噬菌體分離物中，只有3個可以以明顯頻率將trp標(biāo)記從trp+供體轉(zhuǎn)入trp-受體中，盡管甚至這個效率也只有10-7或者更少。這些研究者通過加入4mM環(huán)狀腺苷酸(cAMP)和1.2mM氯化鎂，稍微提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。一些不同的研究者試圖從一些來源比如污染的工業(yè)發(fā)酵物，土壤和動物廢物中分離corynephage開發(fā)可靠的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。盡管分離和鑒定出了許多噬菌體，但是幾乎沒有與轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，開發(fā)出可普遍用于谷氨酸-產(chǎn)生細(xì)菌的可靠的高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的機會仍然是存在的。
實施例下列實施例列出了以下的實驗方案和實驗細(xì)節(jié)。
細(xì)菌菌株和質(zhì)粒谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)21253(hom，賴氨酸過量生產(chǎn)者)被用于制備染色體DNA。大腸桿菌DH5α(hsdR-，recA-)(Hanahan，D.，J.mol.Biol166-577(1983))被用于轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒pCR2.1TOPO(Invitrogen公司)被用于克隆聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物。本研究構(gòu)建了pRR850質(zhì)粒，它含有一個克隆進(jìn)pCR2.1TOPO質(zhì)粒的850bp的片段。
培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件大腸桿菌菌株在37℃生長在Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中(Sambrook，J，等，Molecular cloninga laboratory manual，2ndedn，.Cold Spring Habour Laboratory，Cold Spring Habour，NY(1989))。谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)在30℃生長在LB培養(yǎng)基中。當(dāng)提到時，氨芐青霉素以下列濃度使用平板上100μg/ml和液體培養(yǎng)基中50μg/ml。
DNA操作如Tomioka，等所述從谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)中分離了基因組DNA(Tomioka，N，等，Mol，gen.Genet.184359-363(1980).根據(jù)供應(yīng)商操作手冊將PCR片段克隆入pCR2.1TOPO載體中。粘粒和質(zhì)粒DNA使用Qiaprep spin柱制備，用Qiaex試劑盒(Qiagen公司)從瓊脂糖凝胲中抽提DNA。測序所需的粘粒的大規(guī)模高純度制備，使用Promega Wizard試劑盒(Promega公司)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化和瓊脂糖凝膠電泳(Sambrook，J，等，Molecular cloningalaboratory manual，2nd edn，.Cold Spring Habour Laboratory，ColdSpring Habour，NY(1989))。限制酶購自Boehringer Mannheim公司或者New England Bioabs公司。
粘粒文庫所用的粘粒文庫是通過將谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)染色體DNA，克隆入Supercos載體而構(gòu)建的(Stratagene公司)。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)PCR是使用Boehringer Mannheim PCR core試劑盒依照制造商的說明進(jìn)行的。當(dāng)在谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)染色體DNA上進(jìn)行PCR反應(yīng)時，每一反應(yīng)中加入約1μg DNA。PCR反應(yīng)所用的正向引物為5’GTCTTCATCGAGATGAATCCGCG 3’反向引物為5’CGCAGCGCCACATCGTAAGTCGC 3’斑點印跡分析含有本研究中鑒定的粘粒DNA的斑點印跡和作為正對照的探針用S&S小倍量儀(Schleicher & Schull公司)制備。編碼谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)丙酮酸羧化酶基因的一部分的一段850bp片段作為探針。如制造商所述，探針在一個隨機引發(fā)的DNA標(biāo)記反應(yīng)用地高辛配基-11-duTP(Boehringer monabeim公司)進(jìn)行標(biāo)記。斑點印跡的雜交，清洗和比色檢測使用Boehringer公司的Genius系統(tǒng)，遵照他們的濾膜雜交用戶指導(dǎo)的方法進(jìn)行。291個粘粒起始雜交，在65℃進(jìn)行過夜，在雜交溫度清洗。用于第二輪篩選的17個粘粒的雜交，在65℃下進(jìn)行雜交，但是只雜交8小時，膠片暴光的時間也減少。
用Western印跡檢測含生物素的蛋白質(zhì)如Jetten和Sinskey所述制備谷氨酸棒狀桿菌(C.gluamicum)細(xì)胞抽提物(Jetten，M.S.M，和Sinstrey，A.J.，F(xiàn)EMS，MicrobiolLett.111183-188(1993))。細(xì)胞抽提物中的蛋白質(zhì)，使用十二烷基硫酸納(SDS)/7.5％聚丙烯胺凝膠，在BioRad微型凝膠裝置上進(jìn)行分離，然后使用BioRad微型轉(zhuǎn)膜裝置電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，如Towin等所述(Towbin，H.等，Proc，Natl，Acad，Sci，USA764350-4353(1979))。生物素化的蛋白使用Biorad公司抗生物素蛋白結(jié)合的堿性磷酸酶和Schleicher&Schull公司的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-對-甲苯胺鹽/氯化氮藍(lán)四唑進(jìn)行檢測。
DNA測序使用ABIPrism377DNA測序儀由MIT生物聚合物設(shè)備進(jìn)行自動DNA測序。
序列分析使用DNA strider1.0版本程序(法國，Institut de RechercheFondamentale)進(jìn)行DNA序列的倒轉(zhuǎn)，互補，翻譯和在序列中尋找可讀框。使用國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的BLAST程序(Altsschul，S.F.等，J.Mol.Biol，215403-410(1990))比較蛋白質(zhì)和DNA序列。使用MACAW軟件(NCBI)進(jìn)行蛋白質(zhì)的同源性搜索。使用Biosoft International的Primer Prenier軟件設(shè)計PCR引物。使用Genevn大學(xué)的Expasy分子生物學(xué)服務(wù)器上的計算PI/MW工具來預(yù)測推定的氨基酸序列的分子量和pI。
實施例1Western印跡檢測生物素化的酶既然已知丙酮酸羧化酶含有生物素，就可以用Western印跡來檢測谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)中生物素化的蛋白的產(chǎn)生。從LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中制備的抽提物中檢測到了兩種生物素化的蛋白質(zhì)，(資料來顯示)和以前的報告一致。大約位于80kDa的一條帶鑒定為乙酰基輔酶A羧化酶的生物素羧基載體結(jié)構(gòu)域(BCCP)(Jager，W.等，Arch.Microbiol 16676-82(1996))。在120kDa的第二條帶相信是丙酮酸羧化酶，因為這些蛋白在113-130kDa的范圍內(nèi)(Actwood，P.V.Int，J.Biochem.Cell.Biol.，27231-249(1995))。
實施例2PCR和克隆基于以前已克隆出基因高度保守區(qū)的同源性克隆了谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)的丙酮酸羧化酶基因。檢測了13種生物體的丙酮酸羧化酶基因，設(shè)計了相應(yīng)于丙酮酸羧化酶中保守的ATP結(jié)合亞基序，和緊靠丙酮酸結(jié)合基序(表1)的區(qū)域的引物。當(dāng)氨基酸不同時，基于結(jié)核分枝桿菌(M.glutamicum)來設(shè)計引物，因為它和產(chǎn)谷氨酸棒狀細(xì)菌(C.glutamicum)的近親緣關(guān)系。從谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)的基因組DNA中用PCR擴增了一個850bp的片段，并克隆到Invitrogen公司的pCR2.1TOPO載體上構(gòu)建了pBR850質(zhì)粒。引物還可以基于保守的生物素結(jié)合位點和丙酮酸結(jié)合位點(資料來顯示)設(shè)計。
實施例3；分離含有谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)丙酮酸羧化酶基因的粘粒。
含有谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)丙酮酸羧化酶基因一部分的850堿基對的片段被用作探針檢測谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)基因組文庫。在第一輪篩選中，斑點印跡中的291個粘粒中的17個表現(xiàn)為陽性。對這17個粘粒進(jìn)行第二輪篩選，使用相同的探針，但是更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件，獲得4個有陽性信號的粘粒。為確證這些粘粒確實含有丙酮酸羧化酶基因，使用4個陽性粘粒作為模板，用于制備探針的相同引物進(jìn)行PCR。從所有4個陽性相斯質(zhì)粒中擴增出了850bp的片段，命名為IIIF10，IIE9，IIIG7和IIIB7。

表1，使用NASAW軟件對13種生物的丙酮酸羧化酶序列(來自Genbank)進(jìn)行比較。選出兩個高度保守的區(qū)，基于與這些區(qū)域相對應(yīng)的結(jié)核分枝桿菌DNA序列設(shè)計了寡核苷酸生物。正向引物基于對應(yīng)于保守區(qū)A的DNA序列。反向引物基于對應(yīng)于保守區(qū)B的DNA序列。實施例4測序策略使用M13正向和M13反向引物對質(zhì)粒pRR850中的850bp的插入片段進(jìn)行了測序?；谶@個序列設(shè)計了Begrev1和Endfor1引物，用于對丙酮酸羧化酶基因的850bP部分的開始和終止位點之外的序列的測序。粘粒IIIF10被用作測序模板。通過設(shè)計新的引物(表2)并“步移”過整個基因而連續(xù)測序。
實施例5序列分析測序粘粒IIIF10的3637個bp的序列。鑒定出了一個3420bp的讀碼框，預(yù)測它編碼一個1140個氨基酸的蛋白質(zhì)。推斷的蛋白質(zhì)和結(jié)核分枝桿菌(M tuberculosis)的丙酮酸羧化酶有63％的同一性，和人的丙酮酸羧化酶有44％的同一性，基于此同源性命名為谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)基因pc。預(yù)測推斷的蛋白質(zhì)的pI為5.4，分子量為123.6KDa，它與通過SDS/聚丙烯酰胺凝膠電泳得到的估計為120KDa的亞基的分子量是類似的。起始甲硫氨基酸的上游顯示出具有共有核糖體結(jié)合位點AAGGAA?；诤徒Y(jié)核分枝桿菌(M tuberculosis)序列的同源性，預(yù)測的翻譯起始位點是GTG密碼子，它也在其它的細(xì)菌序列中被觀察到(Stryer，L.，Biocbemistry，3rd edn，F(xiàn)reeman，NY(1988)；Keilhauer，C，等，J.Bacterio，1755595-5603(1993))。該DNA序列被遞交給GenBank并被給與的登記號為AF038548。
谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)丙酮酸羧化酶的氨基端節(jié)段含有六肽GGGGRG，它與發(fā)現(xiàn)在所有生物素給合蛋白中的GGGG(R/K)G序列相匹配，相信是一個ATP結(jié)合位點(Fry，D.C.，等Proc Nal AcadSci USA 83907-911(1986)；Post，L.E，等，J.Biol.Chem2657742-7747(1990)。第二個被提出與ATP結(jié)合有關(guān)，且存在于生物素依賴性的羧化酶和氨甲?；姿岷铣擅钢械膮^(qū)域在谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)序列中是保守的(Lim F，等，J.Biol.chem.26311493-11497(1988))。預(yù)測的谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)丙酮酸羧化酶蛋白也含有推定的丙酮酸結(jié)合基序，F(xiàn)LFEDPWDR，它在分枝桿菌，根瘤菌和人丙酮酸羧化酶的轉(zhuǎn)羧基酶結(jié)構(gòu)域是保守的(Dunn，N，F(xiàn)等，J.Bacteriol 1785960-1970(1996). 用轉(zhuǎn)羧基酶的色氨酸熒光的研究表明，在這個基序中的Trp殘基與丙酮酸的結(jié)合有關(guān)(Kumer，G.K等，Biochemistry272978-5983(1988))。該酶的羧基端節(jié)段含有推定的生物素結(jié)合位點，AMKM，它與在其它丙酮酸羧化酶以及其它生物素賴性酶的生物素羧基載體蛋白(BCCP)結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的是一致的。

表2，用于得到粘粒IIIF10中的丙酮酸羧酶基因的引物的DNA序列。
以前的研究表明磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)不是谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)中主要的添補酶，因為缺少它并不影響賴氨酸的生成(Gubler，M等，Appl，Microbiol，Biotechnol.40857--863(1994)；Peters-Wendisch，P.G.等，Microbiol，lett.11269-274(1993)).而且，大量研究表明了存在丙酮酸羧化的酶，研究使用13C標(biāo)記實驗和NMR和GC-MS分析(Park，S.M.等，Apllied，Microbiol，Biotechnol，47430-440(1997b)；Peters-Wendisch，P.G.等，Arch，Microbiol，165387-396(1996))，或者使用無細(xì)胞抽提物(Tosaka，O，Agri，Boil.Chem，431513-1519(1979))和可通透細(xì)胞(Peters-Wendisch，P.G等，Microbiol，1431095-1103(1997)的酶學(xué)實驗。在無細(xì)胞抽提物中只能檢測到很低的丙酮酸羧化酸活性。而這與非常的ATP背景并不脫離。很可能測得的這種活性是由于可逆的葡糖異生酶，比如草酰乙酸脫羧化酶和蘋果酸酶。谷氨酸棒桿菌中丙酮酸羧化酶的存在，使上述的葡萄糖異生酶滿足這株細(xì)菌的添補的需要成為很不可能。
推斷的谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)丙酮酸羧化酶的基因的氨基酸序列和來自不同種群生物的丙酮酸羧化酶序列有顯著的相似性。它含有在N一端區(qū)域的生物素羧化酶結(jié)構(gòu)域，在C端區(qū)域的BCCP結(jié)構(gòu)域，和在中間區(qū)域的具有丙酮酸特異結(jié)合位點的轉(zhuǎn)羧基酶結(jié)構(gòu)域。谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)的丙酮酸羧化酶蛋白和結(jié)核分枝桿菌和人的丙酮酸羧化酶顯示出強烈的同源性(Wexler，I，D等，Biochem.Biophys.Acta，12274652(1994))。
有先例發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)含有不止一種行使再生草酰乙酸的添補功能的酶。產(chǎn)香茅醇假單胞菌(Pseudomonascitronellolis)，熒光假單胞菌(Pseudomonas fuorscens)，棕色固氮菌和新型硫桿菌(Thiobacillus novellus)含有ppc和丙酮酸羧化酶(O’Brien，R，W，等，J.Biol Chem 2521257-1263(1977))；Scrutton，M.C.和Taylor，B.L.Arch，Biochem.Biophys，164641--654(1974)，Milrad de Forcheet，SR，和Cazullo，J.J.J.Gen，Microbiol，9375-81(1976)；Charles，A.M，和Wiler，D.W，Can，J，Microbiol，30532-539(1984)。玉米含有ppc的三種同功酶(Toh，H.等，Plant Cell Environ 1731-43(1994).釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)中含有兩種丙酮酸羧化酶的同功酶(Brewser，N，K等，Arch.Biochem.Biophys31162-71(1994))，每種被示差調(diào)節(jié)。已發(fā)現(xiàn)丙酮酷羧化酶基因存在于谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)中，可相互轉(zhuǎn)化磷酸烯醇丙酮酸，草酰乙酸和丙酮酸的酶在此菌株中的數(shù)量達(dá)到6個。在一種生物體中存在全部6種酶的情況還沒有被報道過。產(chǎn)香茅醇假單胞菌含有相互轉(zhuǎn)化草酰乙酸，PEP和丙酮酸的5種酶，即丙酮酸激酶，PEP合成酶，PEP羧化酶，草酰乙酸脫羧酶和丙酮酸羧化酶(O’Brien，R，W，等，J.BiolChem2521257-1263(1997).固氮菌含有上面除了PEP合成酶以外的所有酶(Scrutton，M.C.和Taylor，B.L.Arch，Biochem.Biophys，164641-654(1974))。
谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)中6種代謝相關(guān)的酶的存在，提示了通過效應(yīng)子進(jìn)行調(diào)節(jié)這些酶是重要的。所有6種相關(guān)的酶與其它下游活性協(xié)調(diào)的生化和遺傳學(xué)研究可以導(dǎo)致對于最大化這種工業(yè)上重要的生物體的初級代謝物的產(chǎn)量必要的準(zhǔn)確過程的闡明。
實施例6丙酮酸羧化酶突變體的構(gòu)建應(yīng)用PCR擴增了丙酮酸羧化酶從180到3630位核苷酸的完整的可讀框。設(shè)計PCR使用的寡核甘酸引物，通過沉默誘變?nèi)コ幋a序列中的SalI位點，并在可續(xù)框的上游和下游分別導(dǎo)入EcoRV和SalI位點。用EcoRV和SalI消化PCR產(chǎn)物并克隆到pBluescript載體上。獲得pPCBluescript質(zhì)粒。為獲得在質(zhì)粒攜帶的pyc的破壞，構(gòu)建了pPCBluescript的衍生物，其中的pyc基因的中間部分被刪除并替換上了tsr基因，它編碼對于抗生素硫鏈絲菌肽的抗性。然后將RP4mob元件插入質(zhì)粒中，得到pAL240。這個質(zhì)粒能夠經(jīng)結(jié)合轉(zhuǎn)移到棒狀桿菌中，但是它轉(zhuǎn)入后不能復(fù)制，因為它僅僅具有ColE1復(fù)制起始位點。經(jīng)轉(zhuǎn)接合將pAL240從大腸桿菌S17-1轉(zhuǎn)入谷氨酸棒狀桿菌中，然后在含有硫鏈絲菌肽和萘啶酮酸的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)結(jié)合體。
在確證每一個轉(zhuǎn)接合體的藥物抗性表型之后，檢測它們在不同碳源上生長的能力。因為pAL240不能在棒狀桿菌中復(fù)制，能夠存活的那些細(xì)胞應(yīng)是其基因組和質(zhì)粒進(jìn)行了重組的。鑒定出的幾種侯選物具有合適的表型它們具有對硫鏈絲菌肽和萘啶酮酸的抗性，在含有葡萄糖和醋酸作為單一碳源的極限平板上生長良好，在含有乳酸作為單一碳源的極限平板上生長較差或者根本不在生長。應(yīng)用Southern雜交和基于PCR的實驗來確證是否僅有一個拷貝的丙酮酸羧化酶基因存在于基因組中，以及是否它被硫鏈絲菌肽抗性標(biāo)記破壞了。檢測這一菌殊中的賴氨酸的合成和生物素化蛋白的產(chǎn)生，Δpyc菌株作為活性實驗的負(fù)對照，和互補實驗的宿主株。
實施例7開發(fā)過量表達(dá)的菌株為了檢測丙酮酸羧化酶水平的增加會導(dǎo)致賴氨酸產(chǎn)量的增加這一假說，有必要構(gòu)建菌株，其中的丙酮酸羧化酶基因的表達(dá)是處在誘導(dǎo)型啟動子的控制下。
載體pAPE12，它具有NG2的復(fù)制起始位點和IPTG控制的Trp啟動子的下游的多克隆位點，被用作谷氨酸棒狀桿菌中的表達(dá)載體。構(gòu)建了pAPE12的衍生物，其中含有的丙酮酸羧化酶位于Ptrc的下游。將pyc基因從pPCBluescript上，用SalI和XbaI切下，并連接到用同樣酶切割的pAPE12上，形成pLW305。pPCBluescript上的丙酮酸羧化酶基因(因此，同樣地pLW305上)具有野生型的GTG起始密碼子，并且存在于靠近野生型基因的5’端的SalI限制性位點，被通過在丙酮酸羧化酶基因的擴增中引入一個堿基的沉默突變而消除掉了。
pLW305和pAPE12被通過電穿孔導(dǎo)入幾種其它的棒狀桿菌的遺傳背景中。
因為pLW305中的丙酮酸羧化酶基因具有GTG起始密碼子，并在trc啟動子和起始密碼間含有一些間插DNA，設(shè)計一種丙酮酸羧化酶過表達(dá)質(zhì)粒，pXL1，其消除了這些缺點。使用寡核苷酸引物，從pLW305擴增該基因的5’端時，同時，將GTG啟始密碼子變成了ATG并引入了BspLU11-I限制性位點，其與NcoI相容。然后用BspLU11-I和AfeI切割PCR產(chǎn)物，并連入pLW305的用NcoI部分消化后用AfeI完全切割所得到的7.5Kb的骨架上。兩個獨立套的連接和轉(zhuǎn)化得到了推定的pXL1克隆。
實施例8發(fā)酵結(jié)果已經(jīng)顯示出，當(dāng)基因從其天然谷氨酸棒狀桿菌C.glutamicum啟動子表達(dá)時，丙酮酸羧化酶的活性水平隨碳源的不同而有很大的變化。因此，檢測了在這些碳源上生長的各個菌株的丙酮酸羧化酶的產(chǎn)量。
菌株NRRL B-11474，NRRLB-11474(pLW305)，和NRRL B-11474Δpyc侯選物35在具兩種不同碳源，葡萄糖和乳酸的燒瓶中于NRRLB-11474的極限培養(yǎng)基上生長。生長結(jié)果和氨基酸產(chǎn)生量列出如下。

NRRL B-11474和pLW305在葡萄糖上表現(xiàn)出相同的行為。兩株都產(chǎn)生相同的生物量和賴氨酸。在乳酸上也具有相似的賴氨酸產(chǎn)量。在相同的時期中，NRRL B-11474(pLW305)消耗了培養(yǎng)基中所有的乳酸，而野生型的NRRL-11474消耗少40％的乳酸。通過計算得到NRRLB-11474以0.37克乳酸/小時的速率消耗乳酸，而NRRL B-11474(pLW305)菌株以0.65克乳酸/小時的速率消耗是這種基質(zhì)。
NRRL B-11474Δpyc不在乳酸上生長，這與預(yù)期的表型是一致的。它的葡萄糖上的生長非常低，且該菌株不產(chǎn)生賴氨酸。進(jìn)行動力學(xué)研究可以獲知這些菌株行為的更多的特征。
實施例9目測觀察生物素化的蛋白丙酮酸羧化酶含有生物素。因此通過監(jiān)測細(xì)胞中特定的生物素化產(chǎn)物的出現(xiàn)，應(yīng)該可以測定這種酶的積累。
實施例10電泳凝膠為在電泳凝膠中檢測生物素化的蛋白質(zhì)，使用了一種商業(yè)來源的連接著堿性磷酸酶的鏈霉抗生物素蛋白。經(jīng)過誘導(dǎo)或者未誘導(dǎo)的大腸桿菌DH5α或者含有pAPE12或者pLW305的NRRL B-11474的培養(yǎng)物的粗蛋白裂解物在雙份的7.5％聚丙烯胺變性電泳膠上分離蛋白質(zhì)。每對之一的凝膠用考馬斯亮蘭染色以觀察所有的蛋白質(zhì)，并保證每一上樣孔中所上樣的蛋白質(zhì)量是一樣的。其它的凝膠用能夠結(jié)合生物素化蛋白的鏈霉抗生物素蛋白質(zhì)-堿性磷酸酶試劑處理。給堿性磷酸酶提供比色底物，5-溴-4-氯-3-引哚磷酸(BCIP)可以目測觀察到這些蛋白質(zhì)的位置。與其它人所報道的一樣，檢測到了兩種主要的生物素化蛋白。高分子量的那種(大約120KDa)顯示為丙酮酸羧化酶，低分子量的那種(大約60KDa)是生物素化的乙酰輔酶A羧化酶亞基。
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盡管為了闡明和理解的目的已用一些細(xì)節(jié)描述了前述發(fā)明，但閱讀本說明書的本領(lǐng)域的技術(shù)人員會充分理解各種形式和細(xì)節(jié)的變化并非脫離本發(fā)明和所附權(quán)利要求的范圍。
序列表<110>Sinskey，Anthony J.
Lessard，Philip A.
Willis，Laura B.
Stephanopoulos，Gregory<120>來自谷氨酸棒桿菌的丙酮酸羧化酶<130>1533.079CN00<140><141><160>36<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>3621<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><221>CDS<222>(199)..(3621)<400>1tggggcgggg ttagatcctg gggggtttat ttcattcact ttggcttgaa gtcgtgcagg 60tcaggggagt gttgcccgaa aacattgaga ggaaaacaaa aaccgatgtt tgattggggg 120aatcgggggt tacgatacta ggacgcagtg actgctatca cccttggcgg tctcttgttg 180aaaggaataa ttactcta gtg tcg act cac aca tct tca acg ctt cca gca 231Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala1 5 10ttc aaa aag atc ttg gta gca aac cgc ggc gaa atc gcg gtc cgt gct 279Phe Lys Lys Ile Leu Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala15 20 25ttc cgt gca gca ctc gaa acc ggt gca gcc acg gta gct att tac ccc 327Phe Arg Ala Ala Leu Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro30 35 40cgt gaa gat cgg gga tca ttc cac cgc tct ttt gct tct gaa gct gtc 375Arg Glu Asp Arg Gly Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val45 50 55cgc att ggt acc gaa ggc tca cca gtc aag gcg tac ctg gac atc gat 423Arg Ile Gly Thr Glu Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp60 65 70 75gaa att atc ggt gca gct aaa aaa gtt aaa gca gat gcc att tac ccg471Glu Ile Ile Gly Ala Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro80 85 90gga tac ggc ttc ctg tct gaa aat gcc cag ctt gcc cgc gag tgt gcg519Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala95 100 105gaa aac ggc att act ttt att ggc cca acc cca gag gtt ctt gat ctc567Glu Asn Gly Ile Thr Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu110 115 120acc ggt gat aag tct cgc gcg gta acc gcc gcg aag aag gct ggt ctg615Thr Gly Asp Lys Ser Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu125 130 135cca gtt ttg gcg gaa tcc acc ccg agc aaa aac atc gat gag atc gtt663Pro Val Leu Ala Glu Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val140 145 150 155aaa agc gct gaa ggc cag act tac ccc atc ttt gtg aag gca gtt gcc711Lys Ser Ala Glu Gly Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala160 165 170ggt ggt ggc gga cgc ggt atg cgt ttt gtt gct tca cct gat gag ctt759Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu175 180 185cgc aaa tta gca aca gaa gca tct cgt gaa gct gaa gcg gct ttc ggc807Arg Lys Leu Ala Thr Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly190 195 200gat ggc gcg gta tat gtc gaa cgt gct gtg att aac cct cag cat att855Asp Gly Ala Val Tyr Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile205 210 215gaa gtg cag atc ctt ggc gat cac act gga gaa gtt gta cac ctt tat903Glu Val Gln Ile Leu Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr220 225 230 235gaa cgt gac tgc tca ctg cag cgt cgt cac caa aaa gtt gtc gaa att951Glu Arg Asp Cys Ser Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile240 245 250gcg cca gca cag cat ttg gat cca gaa ctg cgt gat cgc att tgt gcg999Ala Pro Ala Gln His Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala255 260 265gat gca gta aag ttc tgc cgc tcc att ggt tac cag ggc gcg gga acc1047Asp Ala Val Lys Phe Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr
270 275 280gtg gaa ttc ttg gtc gat gaa aag ggc aac cac gtc ttc atc gaa atg1095Val Glu Phe Leu Val Asp Glu Lys Gly Ash His Val Phe Ile Glu Met285 290 295aac cca cgt atc cag gtt gag cac acc gtg act gaa gaa gtc acc gag1143Asn Pro Arg Ile Gln Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu300 305 310 315gtg gac ctg gtg aag gcg cag atg cgc ttg gct gct ggt gca acc ttg1191Val Asp Leu Val Lys Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu320 325 330aag gaa ttg ggt ctg acc caa gat aag atc aag acc cac ggt gca gca1239Lys Glu Leu Gly Leu Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala335 340 345ctg cag tgc cgc atc acc acg gaa gat cca aac aac ggc ttc cgc cca1287Leu Gln Cys Arg Ile Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro350 355 360gat acc gga act atc acc gcg tac cgc tca cca ggc gga gct ggc gtt1335Asp Thr Gly Thr Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val365 370 375cgt ctt gac ggt gca gct cag ctc ggt ggc gaa atc acc gca cac ttt1383Arg Leu Asp Gly Ala Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe380 385 390 395gac tcc atg ctg gtg aaa atg acc tgc cgt ggt tcc gac ttt gaa act1431Asp Ser Met Leu Val Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr400 405 410gct gtt gct cgt gca cag cgc gcg ttg gct gag ttc acc gtg tct ggt1479Ala Val Ala Arg Ala Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly415 420 425gtt gca acc aac att ggt ttc ttg cgt gcg ttg ctg cgg gaa gag gac1527Val Ala Thr Asn Ile Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp430 435 440ttc act tcc aag cgc atc gcc acc gga ttc att gcc gat cac ccg cac1575Phe Thr Ser Lys Arg Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Pro His445 450 455ctc ctt cag gct cca cct gct gat gat gag cag gga cgc atc ctg gat1623Leu Leu Gln Ala Pro Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp460 465 470 475tac ttg gca gat gtc acc gtg aac aag cct cat ggt gtg cgt cca aag1671Tyr Leu Ala Asp Val Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys
480 485 490gat gtt gca gct cct atc gat aag ctg cct aac atc aag gat ctg cca1719Asp Val Ala Ala Pro Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro495 500 505ctg cca cgc ggt tcc cgt gac cgc ctg aag cag ctt ggc cca gcc gcg1767Leu Pro Arg Gly Ser Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala510 515 520ttt gct cgt gat ctc cgt gag cag gac gca ctg gca gtt act gat acc1815Phe Ala Arg Asp Leu Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr525 530 535acc ttc cgc gat gca cac cag tct ttg ctt gcg acc cga gtc cgc tca1863Thr Phe Arg Asp Ala His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser540 545 550 555ttc gca ctg aag cct gcg gca gag gcc gtc gca aag ctg act cct gag1911Phe Ala Leu Lys Pro Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu560 565 570ctt ttg tcc gtg gag gcc tgg ggc ggc gcg acc tac gat gtg gcg atg1959Leu Leu Ser Val Glu Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met575 580 585cgt ttc ctc ttt gag gat ccg tgg gac agg ctc gac gag ctg cgc gag2007Arg Phe Leu Phe Glu Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu590 595 600gcg atg ccg aat gta aac att cag atg ctg ctt cgc ggc cgc aac acc2055Ala Met Pro Asn Val Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr605 610 615gtg gga tac acc ccg tac cca gac tcc gtc tgc cgc gcg ttt gtt aag2103Val Gly Tyr Thr Pro Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys620 625 630 635gaa gct gcc agc tcc ggc gtg gac atc ttc cgc atc ttc gac gcg ctt2151Glu Ala Ala Ser Ser Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu640 645 650aac gac gtc tcc cag atg cgt cca gca atc gac gca gtc ctg gag acc2199Asn Asp Val Ser Gln Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr655 660 665aac acc gcg gta gcc gag gtg gct atg gct tat tct ggt gat ctc tct2247Asn Thr Ala Val Ala Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser670 675 680gat cca aat gaa aag ctc tac acc ctg gat tac tac cta aag atg gca2295Asp Pro Asn Glu Lys Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala
685 690 695gag gag atc gtc aag tct ggc gct cac atc ttg gcc att aag gat atg2343Glu Glu Ile Val Lys Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met700 705 710 715gct ggt ctg ctt cgc cca gct gcg gta acc aag ctg gtc acc gca ctg2391Ala Gly Leu Leu Arg Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu720 725 730cgc cgt gaa ttc gat ctg cca gtg cac gtg cac acc cac gac act gcg2439Arg Arg Glu Phe Asp Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala735 740 745ggt ggc cag ctg gca acc tac ttt gct gca gct caa gct ggt gca gat2487Gly Gly Gln Leu Ala Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp750 755 760gct gtt gac ggt gct tcc gca cca ctg tct ggc acc acc tcc cag cca2535Ala Val Asp Gly Ala Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro765 770 775tcc ctg tct gcc att gtt gct gca ttc gcg cac acc cgt cgc gat acc2583Ser Leu Ser Ala Ile Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr780 785 790 795ggt ttg agc ctc gag gct gtt tct gac ctc gag ccg tac tgg gaa gca2631Gly Leu Ser Leu Glu Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala800 805 810gtg cgc gga ctg tac ctg cca ttt gag tct gga acc cca ggc cca acc2679Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr815 820 825ggt cgc gtc tac cgc cac gaa atc cca ggc gga cag ttg tcc aac ctg2727Gly Arg Val Tyr Arg His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu830 835 840cgt gca cag gcc acc gca ctg ggc ctt gcg gat cgt ttc gaa ctc atc2775Arg Ala Gln Ala Thr Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile845 850 855gaa gac aac tac gca gcc gtt aat gag atg ctg gga cgc cca acc aag2823Glu Asp Asn Tyr Ala Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys860 865 870 875gtc acc cca tcc tcc aag gtt gtt ggc gac ctc gca ctc cac ctc gtt2871Val Thr Pro Ser Ser Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val880 885 890ggt gcg ggt gtg gat cca gca gac ttt gct gcc gat cca caa aag tac2919Gly Ala Gly Val Asp Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr
895 900 905gac atc cca gac tct gtc atc gcg ttc ctg cgc ggc gag ctt ggt aac2967Asp Ile Pro Asp Ser Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn910 915 920cct cca ggt ggc tgg cca gag cca ctg cgc acc cgc gca ctg gaa ggc3015Pro Pro Gly Gly Trp Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly925 930 935cgc tcc gaa ggc aag gca cct ctg acg gaa gtt cct gag gaa gag cag3063Arg Ser Glu Gly Lys Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln940 945 950 955gcg cac ctc gac gct gat gat tcc aag gaa cgt cgc aat agc ctc aac3111Ala His Leu Asp Ala Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn960 965 970cgc ctg ctg ttc ccg aag cca acc gaa gag ttc ctc gag cac cgt cgc3159Arg Leu Leu Phe Pro Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg975 980 985cgc ttc ggc aac acc tct gcg ctg gat gat cgt gaa ttc ttc tac ggc3207Arg Phe Gly Asn Thr Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly990 9951000ctg gtc gaa ggc cgc gag act ttg atc cgc ctg cca gat gtg cgc acc3255Leu Val Glu Gly Arg Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg 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Leu Ala Thr180 185 190Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ala Val Tyr195 200 205Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu210 215 220Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser225 230 235 240Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His245 250 255Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe260 265 270Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val275 280 285Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln290 295 300Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys305 310 315 320Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu325 330 335Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile340 345 350Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile355 360 365Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala370 375 380Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val385 390 395 400Lys 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740 745 750Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala755 760 765Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile770 775 780Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu785 790 795 800Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr805 810 815Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg820 825 830His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr835 840 845Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala850 855 860Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser865 870 875 880Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp885 890 895Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser900 905 910Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp915 920 925Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys930 935 940Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala945 950 955 960Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro965 970 975Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr980 985 990Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg99510001005Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val Arg101010151020Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn Val Val025103010351040Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg Asp Arg Ser104510501055Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp Ser Ser Asn Lys106010651070Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val Thr Val Thr Val Ala107510801085Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala Val Ala Ile Ile Glu Ala109010951100Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp105111011151120Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile112511301135Val Val Val Ser1140<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述正向DNA引物<400>3gtcttcatcg agatgaatcc gcg 23<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述反向DNA引物<400>4cgcagcgcca catcgtaagt cgc 23<210>5<211>8<212>PRT<213>Caenorhabditis elegans<400>5Tyr Phe Ile Glu Val Asn Ala Arg1 5<210>6<211>7<212>PRT<213>Caenorhabditis elegans<400>6Ala Thr Phe Asp Val Ser Met1 5<210>7<211>8<212>PRT<213>Aedes aegypti<400>7Tyr Phe Ile Glu Val Asn Ala Arg1 5<210>8<211>7<212>PRT<213>Aedes aegypti<400>8Ala Thr Phe Asp Val Ala Leu1 5<210>9<211>8<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<400>9Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg1 5<210>10<211>7<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<400>10Ala Thr Tyr Asp Val Ala Leu1 5<210>11<211>8<212>PRT<213>嗜熱脂肪桿菌<400>11Tyr Phe Ile Glu Val Asn Pro Arg1 5<210>12<211>7<212>PRT<213>嗜熱脂肪桿菌<400>12Ala Thr Phe Asp Val Ala Tyr1 5<210>13<211>8<212>PRT<213>巴斯德畢赤酵母<400>13Tyr Phe Ile Glu Ile Asn Pro Arg1 5<210>14<211>7<212>PRT<213>巴斯德畢赤酵母<400>14Ala Thr Phe Asp Val Ser Met1 5<210>15<211>8<212>PRT<213>Mus musculus<400>15Tyr Phe Ile Glu Val Asn Ser Arg1 5<210>16<211>7<212>PRT<213>Mus musculus<400>16Ala Thr Phe Asp Val Ala Met1 5<210>17<211>8<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>17Tyr Phe Ile Glu Val Asn Ser Arg1 5<210>18<211>7<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>18Ala Thr Phe Asp Val Ala Met1 5<210>19<211>8<212>PRT<213>釀酒酵母1<400>19Tyr Phe Ile Glu Ile Asn Pro Arg1 5<210>20<211>7<212>PRT<213>釀酒酵母1<400>20Ala Thr Phe Asp Val Ala Met1 5<210>21<211>8<212>PRT<213>釀酒酵母2<400>21Tyr Phe Ile Glu Ile Asn Pro Arg1 5<210>22<211>7<212>PRT<213>釀酒酵母2<400>22Ala Thr Phe Asp Val Ala Met1 5<210>23<211>8<212>PRT<213>Rhizobium etli<400>23Tyr Phe Ile Glu Val Asn Pro Arg1 5<210>24<211>7<212>PRT<213>Rhizobium etli<400>24Ala Thr Phe Asp Val Ser Met1 5<210>25<211>8<212>PRT<213>人<400>25Tyr Phe Ile Glu Val Asn ser Arg1 5<210>26<211>7<212>PRT<213>人<400>26Ala Thr Phe Asp Val Ala Met1 5<210>27<211>8<212>PRT<213>粟酒裂殖酵母<400>27Tyr Phe Ile Glu Ile Asn Pro Arg1 5<210>28<211>7<212>PRT<213>粟酒裂殖酵母<400>28Ala Thr Phe Asp Val Ser Met1 5<210>29<211>9<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>29Phe Leu Phe Glu Asp Pro Trp Asp Arg1 5<210>30<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述DNA引物<400>30ttcaccaggt ccacctcg18<210>31<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述DNA引物<400>31cgtcgcaaag ctgactcc 18<210>32<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述DNA引物<400>32gatgcttctg ttgctaattt gc22<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述DNA引物<400>33ggccattaag gatatggctg 20<210>34<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述DNA引物<400>34gcggtggaat gatccccga19<210>35<211>18<213>人工序列<220><223>人工序列的描述DNA引物<400>35accgcactgg gccttgcg18<210>36<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述DNA引物<400>36tcgccgcttc ggcaacac18
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，包括與選自下列的序列具有至少95％的同一性的多核苷酸(a)一種編碼具有SEQ ID NO2中的氨基酸序列的丙酮酸羧化酶多肽的核苷酸序列；(b)一種編碼具有ATCC保藏號_中所含的粘?？寺∷幋a的完整的氨基酸序列的丙酮酸羧化酶多肽的核苷酸序列；以及(c)一種和(a)或者(b)中的任一種核苷酸序列互補核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所說的多核苷酸具有SEQ ID NO1中的完整的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所說的多核苷酸具有編碼具有SEQ ID NO2中的氨基酸序列的丙酮酸羧化酶多肽的SEQ ID NO1中的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所說的多核苷酸具有編碼具有包含在ATCC保藏號_中的粘?？寺∷幋a的全部氨基酸序列的丙酮酸羧化酶多肽的核苷酸序列。
5.一種分離的核酸分子，包括在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與具有相同于權(quán)利要求1的(a)，(b)或(c)中的核苷酸序列的核苷酸序列的雜交的多核苷酸，其中所說的雜交的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下不與具有僅由A殘基或僅由T殘基組成的核苷酸序列的多核苷酸雜交。
6.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所說的多核苷酸是DNA。
7.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所說的多核苷酸是RNA。
8.一種制備重組載體的方法，包括將權(quán)利要求1的一種分離的核酸分子插入到載體中。
9.由權(quán)利要求8的方法所制備的重組載體。
10.一種制備重組宿主細(xì)胞的方法，包括將權(quán)利要求9的重組載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。
11.由權(quán)利要求10的方法所制備的重組宿主細(xì)胞。
12.一種制備丙酮酸羧化酶多肽的重組方法，包括將權(quán)利要求11的重組宿主細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)，從而使該多肽得到表達(dá)，并回收該多肽。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所說的丙酮酸羧化酶的表達(dá)比它在谷氨酸棒桿菌中的表達(dá)高2-20倍。
14.一種分離的丙酮酸羧化酶多肽，它具有與選自下列的序列有至少95％的同一性的氨基酸序列(a)具有SEQ ID NO2中的完整的氨基酸序列的丙酮酸羧化酶多肽的氨基酸序列；(b)具有包含在ATCC保藏號_中的粘粒克隆所編碼的完整的氨基酸序列的丙酮酸羧化酶多肽的氨基酸序列；以及
15.一種制備氨基酸的方法，包括表達(dá)權(quán)利要求1的核苷酸序列并回收所說的氨基酸。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所說的氨基酸是賴氨酸。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所說的丙酮酸羧化酶多肽的表達(dá)比它在谷氨酸棒桿菌中的表達(dá)高2-20倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種來自谷氨酸棒狀桿菌的添補酶,它可在賴氨酸和谷氨酸的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中補充消耗的草酰乙酸。特別地,本發(fā)明提供了編碼丙酮酸羧化酶蛋白的分離的核酸。本發(fā)明還提供了丙酮酸羧化酶多肽。
文檔編號C12N15/09GK1336958SQ9881437
公開日2002年2月20日 申請日期1998年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月23日
發(fā)明者A·J·辛斯基, P·A·萊薩德, L·B·威利斯 申請人:麻省理工學(xué)院